JP2942564B2 - 乳酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、１モルのＬ−乳酸に作用して１モルの酵素
を消費し、１モルのピルビン酸および１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒する酵素である常用名“乳酸オ
キシダーゼ”を構成するポリペプチドをコードする新規
な遺伝子を用いた乳酸オキシダーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、乳酸を基質とする乳酸オキシダーゼとしては、 Ｌ−乳酸＋O₂→ピルビン酸＋H₂O₂ で示される酵素反応、すなわちＬ−乳酸と１分子の酵素
からピルビン酸と１分子の過酸化水素との生成反応を触
媒する酵素が報告されており、該酵素はこれまでにペデ
ィオコッカス（Pediococcus）属、ストレプトコッカス
（Streptococcus）属、アエロコッカス（Aerococcus）
属に属する細菌等に存在することが知られている（特公
昭58−4557号、特公昭59−10190号）。これらの乳酸オ
キシダーゼは、補欠分子族であるFMNと結合して木口酵
素の形にて酵素活性を発現するものであり、Ｌ−乳酸を
基質とすることから、生体成分、例えば血清または乳酸
塩を用いた種々医薬品あるいは乳酸発酵における乳酸の
定量および乳酸試薬の乳酸純度試験、直接間接に乳酸を
生成または乳酸消費に関与する酵素の活性測定などの分
析や血清中の乳酸の除去等に使用されており、極めて有
用な酵素である。一方、上記乳酸オキシダーゼ以外に以
前より公知であった常用名“乳酸オキシダーゼ”とし
て、エンザイム・ハンドブック（Enzyme handbook）第
１巻第11頁（Springer−Verlag Berlin Heidelberg New
York発行、1969年、Ｅ・バーマン著）に記載されてい
るマイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phle
i）またはネーチャー（Nature）第170巻第207頁（1952
年）に記載されているマイコバクテリウム・アビウム
（Mycobacterium avium）由来の、Ｌ−ラクテート：オ
キシゲン・オキシドレダクターゼ（Ｌ−Lactate:oxygen
oxidoreductase、酵素番号1.1.3.2）が知られている
が、この乳酸オキシダーゼは本発明の乳酸オキシダーゼ
とは異なる次式の反応を触媒する酵素であり、その反応
生成物は酢酸、二酸化炭素および水を生成する。

従って、以下に単に乳酸オキシダーゼと記載する場合
は、１モルのＬ−乳酸に作用して１モルの酸素を消費
し、１モルのピルビン酸および１モルの過酸化水素を生
成する反応を触媒する酵素を表すものとする。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来より報告されている乳酸オキシダーゼ生産菌は、
乳酸オキシダーゼの生産性が低く、また純度の高い良質
な乳酸オキシダーゼを得るために精製コストが非常に高
いものとなり、研究用または臨床診断用の酵素試薬とし
て容易に広く用いるには必ずしも満足のいくものではな
かった。またこれら乳酸オキシダーゼのアミノ酸配列を
コードした詳細な遺伝子の一次構造及び該酵素を構成す
るポリペプチドの一次構造は未だ報告されておらず、従
って遺伝子工学的手段を用いる該酵素の生産性向上によ
る上記問題点の具体的解決法が求められていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記乳酸オキシダーゼの生産性向上に
よる製造コストの低減を図るべく高生産性菌株のスクリ
ーニングおよび菌株改良に努力したところ、乳酸オキシ
ダーゼをコードする詳細な遺伝子の一次構造決定及び該
酵素を構成するポリペプチドの一次構造推定に成功し、
さらに少なくとも該DNAを挿入したベクターを保持する
形質転換体を取得し、次いで該形質転換体を培養するこ
とにより目的とする乳酸オキシダーゼの製造法を確立
し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、 １モルのＬ−乳酸に作用して１モルの酵素を消費し、１
モルのピルビン酸および１モルの過酸化水素を生成する
反応を触媒する酵素である乳酸オキシダーゼを構成する
ポリペプチドの下記アミノ酸配列 をコードするDNA塩基配列を含むDNA、 少なくとも、該DNAを保持することを特徴とするベク
ターDNA、 宿主にとって外来性であるDNAを有する該ベクターDNA
を保持することを特徴とする形質転換体、 上記の乳酸オキシダーゼを構成し、Ｎ末端側より下記
に表されるアミノ酸配列 からなるポリペプチド 宿主にとって外来性であるDNAを有する上記ベクターD
NAを保持する形質転換体を培養して、上記の乳酸オキシ
ダーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコード
するDNA塩基配列を含むDNAの遺伝情報を発現せしめ、そ
の培養物から上記の乳酸オキシダーゼを採取することを
特徴とする乳酸オキシダーゼの製造法、 を提供する。

本発明の乳酸オキシダーゼは、その乳酸オキシダーゼ
を構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする新
規なDNA遺伝子（以下、乳酸オキシダーゼ遺伝子または
乳酸オキシダーゼDNAということもある）を発現せしめ
て、補欠分子族であるFADとの共存により活性型である
乳酸オキシダーゼとなり、その酵素作用は前述の通りＬ
−乳酸と酸素からピルビン酸と過酸化水素を生成する反
応を触媒するものであるが、さらに該酵素における2,3
の特徴としてその理化学的性質を例示すれば次の如くで
ある。

即ち、 （ａ）作用；反応式〔Ｉ〕 Ｌ−乳酸＋O₂→ピルビン酸＋H₂O₂〔Ｉ〕 で表される反応を触媒する作用。

（ｂ）基質特異性;L−乳酸に基質特異性を有する。

（ｃ）至適pH;pH6−７付近。

（ｄ）pH安定性;pH6.8−8.5付近で安定。

（ｅ）至適温度;35℃付近。

（ｆ）等電点;pH4.6±0.3（キャリア・アンフォライト
を用いる電気泳動法）。

（ｇ）分子量;80000±10000。

本発明のDNAは、例えば遺伝子組換え技術を利用し次
の如くして製造される。すなわち、乳酸オキシダーゼ産
生能を有する乳酸オキシダーゼ遺伝子の供与体である微
生物より該微生物のDNAを分離精製した後、超音波、制
限酵素等を用いて切断した該DNAと切断してリニヤーに
した発現ベクターと両DNAの平滑または接着末端部にお
いてDNAリガーゼ等により結合閉環させる。次いで、得
られた組換えDNAベクターを複製可能な宿主微生物に移
入した後、ベクターのマーカーまたは／および乳酸オキ
シダーゼの活性とを指標としてスクリーニングして取得
した該組換えDNAベクターを保持する微生物を培養し、
該培養菌体から該組換えDNAベクターを分離精製し、次
いで該組換えベクターから乳酸オキシダーゼ遺伝情報を
有する本発明DNAを採取することにより製造できる。

DNAの供与微生物は、乳酸オキシダーゼ産生能を有す
る微生物であればよく、例えば、ペディオコッカス属、
ストレプトコッカス属、アエロコッカス属に属する生産
菌等の群から適宜選ばれ、例えば、ペディオコッカス・
エス・ピー・Ｂ−0667（FERM BP−465）、ストレプトコ
ッカス・エス・ピー・Ｂ−0668（FERM BP−466）、スト
レプトコッカスファエシウムATCC12755、アエロコッカ
ス・ビリダンスIFO12219、アエロコッカス・ビリダンス
IFO12317等が挙げられ、好ましくは、アエロコッカス属
に属する乳酸オキシダーゼ生産菌としてアエロコッカス
・ビリダンスIFO12219が挙げられる。

遺伝子の供与体である微生物に由来するDNAは次の如
くにして採取される。即ち、DNAの供与微生物を、例え
ば、液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養し、得られる
培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させる
ことによって乳酸オキシダーゼ遺伝子を含有する溶菌物
を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ
−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施さ
れ、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル
硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細
胞壁の物理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処
理を上述の溶菌法との組み合せで行ってもよい。このよ
うにして得られた溶菌物からDNAを分離、精製するに
は、常法に従って、例えばフェノール抽出による除蛋白
処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アル
コール沈殿、遠心分離などの方法を適宜組み合わせるこ
とにより行うことができる。

分離精製された微生物DNAを切断する方法は、例え
ば、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことがで
きるが、得られるDNA断片とベクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する、例えば、EcoRI,HindIII,BamHIなどのII
型制限酵素が適している。

ベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖し
うるファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用とし
て構築されたものが適している。

ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Es
cherichia coli）を宿主微生物とする場合には、λgt・
λC,λgt・λＢなどが使用できる。

また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・
コリを宿主微生物とする場合には、pBR322,pBR325,pACY
C184,pUC12,pUC13,pUC18,pUC19などが、バチルス・ズブ
チルス（Bacillus subtilis）を宿主微生物とする場合
にはpUB110、pC194などが使用でき、またサッカロマイ
セス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）を宿主
微生物とする場合には、YRp7,pYC1,YEp13,pJDB,YIp1等
が使用できる。さらに、エシェリヒア・コリおよびサッ
カロマイセス・セレビシアなどの二種以上の宿主微生物
の細胞中で自律的に増殖可能なシャトルベクターを利用
することもできる。このようなベクターを、先に述べた
乳酸オキシダーゼ遺伝子供与体である微生物DNAの切断
に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクタ
ー断片を得ることが好ましい。

微生物DNA断片とベクター断片とを結合させる方法
は、公知のDNAリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物DNA断片の接着末端とベクター断片の接着
末端とのアニーリングの後、適当なDNAリガーゼの作用
により微生物DNA断片とベクター断片との組換えDNAを作
成する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物に
移入して、生体内のDNAリガーゼを利用し組換えDNAを作
成することもできる。

宿主微生物としては、組換えDNAが安定かつ自律的に
増殖可能で、且つ外来性DNAの形質が発現のできるもの
であればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コ
リの場合、エシェリヒア・コリDH1,エシェリヒア・コリ
HB101,エシェリヒア・コリW3110,エシェリヒア・コリC6
00等が使用でき、宿主微生物がバチルス・ズブチルスの
場合、バチルス・ズブチルス207−25〔ジーン（Gene）
第34巻、第１〜８頁、1985年〕、バチルス・ズブチルス
207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Jou
rnal of Biochemistroy）第95巻、第87〜93頁、1984
年〕、バチルス・ズブチルスBD170〔ネーチャー（Natur
e）第293巻、第481〜483頁、1981年〕、バチルス・ズブ
チルスＭ株（ATCC6051）等が使用でき、宿主微生物がサ
ッカロマイセス・セレビシアの場合、サッカロマイセス
・セレビシアAH−22〔ジーン（Gene）第39巻、第117〜1
20頁、1985年〕、サッカロマイセス・セレビシアBWG1−
7A〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Molecular＆Cellular Biology）第６巻、第355〜367
頁、1986年〕等が使用できる。

宿主微生物に組換えDNAを移入する方法としては、例
えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場
合には、カルシュウムイオンの存在下で組換えDNAの移
入を行い、またバチルス属に属する微生物の場合には、
コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを採用
することができ、さらにマイクロインジェクション法を
用いてもよい。

宿主微生物への目的組換えDNA移入の有無についての
選択は、目的DNA断片を保持する組換えDNAであるベクタ
ーのマーカー、好ましくは薬剤耐性マーカーおよび／ま
たは乳酸オキシダーゼ活性を発現し得る微生物を検索す
ればよく、例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地
で生育し、かつ乳酸オキシダーゼを構成するポリペプチ
ドを生成する微生物を選択すればよい。

このようにして一度選択された乳酸オキシダーゼ遺伝
子を保有する組換えDNAは、形質転換微生物から取り出
され、他の宿主微生物に移入することもできる。また、
乳酸オキシダーゼ遺伝子を保持する組換えDNAから制限
酵素などにより切断して乳酸オキシダーゼ遺伝子である
DNAを切り出し、これと同様な方法により切断して得ら
れる他の開環ベクター末端とを結合させて新規な特徴を
有する組換えDNAを作成して、他の宿主微生物に移入す
ることもできる。

また本質的に乳酸オキシダーゼ活性のある乳酸オキシ
ダーゼムテインをコードするDNAは、本発明の乳酸オキ
シダーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される
人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は部位特
異的塩基変換法および目的遺伝子の特定DNA断片を人工
変異DNA断片で置換するなどの種々なる遺伝子工学的方
法を使用して得られ、斯くして取得された人工変異遺伝
子のうち特に優れた性質を有する乳酸オキシダーゼムテ
インDNAをベクターに挿入せしめて組換えDNAを作成し、
これを宿主微生物に移入させることによって、乳酸オキ
シダーゼムテインの製造が可能である。

かくして得られた形質転換体を具体的に例示すれば、
アエロコッカス・ビリダンスIFO12219より採取した乳酸
オキシダーゼをコードするDNAをプラスミドpACYC184に
組み込み、該プラスミドpOX18を宿主微生物に移入して
得た形質転換体エシェリヒア・コア（Escherichia col
i）DH1・pOX18株「微工研菌条寄第2173号（FERM BP−21
73〕が挙げられる。

かくして得られる本発明DNAの塩基配列は、Science21
4 1205〜1210（1981年）に示されているジデオキシ法で
解読し、決定することができる。

例えば、乳酸オキシダーゼ遺伝子供与体としてアエロ
コッカス属に属する菌を用い、宿主微生物としてエシェ
リヒア・コリを用いて得られたプラスミド中の遺伝子の
塩基配列は第２図の通りである。

第２図において、Ｎ末端の１位Asnを示すコドンAATの
上流たる５′末端側はアミノ酸をコードするコドンであ
ればいずれでもよく、さらにその５′末端側にアミノ酸
をコードするコドンを１個以上有してもよいが、好まし
くはATGまたはATG以外の開始コドンやシグナルペプチド
に対応するポリデオキシリボ核酸を挙げることができ
る。またＣ末端のTyrを示すTACの下流たる３′末端側に
は、翻訳終始コドンまたはアミノ酸をコードするコドン
であればいずれでもよく、さらにその３′末端側にアミ
ノ酸をコードするコドンを１個以上有していてもよい
が、その場合にはこの複数個のコドンの３′末端にさら
に翻訳終始コドンを有することが好ましい。

さらに、本発明の乳酸オキシダーゼの塩基配列の解明
により、今後コロニーハイブリダイゼーション法により
目的乳酸オキシダーゼ構造遺伝子をクローニングするこ
ともできる。その場合、まず本発明で得られる乳酸オキ
シダーゼのDNAの断片を取り出し、該DNA断片を³²P等で
ラベルし、コロニーハイブリダイゼーションにより、乳
酸オキシダーゼオキシダーゼDNA供与微生物の培養細胞
より採取した遺伝子ライブラリーの中から、乳酸オキシ
ダーゼの構造遺伝子を含むプラスミドで形質転換された
株の選択をすることにより目的乳酸オキシダーゼ構造遺
伝子をクローニングすればよい。

また、本発明DNAを発現させることにより生産される
乳酸オキシダーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配
列は、DNAの塩基配列より予測決定できる。なお、該ペ
プチドのＮ−末端部を構成する部分アミノ酸配列は、以
下の如くして決定できる。すなわち、乳酸オキシダーゼ
産生能を有する乳酸オキシダーゼ遺伝子供与微生物を栄
養培地で培養して菌体内に乳酸オキシダーゼを産生蓄積
せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心
分離等の手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機
械的方法またはリゾチーム等の酵素的方法破壊し、また
必要に応じてEDTAおよび／または適当な界面活性剤等を
添加すれば、乳酸オキシダーゼが可溶化され、水溶液と
して分離採取される。この様にして得られた乳酸オキシ
ダーゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく
硫安分画、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィーにより処理して、高純度な乳酸
オキシダーゼが得られ、高純度乳酸オキシダーゼを用い
て液相プロテイン・シーケンサー（ベックマン社製:BEC
KMAN System 890ME）により乳酸オキシダーゼであるペ
プチドのＮ末端部を構成する部分アミノ酸配列が決定さ
れる。また、このようにして得られたポリペプチドは少
なくとも該部分アミノ酸配列において、遺伝子操作によ
って得られた遺伝子を解析することにより予測される乳
酸オキシダーゼのＮ末端部分アミノ酸配列と一致するも
のであることを確認し、第２図で示す塩基配列から、上
記の如くして決定されたアミノ酸配列は第１図に表され
る通りである。ここで、本発明で得られる乳酸オキシダ
ーゼは、分子量と本発明の第１図にて示されるポリペプ
チドのアミノ酸数との比較から、前述のポリペプチドの
二量体であると推定される。

第１図のアミノ酸配列において、Ｎ末端のAsnで示さ
れる上流のアミノ酸残基としては、一個または複数個の
アミノ酸残基よりなり、好ましくは、水素原子若しくは
Metまたはシグナルペプチドが挙げられる。Ｃ末端のTyr
で示される下流のものとしてはそのまま、または酸アミ
ドであってもよく、また１個以上のアミノ酸残基であっ
てもよい。

かくして得られる形質転換体である微生物は、栄養培
地に培養されることにより多量の乳酸オキシダーゼを安
定して産生し得る。

形質転換体である微生物の培養形態はその栄養生理的
性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの
場合は、液体培養で行うか、工業的には深部通気攪拌培
養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生
物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭
素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例
えばグルコース，サッカロース，ラクトース，マルトー
ス，フラクトース，糖蜜，などが使用される。窒素源と
しては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプ
トン，肉エキス，酵母エキス，カゼイン加水分解物など
が使用される。その他、リン酸塩，炭酸塩，硫酸塩，マ
グネシウム，カルシウム，カリウム，鉄，マンガン，亜
鉛などの塩類、特定のアミノ酸，特定のビタミンなどが
必要に応じて使用される。

培養温度は微生物が発育し、乳酸オキシダーゼを生産
する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場
合、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は、条件
によって多少異なるが、乳酸オキシダーゼが最高収量に
達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すれば
よく、通常は12〜48時間程度である。培地pHは菌が発育
し、乳酸オキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得る
が、特に好ましくはpH6.0〜8.0程度である。

培養物中の乳酸オキシダーゼは、菌体を含む培養液を
そのままを採取し、利用することもできるが、一般には
常法に従って、乳酸オキシダーゼが培養液中に存在する
場合には、濾過、遠心分離などにより乳酸オキシダーゼ
含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。乳
酸オキシダーゼが菌体内に存在する場合には、得られた
培養物を濾過または遠心分離などの手段により、菌体を
採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチーム
などの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等の
キレート剤および／または界面活性剤を添加して乳酸オ
キシダーゼを可溶化し水溶液として分離採取する。

この様にして得られた乳酸オキシダーゼ含有溶液を、
例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウ
ムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメ
タノール，エタノール，アセトンなどにより分別沈澱法
により沈澱せしめればよい。次いでこの沈澱物を、水に
溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純
物を除去することができる。また吸着剤あるいはゲル濾
過剤などによるゲル濾過，吸着クロマトグラフィー，イ
オン交換クロマトグラフィーにより精製し、これらの手
段を用いて得られる乳酸オキシダーゼ含有溶液は、必要
に応じて凍結乾燥のための安定化剤を添加して、減圧濃
縮凍結乾燥等の処理により精製された乳酸オキシダーゼ
を得ることができる。

本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、核酸関
連物質、その他に関する略号は、それらの当該分野にお
ける慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記
する。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。

DNA:デオキシリボ核酸 RNA:リボ核酸 A:アデニン T:チミン G:グアニン C:シトシン Ala:アラニン Arg:アルギニン Asn:アスパラギン Asp:アスパラギン酸 Cys:システイン Gln:グルタミン Glu:グルタミン酸 Gly:グリシン His:ヒスチジン Ile:イソロイシン Leu:ロイシン Lys:リジン Met:メチオニン Phe:フェニルアラニン Pro:プロリン Ser:セリン Thr:スレオニン Trp:トリプトファン Tyr:チロシン Val:バリン 〔実施例〕 以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本
発明はこれによって何ら限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例1.〔染色体DNAの分離〕 Aerococcus viridans（IFO12219）の染色体DNAを次の
方法で分離した。同菌株を150mlの普通ブイヨン培地
（0.5％チオ硫酸ソーダ含有）で37℃一晩振盪培養後遠
心（3,000回転10分）により集菌した。10％サツカロー
ス、50mMトリス塩酸（pH8.0）50mMEDTAを含んだ溶液5ml
に懸濁させ、1mlのリゾチーム（10mg/ml）を加えて37
℃、15分間保温し、次いで1mlの10％SDS（ドデシル硫酸
ナトリウム）溶液を加えた。この懸濁液に等量のクロロ
ホルム−フエノール混液（1:1）を加え、攪拌混合し、1
0,000rpm3分の遠心で水層と溶媒層に分け、水層を分取
した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層し、
ガラス棒でゆつくり攪拌しながらDNAをガラス棒にまき
つかせて分離した。これを10mlの10mMトリス塩酸（pH8.
0）,1mM EDTAを含んだ溶液（以下TEと略す）で溶解し
た。これを等量のクロロホルム−フエノール混液で処理
後、遠心により水層を分取し、２倍量のエタノールを加
えて上記の方法でもう一度DNAを分離し、2mlのTEで溶解
した。

実施例2.〔pACYC184プラスミドDNAの分離〕 pACYC184を保有するエシエリヒア・コリpM191（J.Bac
terilo134,1141（1981）;ATCC37033）を１のBHI培地
（Difco社製）で振盪培養した。濁度がOD₆₆₀＝1.0に増
殖したとき、スペクチノマイシン（最終濃度300μg/m
g）を加え、さらに37℃で16時間以上振盪を続けた。300
0rpm10分間の遠心により集菌し、リゾチーム−SDS法と
セシウムクロライド−エチジウムブロマイド法（Maniar
tisら:Molecular Cloning pp86〜94Cold Spring Harbor
（1982））に従いプラスミドDNAを調製した。

実施例3.〔乳酸オキシダーゼ遺伝子を有するプラスミド
pOXI8の作成〕 （ｉ）実施例1.で調製したA.viridansの染色体DNA2μｌ
（約0.5μｇ）と10倍濃度のEcoRIの切断用バツフアー
（500mMトリス塩酸（pH7.5）、70mMMgCl₂,1M NaCl,70mM
メルカプトエタノール）１μl,EcoRI（宝酒造製10unit/
ul）１μl,水６μｌを混合し、37℃１時間切断した。別
に調製したプラスミドpACYC184DNA約0.3μｇを同様の方
法を用いてEcoRIで切断し、さらにアルカリ製フオスフ
アターゼ（以下BAPと略すことがある。宝酒造製）0.6un
itを加え、65℃１時間処理した。これらのEcoRIで切断
した２種のDNA溶液を混合し、その1/10量の3M酢酸ナト
リウムを加え、さらに全体量と等量のクロロホルム−フ
エノール混液で処理し、遠心分離により水層を分取し
た。この水層に２倍容のエタノールを加え、遠心でDNA
を沈澱させたのち減圧乾燥した。水89μｌで溶解後、10
倍濃度のライゲーシヨンバツフア（0.5Mトリス塩酸（pH
7.6）,0.1M MgCl₂,0.1Mジチオスレイトール,10mMスペル
ミジン,10mMATP）10μｌとT4DNAリガーゼ１μｌ（宝酒
造製175unit）を加え混合し４℃で一晩放置した。このD
NA溶液をクロロホルム−フエノール処理し、エタノール
沈澱を集め減圧乾燥した後、10μｌのTEで溶解した。

（ii）100mlのBHI培地（Brain Heart Infusion,Difco社
製）で培養した対数増殖期のエシエリヒア・コリDH1株
〔国立遺伝学研究所より分与を受けた、ストツク番号ME
8569（ATCCNo.33849）〕を遠心分離により集菌し（10,0
00rpm.2分間）40mlの氷冷した30mM酢酸カリウム、100mM
RbCl,10mM CaCl₂、50mM MnCl₂および15％グリセリンを
含んだ溶液（pH5.8）で懸濁した。０℃で５分間放置
後、遠心し上清をすて、さらに4mlの10mMMOPS緩衝液
（ドータイト社製）、75mM CaCl₂、10mM RbClおよび15
％グリセリンを含んだ溶液（pH6.5）で懸濁し、０℃で1
5分間放置してコンピテント細胞とした。

（iii）この大腸菌懸濁液200μｌに（ｉ）で調製したDN
A溶液10μｌを加え、30分間０℃で放置した。BHI培地1m
lを加え、37℃で90分間保温後、この100μｌをテトラサ
イクリン（15μg/ml）を含んだBHI寒天プレートにま
き、37℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換
体を乳酸オキシダーゼ培地（組成はペプトン5g、NaCl 1
g、K₂HPO₄ 1g,MgSO₄ 0.5g、パーオキシダーゼ500IU、ジ
アニジン0.1g、乳酸ナトリウム5.6g、寒天15g,蒸留水１
、pH7.0）のプレートにレプリカし、37℃でさらに一
晩培養した。約8000コロニーの形質転換体を調べたとこ
ろ、コロニーの周辺が茶褐色に変色したもの４株を得、
このうちの１株をエシエリヒア・コリDH1・pOXI8株「微
生物受託番号 微工研条寄第2173号、FERM BP−2173」
と命名した。この菌を純粋分離後BHI培地で37℃一晩培
養し、乳酸オキシダーゼの生産性を後述する乳酸オキシ
ダーゼ活性測定法により調べたところ、約0.5u/mlの乳
酸オキシダーゼ活性を有していた。

この菌株の保有していたプラスミドを実施例２と同様
にしてプラスミドを分離し、乳酸オキシダーゼ遺伝子を
含み、pACYC184遺伝子を含むプラスミドpOXI8と命名し
た。

乳酸オキシダーゼ活性測定法 本発明の乳酸オキシダーゼの活性測定法は次の通りで
ある。

反応第１液 パーオキシダーゼ（50u/ml） 0.1ml 0.2M 3.3−ジメチルグルタレート−NaOH緩衝液（pH6.
5） 0.2ml 15mM 4−アミノアンチピリン 0.1ml 0.5MDL−乳酸（pH6.5） 0.1ml 水 0.3ml 合計 0.8ml 反応第２液 0.2％ N,N−ジメチルアニリン 反応停止後 0.25％ ラウリルベンゼン硫酸ナトリウム液 上記の組成の反応第１液0.8mlと反応第２液0.2mlを混
合し、37℃、３分間予備加温した後、酵素液20μｌを加
えて37℃、10分間反応を行い、反応後、2.0mlの反応停
止液を加えて反応を停止し、生じた紫色を565nmの波長
にて比色定量する。１分間に１μmoleの過酸化水素を生
じる活性を１単位（Ｕ）とした。

また、この酵素活性測定法による酵素活性（力価）の
算出は次式に従う。

実施例4.〔pOXI8のマツピングおよび乳酸オキシダーゼ
遺伝子の塩基配列の決定〕 エシエリヒア・コリDH1・pOXI8株からpACYC184と同様
の方法でpOXI8プラスミドDNAを調製した。

pOXI8DNAについて制限酵素EcoRV,HpaI,MluI,ScaI,PstI,
XbaI,XhoI（いずれも宝酒造製）による切断地図を作成
した。その結果を第３図に示した。乳酸オキシダーゼ遺
伝子を含んだDNAの塩基配列M13フアージを用いたジデオ
キシ法（Science2141205−12190（1981））を用いて決
定した。乳酸オキシダーゼの構造遺伝子の塩基配列を第
２図並びにアミノ酸配列を第１ に示した。

実施例5.〔乳酸オキシダーゼの製造〕 エシエリヒア・コリDH1・pOXI8株を20lのBHI培地（Di
fco社製）で37℃18時間ジヤーフアーメーターにより培
養し、5,000rpm 10分間の遠心で集菌した。生理食塩水2
lで洗浄後、2lの10mMリン酸バツフア（pH7.0）で懸濁し
た。リゾチームを1mg1ml、EDTA−2Naを2mM、トリトンＸ
−100を0.1％となるように加えて37℃30分間保温し、5,
000rpm10分の遠心により上清液を分離した。

この上清液1.9lについてアセトン沈澱（30％〜65％）を
行い、沈澱物を遠心（5,000rpm30分）により集めた。こ
の沈澱物を200mlの10mMリン酸バツフア（pH7.0,10μＭ
のFADを含む）で溶解し、セフアデツクスＧ−25で脱塩
処理をした。この後、DEAE−セフアロースCL−6Bを用い
てイオン交換クロマトを行い活性画分を分取後脱塩し、
凍結乾燥により粉末標品を得た。この酵素標品の前述の
乳酸オキシダーゼ活性測定法により測定した結果75u/mg
の比活性を有していた。

〔発明の効果〕

本発明によって、乳酸オキシダーゼ遺伝子および乳酸
オキシダーゼのアミノ酸配列が明らかになり、遺伝子工
学手法による効率的な乳酸オキシダーゼの製造方法を提
供した。これにより、乳酸オキシダーゼの生産性が高
く、また純度の高い良質な乳酸オキシダーゼを構成する
ポリペプチドを大量に生産することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例４で得られる乳酸オキシダーゼを構成す
るポリペプチドをコードするアミノ酸配列を示す図面で
ある。第２図は実施例４で得られるDNAの塩基配列を示
す図面である。第３図はプラスミドpOXI8の制限酵素地
図を示す図面である。

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１モルのＬ−乳酸に作用して１モの酸素を
   消費し、１モルのピルビン酸および１モルの過酸化水素
   を生成する反応を触媒する酵素である乳酸オキシダーゼ
   活性を発現できる、当該乳酸オキシダーゼを構成するポ
   リペプチドの下記のアミノ酸配列 をコードするDNA塩基配列を含むDNA。
2. 【請求項２】上記のDNA塩基配列が、５′末端側より下
   記の塩基配列 にて表されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載のDNA。
3. 【請求項３】乳酸オキシダーゼが、下記の理化学的性状
   を示すことを特徴とする酵素のアミノ酸配列をコードす
   るDNA塩基配列を含む特許請求の範囲第１項に記載のDN
   A。 （ａ）作用；反応式〔Ｉ〕 Ｌ−乳酸＋O₂→ピルビン酸＋H₂O₂〔Ｉ〕 で表される反応を触媒する作用。 （ｂ）基質特異性;L−乳酸に基質特異性を有する。 （ｃ）至適pH;pH6−７付近。 （ｄ）pH安定性;pH6.8−8.5付近で安定。
4. 【請求項４】少なくとも、特許請求の範囲第１項記載の
   DNAを保持することを特徴とするベクター。
5. 【請求項５】宿主にとって外来性である特許請求の範囲
   第４項記載のベクターDNAを保持することを特徴とする
   形質転換体。
6. 【請求項６】宿主が、エシェリヒア属に属する微生物で
   ある特許請求の範囲第５項に記載の形質転換体。
7. 【請求項７】エシェリヒア属に属する微生物が、エシェ
   リヒア・コリに属する微生物である特許請求の範囲第６
   項に記載の形質転換体。
8. 【請求項８】エシェリヒア・コリに属する微生物が、エ
   シェリヒア・コリ（Escherichia coli）DH1・pOX18「微
   生物受託番号；微工研条寄第2173号、FERM BP−2173」
   である特許請求の範囲第７項に記載の形質転換体。
9. 【請求項９】宿主にとって外来性である特許請求の範囲
   第５項記載のベクターDNAを保持する形質転換体を培養
   して特許請求の範囲第１項記載のDNAの遺伝情報を発現
   せしめ、その培養物から１モルのＬ−乳酸に作用して１
   モルの酵素を消費し、１モルのピルビン酸および１モル
   の過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である乳酸
   オキシダーゼを採取することを特徴とする乳酸オキシダ
   ーゼの製造法。