JP5593689B2 - 乳酸オキシダーゼ組成物 - Google Patents
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項1.(a)乳酸オキシダーゼ、(b)糖類、糖アルコール類、アミノ酸類、オリゴペプチド類、タンパク質類よりなる群から選ばれるいずれか1つ以上の化合物および/または(c)界面活性剤を含有することを特徴とする乳酸オキシダーゼ組成物。
項2.(b)の化合物がシュークロース、β−シクロデキストリン、myo−イノシトール、マンニトール、セリン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、グリシルグリシン、セリシンおよびHSP70ファミリータンパク質由来のタンパク質よりなる群から選ばれるいずれか1つ以上であることを特徴とする項1の乳酸オキシダーゼ組成物。
項3.(c)がコール酸ナトリウム、Triton X−100およびTween20よりなる群から選ばれるいずれか1つ以上であることを特徴とする項1または2載の乳酸オキシダーゼ組成物。
項4.HSP70ファミリータンパク質由来のタンパク質が大腸菌のDnaKタンパク質由来のタンパク質であることを特徴とする項1〜3のいずれかの乳酸オキシダーゼ組成物。
項5.DnaKタンパク質由来のタンパク質が配列番号3に記載されるアミノ酸配列からなる項5の乳酸オキシダーゼ組成物。
項6.配列番号3に記載されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする項1〜3のいずれかの乳酸オキシダーゼ組成物。
項7.DnaKタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともN末端から387番目まで、多くとも472番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする項6の乳酸オキシダーゼ組成物。
項8.DnaKタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともN末端から387番目まで、多くとも418番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする項6の乳酸オキシダーゼ組成物。
項9.DnaKタンパク質の419〜607番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることを特徴とする項6の乳酸オキシダーゼ組成物。
項10.ATPaseドメインもしくはその一部を除去したDnaKタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いることを特徴とする項6の乳酸オキシダーゼ組成物。
項11.ATPaseドメインもしくはその一部を除去したDnaKタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号479と481のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする項10の乳酸オキシダーゼ組成物。
項12.DnaKタンパク質の384〜607番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号479と481のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする項6の乳酸オキシダーゼ組成物。
項13.乳酸オキシダーゼが下記のいずれかのタンパク質である項1〜12のいずれかの乳酸オキシダーゼ組成物。
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質であって、乳酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質
項14.項1における(b)の化合物の乳酸オキシダーゼ酵素タンパク質の重量に対する割合が20〜100重量%である項1〜13のいずれかの乳酸オキシダーゼ組成物。
項15.項1における(c)の界面活性剤の乳酸オキシダーゼ酵素タンパク質の重量に対する割合が1.8〜18重量%である項1〜14のいずれかの乳酸オキシダーゼ組成物。
項16.項1〜15のいずれかの乳酸オキシダーゼ組成物を含むことを特徴とする乳酸センサ。
項17.(1)乳酸オキシダーゼに、糖類、アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質より選ばれるいずれか1つ以上の化合物および/または界面活性剤を共存させて液状組成物にする工程、および(2)該液状組成物の水分を除去する工程を含むことを特徴とする乳酸オキシダーゼ組成物の製造方法。
本発明の方法に適用することができる乳酸オキシダーゼの給源は特に限定されないが、特に好ましくは(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または、(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、あるいは置換されているアミノ酸配列であって、乳酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
添加する化合物は特に限定されるものではないが、好ましいものとして、糖類ではシュークロース、ガラクトース、アラビノース、リボース、メリビオース、メレジトース、デキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、糖アルコール類ではmyo−イノシトール、ソルビトール、アラビトール、キシリトール、グルシトール、リビトール、D−マンニトール、アミノ酸類ではアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、オリゴペプチド類ではグリシルグリシン、アラニルグルタミン、グリシルグルタミン、グルタチオン、タンパク質類では牛血清アルブミン(BSA)、セリシンなどがある。より好ましくは、糖類ではシュークロース、β−シクロデキストリン、糖アルコール類ではmyo−イノシトール、D−マンニトール、アミノ酸類ではセリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、オリゴペプチド類ではグリシルグリシン、タンパク質類ではセリシン、HSP70ファミリータンパク質由来のタンパク質などを挙げることができる。
本発明において用いられる界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、好ましくはコール酸ナトリウム、Triton X−100(polyoxyethylene−p −isooctylphenol)、Tween20(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate)などが挙げられる。より好ましくはコール酸ナトリウムを挙げることができる。
これらは、種々の市販の試薬を用いることができる。
後述の乳酸オキシダーゼ酵素活性の測定方法に記載の活性測定法において、乾燥化を行った後の乾燥品重量あたりの乳酸オキシダーゼ活性値(a)と、一定温度で一定期間保存した後の乾燥品重量あたりの乳酸オキシダーゼ活性値(b)を測定し、測定値(a)を100とした場合に対する相対値((b)/(a)×100)を求めた。この相対値を残存率とした。そして、該化合物の添加の有無を比較して、添加により残存率が増大した場合、安定性が向上したと判断した。
乾燥化前の酵素溶液の乳酸オキシダーゼ活性値と粉末化に供した液量とを掛け合わせて粉末化前の総活性(a)と、粉末化後の乾燥品重量あたりの乳酸オキシダーゼ活性値と得られた乾燥品重量とを掛け合わせて乾燥化後の総活性(b)とを算出し、総活性(a)を100とした場合に対する相対値((b)/(a)×100)を求めた。この相対値を工程収率とした。そして該化合物の添加の有無を比較して、添加により回収率が増大した場合、工程収率が向上したと判断した。
本発明において、乳酸オキシダーゼの活性測定は以下の条件で行うものとする。
L−乳酸+O2→ピルビン酸+H2O2
2H2O2+4−AA+DMA→Quinoneimine色素+4H2O
乳酸オキシダーゼの触媒する反応により生成した過酸化水素(H2O2)2分子、4−アミノアンチピリン(4−AA)、およびジメチルアニリン(DMA)が溶液中に共存するペルオキシダーゼの触媒する反応によって酸化縮合し、Quinoneimine色素が生じる。この色素の存在は、565nmにおける分光光度法により測定した。
1単位は、以下に記載の条件下で1分間にQuinoneimine色素を0.5マイクロモル形成させる乳酸オキシダーゼの酵素量をいう。
試薬
A. DL−乳酸溶液,pH6.5:0.125M(約90mlの水中に2.0gの3,3−ジメチルグルタル酸(分子量160.17)を溶解した後に1.2gの乳酸リチウム(分子量96.61)を溶解し、5N NaOHを用いて25℃でpH6.5±0.01に調整し、水を加えて100mlとする。)
B. 4−AA溶液:0.3%(w/v)(300mgの4−アミノアンチピリン(分子量203.24)/100ml H2O)
C. DMA溶液:0.1%(v/v)(100μlのジメチルアニリン(分子量121.18)を100mlのH2Oに加える。)
D. ペルオキシダーゼ溶液:25U/ml(2500Uのペルオキシダーゼ/100ml H2O)
E. 酵素希釈液:10μM FADを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
F. 粉末溶解液:ACES−NaOH緩衝液(pH7.0):20mM(約80mlの水に0.364gのN−(2−アセタミド)−2−アミノエタンスルホン酸(分子量182.2)および372mgのエチレンジアミン四酢酸ニ水素ニナトリウム二水和物(分子量372.24)を溶解し、5N NaOHを用いて25℃でpH7.0±0.01に調整し、水を加えて100mlとする。)
1. 遮光瓶に以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した(用時調製)。
4ml DL−乳酸溶液(pH6.5) (A)
1ml 4−AA溶液 (B)
4ml DMA溶液 (C)
1ml ペルオキシダーゼ溶液 (D)
上記アッセイ混合物の反応液中の濃度は次の通りである。
3,3−ジメチルグルタル酸緩衝液 49mM
DL−乳酸 49mM
4−AA 0.029%
DMA 0.039%
ペルオキシダーゼ 2.5U/ml
・ 3.0mlの反応混合液を試験管に入れ、37℃で約5分間予備加温した。
・ 0.06mlの酵素溶液を加え、穏やかに混合した。
・ 37℃に維持しながら565nmでの吸光度(水対照)の増加を2〜3分間記録し、1分当たりのΔODを計算した(ΔODtest)。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液(E)を加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク(ΔODblank)を測定した。
アッセイの直前に氷冷した粉末溶解液(F)で酵素粉末を溶解し、酵素希釈液(E)で0.1−0.35U/mlに希釈した。
活性は以下の式を用いて計算する:
U/ml={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×Vt×df}/(35.3×1/2×1.0×Vs)
U/mg=(U/ml)×1/C
Vt:総体積(3.06ml)
Vs:サンプル体積(0.06ml)
35.33:上記測定条件でのQuinoneimine色素のミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)
1/2:酵素反応で生成したH2O2の1分子から形成するQuinoneimine色素は1/2分子であることによる係数
1.0:光路長(cm)
df:希釈係数
C:溶解時の酵素濃度(c mg/ml)
乳酸オキシダーゼの発現プラスミドpLCO3は、ベクターpBluescriptのマルチクローニング部位にエンテロコッカス属細菌(かつてはラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)に分類)IFO3427株の乳酸オキシダーゼをコードする構造遺伝子を含む該菌株の染色体DNA断片を挿入したものである(特開平10−248574号公報)。これを鋳型にして、乳酸オキシダーゼ構造遺伝子の開始コドン上流約200塩基から終止コドンの下流約80塩基をPCRで増幅した。増幅されたDNA断片は、乳酸オキシダーゼ構造遺伝子および推定されるプロモーター、ターミネーター領域を含む。クローニングキットTArget Clone−Plus−(東洋紡績製)を用いて増幅したDNA断片をベクターpTA2へ挿入した。得られた発現プラスミドをpTALCOL2と命名した(図2)。この発現プラスミド上に挿入されたDNAの塩基配列を配列番号2に、このDNA配列より予想される乳酸オキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号1に示す。
コンピテントハイDH5α(東洋紡績製)をpTALCOL2で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリーDH5α(pTALCOL2)を得た。
6LのTerrific brothを10L容ジャーファーメンター中に調製し、121℃、20分間オートクレーブを行った。放冷後別途無菌ろ過した100mg/mlアンピシリン(ナカライテスク製)6mlを添加した。この培地にLB培地で予め、30℃、16時間振とう培養したエシェリヒア・コリーDH5α(pTALCOL2)の培養液60mlを接種し、培養を開始した。培養条件は、温度30℃、通気量2L/分、撹拌数390rpmで行った。培養開始から39時間後に培養を停止した。このときの乳酸オキシダーゼ活性は約230U/ml−brothであった。
実施例4で取得した標品は1mM EDTAを含む20mM ACES−NaOH緩衝液(pH7.0)中に約45mg/mlの乳酸オキシダーゼタンパク質を含んでいる。ここに酵素タンパク質に対し45〜65%に相当する安定化剤を溶解したものを用意した。例えば、40mgの乳酸オキシダーゼを含有する酵素液に対して、50%相当の各種の安定化剤を添加する場合には、20mgを溶解し、活性測定を行った。各種安定化剤を添加した酵素溶液から正確に2mlずつ、風袋重量を測定済みのバイアルに分取した。また、コントロールには、安定化剤を添加しないものを用意した。これを凍結真空乾燥(FDR)して、水分を完全に蒸発させた後、バイアルの重量を測定し、風袋重量を差し引いて得られた粉末重量を算出した。その後に約10mgの粉末をスピッツロールに正確に計量し、(1)直ちに活性測定、(2)37℃で2週間保存してから活性測定、を行い粉末重量あたりの活性を計算した。工程収率は、FDR前の総活性を100%として、粉末化後の総活性の割合を算出した。活性残存率は、FDR直後の粉末重量あたりの活性を100%として、37℃処理後の各サンプルの粉末重量あたりの活性の割合を算出した。その結果、糖類、糖アルコール類、アミノ酸類、タンパク質類の多くで何も添加しない場合と比較して工程収率および安定性の向上が見られた(表1)。
次に、安定性が約10%以上向上したβ−シクロデキストリンおよびセリンについて、その効果を発揮する有効濃度について検討した。方法は、先の実施例5に準じて行った。β−シクロデキストリンは水への溶解度が18g/Lと低く、添加量の上限は酵素タンパク質重量の50%程度であった。検討の結果、少なくとも酵素タンパク質重量に対し20〜50%の範囲では高い安定性を保持していた。セリンについては酵素タンパク質重量に対し少なくとも20〜100%の範囲では安定化剤を何も加えないものと比較して高い安定性を保持していた(表2)。
セリン×界面活性剤の組み合わせにおいて安定性が向上するかどうか検討した。セリンはタンパク質重量に対して70%、界面活性剤はタンパク質重量に対し0.18〜18%を添加した。界面活性剤としてはコール酸ナトリウムを使用し、基本的な方法は先の実施例5に準じて行った。その結果、コール酸ナトリウムをタンパク質重量に対し0.18%添加した程度ではセリンのみの場合と比べて安定性に差はないものの、1.8%以上のコール酸ナトリウムを添加することにより、安定化剤を何も添加しない場合と比較して最大20%安定性が向上した(表3)。
実施例5で安定化効果の見られた化合物を各々組み合わせたときの安定化効果についても調べた。具体的には、セリシン×安定化効果を保持する種々のアミノ酸、セリンおよびBlocking Peptide Fragment(BPF;東洋紡績製)、あるいはセリン、BPFおよびコール酸ナトリウムの組み合わせである。検討の結果、これらの組み合わせの中では相乗効果を有するものは見出せなかった。例えばセリンおよびBPFの組み合わせでは、セリンのみを添加した場合に比べ安定性は向上したものの、BPFを単独で添加した場合の方が高い安定性を有していた。セリンおよびアミノ酸類の場合も同様であった(表4)。
Claims (10)
- (a)乳酸オキシダーゼ
(b)シュークロース、β−シクロデキストリン、myo−イノシトール、D−マンニトール、L−グルタミン酸ナトリウム、セリン、スレオニン、セリシンおよびBPF(B
locking Peptide Fragment;東洋紡製)よりなる群から選ばれるいずれか1つ以上の化合物
を含有することを特徴とする乳酸オキシダーゼ組成物。 - (a)乳酸オキシダーゼ
(b)セリンおよび1.8%以上のコール酸ナトリウム
を含有することを特徴とする乳酸オキシダーゼ組成物。 - さらに、
(c)界面活性剤
を含有する、請求項1または2に記載の乳酸オキシダーゼ組成物。 - (c)がコール酸ナトリウム、Triton X−100およびTween20よりなる群から選ばれるいずれか1つ以上であることを特徴とする請求項3に記載の乳酸オキシダーゼ組成物。
- 請求項1〜4のいずれかにおける(b)の化合物の乳酸オキシダーゼ酵素タンパク質の重量に対する割合が20〜100重量%である請求項1〜4のいずれかに記載の乳酸オキシダーゼ組成物。
- 請求項3〜5のいずれかにおける(c)の界面活性剤の乳酸オキシダーゼ酵素タンパク質の重量に対する割合が1.8〜18重量%である請求項3〜5のいずれかに記載の乳酸オキシダーゼ組成物。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の乳酸オキシダーゼ組成物を含むことを特徴とする乳酸センサ。
- (1)乳酸オキシダーゼに、シュークロース、β−シクロデキストリン、myo−イノシトール、D−マンニトール、L−グルタミン酸ナトリウム、セリン、スレオニン、セリシンおよびBPF(Blocking Peptide Fragment;東洋紡製)よりなる群から選ばれるいずれか1つ以上の化合物を共存させて液状組成物にする工程、および
(2)該液状組成物の水分を除去する工程を含むことを特徴とする乳酸オキシダーゼ組成物の製造方法。 - (1)乳酸オキシダーゼに、「セリンおよび1.8%以上のコール酸ナトリウム」を共存させて液状組成物にする工程、および
(2)該液状組成物の水分を除去する工程を含むことを特徴とする乳酸オキシダーゼ組成物の製造方法。 - 請求項8または9の乳酸オキシダーゼ組成物の製造方法において、工程(1)が、さらに界面活性剤を共存させて液状組成物にする工程である、請求項8または9の乳酸オキシダーゼ組成物の製造方法。
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