KR20220143091A

KR20220143091A - 검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스, 그것을 포함하는 시스템, 검체의 상태를 평가하는 방법 및 그에 사용되는 유산 데히드로게나아제

Info

Publication number: KR20220143091A
Application number: KR1020227032145A
Authority: KR
Inventors: 요스케 마사카리; 치아키 이나모토; 미키 나카무라; 에이치로 간; 아츠시 이치야나기; 하루카 히라구치; 료타 스즈키
Original assignee: 기꼬만 가부시키가이샤
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2021-02-18
Publication date: 2022-10-24
Also published as: JPWO2021167011A1; US20230213499A1; EP4108678A1; WO2021167011A1; EP4108678A4

Abstract

본 발명은 인간 및 비인간 생물의 간질액, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 음식품, 양조물 등의 상태를 평가하기 위한 디바이스, 시스템, 프로그램, 그것들을 사용한 평가 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 검체에 유산 데히드로게나아제를 작용시키기 위한 작용부와, 유산 데히드로게나아제를 작용시킨 검체의 상태를 감지하는 센서를 포함하는, 검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스, 시스템, 프로그램, 그것들을 사용한 검체의 상태를 평가하기 위한 방법, 그에 사용되는 효소를 제공한다.

Description

검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스, 그것을 포함하는 시스템, 검체의 상태를 평가하는 방법 및 그에 사용되는 유산 데히드로게나아제

본 발명은 플라빈 화합물을 보효소로 하는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제를 사용한 센서를 포함하는, 검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스, 상기 디바이스가 추가로 출력부를 포함하는 시스템, 상기 디바이스 또는 시스템을 사용하여 검체의 상태를 평가하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 디바이스, 시스템 및 그것들을 사용하여 검체의 상태를 평가하는 방법에 적합하게 사용하는 것이 가능한 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제에 관한 것이다.

혈중 유산 농도나 땀 중 유산 농도는, 피로나 신체 상태를 반영하는 마커로서 알려져 있다. 유산은 주요 대사 산물이고, 건강 관리의 지표뿐만 아니라, 위중한 병 및/또는 외과 환자를 포함하는 건강 평가에 있어서 중요한 것으로 인식되고 있고, 체액 중의 유산값은 순환 부전, 간장 장애 등의 다양한 병태에 대한 지표가 될 수 있다. 유산 감시는, 패혈증, 저산소증, 및 암 조직의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다(비특허문헌 1).

질병 상태의 인간에게 한정되지 않는 몸 상태 관리의 목적에 관해서도, 스포츠 선수나 일상적으로 운동하는 것에 관심이 높은 사람이 행하는 트레이닝의 적절성을 모니터링하기 위한 하나의 지표로서, 유산 감시가 행해지고 있다(비특허문헌 2).

특허문헌 1 내지 3에는, 인간의 상태나 자세 등을 일정 시간 연속적으로 모니터링하는 기술적인 제안으로서, 소정의 정보 처리 장치가 제안되어 있다(특허문헌 1 내지 3).

유산을 기질로 하는 효소로서는, 유산 옥시다아제(이하, LOD)가 알려져 있다. LOD는, 건조 후의 보관 중에 활성이 상실되어 간다는 문제가 있다. 그 때문에, 특허문헌 4에는, 건조 공정 시에 특정 안정화제와 조합하여 건조시키는 방법이 제안되어 있다.

특허문헌 5에는, 과산화수소에 의한 LOD 활성 저하를 회피하는 수단으로서, 과산화수소 소거 목적으로 카탈라아제를 공존시킨 유산 센서도 제안되어 있다.

또한, 유산을 기질로 하는 효소로서는, FMN 의존성 유산 데히드로게나아제(이하, FMN-LDH)가 알려져 있다. 비특허문헌 3에는, 지금까지 알려져 있는 Saccharomyces cerevisiae 유래 FMN-LDH는, 안정성에 과제가 있는 것이 기재되어 있다.

일본 특허 공개 제2019-150649호 공보 일본 특허 공개 제2017-100039호 공보 국제 공개 제17/163521호 팸플릿 일본 특허 제5593689호 일본 특허 공표 제2018-519507호 공보

일본판 패혈증 진료 가이드라인 2016, PNAS September 15, 2015, 112(37), 11642-11647 스포츠 퍼포먼스 연구, 3, 31-48, 2011 Methods Enzymol., 53, 238-56, 1978

식품 중의 유산값은 품질 관리 등의 지표가 될 수 있다. 유산 발효 공정을 거쳐 제조되는 각종 발효 음식품, 예를 들어 일본 술이나 와인, 위스키, 치즈, 요구르트, 사워크라우트, 쿠즈모치, 절임, 된장, 간장, 유산 발효 효모 엑기스 등의 제조 현장에 있어서는, 양호한 품질의 제품을 안정적으로 제조하기 위해, 적절한 유산 발효 공정 관리가 행해지는 것이 바람직하고, 그 공정 관리에 있어서, 유산량이 제조 공정 관리의 지표가 될 수 있다.

또한, 유산의 생성은, 유산 발효시킨 음식품에 한정되지 않고, 예를 들어 화장품 원료인 식물성 소재를 유산균으로 발효시켜 얻어지는 유산 발효 조성물이나, 화성품으로서 생성되는 유산 조성물에 있어서도 진행되고 있고, 이러한 제품의 제조 공정 관리, 품질 관리에 있어서도, 유산량이 지표가 될 수 있다.

또한, 유산을 포함하는 올리고머나 폴리머, 예를 들어 폴리 유산을 분해했을 때, 분해율을 산출할 때, 모노머의 유산량이 지표가 될 수 있다.

상기와 같은 목적으로 행하는 유산량의 측정은, 일상 생활 혹은 매회의 음식품 등의 제조 공정 중에, 빈번하고 간편하게 실시할 수 있는 것이 바람직하고, 가능한 한 단순한 공정으로 반복하여 행할 수 있는 것이 보다 바람직하고, 자동적 또한 연속적으로 모니터링할 수 있는 것이 더욱 바람직하다.

현 상황에서는, 검체 중의 유산량을, 간편하게, 연속적으로 모니터링 가능한 유산 측정용의 디바이스는 존재하고 있지 않고, 검체로부터 어떠한 전처리를 통해 취득해 온 유산을 함유하는 검체(예를 들어, 천자에 의해 환자의 신체로부터 채취한 혈액)를 어떠한 방법에 의해 그때마다 측정하는 수단으로 측정하고 있는 것이 실정이다.

현 상황의 측정 방법에 있어서의 천자 등의 침윤적인 샘플링 방법은, 생물 검체에게는 통증이나 스트레스를 주는 것이며, 빈번한 샘플링을 행하는 것의 방해가 되고 있다. 또한, 통증이나 스트레스라는 과제는 없는 음식품 등의 제조 공정 관리에 있어서도, 제조 중의 유산 함유 조성물로부터 그때마다 수동으로 샘플링을 행하고 나서 유산을 측정하고, 측정 데이터를 그때마다 수동으로 기록해야 하기 때문에, 현 상황의 유산 측정 기술에 있어서의 이러한 빈번한 샘플링 작업은, 번잡함을 수반한다.

인간의 상태나 자세 등을 일정 시간 연속적으로 모니터링하는 기술적인 제안으로서, 예를 들어, 인간의 신체나 의류, 트레이닝 머신 등에 복수의 센서를 장착시켜, 그들 센서에 의해 취득한 어떠한 생체 유래의 데이터나, 그 인간의 연령이나 성별 등의 입력 정보에 기초하여 트레이닝 프로그램을 제안하거나, 인간의 몸 상태를 추정하거나 하기 위한 시스템, 각종 데이터에 준거한 애플리케이션 프로그램을 기동하는 정보 처리 장치 등이 제안되어 있다(특허문헌 1 내지 3). 그리고, 이러한 제안 중 소수에 있어서는, 유산 측정이라는 문언을 포함하는 것도 볼 수 있다. 그러나, 그들 제안 중에, 유산의 양을 현실의 지표로서 구체적으로 측정할 수 있고, 그에 의해 검체의 상태를 모니터링할 수 있는 방법에 대해서는, 전혀 개시되어 있지 않다.

예를 들어, 특허문헌 1에서는, 자전거의 페달을 밟는 트레이닝 기기에 설치 가능하고, 트레이닝 시간 중의 인간(운전자)으로부터 심박계에 의해 취득한 심박 정보를, 당해 운전자의 안정 시 심박이나 트레이닝 중의 심박, 연령 성별 등 정보 및 자전거의 주행 데이터 등에 기초하여 해석하여, 당해 운전자의 현시점 운동 상태를 이상적인 상태에 접근시키기 위한 메시지를 출력할 수 있는 시스템이 제안되어 있다. 특허문헌 2에서는, 인간의 몸 상태에 따라 혈류량이 변동하지 않는 제1 부위와, 몸 상태에 따라 혈류량이 변동하는 제2 부위 각각에 있어서의 혈류량을 레이저 스펙클 카메라나 레이저 도플러 혈류계 등의 비접촉의 카메라 기술을 사용하여 측정하고, 필요에 따라 추가적으로 입력·측정될 수 있는 기타의 개별 정보에 기초하여, 인간의 졸음이나 술에 취함, 공복 레벨이나 멀미, 스트레스 레벨이나 우울 레벨 등을 추정하는 시스템이 제안되어 있다. 특허문헌 3에서는, 인간의 속옷이나 상의, 모자나 안경, 귀마개나 헤드폰 등에 장착시킨 1개 이상의 웨어러블 센서를 사용하여, 인간의 체온, 가속도, 심박 데이터, GPS 데이터, 고도 데이터 등을 취득하여, 이들을 걸치고 있는 인간의 자세나, 수면 중인지 기상 중인지 보행 중인지 등의 동작의 추정, 등산 중의 경우 고산병의 예조가 없는지 등을 감시할 수 있는 정보 처리 장치가 제안되어 있다. 그러나, 어느 제안에 있어서도, 이미 간편하면서도 연속적인 데이터 취득이 기술적으로 실현되어 있는 심박 측정이나 혈류 측정, GPS 데이터 등 취득과 마찬가지로 유산 데이터의 취득까지도, 간편하면서도 연속적으로 실현할 수 있고, 그에 의해 유산 감시와 인간의 상태의 평가가 실현된다는 개시나, 그것을 가능하게 하기 위한 기술적 제안은 이루어져 있지 않다.

간편한, 또한 바람직하게는 연속적인 유산 감시의 실현에 대한 기술적 과제에는, 유산을 측정하는 수단으로서의 효소법 측정에 있어서의, 측정용 효소의 성능적인 과제도 들 수 있다.

유산을 기질로 하는 효소로서는, 유산 옥시다아제(이하, LOD)나, 니코틴아미드디뉴클레오티드(NAD)를 보효소로 하는 NAD 의존성 유산 데히드로게나아제(이하, NAD-LDH), 그리고, 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)를 보효소로 하는 FMN 의존성 유산 데히드로게나아제(이하, FMN-LDH)가 알려져 있다. LOD를 사용한 혈중 유산 측정 장치는 시판되고 있고, 측정할 때마다, 보관되어 있는 센서(LOD를 포함하는 혈중 유산 측정용 전극 부분)를 취출하여 전용의 계측 장치에 삽입하고, 천자에 의해 인간 검체로부터 짜낸 혈액을 센서 내에 흡인시켜, 계측 장치에 표시된 측정값을 판독한다. 이에 의해, 단발적으로 검체 중의 유산량을 알 수 있고, 이를 반복함으로써, 그때마다 그때마다의, 검체 중의 유산량을 측정할 수 있다.

그러나, 상술한 바와 같이, 생물의 간질액, 혈액이나 땀, 음식품이나 화성품을 포함하는 유산 함유 조성물 중의 유산을, 장기에 걸쳐 안정적으로, 고정밀도로 또한 바람직하게는 연속적으로 간편하게 측정하고 싶다고 생각한 경우에는, 공지의 측정용 효소로는 충분히 대응할 수 없다.

LOD는, 열 안정성이 충분하지 않다는 과제를 갖고, LOD 제품을 제조할 때에도, 건조 공정 혹은 건조 후의 보관 중에 활성이 상실되어 가는 정도가 크다. 그 과제에 대한 제안으로서, 건조 공정 시에 특정 안정화제와 조합하여 건조시키는 방법도 제안되어 있지만(특허문헌 4), 그 안정성 개선 효과는 아직 불충분하다. 실제의 효소 반응 중의 액체 상태에서의 LOD의 안정성은 분말 상태에서의 안정성과 비교하여 더 낮은 것도 고려되어야 한다. 예를 들어, LOD를 사용한 센서를 인간의 신체에 장기적으로 밀착시켜 사용하는 장면이나, 유산균 발효 공정의 발효 온도 하에 놓일 수 있는 음식품의 제조 공정 등에서 장시간에 걸쳐 유산의 모니터링을 행하는 장면을 상정했을 때, 실온 부근으로부터 인간의 체온 부근인 37℃ 부근에서의 효소의 안정성이라는 관점에 있어서, 기존의 LOD로는 충분한 실용성을 발휘할 수 없다는 것이 우려된다.

또한, LOD에는, 반응 생성물로서 과산화수소를 발생시킨다는 문제도 있다. 특히, 유산 센서를 피부에 밀착시키거나, 경우에 따라서는 피하에 매립하거나 하는 사용 방법을 상정하는 경우에는, 활성 산소종의 1종이며 산화 스트레스의 원인 물질이기도 한 과산화수소를 연속적으로 발생시킬 수 있는 효소를 탑재한 센서를 채용하는 것은 바람직하지 않을 것이 우려된다. 또한, LOD의 작용에 의해 발생하는 과산화수소는 LOD 자신의 안정화에도 악영향을 주고, 이로 의한 LOD 활성 저하를 회피하는 수단으로서, 과산화수소 소거 목적으로 카탈라아제를 공존시킨 유산 센서도 제안되어 있다(특허문헌 5).

NAD-LDH는 과산화수소를 발생시키지 않는 효소 반응을 촉매하기 때문에, 과산화수소의 생성이라는 과제는 발생하지 않는다. 그러나, NAD-LDH에 의한 효소 반응계에 있어서는, 유산과 피루브산이 가역적으로 반응해 버리기 때문에, 정량이라는 용도에 대해서는, 정확한 측정값이 얻어지지 않는다는 문제점이 존재하여, 센서에의 채용은 어렵다.

FMN-LDH도 또한, 과산화수소를 발생시키지 않는 효소 반응을 촉매하기 때문에, 과산화수소의 생성이라는 과제는 발생하지 않는다. 또한, 가역적 반응의 과제도 없기 때문에, 상술한 3 효소 중에서는, 유산 감시 목적으로의 실용 효소로서는 가장 유망한 것으로 생각되지만, 지금까지 알려져 있는 Saccharomyces cerevisiae 유래 FMN-LDH로는, 역시 안정성에 과제를 가지고 있다(비특허문헌 3).

즉, 생물 검체의 상태의 평가나, 음식품의 제조 관리·품질 관리 등에 있어서 간편하면서도 바람직하게는 연속적인 유산 감시를 실현하고 싶다는 시장의 요구를 충족시키는 데 있어서의 기술적 과제로서, 상술한 바와 같은 샘플링 방법에 있어서의 과제, 단회 측정마다의 데이터 처리에 수반되는 기록 처리의 번잡함의 과제, 추가로, 유산을 측정하기 위해 사용하는 효소의 성능면에서의 과제가 존재한다. 본 발명은 상기의 문제점의 적어도 일부를 해결할 수 있는, 검체의 상태를 모니터링 혹은 평가하기 위한 디바이스, 검체의 상태를 모니터링 혹은 평가하는 방법 및 그에 사용되는 FMN-LDH를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는, 상기의 문제점에 비추어, 검체 중의 유산량을 측정함에 있어서, 비침습적으로 검체 중의 유산을 간편하게 측정할 수 있는 구성을 구비한 검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스를 착상하고, 그러한 디바이스를 사용하여 검체의 상태를 평가하는 방법 및 그에 사용되는 시스템과, 유산 측정에 적합하게 적용 가능한 FMN-LDH를 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.

본 발명은 이하의 양태를 포함한다.

(1)

검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스로서,

검체에 유산 데히드로게나아제를 작용시키기 위한 작용부와,

유산 데히드로게나아제를 작용시킨 검체의 상태를 감지하기 위한 센서로서, 작용부에서의 검체의 상태를 감지하는 것이 가능하도록 배치되는 센서

를 포함하는, 디바이스.

(2)

센서로부터의 신호를 출력하기 위한 출력부를 더 포함하는, (1) 기재의 디바이스.

(3)

(2) 기재의 디바이스와,

디바이스의 출력부에 접속되어, 센서로부터의 신호를 처리하기 위한 데이터 처리 유닛

을 포함하는, 시스템.

(4)

검체의 상태를, 디바이스 및 데이터 처리 유닛을 포함하는 시스템에 의해 평가하기 위한 프로그램으로서,

디바이스가,

유산 데히드로게나아제를 작용시킨 검체의 상태를 감지하기 위한 센서로서, 작용부에서의 검체의 상태를 감지하는 것이 가능하도록 배치되는 센서와,

센서로부터의 신호를 출력하기 위한 출력부

를 포함하고,

데이터 처리 유닛이, 디바이스의 출력부에 접속되어, 센서로부터의 신호를 처리하도록 구성되고,

프로그램이, 디바이스에 대하여,

센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 검체의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하기 위한, 측정 처리와,

상기 측정 처리에서 얻어진 신호를 출력부로부터 데이터 처리 유닛에 대하여 전송하기 위한, 전송 처리를 실행시키고,

프로그램이, 상기 데이터 처리 유닛에 대하여, 상기 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하기 위한, 데이터 처리를 실행시키는, 프로그램.

(5)

(1) 또는 (2) 기재의 디바이스, 또는 (3) 기재의 시스템을 사용하는, 검체의 상태를 평가하는 방법.

(6)

검체가, 인간 및 비인간 생물의 체액, 간질액, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 피부, 근육, 안구, 각막, 위액, 음식품, 양조물, 화성품, 물, 토양을 포함하는 유산 함유 조성물인, (5) 기재의 방법.

(7)

검체의 상태가, 운동 부하에 대한 신체 상태, 질병 상태, 유산량의 변화를 수반하는 양조물의 양조 상태, 유산량의 변화를 수반하는 음식품의 숙성·추숙 정도, 유산량의 변화를 수반하는 화성품 제조의 유산 함유 비율, 유산량의 변화를 수반하는 물, 토양 중의 유산량인, (5) 또는 (6) 기재의 방법.

(8)

검체의 상태를 모니터링하기 위한 디바이스로서, 디바이스는, 검체에,

(A) 용액 중에서, 37℃에서 10일간 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제,

(B) 용액 중에서, 37℃에서 3일간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제, 또는

(C) 용액 중에서, 37℃에서 15시간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제

를 작용시키기 위한 작용부를 포함하는, 디바이스.

(9)

(8) 기재의 디바이스가 추가로 출력부를 포함하고, 그 출력부가 데이터 처리 유닛에 접속되는, 시스템.

(10)

(8) 기재의 디바이스 또는 (9) 기재의 시스템을 사용하는, 검체의 상태를 모니터링하는 방법.

(11)

서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 110 내지 502위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 113 내지 505위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 112 내지 503위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 12로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 102 내지 499위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유산 데히드로게나아제.

(12)

서열 번호 4, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 그것과의 동일성이 70％ 이상인 아미노산 서열을 갖는 (11) 기재의 유산 데히드로게나아제.

(13)

(11) 또는 (12) 기재의 유산 데히드로게나아제를 코딩하는 핵산.

(14)

(13) 기재의 핵산을 갖는 숙주 세포.

(15)

(14) 기재의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 유산 데히드로게나아제의 제조 방법.

(16)

검체의 상태를 평가하기 위한 방법으로서,

i) (11) 또는 (12) 기재의 유산 데히드로게나아제와 검체를 접촉시키는 공정, 및

ii) 유산을 측정하는 공정

을 포함하는, 방법.

본 발명에 의해, 검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스, 검체의 상태를 평가하는 방법 및 그에 사용되는 FMN-LDH를 제공할 수 있다.

도 1은 (a)는 본 발명의 일 실시 형태에 관한 센서 칩(10)의 모식도이고, (b) 내지 (d)는 센서 칩(10)을 구성하는 부재를 도시하는 모식도이다.
도 2는 각 온도에서 열처리 후의 PkLDH 및 ScLDH의 잔존 활성율을 나타내는 도면이다.
도 3의 A 및 도 3의 B는, 37℃에서 각 시간 보존한 후의 PkLDH, ScLDH, CaLDH 및 OgLDH의 잔존 활성율을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시 형태의 디바이스 및 시스템의 일례를 도시하는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 실시 형태의 프로그램의 일례를 나타내는 흐름도이다.
도 6은 본 발명의 실시 형태의 트랜스미터를 이용한 디바이스 및 시스템의 일례를 도시하는 모식도이다.
도 7은 실시예 4에서 평가된 PkLDH의 안정 pH를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 4에서 평가된 PkLDH의 최적 pH를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 4에서 평가된 유산 농도와 PkLDH의 활성의 관계를 나타내는 도면이다.
도 10은 실시예 8에서 평가된 유산 농도와 응답 전류값의 관계를 나타내는 도면이다.
도 11a는 본 발명의 유산 데히드로게나아제 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타낸다.
도 11b는 도 11a의 계속이다.
도 12는 실시예 11에서 평가된 55℃에서 15분간 처리된 PkLDH 및 PkLDH의 N 말단 삭제 변이체의 잔존 활성율을 나타내는 도면이다.
도 13은 실시예 11에서 평가된 55℃에서 15분간 처리된 PkLDH 및 일 치환 변이체의 잔존 활성율을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여, 구체적으로 설명한다. 또한, 이하의 실시 형태는, 본 발명을 구체화할 때의 형태로서, 본 발명을 그 범위 내에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 말하는 검체는, 유산이 포함되어 있는지 여부를 측정하는 대상이면 되고, 인간 및 비인간 생물의 체액, 예를 들어 간질액, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 피부, 근육, 안구, 각막, 위액이어도 되고, 유산 발효를 하고 있지 않거나, 유산 발효하고 있거나 또는 유산 발효한 음식품, 양조물, 화성품을 포함하는 유산 함유 조성물이어도 된다. 게다가, 유산을 포함하는 물, 토양과 같은 환경 중에 존재하는 것이어도 된다.

본 발명에서 말하는 유산 데히드로게나아제(LDH)는 환원제인 NADH를 사용하여, 피루브산 이온을 유산 이온으로 환원하는 가역 반응을 촉매하는 효소이면 되고, NAD 의존성 유산 데히드로게나아제와 FMN 의존성 유산 데히드로게나아제가 알려지는데, 바람직하게는 FMN 의존성 유산 데히드로게나아제, 더욱 바람직하게는 서열 번호 4, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 더욱 바람직하게는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 97 내지 502위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 또는, 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 100 내지 505위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 또는, 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 99 내지 503위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 또는, 서열 번호 12로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 89 내지 499위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 더욱 바람직하게는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 110 내지 502위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 또는, 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 113 내지 505위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 또는, 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 112 내지 503위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 또는, 서열 번호 12로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 102 내지 499위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 또한, 서열 번호 4에 있어서의 97 내지 502위의 아미노산 서열에 대하여 서열 번호 4에 있어서의 1 내지 96위의 아미노산 서열, 서열 번호 7에 있어서의 1 내지 99위의 아미노산 서열, 서열 번호 10에 있어서의 1 내지 98위의 아미노산 서열, 서열 번호 12에 있어서의 1 내지 88위의 아미노산 서열 또는 그것들과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 연결시킬 수도 있다. 마찬가지로 하여, 서열 번호 7에 있어서의 100 내지 505위의 아미노산 서열, 서열 번호 10에 있어서의 99 내지 503위의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12에 있어서의 89 내지 499위의 아미노산 서열에 대하여 서열 번호 4에 있어서의 1 내지 96위의 아미노산 서열, 서열 번호 7에 있어서의 1 내지 99위의 아미노산 서열, 서열 번호 10에 있어서의 1 내지 98위의 아미노산 서열, 서열 번호 12에 있어서의 1 내지 88위의 아미노산 서열 또는 그것들과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 연결시킬 수도 있다. 또한, 서열 번호 4에 있어서의 1 내지 96위의 아미노산 서열, 서열 번호 7에 있어서의 1 내지 99위의 아미노산 서열, 서열 번호 10에 있어서의 1 내지 98위의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12에 있어서의 1 내지 88위의 아미노산 서열을 포함하는 영역에 대해서는, 도 11a에 나타내는 바와 같이, 서열 동일성은 낮고, 본 발명의 유산 데히드로게나아제에 있어서는 중요성이 낮다고 할 수 있다. 따라서, 전체 길이의 아미노산 서열 중, 서열 번호 4에 있어서의 97 내지 502위의 아미노산 서열, 서열 번호 7에 있어서의 100 내지 505위의 아미노산 서열, 서열 번호 10에 있어서의 99 내지 503위의 아미노산 서열, 서열 번호 12에 있어서의 89 내지 499위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 유산 데히드로게나아제인 것이 바람직하고, 서열 번호 4에 있어서의 1 내지 96위의 아미노산 서열, 서열 번호 7에 있어서의 1 내지 99위의 아미노산 서열, 서열 번호 10에 있어서의 1 내지 98위의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12에 있어서의 1 내지 88위의 아미노산 서열을 포함하는 영역에 대해서는, 서열 동일성이 각각 45％ 이상, 50％ 이상, 60％ 또는 70％ 이상이면 되고, 또는 이 영역은 결실되어 있어도 된다. 또는 부분적으로 결실되어 있어도 되고, 예를 들어, N 말단 배열로부터 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개의 아미노산이 결실되어 있어도 된다. 예를 들어, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 10위의 아미노산이 결실되어 있어도 된다. 결실되어 있는 경우에는, 적절히, 메티오닌을 배열의 처음에 부가할 수 있다.

(상동성 영역에 대하여)

아미노산 서열의 동일성 또는 유사성은, GENETYX Ver. 11(제네틱스사제)의 맥시멈 매칭이나 서치 호몰로지 등의 프로그램 또는 DNASIS Pro(히타치 솔루션즈사제)의 맥시멈 매칭이나 멀티플 얼라인먼트 등의 프로그램에 의해 계산할 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 계산하기 위해, 2 이상의 LDH를 얼라인먼트했을 때, 해당 2 이상의 LDH에 있어서 동일한 아미노산의 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 기초로, 아미노산 서열 중의 동일 영역을 결정할 수 있다.

또한, 2 이상의 LDH에 있어서 유사한 아미노산의 위치를 조사할 수도 있다. 예를 들어 CLUSTALW를 사용하여 복수의 아미노산 서열을 얼라인먼트할 수 있고, 이 경우, 알고리즘으로서 Blosum62를 사용하여, 복수의 아미노산 서열을 얼라인먼트했을 때 유사라고 판단되는 아미노산을 유사 아미노산이라고 칭하는 경우가 있다. 본 발명의 변이체에 있어서, 아미노산 치환은 이러한 유사 아미노산 간의 치환에 의한 것일 수 있다. 이러한 얼라인먼트에 의해, 복수의 아미노산 서열에 대하여, 아미노산 서열이 동일한 영역 및 유사 아미노산에 의해 차지되는 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 기초로, 아미노산 서열 중의 상동성 영역(보존 영역)을 결정할 수 있다.

예를 들어, 서열 번호 4로 표시되는 유산 데히드로게나아제를 기준으로 하여, 138 내지 140위, 150 내지 154위, 185 내지 194위, 217 내지 222위, 243 내지 245위, 271 내지 278위, 280 내지 283위, 355 내지 367위, 398 내지 401위, 403 내지 406위, 425 내지 433위, 447 내지 450위, 455 내지 457위는 상동성 영역에 해당할 수 있다. 또한, 예를 들어, 서열 번호 4로 표시되는 유산 데히드로게나아제를 기준으로 하여, 138 내지 140위, 150 내지 154위, 185 내지 188위, 191 내지 194위, 217 내지 219위, 243 내지 245위, 271 내지 275위, 280 내지 283위, 355 내지 366위, 398 내지 400위, 405 내지 410위, 425 내지 431위, 447 내지 450위, 455 내지 457위는 상동성 영역에 해당할 수 있다. 또한, 본 발명의 유산 데히드로게나아제 상동성 영역에 있어서의 아미노산 서열은, 서열 번호 4에 있어서의 상동성 영역의 아미노산 서열과 75％ 이상, 예를 들어 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 예를 들어 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는다.

또한, 특히 본 발명의 유산 데히드로게나아제가 활성을 유지하기 위해 중요한 아미노산으로서, 서열 번호 4로 표시되는 유산 데히드로게나아제에 있어서의 361위의 히스티딘이나 364위의 아르기닌을 들 수 있다. 도 11a, 도 11b에 나타내어지는 각 유산 데히드로게나아제의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 사용함으로써, 서열 번호 4 이외의 유산 데히드로게나아제에 있어서의, 이들 중요한 아미노산 위치에 상당하는 위치를 밝히는 것도 가능하다(도 11b 중의 화살표로 표시된 위치). 또한, 도 11a, 도 11b에는 서열 번호 4, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12로 표시되는 유산 데히드로게나아제에 더하여, Ogataea polymorpha 유래 유산 데히드로게나아제의 아미노산 서열인 558 아미노산 중, 2 내지 51위를 제거한 서열 번호 46으로 표시되는 503 아미노산(LDH-1), Candida californica 유래 유산 데히드로게나아제의 아미노산 서열인 558 아미노산 중, 2 내지 86위를 제거한 서열 번호 47로 표시되는 506 아미노산(LDH-2), Chaetomium globosum 유래 유산 데히드로게나아제의 아미노산 서열인 서열 번호 48로 표시되는 502 아미노산(LDH-3), Madurella mycetomatis 유래 유산 데히드로게나아제의 아미노산 서열인 서열 번호 49로 표시되는 499 아미노산(LDH-4)을 포함한 얼라인먼트를 나타낸다.

먼저, 본 발명의 디바이스 및 시스템에 대하여, 설명한다.

도 4에 도시하는 바와 같이, 본 발명에 있어서의 검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스는, 검체에 유산 데히드로게나아제를 작용시키기 위한 작용부와, 유산 데히드로게나아제를 작용시킨 검체의 상태를 감지하는 센서를 포함한다. 센서는, 작용부에서의 검체의 상태를 감지하는 것이 가능하도록 배치된다. 또한, 센서의 작용부를 겔, 바람직하게는 생체 적합성 겔에 의해 포함시켜도 된다. 이 경우에는, 겔을 검체에 접촉시켜, 침투압 등의 효과에 의해 유산을 포함하는 수분을, 겔을 통하여 채취하고, 센서에 유산을 접촉시킴으로써 검체 중의 유산을 감지할 수 있다. 생체 적합성을 갖는 성분(즉, 겔 구조를 구성하는 겔의 소재)으로서는, 세포 접착성이나 생체 친화성을 갖고, 투명성이 높고, 친수성을 갖는 것이면, 특별히 한정되는 것은 아니며, 합성 분자 및 생체 분자 중 어느 것이나 사용할 수 있다.

상술한 합성 분자로서는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜이나 아크릴아미드 등의 친수성 아크릴계 분자를 들 수 있다. 이들 중에서도, 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트는, 신축성 고분자이고, 세포나 생체 조직에 대한 친화성뿐만 아니라, 신축성, 점탄성, 견고성을 향상시킬 수 있기 때문에 바람직하다.

또한, 생체 분자로서는, 예를 들어, 알긴산나트륨 등의 다당류, 젤라틴이나 실크 등의 단백질 재료, 콜라겐 등의 세포외 매트릭스 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 단백질을 많이 함유하는 재료가 바람직하다. 따라서, 본 실시 형태의 생체 적합성 겔 재료로서는, 생체 적합성을 갖는 성분의 하나로서 실크 피브로인 겔을 사용하는 것이 바람직하다. 단백질을 많이 함유하는 실크 피브로인 겔을 사용함으로써, 겔 재료의 표면에서는, 생체 적합성이 높고, 세포의 접착성의 촉진이 관찰될수록, 세포 독성을 적게 할 수 있다.

상술한 합성 분자 및 생체 분자는, 고분자여도 되고, 저분자여도 된다. 여기서, 고분자의 분자량(Mw)으로서는, 당해 고분자가 겔 구조를 구성 가능하다면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 분자량이 5,000 내지 1,000,000Da 정도의 고분자를 사용할 수 있다.

유산 데히드로게나아제를 작용시키기 위한 작용부란, 작용에 적합한 소재로 구성되어 있으면 되고, 금속, 플라스틱, 천, 액체, 종이, 나일론과 같은 소재로 구성된 효소를 작용시키는 부재를 말한다. 또한, 검체의 상태를 감지하는 센서는, 효소를 작용시키는 부재와 일체로 되어 있어도 되고, 떨어져 있어도 되고, 또한 직접적으로 또는 간접적으로 접속되어 있어도 된다.

작용부에는, 검체 및 본 발명의 유산 데히드로게나아제가 배치된다. 또한, 필요에 따라, 작용부에, 전자 수용체, 및/또는 전자 수용체(미디에이터)의 변화를 나타내기 위한 시약 등을 배치할 수 있다. 작용부(작용 전극이라고 표현하기도 함)를 포함하는 센서는, 본 발명의 LDH를 포함하는 작용 전극, 참조 전극 및 대향 전극을 갖는다. 작용 전극으로서는, 카본 전극, 금 전극, 백금 전극 등을 사용하고, 이 전극 상에 본 발명의 LDH를 고정화한다. 또한, 또는 이와는 별도로, 작용 전극 상에 전자 미디에이터를 고정화해도 된다. 대향 전극은 백금 전극이나 Pt/C 등의 관용의 전극일 수 있다. 참조 전극은 Ag/AgCl 전극 등의 관용의 전극일 수 있다. 고정화 방법으로서는, 가교 시약을 사용하는 방법, 고분자 매트릭스 중에 봉입하는 방법, 투석막으로 피복하는 방법, 광가교성 폴리머, 도전성 폴리머, 산화 환원 폴리머 등이 있고, 혹은 페로센 혹은 그의 유도체로 대표되는 전자 미디에이터와 함께 폴리머 중에 고정 혹은 전극 상에 흡착 고정해도 되고, 또한 이들을 조합하여 사용해도 된다. 전형적으로는, 글루타르알데히드를 사용하여 본 발명의 LDH를 카본 전극 상에 고정화한 후, 아민기를 갖는 시약으로 처리하여 글루타르알데히드를 블로킹한다. 글루타르알데히드 대신에 폴리(에틸렌글리콜)디글리시딜에테르 등의 가교 시약을 사용할 수도 있다.

본 발명의 디바이스에 사용할 수 있는 센서로서는, 유산 데히드로게나아제를 작용시킨 검체의 상태를 감지할 수 있는 것이면, 한정 없이 사용할 수 있다.

[센서 칩]

센서로서, 센서 칩을 사용해도 된다. 도 1의 (a)는 본 발명의 일 실시 형태에 관한 센서 칩(10)의 모식도이고, 도 1의 (b) 내지 도 1의 (d)는 센서 칩(10)을 구성하는 부재를 도시하는 모식도이다. 센서 칩(10)은, 기재(11) 상에 배치한 2 이상의 전극을 구비한다. 기재(11)는 절연 재료로 구성된다. 도 1의 (a) 및 도 1의 (b)에 있어서는, 일례로서, 작용극(1), 대향 전극(3) 및 참조극(5)이 기재(11) 상에 배치된다. 각 전극은 배선부(7)에 각각 전기적으로 접속되고, 배선부(7)는 각 전극과는 배선 방향의 반대 측에 위치하는 단자(9)에 전기적으로 접속된다. 작용극(1), 대향 전극(3) 및 참조극(5)은 서로 이격되어 배치된다. 또한, 작용극(1), 대향 전극(3) 및 참조극(5)은, 배선부(7) 및 단자(9)와 일체로 구성되는 것이 바람직하다. 또한, 대향 전극(3) 및 참조극(5)을 일체형으로 해도 된다.

도 1의 (a) 및 도 1의 (c)에 도시하는 바와 같이, 배선부(7)에 평행한 기재(11)의 단부에는, 스페이서(13)가 배치되고, 작용극(1), 대향 전극(3), 참조극(5) 및 스페이서(13)을 덮는 커버(15)가 배치된다. 스페이서(13) 및 커버(15)는 절연 재료로 구성된다. 스페이서(13)는 작용극(1), 대향 전극(3) 및 참조극(5)와 개략 동등한 두께를 갖고, 작용극(1), 대향 전극(3) 및 참조극(5)에 밀착하는 것이 바람직하다. 또한, 스페이서(13)와 커버(15)는 일체로 구성되어도 된다. 커버(15)는, 배선부(7)가 외기에 노출되어 열화되거나, 측정 시료의 스며듦에 인한 단락을 방지하거나 하는 보호층이다.

도 1의 (a) 및 도 1의 (d)에 도시하는 바와 같이, 작용극(1), 대향 전극(3) 및 참조극(5) 상에는 반응층(19)이 배치된다. 반응층(19)은, 유산과 유산 데히드로게나아제의 반응의 장을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 유산 데히드로게나아제는 이들 전극에 도포, 흡착, 또는 고정화되어 있어도 된다. 바람직하게는, 본 발명의 유산 데히드로게나아제는 작용극에 도포, 흡착, 또는 고정화된다. 다른 실시 형태에서는, 유산 데히드로게나아제와 함께 미디에이터도 전극에 도포, 흡착, 또는 고정화해도 된다. 전극으로서는 탄소 전극, 백금, 금, 은, 니켈 및 팔라듐 등의 금속 전극 등을 사용할 수 있다. 탄소 전극의 경우, 재료로서 파이로리틱·그래파이트 카본(PG), 글래시 카본(GC), 카본 페이스트 및 플라스틱 폼드 카본(PFC) 등을 들 수 있다. 측정 시스템은 2전극계여도 되고 3전극계여도 되고, 예를 들어 작용 전극 상에 효소를 고정할 수 있다. 참조 전극으로서는, 표준 수소 전극, 가역 수소 전극, 은-염화은 전극(Ag/AgCl), 팔라듐·수소 전극 및 포화 칼로멜 전극 등을 들 수 있고, 안정성이나 재현성의 관점에서, Ag/AgCl을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 측정에 필요한 용액량을 저감시키기 위해, 인쇄 전극을 사용할 수도 있다. 이 경우, 전극은 절연 기판으로 구성된 기재(11) 상에 형성되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 포토리소그래피 기술이나, 스크린 인쇄, 그라비아 인쇄 및 플렉소 인쇄 등의 인쇄 기술에 의해, 기재(11) 상에 전극이 형성되는 것이 바람직하다. 또한, 절연 기판의 소재로서는, 실리콘, 유리, 세라믹, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리에스테르 등을 들 수 있지만, 각종 용매나 약품에 대한 내성이 강한 것을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

예를 들어, 전자 수용체로서 페리시안화 칼륨이 포함되어 있는 작용부에 있어서, 검체에 포함되는 유산에 대하여 유산 데히드로게나아제를 작용시켰을 경우, 페리시안화 칼륨이 페로시안화 칼륨으로 변화한다. 페리시안화 칼륨은 파장 420nm에 흡수를 나타내므로, 파장 420nm에서의 흡광도를 분광 광도계에 의해 측정함으로써, 검체 중의 유산의 상태를 감지할 수 있다. 또한, 유산에 대하여 유산 데히드로게나아제를 작용시키고, 추가로 페리시안화 칼륨을 작용시켰을 때의 산화 환원 반응을 전기 화학적으로 센서로 측정할 수도 있다. 전기 화학적인 측정을 하기 위한 센서로서, 구체적으로는, 예를 들어, 아크레이사제의 락테이트·프로2 형식 번호 LT-1730의 센서를 사용할 수 있다. 기타의 전자 수용체로서는, 퀴논류, 페나진류(예를 들어, 페나진메토술페이트), 비올로겐류, 시토크롬류(예를 들어, 시토크롬b, 시토크롬c), 페녹사진류, 페노티아진류, 페리시안화물, 페레드키신류, 페로센, 오스뮴 착체, 루테늄 착체, 페닐렌디아민류 및 그의 유도체 등 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 유산 데히드로게나아제는 산소를 전자 수용체로 하지 않는다.

예를 들어, 유산 농도의 측정은, 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 항온 셀에 완충액을 넣고, 일정 온도로 유지한다. 작용 전극으로서 LDH 및 전자 수용체(예를 들어 퀴논 부가 폴리머)를 고정화한 전극을 사용하고, 대향 전극(예를 들어 백금 전극) 및 참조 전극(예를 들어 Ag/AgCl 전극)을 사용한다. 카본 전극에 일정 전압을 인가하여, 전류가 일정하게 된 후, L-유산을 포함하는 시료를 첨가하여 전류의 증가를 측정한다. 표준 농도의 유산 용액에 의해 작성한 캘리브레이션 커브에 따라, 시료 중의 유산 농도를 계산할 수 있다.

구체적인 일례로서는, 글래시 카본(GC) 전극에 본 발명의 4U의 LDH를 고정화하여, 유산 농도에 대한 응답 전류값을 측정한다. 전해 셀 중에, 50mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5) 1.8ml, 및 1M 헥사시아노철(III)산칼륨(페리시안화 칼륨) 수용액 0.2ml를 첨가한다. GC 전극을 포텐쇼스탯 BAS100B/W(BAS제)에 접속하고, 37℃에서 용액을 교반하고, 은염화은(포화 KCl) 참조 전극에 대하여 +500mV를 인가한다. 이들 계에 1M L-유산 용액을 최종 농도가 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50mM이 되도록 첨가하고, 첨가마다 정상 상태의 전류값을 측정한다. 이 전류값을 기지의 유산 농도(1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50mM)에 대하여 플롯하여, 검량선을 작성한다. 이에 의해 본 발명의 FMN-LDH를 사용한 효소 고정화 전극을 사용한 유산의 정량이 가능하게 된다.

어떤 실시 형태에 있어서, 본 발명의 유산 센서 칩에 본 발명에 0.01U 내지 1000U, 0.1U 내지 1000U, 보다 바람직하게는 0.5U 내지 700U, 보다 바람직하게는 0.5U 내지 500U, 보다 바람직하게는 1U 내지 300U, 보다 바람직하게는 1U 내지 100U의 FMN-LDH 용액을 도포 혹은 고정화한다.

어떤 실시 형태에 있어서, 본 발명의 유산 센서를 갖는 연속 유산 모니터링 디바이스가 제공된다. 또한, 어떤 실시 형태에 있어서, 본 발명의 LDH를 사용하는 14일 동안, 연속으로 유산을 모니터링하는 방법이 제공된다. 측정하는 기간은, 5초, 1분, 5분, 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 15시간, 24시간, 2일, 5일, 7일, 10일, 14일 등, 목적에 맞추어 설정할 수 있다.

어떤 실시 형태에 있어서, 연속 유산 모니터링은, 재 캘리브레이션 있음으로 또는 없음으로 행할 수 있다. 어떤 실시 형태에 있어서, 예를 들어 재 캘리브레이션을 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일마다 행할 수 있다.

본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하다. 그 때문에, 간편하면서도 바람직하게는 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다.

본 발명은 i) 유산 데히드로게나아제와 검체를 접촉시키는 공정, 및 ii) 유산을 측정하는 공정을 포함하는, 유산을 측정하는 방법에도 관련된다. 구체적으로는, 공정 i)의 유산 데히드로게나아제는 FMN 의존성 유산 데히드로게나아제, 더욱 바람직하게는 서열 번호 4, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제이다. 또한, 구체적으로는, 공정 i)의 유산 데히드로게나아제는 0.01U 내지 1000U, 0.1U 내지 1000U, 보다 바람직하게는 0.5U 내지 700U, 보다 바람직하게는 0.5U 내지 500U, 보다 바람직하게는 1U 내지 300U, 보다 바람직하게는 1U 내지 100U의 유산 데히드로게나아제이다. 또한, 공정 i)의 유산 데히드로게나아제는, (A) 용액 중에서, 약 30, 35℃ 또는 37℃에서 10일간 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제; (B) 용액 중에서, 약 30, 35℃ 또는 37℃에서 3일간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제, 또는 (C) 용액 중에서, 약 30, 35℃ 또는 37℃에서 15시간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제여도 된다. 또한, 공정 i)의 유산 데히드로게나아제와 검체를 접촉시킬 때의 온도는, 20 내지 60℃이면 되고, 바람직하게는 30 내지 55℃의 범위 내이면 되고, 바람직하게는 30 내지 40℃의 범위 내이면 된다. 또한, 공정 i)의 유산 데히드로게나아제와 검체를 접촉시킬 때의 pH는 3 내지 10의 범위 내이면 되고, 바람직하게는 5 내지 9의 범위 내이면 되고, 바람직하게는 6 내지 8의 범위 내이면 된다.

또한, 공정 ii)의 유산을 측정하는 공정은 단회 측정이어도 되고, 연속 측정이어도 된다. 공정 ii)의 측정하는 기간은, 5초, 1분, 5분, 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 15시간, 24시간, 2일, 5일, 7일, 10일 혹은 14일이어도 된다.

도 4에 도시하는 바와 같이, 본 발명에 있어서의 검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스는, 추가로 출력부를 포함할 수 있다. 출력부는, 센서로부터의 신호를 외부에 출력할 수 있다. 또한, 그 출력부가 데이터 처리 유닛에 접속되어, 시스템을 구성하고 있어도 된다. 즉, 시스템은, 디바이스 및 데이터 처리 유닛을 포함한다. 데이터 처리 유닛은, 센서로부터의 신호를 처리할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「데이터 처리 유닛」이란, 단체의 컴퓨터 등의 장치를 의미할 뿐만 아니라, 로컬 네트워크나 인터넷 등의 통신 회선에 의해 접속된 다른 장치를 연결한 형태의 정보 처리를 하기 위한 네트워크의 개념을 포함한다.

출력부와 데이터 처리 유닛의 접속은, 센서로부터의 신호를 출력부로부터 출력하고, 데이터 처리 유닛에 입력하는 것이 가능하도록, 전기적, 전자적 방법에 의해 접속하는 것을 의미한다. 예를 들어, 접속을 위한 물리적인 접속 방법으로서는, 유선에 의한 접속 외에, 무선 LAN 등의 무선 통신에 의해 접속할 수도 있다.

데이터 처리 유닛은, 제어부를 포함할 수 있다. 제어부는, 예를 들어 CPU(Central Processing Unit)일 수 있다. 후술하는 프로그램은, 제어부에 읽힐 수 있다.

데이터 처리 유닛은, 기억부를 포함할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「기억부」란, 메모리 및 하드 디스크 등과 같이, 입력된 정보를 판독 가능하도록 기입할 수 있는 것을 말한다. 기억부는, 소정의 장치의 내부에 배치할 수 있다. 또한, 기억부는, 로컬 네트워크나 인터넷 등의 통신 회선에 의해 접속된 다른 장치의 내부에 존재할 수 있다. 기억부를 포함함으로써, 센서에 의해 측정된 신호를 기억할 수 있고, 또한 데이터 처리 유닛에 의해 처리된 결과를 기억할 수 있다.

데이터 처리 유닛은, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 표시하기 위한 표시부를 갖는 표시부에 접속하거나, 또는 표시부로 전송할 수 있다. 표시부로서는, 디스플레이, 인쇄 장치, 음성 출력 장치 및 로컬 네트워크나 인터넷 등의 통신 회선에 의한 외부로의 출력 등, 공지의 표시를 하기 위한 수단을 사용할 수 있다. 즉, 표시부는, 데이터 처리 유닛이 표시 장치를 물리적으로 갖고 있는 것뿐만 아니라, 다른 정보 처리 장치로의 데이터(결과)의 전송에 의해, 다른 정보 처리 장치에 대하여 결과를 표시하는 것을 포함한다.

또한, 데이터 처리 유닛에 트랜스미터를 구비할 수도 있고, 표시부나 기억부를 구비한 별개의 측정 장치와 무선으로 송수신할 수도 있다. 트랜스미터는, 디바이스가 측정한 전류값을 측정부(100)에서 측정하고, 그 전류값을 제어부(101)에 보낸다. 제어부(101)에서는, 온도 센서(102)에 의해, 디바이스의 근방의 온도를 측정하고, 온도 보정을 행한 후에 전류값으로부터 유산 농도를 연산한다. 제어부(101)에서는, 이 유산 농도의 연산은, 소정의 샘플링 시간 간격마다 실행하고 있다.

그리고, 제어부(101)에서는, 연산한 유산 농도를, 소정의 기록 시간 간격마다, 적산 평균을 행하여, 기억부(103)에 대하여 기록한다. 제어부(101)은, 기억부(103)에 기억된 값을, 측정 장치(106)로부터의 지시에 따라, 통신부(104)를 경유하여, 측정 장치(106)로 송신한다.

본 실시 형태에서의 트랜스미터는, 전지(105)를 내장하고 있다. 이 전지(105)의 배터리 잔량이 부족하게 된 시점에, 트랜스미터는 폐기되는 구성으로 되어 있다. 전지(105)의 배터리 잔량은, 측정 장치(106)를 통하여 모니터되고 있다. 그리고, 디바이스를 교환한 시점에, 측정 장치(106)는, 트랜스미터의 전지(105)의 배터리 잔량에 대하여, 다음 디바이스의 교환까지 전지(105)의 잔량이 충분한지 여부를 확인한다. 그리고, 가령, 잔량이 충분하지 않은 경우에는, 트랜스미터를 교환하도록, 사용자에 대하여 지시를 내림과 함께, 그 트랜스미터를 사용할 수 없도록 한다.

본 발명에 있어서의 시스템에 의하면, 검체의 상태, 예를 들어, 운동 부하에 대한 신체 상태, 질병 상태, 유산량의 변화를 수반하는 양조물의 양조 상태, 유산량의 변화를 수반하는 음식품의 숙성·추숙 정도, 유산량의 변화를 수반하는 화성품 제조의 유산 함량 비율, 유산량의 변화를 수반하는 물이나 토양의 상태 등을 평가할 수 있다.

본 발명의 디바이스에 있어서 사용하는 유산 데히드로게나아제는, (A) 용액 중에서, 약 30, 35℃ 또는 37℃에서 10일간 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제; (B) 용액 중에서, 약 30, 35℃ 또는 37℃에서 3일간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제, 또는 (C) 용액 중에서, 약 30, 35℃ 또는 37℃에서 15시간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제여도 된다. 또한, 본 발명의 디바이스에 있어서 사용하는 유산 데히드로게나아제는, 사용에 제공하고 나서 15시간 후를 기점으로 해도, 70％ 이상 활성을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제여도 된다.

상기 디바이스는, 추가로 출력부를 포함하고 있어도 되고, 그 출력부가 데이터 처리 유닛에 접속되어, 시스템을 구성하고 있어도 된다.

본 발명의 디바이스 및 시스템에 의하면, 평가 또는 모니터링은, 검체에 대하여 비침윤적으로 행할 수 있고, 샘플링의 스텝이 없이 직접 측정할 수 있고, 즉 테스트 시험지를 센서에 삽입하여 버튼을 누르는 것 같은 일회용의 측정은 아니고, 첩부한 채, 끼워 넣은 채로 장기에 걸쳐 계속하여 사용할 수 있다는 점에서, 매우 유리하다.

다음으로, 본 발명의 프로그램에 대하여, 설명한다. 본 발명의 프로그램은, 검체의 상태를, 디바이스 및 데이터 처리 유닛을 포함하는 시스템에 의해 평가하기 위한 프로그램이다.

본 명세서에 있어서, 프로그램이란, 소정의 디바이스를 작동시키기 위해, 소정의 정보 처리 장치에 대하여 소정의 처리를 실행시키는 어플리케이션 소프트웨어일 수 있다. 또한, 본 발명의 프로그램은, 모바일 애플리케이션(애플리케이션)일 수도 있다.

본 발명의 프로그램은, 상술한 도 4에 도시하는 바와 같은 시스템을 작동시키기 위한 프로그램이다. 시스템은, 디바이스 및 데이터 처리 유닛을 포함한다.

디바이스는, 작용부와, 센서와, 출력부를 포함한다. 작용부, 센서 및 출력부에 대해서는, 상술한 설명과 같다. 즉, 작용부는, 검체에 유산 데히드로게나아제를 작용시킬 수 있도록 구성된다. 센서는, 작용부에서의, 유산 데히드로게나아제를 작용시킨 검체의 상태를 감지하는 것이 가능하도록 배치되도록 구성된다. 출력부는, 센서로부터의 신호를 출력할 수 있도록 구성된다.

데이터 처리 유닛은, 디바이스의 출력부에 접속되어, 센서로부터의 신호를 처리하도록 구성된다. 데이터 처리 유닛은, 제어부, 기억부 및 표시부를 포함할 수 있다. 제어부, 기억부 및 표시부에 대해서는, 상술한 설명과 같다.

본 발명의 프로그램은, 시스템에 대하여, 측정 처리 S01과, 전송 처리 S02와, 데이터 처리 S03을 실행시킨다. 본 발명의 프로그램은 또한 시스템에 대하여, 결과 표시 처리 S04를 실행시킬 수 있다.

측정 처리 S01에서는, 센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 검체의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

전송 처리 S02에서는, 측정 처리에서 얻어진 신호를 출력부로부터 데이터 처리 유닛에 대하여 전송하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

본 프로그램은, 구체적으로는, 이하와 같은 용도의 프로그램으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 프로그램은, 식품 및 음료의 용도의 프로그램으로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 이하와 같다.

(식품 및 음료를 위한 프로그램의 실시 형태 1)

본 실시 형태의 프로그램은, 쇠고기의 신선도 관리를 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 쇠고기이다.

측정 처리 S01에서는, 센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 쇠고기의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 쇠고기의 신선도 관리를 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 쇠고기의 신선도 관리를 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

또한, 본 실시 형태에서는, 유산값 외에, 온도, 습도를 모니터링함으로써, 쇠고기의 소비 기한을 예측할 수 있다. 또한, 고기의 부위를 파라미터로서 입력함으로써, 고기의 가치를 산출하여, 판매 가격의 지표로 할 수 있다. 또한, 본 실시 형태에서는, 요리에 맞추어, 고기의 숙성도의 제안을 할 수 있다. 본 실시 형태에서는, 쇠고기에 직접, 작용부를 붙이고, 센서에 의해 고기의 상태를 감지할 수 있다.

종래, 쇠고기의 신선도 관리는, 온도에 의해 관리하는 것이 주류였다. 본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 유산을 지표로 한 신선도 관리로 할 수 있다. 그 때문에, 쇠고기의 수송 조건이나 보관 조건을 적절하게 할 수 있다. 본 실시 형태의 프로그램을 사용함으로써, 쇠고기의 가치를 객관적으로 나타내는 지표로도 되어, 소비자의 판단을 지원할 수 있다.

(식품 및 음료를 위한 프로그램의 실시 형태 2)

본 실시 형태의 프로그램은, 쇠고기의 숙성의 관리와 제어 지표를 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 쇠고기이다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 쇠고기의 숙성의 관리와 제어 지표를 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 쇠고기의 숙성의 관리와 제어 지표를 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

또한, 본 실시 형태에서는, 유산값 외에, 온도, 습도, pH를 모니터링함으로써, 쇠고기의 소비 기한을 예측할 수 있다. 또한, 고기의 부위를 파라미터로서 입력함으로써, 고기의 가치를 산출하여, 판매 가격의 지표로 할 수 있다. 또한, 본 실시 형태에서는, 요리에 맞추어, 고기의 숙성도의 제안을 할 수 있다. 본 실시 형태에서는, 쇠고기에 직접, 작용부를 붙이고, 센서에 의해 고기의 상태를 감지할 수 있다.

종래, 쇠고기의 숙성 관리는, 온도에 의해 관리하는 것이 주류였다. 본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 유산을 지표로 한 신선도 관리로 할 수 있다. 그 때문에, 쇠고기의 수송 조건이나 보관 조건을 적절하게 할 수 있다. 본 실시 형태의 프로그램을 사용함으로써, 쇠고기의 가치를 객관적으로 나타내는 지표로도 되어, 소비자의 판단을 지원할 수 있다.

(식품 및 음료를 위한 프로그램의 실시 형태 3)

본 실시 형태의 프로그램은, 다랑어 등의 물고기의 신선도 관리를 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 다랑어 등의 물고기이다.

측정 처리 S01에서는, 센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 다랑어 등의 물고기의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 다랑어 등의 물고기의 신선도 관리를 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 다랑어 등의 물고기의 신선도 관리를 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

또한, 본 실시 형태에서는, 유산값 외에, 온도, 습도, K값을 모니터링함으로써, 다랑어 등의 물고기의 신선함의 정도나 소비 기한을 예측할 수 있다. 본 실시 형태에서는, 물고기의 종류를 파라미터로서 입력함으로써, 물고기의 가치를 산출하여, 판매 가격의 지표로 할 수 있다. 또한, 본 실시 형태에서는, 요리에 맞추어, 물고기의 신선도의 제안을 할 수 있다. 본 실시 형태에서는, 예를 들어 물고기의 눈에 직접, 작용부를 붙이고, 센서에 의해 다랑어 등의 물고기의 상태를 감지할 수 있다.

종래, 다랑어 등의 물고기의 신선도 관리는, 온도나 K값에 의해 관리하는 것이 주류였다(「바다-자연과 문화」 도카이 대학 정기 간행물 해양학부 제4권 제2호 31-46페이지(2006) 참조). 그러나, 앞의 문헌에는, K값이 낮고 신선도가 높다고 판정된 경우에도, 근육 중의 유산량이 증가했기 때문에 산 변성이 일어난 결과, 신선도가 낮은 것도 있다고 기재되어 있다. 본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 유산을 지표로 한 신선도 관리로 할 수 있다. 유산량과 K값과 조합하여 관리할 수도 있다. 그 때문에, 다랑어 등의 물고기의 수송 조건이나 보관 조건을 적절하게 할 수 있다. 본 실시 형태의 프로그램을 사용함으로써, 다랑어 등의 물고기의 가치를 객관적으로 나타내는 지표로도 되어, 소비자나 도매업자의 판단을 지원할 수 있다.

(식품 및 음료를 위한 프로그램의 실시 형태 4)

본 실시 형태의 프로그램은, 다랑어 등의 물고기의 숙성의 관리와 제어 지표를 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 다랑어 등의 물고기이다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 다랑어 등의 물고기의 숙성의 관리와 제어 지표를 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 다랑어 등의 물고기의 숙성의 관리와 제어 지표를 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

또한, 본 실시 형태에서는, 유산값 외에, 온도, 습도를 모니터링함으로써, 다랑어 등의 물고기가 적절한 숙성 상태를 예측할 수 있다. 본 실시 형태에서는, 물고기의 종류를 파라미터로서 입력함으로써, 숙성된 물고기의 가치를 산출하여, 판매 가격의 지표로 할 수 있다. 또한, 본 실시 형태에서는, 요리에 맞추어, 물고기의 숙성도의 제안을 할 수 있다. 본 실시 형태에서는, 예를 들어 물고기의 눈에 직접, 작용부를 붙이고, 센서에 의해 다랑어 등의 물고기의 상태를 감지할 수 있다.

종래, 다랑어 등의 물고기의 숙성 관리는, 온도나 숙성 시간, 해동할 온염수의 온도나 수온에 의해 관리하는 것이 주류였다. 본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 유산을 지표로 한 숙성 관리로 할 수 있다. 그 때문에, 다랑어 등의 물고기의 숙성 조건을 적절하게 할 수 있다. 본 실시 형태의 프로그램을 사용함으로써, 다랑어 등의 물고기의 가치를 객관적으로 나타내는 지표로도 되어, 소비자나 도매업자의 판단을 지원할 수 있다.

(식품 및 음료를 위한 프로그램의 기타의 실시 형태)

본 실시 형태의 프로그램은, 상기 이외의 식품 및 음료를 위한 프로그램으로서, 예를 들어, 와인의 말로락틱 발효 관리, 일본 술이나 베이글 등의 빵, 쿠즈모치의 발효 관리, 위스키의 유산 발효 관리, 차의 발효 관리, 식품의 안전성 지표 등을 위한 프로그램일 수 있다. 본 실시 형태의 프로그램에 의하면, 경험과 감에 의지하고 있던, 와인이나 일본 술 등의 양조주의 발효 관리를, 유산값 외에, pH값, 용존 산소 값 등을 지표로 함으로써, 적절한 온도 제어나 발효 기간을 얻을 수 있다.

본 발명의 프로그램은, 동물의 용도의 프로그램으로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 이하와 같다.

(동물을 위한 프로그램의 실시 형태 1)

본 실시 형태의 프로그램은, 경주마의 관리를 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 경주마이다.

측정 처리 S01에서는, 센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 경주마의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 경주마의 관리를 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 경주마의 관리를 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

또한, 경주마의 조교에 있어서, 혈중 유산을 지표로 하여 트레이닝 프로그램이 짜여 있다. 운동 강도에 따라, 유산량이 변화하고, 운동 시의 산소 수요량과 공급량의 밸런스가 유지되어 있으면 혈중 유산은 축적되지 않고, 수요 공급의 균형이 무너지면 상승하는 것으로 알려져 있다(JRA 육성장 일지, 유산지(乳酸地)를 지표로 한 조교 부하로부터). 따라서, 본 실시 형태에서는, 경주마의 조교 부하의 적성도를 평가할 수 있다. 또한, 얻어진 유산값을 사용하여 말의 트레이닝 방법을 제안하는 것도 가능하다.

본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 경주마의 조교 관리, 및 건강 관리를 행할 수 있다. 센서를 말에 직접 장착하거나, 혹은 피부와 접촉하는 안장 등의 마구의 표면 등에 장착하고, 혈중, 피부 혹은 간질액, 땀 등에 포함되는 유산을 모니터링함으로써, 조교할 때마다 말에서 채혈을 실시하고, 측정·분석한다는 조련사의 부담이나 말의 스트레스를 경감하는 것도 가능하게 된다.

(동물을 위한 프로그램의 실시 형태 2)

본 실시 형태의 프로그램은, 경주마의 피로도 측정을 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 경주마이다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 경주마의 피로도 측정을 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 경주마의 피로도 측정을 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

또한, 본 실시 형태에서는, 경주마의 피로도에 따라, 유산량이 변화하므로, 유산량의 변화로부터, 경주마의 피로도를 예측할 수 있다.

본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 경주마의 근육 피로도를 나타내는 지표를 얻을 수 있으므로, 초보자라도 경주마의 근육 피로도의 판단을 할 수 있다.

(동물을 위한 프로그램의 실시 형태 3)

본 실시 형태의 프로그램은, 소의 건강 관리, 출하 시 판정 관리 또는 육우의 육질 제어를 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 소이다.

측정 처리 S01에서는, 센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 소의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 소의 건강 관리, 출하 시 판정 관리 또는 육우의 육질 제어를 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 소의 건강 관리, 출하 시 판정 관리 또는 육우의 육질 제어를 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

또한, 본 실시 형태에서는, 작용부를 귀로 하여, 유산 데히드로게나아제를 작용시켜, 센서에 의해, 소의 상태를 감지하여 측정할 수 있다. 귀에는 혈관이 지나고 있어, 귀 태그에 작용부 및 센서를 장치하여 배치함으로써, 귀의 혈액을 구체적인 검체로서 측정하는 것이 가능하다. 땀이나 피부를 검체로 할 수도 있다. 또한, 본 실시 형태에서는, 위를 작용부로 하는 것도 가능하다. 예를 들어, 혈액 중의 유산량을 측정함으로써, 급성 아시도시스가 되기 전에 유산균 혹은 유산이 들어간 곡물 투여를 억제할 수 있다.

본 실시 형태에서는, 삼키기형 센서로 건강 관리, 출하 시 판정 관리 또는 육우의 육질 제어를 행할 수도 있다. 즉, 작용부를 위 등의 소화 기관으로 하여, 유산 데히드로게나아제를 작용시켜, 센서에 의해, 소의 상태를 감지하여 측정할 수 있다. 본 실시 형태에서는, 소의 유산량에 따라, 위 속에 존재하는 미생물의 유산 자화량(資化量)이 결과적으로 변화하고, 그 유산 자화량에 따라 휘발성 지방산이 발생하고, 그 휘발성 지방산을 소가 흡수하여 영양분(탄소원)으로 할 수 있다. 따라서, 유산량의 변화로부터, 양분의 흡수 효율을 예측할 수 있고, 소의 건강 상태 예측, 출하 시 판정 관리 또는 육우의 육질 제어를 행할 수도 있다.

본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 소의 건강 관리, 출하 시 판정 관리 또는 육우의 육질 제어를 할 수 있다.

(동물을 위한 프로그램의 실시 형태 4)

본 실시 형태의 프로그램은, 젖소의 건강 관리를 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 젖소이다.

측정 처리 S01에서는, 센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 젖소의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 젖소의 건강 관리를 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 젖소의 건강 관리를 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

또한, 본 실시 형태에서는, 작용부를 귀로 하여, 유산 데히드로게나아제를 작용시켜, 센서에 의해, 젖소의 상태를 감지하여 측정할 수 있다. 귀에는 혈관이 지나고 있어, 귀 태그에 작용부 및 센서를 장치하여 배치함으로써, 귀의 혈액을 구체적인 검체로서 측정하는 것이 가능하다. 땀이나 피부를 검체로 할 수도 있다. 또한, 본 실시 형태에서는, 위를 작용부로 하는 것도 가능하다. 예를 들어, 혈액 중의 유산량을 측정함으로써, 급성 아시도시스가 되기 전에 유산균 혹은 유산이 들어간 곡물 투여를 억제할 수 있다.

본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 젖소의 건강 관리를 할 수 있다. 또한, 짜낸 젖의 성분값도 함께 분석함으로써, 얻어진 유제품의 가치를, 최종 제품 및 젖소의 건강 상태의 관점에서 평가할 수도 있어, 소비자나 도매업자의 판단의 지원이 된다.

본 발명의 프로그램은, 식물의 용도의 프로그램으로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 이하와 같다.

(식물을 위한 프로그램의 실시 형태 1)

본 실시 형태의 프로그램은, 식물 관리를 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 식목이나 토양이다. 검체로서, 구체적으로는, 식물의 잎, 뿌리, 수액, 과실, 종자 등이 있을 수 있고, 화분에 심은 식목이어도 된다.

측정 처리 S01에서는, 센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 식물의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 식물 관리를 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 식물 관리를 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

토양에 유산이 있으면, 식물의 흡수가 촉진된다. 따라서, 토양의 유산량에 따라, 식물의 흡수가 변화한다. 따라서, 본 실시 형태에서는, 식목의 흡수의 상태를 평가할 수 있다.

본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 화분의 식물에 대한 영양제의 첨가나 물 주기의 타이밍을 제안할 수 있다. 또한, pH가 낮으면 식물의 잡균 번식을 억제하는 것이 가능하게 된다. 따라서, 유산량과 함께 pH를 측정함으로써, 잡균 번식을 억제하는 것이 가능하게 된다.

(식물을 위한 프로그램의 실시 형태 2)

본 실시 형태의 프로그램은, 토양 관리, 및 수경 재배 관리의 지표를 위한 프로그램일 수 있다. 즉, 본 실시 형태에서는, 검체는 토양 또는 물이다.

측정 처리 S01에서는, 센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 토양의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다.

데이터 처리 S03에서는, 데이터 처리 유닛에 대하여, 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 본 실시 형태의 소정의 처리란, 토양 관리, 및 수경 재배 관리의 지표를 위해 적합한 데이터 형식으로 하기 위한 처리이다.

결과 표시 처리 S04에서는, 데이터 처리 유닛에 의해 처리한 결과를 소정의 표시부가 표시하도록, 프로그램이, 시스템에 대하여 처리를 실행시킨다. 이 결과, 표시부에, 토양 관리, 및 수경 재배 관리의 지표를 위해 적합한 데이터 형식의 데이터를 표시할 수 있다.

토양 및 수경 용수에 유산이 있으면, 식물의 흡수가 촉진된다. 따라서 토양 및 수경 용수의 유산량에 따라, 식물의 흡수가 변화한다. 따라서, 본 실시 형태에서는, 토양 및 수경 용수에 존재하는 식물의 흡수의 상태를 평가할 수 있다.

본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 그 때문에, 본 실시 형태의 프로그램에 의해, 식물에 대한 영양제의 첨가나 물 주기의 타이밍, 추비의 타이밍을 제안할 수 있다. 또한, pH가 낮으면 식물의 잡균 번식을 억제하는 것이 가능하게 된다. 따라서, 유산량과 함께 pH를 측정함으로써, 잡균 번식을 억제하는 것이 가능하게 된다.

종래, 식물의 관리는 계절 등 시간에 따라 추비하거나, 식물의 상태가 나빠졌을 때 물이나 영양제를 첨가하거나 하는 등, 데이터에 기초하지 않은 관리가 주류였다. 본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 열 안정성이 충분하므로, 간편하면서도 연속적인 유산 감시를 실현할 수 있다. 토양에 포함되는 유산값이 낮아졌을 때는, 토양 내의 항균성을 높이기 위해, 유산균이 자화 가능한 당류나 유산의 첨가량을 산출하는 시스템을 제공할 수 있다. 반대로 유산값이 높아졌을 때는, 알칼리성 비료의 종류나 첨가량을 산출하는 시스템을 제공한다. 아울러, pH나 전기 전도도, 일조량, 온도, 습도, 아미노산량을 측정함으로써, 정확한 식물 육종 프로그램을 구축, 제공할 수 있다. 또한, 토마토 등 최종 생산물의 성분값(예를 들어, 당도, 산도)을 분석함으로써, 얻어진 최종 생산물의 가치에 대하여, 최종 제품 및 식물이 어떤 경과로 길러져 왔는가라는 소비자에게 보이지 않는 관점에서 객관적인 평가를 할 수 있어, 소비자나 도매업자의 판단의 지원이 된다.

본 발명은 서열 번호 4, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12로 표시되는 아미노산 서열과 동일성이 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상인 아미노산 서열을 갖는 유산 데히드로게나아제, 그것을 코딩하는 핵산에도 관련된다. 어떤 실시 형태에 있어서 본 발명은 서열 번호 5, 서열 번호 8, 서열 번호 11, 또는 서열 번호 13에 나타내는 염기 서열과 60％, 61％, 62％, 63％, 64％, 65％, 66％, 67％, 68％, 69％, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 90％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 가지며, 또한 유산 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 제공한다.

(LDH 유전자)

LDH를 코딩하는 유전자를 얻는 데에는, 통상 일반적으로 사용되고 있는 유전자의 클로닝 방법이 사용된다. 예를 들어, LDH 생산능을 갖는 미생물 균체나 다양한 세포로부터 통상의 방법, 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience, 1989) 기재의 방법에 의해, 염색체 DNA 또는 mRNA를 추출할 수 있다. 또한 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 염색체 DNA 또는 cDNA를 사용하여, 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 제작할 수 있다.

이어서, 상기 LDH의 아미노산 서열에 기초하여, 적당한 프로브 DNA를 합성하고, 이를 사용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리로부터 LDH 유전자를 선발하는 방법, 혹은, 상기 아미노산 서열에 기초하여, 적당한 프라이머 DNA를 제작하고, 5'RACE법이나 3'RACE법 등의 적당한 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR법)에 의해, LDH를 코딩할 목적의 유전자 단편을 포함하는 DNA를 증폭시켜, 이들 DNA 단편을 연결시켜, 목적의 LDH 유전자의 전체 길이를 포함하는 DNA를 얻을 수 있다.

이들 LDH 유전자는, 각종 벡터에 연결 또는 삽입해도 되고, 염색체나 게놈에 편입시켜도 된다. 벡터를 사용하는 경우, 벡터에의 클로닝에는, TA Cloning Kit(인비트로젠사)나 In-Fusion HD Cloning Kit(클론텍사) 등의 시판중인 키트; pUC119(다카라바이오사), pUC18(다카라바이오사), pBR322(다카라바이오사), pBluescript SK+(스트라타진사), pYES2/CT(인비트로젠사) 등의 시판중인 플라스미드 벡터 DNA; λEMBL3(스트라타진사) 등의 시판중인 박테리오파지 벡터 DNA를 사용할 수 있다. 해당 재조합체 DNA(recombinant DNA)를 사용하여, 숙주 생물, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli), 바람직하게는 대장균 JM109주(다카라바이오사)나 대장균 DH5α주(다카라바이오사)를 형질 전환한다. 얻어진 형질 전환체에 포함되는 재조합체 DNA(recombinant DNA)를 QIAGEN Plasmid Mini Kit(퀴아젠사) 등을 사용하여 정제한다. 대량 생산함에 있어서, LDH 생산시키는 숙주는, LDH 유전자를 포함하는 재조합체 DNA(recombinant DNA)를 사용하여 형질 전환된 숙주 생물, 예를 들어, 대장균, 효모, 곰팡이 세포, 사상균 등을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 핵산을 갖는 숙주 세포, 그것을 배양하는 것을 포함하는, 유산 데히드로게나아제의 제조 방법에도 관련된다. 상기와 같이 하여 얻어진 안정성이 우수한 LDH의 생산능을 갖는 균주를 사용하여, 당해 LDH를 생산하는 데에는, 이 균주를 통상의 고체 배양법으로 배양해도 되지만, 가능한 한 액체 배양법을 채용하여 배양하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 균주를 배양하는 배지로서는, 예를 들어, 효모 엑기스, 트립톤, 펩톤, 육 엑기스, 옥수수 침지액 또는 대두 혹은 소맥 밀기울의 침출액 등의 1종 이상의 질소원에, 염화나트륨, 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 염화 제2철, 황산 제2철 또는 황산망간 등의 무기염류의 1종 이상을 첨가하고, 추가로 필요에 따라 당질 원료, 비타민 등을 적절히 첨가한 것이 사용된다.

또한, 배지의 초발 pH는, pH7 내지 9로 조정하는 것이 적당하다.

또한, 배양은 임의의 조건을 사용할 수 있지만, 예를 들어, 20 내지 42℃의 배양 온도, 바람직하게는 30℃ 전후의 배양 온도에서 4 내지 24시간, 더욱 바람직하게는 30℃ 전후의 배양 온도에서 8 내지 16시간, 통기 교반 심부 배양, 진탕 배양, 정치 배양 등에 의해 실시할 수 있다.

배양 종료 후, 해당 배양물로부터 LDH를 채취하는 데에는, 통상의 효소 채취 수단을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 통상의 방법에 의해 균체를, 초음파 파괴 처리, 마쇄 처리 등을 하거나, 또는 리소자임 등의 용균 효소를 사용하여 본 효소를 추출하거나, 또는 톨루엔 등의 존재 하에서 진탕 혹은 방치하여 용균을 행하게 하여, 본 효소를 균체 밖으로 배출시킬 수 있다. 그리고, 이 용액을 여과, 원심 분리하거나 하여 고형 부분을 제거하고, 필요에 따라 스트렙토마이신 황산염, 프로타민 황산염 또는 황산망간 등에 의해 핵산을 제거한 후, 이것에 황산암모늄, 알코올, 아세톤 등을 첨가하여 분획하고, 침전물을 채취하여, LDH의 보효소를 얻는다.

상기 LDH의 보효소로부터 추가로 LDH 정제 효소 표품을 얻는 데에는, 예를 들어, 세파덱스, 슈퍼덱스 혹은 울트로겔 등을 사용하는 겔 여과법; 이온 교환체를 사용하는 흡착 용출법; 폴리아크릴아미드겔 등을 사용하는 전기 영동법; 히드록시아파타이트를 사용하는 흡착 용출법; 자당 밀도 구배 원심법 등의 침강법; 친화성 크로마토그래피법; 분자체막 혹은 중공사막 등을 사용하는 분획법 등을 적절히 선택하거나, 또는 이들을 조합하여 실시함으로써, 정제된 LDH 효소 표품을 얻을 수 있다. 이렇게 하여, 원하는 안정성이 개선된 LDH를 얻을 수 있다.

본 발명의 유산 데히드로게나아제는, (A) 용액 중에서, 약 30 내지 37℃에서 10일간 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제; (B) 용액 중에서, 약 30 내지 37℃에서 3일간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제, 또는 (C) 용액 중에서 약 30~37℃에서 15시간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상 80 % 이상, 90 % 이상 또는 95 % 이상을 유지하는 플라빈 의존성 데히드로게나아제 일 수 있다. 또한, 본 발명의 유산 데히드로게나아제는, 사용에 제공하고 나서 15시간 후를 기점으로 해도, 70% 이상 활성을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제여도 된다.

LDH의 반응 용액에 사용할 수 있는 완충재(완충액)로서는, 예를 들어, 붕산 및/또는 그의 염을 포함하는 붕산 완충제, 트리스 염산 완충제, 인산 및/또는 그의 염을 포함하는 인산 완충제, 예를 들어 인산 칼륨 완충제 또는 인산나트륨 완충제, 유기산 완충제 및/또는 그의 염을 포함하는 유기산 완충제, 예를 들어 트리카르복실산 완충제 및/또는 그의 염을 포함하는 트리카르복실산 완충제, 예를 들어 시트르산 및/또는 그의 염을 포함하는 시트르산 완충제, 모노카르복실산 완충제 및/또는 그의 염을 포함하는 모노카르복실산 완충제, 예를 들어 아세트산 완충제 및/또는 그의 염을 포함하는 아세트산 완충제 등의 완충제를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 키트 등에 사용할 수 있는 완충제로서는, ACES(N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산), BES(N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산), Bicin(N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신), Bis-Tris(비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄), CHES(N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산), EPPS(4-(2-히드록시에틸)-1- 피페라진프로판술폰산), HEPES(4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄술폰산), HEPPSO(N-(히드록시에틸)피페라진-Ｎ'-2-히드록시프로판술폰산), MES(2-(N-모르폴리노)에탄술폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), MOPSO(2-히드록시-3-모르폴리노프로판술폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)), POPSO(피페라진-1,4-비스(2-히드록시프로판술폰산)), TAPS(N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산), TAPSO(3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판술폰산), TES(N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰산), 트리신(N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신) 및/또는 그들의 염 등을 포함하는 굿 완충제(Good's buffers)를 들 수 있다. LDH를 반응시키는 온도로서는, 20 내지 60℃이면 되고, 바람직하게는 30 내지 55℃의 범위 내이면 된다. LDH를 반응시키는 pH는 3 내지 10의 범위 내이면 되고, 바람직하게는 6 내지 10의 범위 내이면 된다.

실시예

이하, 실시예에 의해, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이하의 실시예는, 예시만을 의도한 것이며, 전혀 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것을 의도하는 것은 아니다. 특별히 언급하지 않는 한, 시약은, 시판되고 있거나, 또는 당 기술분야에서 관용의 방법, 공지 문헌의 수순에 따라 입수 또는 조제한다.

본 발명에 있어서, FMN-LDH의 열처리 후의 안정성 평가 및 각종 보존 조건 하에서의 안정성 시험의 평가는, 특별히 기재가 없는 한, 이하의 시험예의 방법에 따라 행하였다.

실시예 1

(1) 재조합체 플라스미드 pKK223-3-ScLDH DNA 및 pKK223-3-PkLDH DNA의 조제

Biochem. J. 258, 255-259(1989)에 기재되어 있는 바와 같이, Saccharomyces cereviciae 유래 유산 데히드로게나아제(ScLDH)의 아미노산 서열인 591 아미노산 중, 2 내지 85위의 아미노산을 제거한 서열 번호 1로 표시되는 506 아미노산을 코딩하는 서열 번호 2로 표시되는 1521bp의 유전자(종지 코돈 TAA를 포함함)를, 정법인 유전자 단편의 PCR에 의해, cDNA로서 취득하였다. 계속해서, Pichia kudriavzevii 유래 유산 데히드로게나아제(PkLDH)의 아미노산 서열인 서열 번호 3으로 표시되는 578 아미노산과 ScLDH를 비교하여, 2 내지 77위를 제거한 서열 번호 4로 표시되는 502 아미노산을 코딩하는, 서열 번호 5로 표시되는 1509bp의 유전자(종지 코돈 TAA를 포함함)를, 정법인 유전자 단편의 PCR에 의해, cDNA로서 취득하였다. 플라스미드 pKK223-3의 멀티클로닝 사이트에 대상 유전자인 ScLDH 유전자 혹은 PkLDH 유전자를 통상의 방법에 의해 삽입시킨 DNA 컨스트럭트를 제작하였다. 구체적으로는, pKK223-3의 멀티클로닝 사이트에 있는 In-Fusion Cloning Site에서, ScLDH 유전자 혹은 PkLDH 유전자를, In-Fusion HD Cloning Kit(클론텍사제)를 사용하여, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 연결하여, 발현용 플라스미드(pKK223-3-ScLDH 및 pKK223-3-PkLDH)를 얻었다. 또한 이들 플라스미드를 사용하여 대장균 JM109를 형질 전환하고, 대장균 JM109(pKK223-3-ScLDH)주와 대장균 JM109(pKK223-3-PkLDH)주를, 3ml의 LB-amp 배지[1％(w/v) 백토 트립톤, 0.5％(w/v) 펩톤, 0.5％(w/v) NaCl, 50μg/ml 암피실린]에 접종하여, 37℃에서 16시간 진탕 배양하여, 각각 배양물을 얻었다.

이들 배양물을 10,000×g로, 1분간 원심 분리함으로써 집균하여 균체를 얻었다. 이 균체로부터, GenElute Plasmid Miniprep Kit(Sigma-Aldrich사제)를 사용하여 재조합체 플라스미드 pKK223-3-ScLDH 및 pKK223-3-PkLDH를 추출하여 정제하여, 2.5μg의 재조합체 플라스미드 pKK223-3-ScLDH 및 pKK223-3-PkLDH DNA를 얻었다.

(2) LDH의 생산

pKK223-3-ScLDH를 형질 도입한 대장균 BL21(pKK223-3-ScLDH)주를, 최종 농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 3ml에 있어서, 25℃에서 24시간 배양하였다. 마찬가지로 하여, pKK223-3-PkLDH를 형질 도입한 대장균 BL21(pKK223-3-PkLDH)주를, 최종 농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 3ml에 있어서, 37℃에서 24시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM의 인산 칼륨 완충액(pH7.5)으로 세정한 후, 동 완충액에 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심 분리하여, ScLDH 또는 PkLDH를 포함하는 보효소액 0.6ml를 조제하였다.

(3) LDH의 활성 측정

상술한 ScLDH 또는 PkLDH를 포함하는 보효소액을 사용하여, 하기의 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해, L-유산에 대한 산화 활성을 측정하였다. 본 발명의 LDH는, L-유산을 산화하여 피루브산을 생성하는 반응을 촉매한다. 이를 편의상, LDH 활성이라고 칭하는 경우가 있다.

본 발명의 PkLDH의 LDH 활성은, 이 작용 원리를 이용하여, 예를 들어, 전자 수용체로서 페리시안화 칼륨을 사용한 이하의 측정계를 사용하여 측정할 수 있다.

(반응) L-유산 + 페리시안화 칼륨

→ 피루브산+페로시안화 칼륨

상기의 「페리시안화 칼륨」의 소실 정도를 파장 420nm에 있어서의 흡광도의 변화량으로서 검지하고, 이 변화량에 기초하여 효소 활성을 구할 수 있다.

구체적으로는, LDH 활성은, 이하의 수순에 따라 측정할 수 있다. 1M 인산 칼륨 완충액(pH7.5) 0.15mL, 0.1M L-유산 용액 0.15mL 및 30mM 페리시안화 칼륨 용액 0.075mL, 초순수 1.075mL를 혼합하여, 30℃에서 5분간 보온한다. 이어서, 효소 샘플 용액 0.05mL를 첨가하여, 반응을 개시한다. 반응 개시 시, 및 경시적인 흡광도를 측정하고, 효소 반응의 진행에 수반되는 420nm에 있어서의 흡광도의 1분간당 감소량(ΔA420)을 구하고, 다음 식을 따라 LDH 활성을 산출한다. 이때, LDH 활성은, 30℃에서 농도 10mM의 L-유산 존재 하에서 1분간에 1㎛ol의 페리시안화 칼륨을 환원하는 효소량을 1U라고 정의한다.

또한, 식 중의 1.5는 반응 시약+효소 시약의 액량(mL), 1.01은 본 활성 측정 조건에 있어서의 밀리몰 분자 흡광 계수(cm²/㎛ol), 0.05는 효소 용액의 액량(mL), 1.0은 셀의 광로 길이(cm), ΔA420blank는 10mM 인산 완충액(pH7.5)을 효소 샘플 용액 대신에 첨가하여 반응 개시한 경우의 420nm에 있어서의 흡광도의 1분간당 감소량, df는 희석배수를 나타낸다.

실시예 2

(온도 안정성)

최종 농도로서 0.07％ BSA를 포함하는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH6.0)이 되도록 상기의 보효소액을 희석하여, 온도 안정성을 조사하였다. 구체적으로는, 실시예 1의 (2)에서 조제한 LDH 효소액을 6U/ml가 되도록 희석하여, 각 온도(35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃)에서 10분간 처리한 후, LDH 활성을 측정하고, 처리 전의 LDH 활성과 비교하여 잔존 활성율을 측정하였다. 또한, 비교를 위해, ScLDH에 대해서도 마찬가지의 시험을 행하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.

결과로부터, ScLDH는, 45℃에서 불안정하지만, PkLDH는, 55℃ 열처리 후에도 안정적인 것을 알 수 있었다.

계속해서, 37℃에서의 장기 안정성을 조사하였다. 구체적으로는, 상기와 마찬가지로 LDH 효소액을, 온도 안정성의 시험과 마찬가지로 완충액으로 6U/ml가 되도록 희석하여, 각 시간 보존하였다. 그 후, 각 시간 경과 후의 잔존 활성율을 측정하였다. 또한, 비교를 위해, ScLDH에 대해서도 마찬가지의 시험을 행하였다. 결과를 도 3의 (A 및 B)에 나타낸다. 도 3의 A는, 경과 시간이 제로 시간일 때의 잔존 활성율을 100％로 한 각 시간 경과 후의 잔존율의 그래프이다. 이에 의해, 어느 정도(본 실시예에서는 37℃)로 가온된 PkLDH는, 보존 중의 일정 기간까지 잔존 활성율이 향상되는 것을 알 수 있었다(도 3의 A). 도 3의 B는, 보존 개시로부터 15시간을 기준 시간으로 한 경우에, 기준 시간에 있어서의 활성율을 100％로 한 각 시간 경과 후의 잔존 활성율의 그래프이다. PkLDH는, 보존 개시로부터 245시간 경과 후(기준 시간으로부터 230시간 후)에도 99％의 활성을 유지하고 있고, 15시간 경과 후부터는, 잔존 활성율은 일정해지고, 37℃에서 약 10일간 보존해도 실활되지 않고, 매우 안정적이었다(도 3의 B). 한편, ScLDH는, 보존 개시로부터 잔존 활성율이 현저하게 저하되기 시작하여, 21시간 후(기준 시간으로부터 6시간 후)의 활성 잔존율은 62％, 65시간 후(기준 시간으로부터 50시간 후)의 활성 잔존율은 0％가 되어, 불안정하였다. 또한, ScLDH의 효소량을 20U/ml가 되도록 하여 평가해도 안정성이 크게 향상되는 일은 없었다.

실시예 3

(효소의 정제)

실시예 1의 (2)에서 얻어진 PkLDH의 보효소액을 20mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5)으로 평형화한 1ml의 Q Sepharose Fast Flow 수지(GE 헬스케어사제)에 제공하여, 수지에 흡착시켰다. 동 완충액으로 수지에 흡착되지 않은 단백질을 용출시켰다. 계속해서, 50mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5), 200mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5)을 사용하여, 세정하였다. 다음으로 500mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5)을 사용하여, 흡착된 PkLDH를 용출하였다. 얻어진 PkLDH의 보효소액을, 150mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5)으로 평형화한 HiLoad 26/10 Q Sepharose HP 칼럼(GE 헬스케어사제)에 제공하고, 1칼럼 분의 체적 완충액을 흘려, 목적 단백질을 포함하는 획분을 회수하였다.

또한 회수한 효소액을 10mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5)으로 투석하고, 동 완충액으로 평형화한 Hiscreen Capto Q칼럼(GE 헬스케어사제)에 흡착시키고, 다음으로 500mM NaCl/10mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5)까지 그래디언트로 점차 NaCl 농도를 높임으로써 수지에 흡착되어 있던 PkLDH를 용출시켜 회수하였다.

얻어진 획분을 SDS-PAGE에 의해 분석하여, 다른 협잡 단백질을 포함하지 않는 순도까지 정제되어 있는 것을 확인하고, PkLDH의 정제 표품으로 하였다. 또한, 열 안정성에 대해서는, 보효소액과 동등하였다.

실시예 4

(pH 안정성)

실시예 3에서 얻어진 정제 PkLDH 효소액(10U/mL)을 사용하여, pH 안정성을 조사하였다. 100mM 인산 칼륨 완충액(pH6.0-pH7.5)을 사용하여, 55℃, 15분간의 열처리 후, 각 완충액 중에서 효소를 유지하고, 이 각각의 효소를 사용하는 것 외에는 실시예 1의 (3)에 기재된 활성 측정법에 따라, 활성을 측정하였다. 처리 후의 활성 값에 있어서 가장 활성이 높았던 조건을 100％로 하고, 기타의 조건에 있어서의 활성 값에 대하여 상대값을 구하였다. 결과를 도 7에 나타낸다. 그 결과, pH6.5에 있어서 가장 안정적이고, 이어서 pH6.0에 있어서 92％의 상대 활성(％)이었다.

(최적 활성 pH)

실시예 3에서 얻어진 정제 PkLDH 효소액(10U/mL)을 사용하여, 최적 활성 pH를 조사하였다. 100mM 인산 칼륨 완충액(pH6.0-pH7.5)을 사용하여, 각각의 pH에 있어서, 온도 30℃에서 효소 반응을 행하여, 상대 활성(％)을 비교하였다. 결과를 도 8에 나타낸다. 그 결과, 본 발명의 FMN 의존성 유산 데히드로게나아제의 최적 활성 pH는, pH6.5 내지 7.5의 범위에서 가장 높은 활성이 나타났다. 또한, pH8.0에 있어서도 양호한 활성을 유지하고 있을 가능성은 있는 것으로 생각된다.

(L-유산의 정량)

실시예 3에서 얻어진 정제 PkLDH 효소액(17U/ml)을 사용하여, 0.2 내지 5mM의 L-유산을 측정하였다. 결과를 도 9에 나타낸다. 그 결과, 유산 농도 의존적으로 420nm에 있어서의 1분간당 흡광도 변화량이 향상되어, L-유산을 정량할 수 있는 것으로 나타났다.

(옥시다아제 활성)

국제 공개 2015/020200에 기재된 활성 측정 방법을 참조하여, 효소로서 PkLDH, 기질로서 최종 농도 10mM의 L-유산이 되도록 하고, 측정 pH를 7.5로 하여 활성 측정을 행하였다. 옥시다아제 활성은, 농도 10mM의 기질 존재 하에서 1분간에 1㎛ol의 과산화수소를 생성하는 효소량을 1unit(U)이라고 정의하였다. 사용하는 효소량은, 데히드로게나아제 활성으로서 600U/ml를 나타내는 양으로 하였다. 그 결과, PkLDH의 옥시다아제 활성은 검출되지 않았다. 따라서, PkLDH는 산소를 전자 수용체로 하지 않는 효소였다.

실시예 5

(인쇄 전극에 의한 L-유산의 정량)

실시예 3에서 얻어진 정제 PkLDH 효소액을 사용하여, 인쇄 전극 측정에 의한 L-유산의 정량을 행한다. 구체적으로는, 카본의 작용 전극, 은의 참조 전극이 인쇄되어 이루어지는, SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens사제, 제품 번호 DRP-110)를 전용 커넥터(DropSens사제, DRP-CAC)를 사용하여, ALS 전기 화학 애널라이저 814D(BAS사제)에 접속하고, PkLDH 효소액 5μl, 1.5M의 염화칼륨을 함유한 100mM의 인산 칼륨 완충액(pH7.5) 20μl, 페리시안화 칼륨 수용액 25μl를 전극 상에 올려놓는다. 그리고, +400mV(v.s. Ag/AgCl)의 전압을 인가하여, 소정 농도의 유산 용액 5μL를 각각 전극 상에 올려놓고 반응을 행하여, 120초 후의 전류값을 측정한다. 그 결과, 유산을 전기 화학적 측정에 있어서도 정량할 수 있다.

실시예 6

(4) 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CaLDH DNA 및 pKK223-3-OgLDH DNA의 조제와 각 LDH의 생산

Candida inconspicua 유래 유산 데히드로게나아제(CaLDH)의 아미노산 서열인 서열 번호 6으로 표시되는 571 아미노산 중, 2 내지 67위를 제거한 서열 번호 7로 표시되는 505 아미노산을 코딩하는, 서열 번호 8로 표시되는 1518bp의 유전자(종지 코돈 TAA를 포함함)를, 정법인 유전자 단편의 PCR에 의해, cDNA로서 취득하였다. 마찬가지로 하여, Ogataea parapolymorpha 유래 유산 데히드로게나아제(OgLDH)의 아미노산 서열인 서열 번호 9로 표시되는 558 아미노산 중, 2 내지 56위를 제거한 서열 번호 10으로 표시되는 503 아미노산을 코딩하는, 서열 번호 11로 표시되는 1512bp의 유전자(종지 코돈 TAA를 포함함)를, 정법인 유전자 단편의 PCR에 의해, cDNA로서 취득하였다. 실시예 1과 마찬가지로 하여, 플라스미드 pKK223-3의 멀티클로닝 사이트에 대상 유전자인 CaLDH 유전자 혹은 OgLDH 유전자를 통상의 방법에 의해 삽입시킨 DNA 컨스트럭트를 제작하여, 발현용 플라스미드(pKK223-3-CaLDH 및 pKK223-3-OgLDH)를 얻었다.

pKK223-3-CaLDH를 형질 도입한 대장균 BL21(pKK223-3-CaLDH)주 및 pKK223-3-OgLDH를 형질 도입한 대장균 BL21(pKK223-3-OgLDH)주를, 최종 농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 3ml에 있어서, 30℃에서 24시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM의 인산 칼륨 완충액(pH7.5)으로 세정한 후, 동 완충액에 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심 분리하여, CaLDH 또는 OgLDH를 포함하는 보효소액 0.6ml를 조제하였다.

실시예 7

(온도 안정성)

실시예 2와 마찬가지로, 37℃에서의 장기 안정성을 조사하였다. 단, 최종 농도로서 0.07％ BSA를 포함하는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH6.0), CaLDH 또는 OgLDH를 약 20U/ml가 되도록 희석하여, 각 시간 보존하였다. 그 후, 각 시간 경과 후의 잔존 활성율을 측정하였다. 결과를 도 3의 (A)에 나타낸다. CaLDH는, 보존 개시로부터 140시간 경과 후에도 72％의 활성을 유지하고 있고, OgLDH는, 보존 개시로부터 140시간 경과 후에도 77％의 활성을 유지하고 있어, ScLDH와 비교하여 매우 안정적이었다.

(pH 안정성)

PkLDH와 마찬가지의 방법으로, CaLDH와 OgLDH의 정제를 행하였다. 얻어진 정제 효소액(10U/mL)을 사용하여, pH 안정성을 조사하였다. 그 결과, CaLDH와 OgLDH는 모두 pH6.5에 있어서 가장 안정적이고, pH6.0 내지 7.0의 범위에 있어서 80％ 이상의 상대 활성(％)을 나타내었다.

(옥시다아제 활성)

CaLDH와 OgLDH의 옥시다아제 활성 측정을 행한 바, 모두 옥시다아제 활성은 검출되지 않았다. 따라서, CaLDH와 OgLDH는 산소를 전자 수용체로 하지 않는 효소였다.

실시예 8

(5) 재조합체 플라스미드 pKK223-3-ThLDH DNA의 조제와 각 LDH의 생산

Thermothelomyces thermophilus 유래 유산 데히드로게나아제(ThLDH)의 아미노산 서열인 서열 번호 12로 표시되는 499 아미노산을 코딩하는, 서열 번호 13으로 표시되는 1500bp의 유전자(종지 코돈 TAA를 포함함)를, 정법인 유전자 단편의 PCR에 의해, cDNA로서 취득하였다. 실시예 1과 마찬가지로 하여, 플라스미드 pKK223-3의 멀티클로닝 사이트에 대상 유전자인 ThLDH 유전자를 통상의 방법에 의해 삽입시킨 DNA 컨스트럭트를 제작하여, 발현용 플라스미드(pKK223-3-ThLDH)를 얻었다.

pKK223-3-ThLDH를 형질 도입한 대장균 BL21(pKK223-3-ThLDH)주를, 최종 농도 1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 3ml에 있어서, 30℃에서 24시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM의 인산 칼륨 완충액(pH7.5)으로 세정한 후, 동 완충액에 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심 분리하여, ThLDH를 포함하는 보효소액 0.6ml를 조제하였다.

실시예 9

(온도 안정성)

실시예 2와 마찬가지로, 37℃에서의 장기 안정성을 조사하였다. 최종 농도로서 0.07％ BSA를 포함하는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH6.0), ThLDH를 약 20U/ml가 되도록 희석하여, 각 시간 보존하였다. 그 후, 각 시간 경과 후의 잔존 활성율을 측정하였다. ThLDH는, 보존 개시로부터 89시간 경과 후에도 74％의 활성을 유지하고 있어, ScLDH와 비교하여 매우 안정적이었다. 즉, ThLDH는, 37℃에서 적어도 3일간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 70％ 이상을 유지하고 있다고 할 수 있다.

실시예 10

(6) PkLDH 변이체의 제작

PkLDH의 N 말단 영역을 추가로 삭제한 변이체의 구축을 행하였다. 먼저, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 95위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-96)를 제작하기 위해, 실시예 1에서 얻은 재조합체 플라스미드 pKK223-3-PkLDH를 주형으로 하여, 서열 번호 14, 15의 합성 올리고뉴클레오티드, KOD One PCR Master Mix(도요보사제)를 사용하여, 이하의 조건에서 PCR 반응을 행하였다. 즉, KOD One PCR Master Mix를 10μl, 주형이 되는 pKK223-3-PkLDH를 20ng, 상기 합성 올리고뉴클레오티드를 각각 6pmol 첨가하여, 멸균수에 의해 전량을 20μl로 하였다. 조제한 반응액을, 서멀 사이클러(Bio-Rad사제)를 사용하여, 「98℃, 10초」 - 「55℃, 5초」 - 「68℃, 35초」의 사이클을 7회 반복하였다.

얻어진 PCR 산물을 포함하는 용액에, 제한 효소 DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS사제)을 1μl 첨가하여 혼합하고, 37℃에서 30분 처리하여, 잔존하고 있는 주형DNA를 절단하였다. 계속해서, 얻어진 DpnI 처리액을 2μl, 멸균수를 7μl, Ligation high(도요보사제)를 5μl, T4 Polynucleotide Kinase(도요보사제)를 1μl, 이온 교환수를 7μl 혼합하여, 16℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 사용하여, 대장균 JM109를 형질 전환하여, LB-amp 한천 배지에 전개하였다. 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 재조합체 플라스미드를 추출하여 정제하여, DNA2.5μg를 얻었다. 해당 플라스미드 중의 PkLDH-96을 코딩하는 DNA의 염기 서열을, 멀티 모세관 DNA 해석 시스템 Applied Biosystems 3130xl 제네틱 애널라이저(Life Technologies사제)를 사용하여 결정하고, 그 결과, PkLDH-96을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

마찬가지로 하여, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 96위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-97)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 16의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 97위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-98)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 17의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 98위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-99)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 18의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 99위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-100)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 19의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 100위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-101)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 20의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 101위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-102)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 21의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 102위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-103)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 22의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 103위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-104)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 23의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 75위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-76)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 50의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 83위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-84)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 51의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 91위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-92)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 52의 합성 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 109위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-110)를 제작하기 위해, 서열 번호 14, 53의 합성 올리고뉴클레오티드를 각각 사용하여 PCR을 행하여, PkLDH-76 내지 PkLDH-110을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, pKK223-3-PkLDH를 주형으로 하여, 서열 번호 24, 25, 26, 27의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하였다. 구체적으로는, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-PkLDH를 주형으로 하여, 서열 번호 24, 25의 합성 올리고뉴클레오티드, KOD One PCR Master Mix(도요보사제)를 사용하여, 이하의 조건에서 PCR 반응을 행하였다. 즉, KOD One PCR Master Mix를 10μl, 주형이 되는 pKK223-3-PkLDH를 20ng, 상기 합성 올리고뉴클레오티드를 각각 6pmol 첨가하여, 멸균수에 의해 전량을 20μl로 하였다. 조제한 반응액을, 서멀 사이클러(Bio-Rad사제)를 사용하여, 「98℃, 10초」 - 「55℃, 5초」 - 「68℃, 35초」의 사이클을 15회 반복하였다. 얻어진 PCR 산물을 제한 효소 DpnI로 처리하여, 잔존하고 있는 주형DNA를 절단한 후, 대장균 JM109를 형질 전환하여, LB-amp 한천 배지에 전개하였다. 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 재조합체 플라스미드를 추출하여 정제하여, DNA2.5μg를 얻었다. 해당 플라스미드 중의 PkLDH 변이체를 코딩하는 DNA의 염기 서열을, 멀티 모세관 DNA 해석 시스템 Applied Biosystems 3130xl 제네틱 애널라이저(Life Technologies사제)를 사용하여 결정하였다. 마찬가지로 하여, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-PkLDH/L386R을 주형으로 하여, 서열 번호 26, 27의 합성 올리고뉴클레오티드, KOD One PCR Master Mix(도요보사제)를 사용하여, 마찬가지의 조건에서 PCR 반응을 행하여, DNA2.5μg를 얻었다. 해당 플라스미드 중의 PkLDH 변이체를 코딩하는 DNA의 염기 서열을, 멀티 모세관 DNA 해석 시스템 Applied Biosystems 3130xl 제네틱 애널라이저(Life Technologies사제)를 사용하여 결정하고, 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 386위의 류신을 아르기닌으로, 461위의 트레오닌을 아르기닌으로, 및 464위의 아스파르트산을 아르기닌으로 치환한 변이체인 PkLDH/L386R/T461R/D464R을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다. 또한, 예를 들어 「L386R/T461R/D464R」은 서열 번호 4의 아미노산 서열 386위의 류신을 아르기닌으로, 461위의 트레오닌을 아르기닌으로, 및 464위의 아스파르트산을 아르기닌으로 각각 치환하는 것을 의미하고, 또한 「/」 기호는 각각의 치환을 모두 갖는 것을 의미한다.

또한, pKK223-3-PkLDH를 주형으로 하여, 서열 번호 28, 29의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 161위의 페닐알라닌을 류신으로 치환한 변이체인 PkLDH/F161L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, pKK223-3-PkLDH를 주형으로 하여, 서열 번호 30, 31의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 187위의 페닐알라닌을 류신으로 치환한 변이체인 PkLDH/F187L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, pKK223-3-PkLDH를 주형으로 하여, 서열 번호 32, 33의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 428위의 페닐알라닌을 류신으로 치환한 변이체인 PkLDH/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, pKK223-3-PkLDH-97을 주형으로 하여, 서열 번호 32, 33의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, PkLDH-97에 있어서의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 428위에 대응하는 위치의 페닐알라닌을 류신으로 치환한 변이체인 PkLDH-97/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, PkLDH-97/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 34, 35의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, PkLDH-97/F428L에 있어서의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 194위에 대응하는 위치의 류신을 알라닌으로 치환한 변이체인 PkLDH-97/F428L/L194A를 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, PkLDH-97/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 36, 37의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, PkLDH-97/F428L에 있어서의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 222위에 대응하는 위치의 류신을 티로신으로 치환한 변이체인 PkLDH-97/F428L/L222Y를 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, PkLDH-97/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 38, 39의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, PkLDH-97/F428L에 있어서의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 274위에 대응하는 위치의 알라닌을 세린으로 치환한 변이체인 PkLDH-97/F428L/A274S를 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, PkLDH-97/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 40, 41의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, PkLDH-97/F428L에 있어서의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 277위에 대응하는 위치의 류신을 세린으로 치환한 변이체인 PkLDH-97/F428L/L277S를 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, PkLDH-97/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 42, 43의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, PkLDH-97/F428L에 있어서의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 313위에 대응하는 위치의 페닐알라닌을 알라닌으로 치환한 변이체인 PkLDH-97/F428L/F313A를 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, PkLDH-97/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 44, 45의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하여, PkLDH-97/F428L에 있어서의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열 314위에 대응하는 위치의 이소류신을 세린으로 치환한 변이체인 PkLDH-97/F428L/I314S를 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, PkLDH-97을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 제작했을 때와 마찬가지로, 서열 번호 4에 있어서의 2위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-3/F428L)을 제작하기 위해, PkLDH/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 14, 54의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, 그 결과, PkLDH-3/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 3위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-4/F428L)을 제작하기 위해, PkLDH/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 14, 55의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, 그 결과, PkLDH-4/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 4위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-5/F428L)을 제작하기 위해, PkLDH/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 14, 56의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, 그 결과, PkLDH-4/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 5위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-6/F428L)을 제작하기 위해, PkLDH/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 14, 57의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, 그 결과, PkLDH-6/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 6위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-7/F428L)을 제작하기 위해, PkLDH/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 14, 58의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, 그 결과, PkLDH-7/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 7위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-8/F428L)을 제작하기 위해, PkLDH/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 14, 59의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, 그 결과, PkLDH-8/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 8위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-9/F428L)을 제작하기 위해, PkLDH/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 14, 60의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, 그 결과, PkLDH-9/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 9위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-10/F428L)을 제작하기 위해, PkLDH/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 14, 61의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, 그 결과, PkLDH-10/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

또한, 서열 번호 4에 있어서의 2 내지 10위의 아미노산을 결실시킨 변이체(PkLDH-11/F428L)을 제작하기 위해, PkLDH/F428L을 주형으로 하여, 서열 번호 14, 62의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, 그 결과, PkLDH-11/F428L을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 얻었다.

얻어진 각종 PkLDH 변이체를 코딩하는 플라스미드를 형질 도입한 대장균 BL21주를, 최종 농도 1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 3ml에 있어서, 30℃에서 24시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM의 인산 칼륨 완충액(pH7.5)으로 세정한 후, 동 완충액에 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심 분리하여, 각종 PkLDH 변이체를 포함하는 보효소액 0.6ml를 조제하였다. 또한, N 말단을 삭제한 13종류의 변이체(PkLDH-76 내지 PkLDH-110)에 대하여, PkLDH 야생형과 비교하여, 보효소액의 활성은 0.3배 내지 6배였다. 또한, N 말단을 삭제한 9종류의 변이체(PkLDH-3/F428L 내지 PkLDH-11/F428L)에 대하여, PkLDH/F428L과 비교하여, 보효소액의 활성은 2배 내지 11배였다.

실시예 11

(온도 안정성)

최종 농도로서 0.15％ BSA를 포함하는 150mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5)이 되도록 실시예 10에서 제작한 보효소액(PkLDH-96 내지 PkLDH-104)을 희석하여, 온도 안정성을 조사하였다. 구체적으로는, 실시예 10에서 조제한 N 말단 삭제 변이체인 LDH 효소액을 6U/ml가 되도록 희석하여, 55℃에서 15분간 처리한 후, LDH 활성을 측정하고, 처리 전의 LDH 활성과 비교하여 잔존 활성율을 측정하였다. 또한, 비교를 위해, PkLDH에 대해서도 마찬가지의 시험을 행하였다. 결과를 도 12에 나타낸다. PkLDH-96 내지 PkLDH-104는 모두 PkLDH보다도 잔존 활성율이 높고, 열 안정성이 높은 것을 알 수 있었다. 또한, 기타의 N 말단 삭제 변이체(PkLDH-76, PkLDH-84, PkLDH-92, PkLDH-110, PkLDH-3/F428L, PkLDH-4/F428L, PkLDH-5/F428L, PkLDH-6/F428L, PkLDH-7/F428L, PkLDH-8/F428L, PkLDH-9/F428L, PkLDH-10/F428L, PkLDH-11/F428L)에 대하여, 마찬가지로 하여 50℃에서 15분간 처리하였다. 계속해서, LDH 활성 측정용 시약으로서, 최종 농도 0.09mM의 2,6-디클로로인도페놀(DCIP), 최종 농도 0.5mM의 페나진메토술페이트(PMS), 최종 농도 10mM의 L-유산 및 최종 농도 100mM의 인산 칼륨 완충액(pH7.5)을 준비하였다. 96 웰 플레이트 중에, 열처리 후의 효소액을 5μL, LDH 활성 측정용 시약을 145μL 첨가하여, 37℃에서 5분간, 인큐베이트한 바, 명백하게 활성 측정 시약의 색이 황색으로 변화하였다. 따라서, 50℃의 열처리로 완전히 실활되는 ScLDH와 비교하여, 이들 변이체는 안정성이 높은 것을 알 수 있었다.

계속해서, 최종 농도로서 0.15％ BSA를 포함하는 150mM 인산 칼륨 완충액(pH7.5)이 되도록 실시예 10에서 제작한 보효소액(PkLDH/F161L, PkLDH/F187L, PkLDH/F428L)을 희석하여, 온도 안정성을 조사하였다. 구체적으로는, 실시예 10에서 조제한 일 치환 변이 LDH 효소액을 6U/ml가 되도록 희석하여, 55℃에서 15분간 처리한 후, LDH 활성을 측정하고, 처리 전의 LDH 활성과 비교하여 잔존 활성율을 측정하였다. 또한, 비교를 위해, PkLDH에 대해서도 마찬가지의 시험을 행하였다. 결과를 도 13에 나타낸다. PkLDH/F161L, PkLDH/F187L, PkLDH/F428L은 모두 PkLDH보다도 잔존 활성율이 높고, 열 안정성이 높은 것을 알 수 있었다.

또한, 실시예 10에서 제작한 보효소액(PkLDH-97/F428L/L194A, PkLDH-97/F428L/L222Y, PkLDH-97/F428L/A274S, PkLDH-97/F428L/L277S, PkLDH-97/F428L/F313A, PkLDH-97/F428L/I314S)을 사용하여, 50℃에서 15분간 처리하였다. 계속해서, LDH 활성 측정용 시약으로서, 상기의 DCIP 및 PMS에 의한 계를 사용하여, 열처리 후의 효소액을 5μL, LDH 활성 측정용 시약을 145μL 첨가하여, 37℃에서 5분간, 인큐베이트한 바, 명백하게 활성 측정 시약의 색이 황색으로 변화하였다. 따라서, 50℃의 열처리로 완전히 실활되는 ScLDH와 비교하여, 이들 변이체는 안정성이 높은 것을 알 수 있었다. 또한, PMS 대신에, 1-메톡시 페나진메토술페이트를 사용하여 마찬가지로 활성 측정을 행해도 마찬가지의 결과였다.

다음으로, 실시예 2와 마찬가지로, 37℃에서의 장기 안정성을 조사하였다. 최종 농도로서 0.07％ BSA를 포함하는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH6.0), 각종 LDH 변이체(PkLDH-96, PkLDH-97, PkLDH-104, PkLDH/L386R/T461R/D464R, PkLDH/F428L)를 약 20U/ml가 되도록 희석하여, 각 시간 보존하였다. 그 결과, PkLDH-96은, 보존 개시로부터 89시간 경과 후에도 95％의 활성을 유지하고 있고, PkLDH-97은, 보존 개시로부터 43시간 경과 후에 114％, 72시간 경과 후에 114％, 171시간 경과 후에도 111％의 활성을 유지하고 있고, PkLDH-104는, 보존 개시로부터 43시간 경과 후에 97％, 72시간 경과 후에 99％, 171시간 경과 후에도 88％의 활성을 유지하고 있고, PkLDH/L386R/T461R/D464R은, 보존 개시로부터 89시간 경과 후에도 96％의 활성을 유지하고 있고, PkLDH/F428L은, 43시간 경과 후에 99％, 72시간 경과 후에 107％, 171시간 경과 후에도 94％의 활성을 유지하고 있어, ScLDH와 비교하여 매우 안정적이었다. 즉, 이들 변이체는, 37℃에서 적어도 3일간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 70％ 이상을 유지하고 있다고 할 수 있다. 또한, PkLDH-98, PkLDH-99, PkLDH-100, PkLDH-101, PkLDH-102, PkLDH-103, PkLDH/F161L 및 PkLDH/F187L에 대해서도, PkLDH와 비교하여 55℃에서의 열 안정성이 높다는 점에서, 37℃에서의 장기 안정성에 있어서도 ScLDH와 비교하여 매우 안정적일 개연성이 높다.

실시예 12

(PkLDH 고정화 전극에 의한 L-유산의 정량)

실시예 3에서 얻어진 정제 PkLDH 효소액을 고정화한 전극을 사용하여 L-유산의 정량을 행하였다. 구체적으로는, 카본의 작용 전극이 인쇄되어 이루어지는, SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens사제, 제품 번호 DRP-C110)의 작용 전극 상에 12U분의 PkLDH를 도포·건조시켰다. 계속해서, 2％의 폴리(에틸렌글리콜)디글리시딜에테르(Mn: 6000, 시그마사제)를 3μL 도포하여, 4℃에서 22시간 반응시켰다. 초순수로 세정하고, PkLDH 고정화 전극으로 하였다. 전용 커넥터(DropSens사제, DRP-CAC)를 사용하여, ALS 전기 화학 애널라이저 814D(BAS사제)에 접속하고, 또한 은염화은 참조 전극과 백금 전극과 접속하고, 0.1mg/ml의 Bindschedler's Green Leuco Base(도쿄 카세이사제)를 함유한 PBS(pH7.4) 10ml 중에 3개의 전극을 침지시켰다. +200mV(vs Ag/AgCl)를 인가하여, 일정 시간마다 L-유산 용액을 첨가했을 때의 응답 전류값을 기록하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다. 1 내지 7mM의 L-유산을 첨가했을 때, 유산 농도 의존적으로 응답 전류가 증가하는 것으로 나타나, L-유산을 정량할 수 있었다.

본 발명의 검체에 FMN-LDH를 작용시키기 위한 작용부와, FMN-LDH를 작용시킨 검체의 상태를 감지하는 센서를 포함하는, 검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스, 및 그것을 사용한 검체의 상태를 평가하기 위한 방법에 따르면, 인간 및 비인간 생물의 간질액, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 피부, 근육, 안구, 각막, 위액, 음식품, 양조물, 화성품, 물, 토양을 포함하는 유산 함유 조성물 중의 유산을 장기에 걸쳐 안정적으로, 고정밀도로 간편하게 측정할 수 있으므로, 사람이나 동물의 건강 관리, 혹은, 음식품이나 양조물, 화성품 등의 제조 공정 관리, 품질 관리 등에 있어서 유용하다.

1: 작용극
3: 대향 전극
5: 참조극
7: 배선부
9: 단자
10: 센서 칩
11: 기반
13: 스페이서
15: 커버
19: 반응층
100: 측정부
101: 제어부
102: 온도 센서
103: 기억부
104: 통신부
105: 전지
106: 측정 장치

SEQUENCE LISTING <110> Kikkoman Corporation <120> A device to evaluate a condition of subject, a system comprising it, a method for evaluating a condition of subject and lactate dehydrogenase <130> FP4657PCT <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 506 <212> PRT <213> enzyme <400> 1 Met Asn Lys Gln Lys Ile Ser Pro Ala Glu Val Ala Lys His Asn Lys 1 5 10 15 Pro Asp Asp Cys Trp Val Val Ile Asn Gly Tyr Val Tyr Asp Leu Thr 20 25 30 Arg Phe Leu Pro Asn His Pro Gly Gly Gln Asp Val Ile Lys Phe Asn 35 40 45 Ala Gly Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Glu Pro Leu His Ala Pro Asn 50 55 60 Val Ile Asp Lys Tyr Ile Ala Pro Glu Lys Lys Leu Gly Pro Leu Gln 65 70 75 80 Gly Ser Met Pro Pro Glu Leu Val Cys Pro Pro Tyr Ala Pro Gly Glu 85 90 95 Thr Lys Glu Asp Ile Ala Arg Lys Glu Gln Leu Lys Ser Leu Leu Pro 100 105 110 Pro Leu Asp Asn Ile Ile Asn Leu Tyr Asp Phe Glu Tyr Leu Ala Ser 115 120 125 Gln Thr Leu Thr Lys Gln Ala Trp Ala Tyr Tyr Ser Ser Gly Ala Asn 130 135 140 Asp Glu Val Thr His Arg Glu Asn His Asn Ala Tyr His Arg Ile Phe 145 150 155 160 Phe Lys Pro Lys Ile Leu Val Asp Val Arg Lys Val Asp Ile Ser Thr 165 170 175 Asp Met Leu Gly Ser His Val Asp Val Pro Phe Tyr Val Ser Ala Thr 180 185 190 Ala Leu Cys Lys Leu Gly Asn Pro Leu Glu Gly Glu Lys Asp Val Ala 195 200 205 Arg Gly Cys Gly Gln Gly Val Thr Lys Val Pro Gln Met Ile Ser Thr 210 215 220 Leu Ala Ser Cys Ser Pro Glu Glu Ile Ile Glu Ala Ala Pro Ser Asp 225 230 235 240 Lys Gln Ile Gln Trp Tyr Gln Leu Tyr Val Asn Ser Asp Arg Lys Ile 245 250 255 Thr Asp Asp Leu Val Lys Asn Val Glu Lys Leu Gly Val Lys Ala Leu 260 265 270 Phe Val Thr Val Asp Ala Pro Ser Leu Gly Gln Arg Glu Lys Asp Met 275 280 285 Lys Leu Lys Phe Ser Asn Thr Lys Ala Gly Pro Lys Ala Met Lys Lys 290 295 300 Thr Asn Val Glu Glu Ser Gln Gly Ala Ser Arg Ala Leu Ser Lys Phe 305 310 315 320 Ile Asp Pro Ser Leu Thr Trp Lys Asp Ile Glu Glu Leu Lys Lys Lys 325 330 335 Thr Lys Leu Pro Ile Val Ile Lys Gly Val Gln Arg Thr Glu Asp Val 340 345 350 Ile Lys Ala Ala Glu Ile Gly Val Ser Gly Val Val Leu Ser Asn His 355 360 365 Gly Gly Arg Gln Leu Asp Phe Ser Arg Ala Pro Ile Glu Val Leu Ala 370 375 380 Glu Thr Met Pro Ile Leu Glu Gln Arg Asn Leu Lys Asp Lys Leu Glu 385 390 395 400 Val Phe Val Asp Gly Gly Val Arg Arg Gly Thr Asp Val Leu Lys Ala 405 410 415 Leu Cys Leu Gly Ala Lys Gly Val Gly Leu Gly Arg Pro Phe Leu Tyr 420 425 430 Ala Asn Ser Cys Tyr Gly Arg Asn Gly Val Glu Lys Ala Ile Glu Ile 435 440 445 Leu Arg Asp Glu Ile Glu Met Ser Met Arg Leu Leu Gly Val Thr Ser 450 455 460 Ile Ala Glu Leu Lys Pro Asp Leu Leu Asp Leu Ser Thr Leu Lys Ala 465 470 475 480 Arg Thr Val Gly Val Pro Asn Asp Val Leu Tyr Asn Glu Val Tyr Glu 485 490 495 Gly Pro Thr Leu Thr Glu Phe Glu Asp Ala 500 505 <210> 2 <211> 1521 <212> DNA <213> enzyme <400> 2 atgaacaaac agaaaatctc cccggcggaa gtggctaaac ataacaaacc ggatgactgc 60 tgggtggtga tcaacggcta tgtgtacgat ctgacccgtt ttctgccgaa ccacccgggc 120 ggtcaggatg ttatcaaatt caacgccggt aaagacgtca cggctatctt cgaaccgctg 180 catgcgccga atgtgattga taaatatatc gccccggaga aaaaactggg cccgctgcag 240 ggttctatgc cgccagaact ggtttgcccg ccgtacgcac cgggcgaaac caaagaagat 300 attgctcgca aagaacaact gaaatcgctg ctgccgccgc tggataacat catcaacctg 360 tacgacttcg aatacctggc gagccagacc ctgacgaaac aagcgtgggc ctattacagc 420 tctggcgcga acgatgaagt gacccatcgt gaaaaccaca atgcctatca tcgcattttc 480 tttaaaccga aaatcctggt cgatgtgcgt aaagtggata tttccaccga catgctgggt 540 tcacacgttg acgtcccgtt ctatgtttct gcaacggctc tgtgcaaact gggcaatccg 600 ctggaaggtg aaaaagatgt ggcccgcggc tgtggtcagg gcgtgaccaa agttccgcaa 660 atgattagta cgctggccag ttgttccccg gaagaaatta tcgaagcggc cccgtctgat 720 aaacagattc aatggtatca gctgtacgtt aacagtgacc gtaaaatcac cgatgacctg 780 gtcaaaaatg tggaaaaact gggcgtcaaa gcactgtttg tgacggttga tgctccgtcc 840 ctgggtcagc gcgaaaaaga catgaaactg aaattctcaa acaccaaagc aggcccgaaa 900 gctatgaaga aaaccaatgt ggaagaatca cagggtgcgt cgcgtgccct gagcaaattt 960 attgatccga gcctgacctg gaaagacatc gaagaactga aaaagaaaac caaactgccg 1020 attgttatca aaggtgtcca gcgcaccgaa gatgtcatta aagcagctga aatcggcgtg 1080 tctggtgtgg ttctgagtaa ccatggcggt cgtcagctgg actttagccg cgcgccgatt 1140 gaagttctgg ccgaaaccat gccgatcctg gaacaacgta atctgaaaga taaactggaa 1200 gtctttgtgg atggcggtgt gcgtcgcggt accgatgttc tgaaagcgct gtgcctgggt 1260 gccaaaggtg tcggcctggg tcgtccgttc ctgtatgcaa actcctgtta cggccgcaat 1320 ggtgtggaaa aagctattga aatcctgcgt gatgaaattg aaatgtcgat gcgtctgctg 1380 ggcgtgacca gcattgcaga actgaaaccg gatctgctgg acctgagtac cctgaaagca 1440 cgcacggttg gtgtcccgaa tgatgtcctg tataacgaag tgtatgaagg cccgaccctg 1500 acggaatttg aagatgcgta a 1521 <210> 3 <211> 578 <212> PRT <213> enzyme <400> 3 Met Leu Leu Arg Ser Leu Asn Ser Ser Ala Arg Cys Val Lys Gln Thr 1 5 10 15 Thr Arg Thr Lys Val Arg Tyr Leu Ser His Val Ser Gly Ala Ser Met 20 25 30 Ala Lys Pro Thr Leu Lys Asn Asn Ser Arg Glu Ser Asn Lys Ser Arg 35 40 45 Asn Tyr Leu Ile Ala Ala Val Thr Ala Leu Ala Val Ser Thr Ser Ile 50 55 60 Gly Val Ala Val His Val Lys Asp Pro Leu Tyr Asn Asp Ala Thr Gly 65 70 75 80 Ser Asp Ser Pro Arg Ser Ile 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Claims

검체의 상태를 평가하기 위한 디바이스로서,
검체에 유산 데히드로게나아제를 작용시키기 위한 작용부와,
유산 데히드로게나아제를 작용시킨 검체의 상태를 감지하기 위한 센서로서, 작용부에서의 검체의 상태를 감지하는 것이 가능하도록 배치되는 센서
를 포함하는, 디바이스.
제1항에 있어서,
센서로부터의 신호를 출력하기 위한 출력부를 더 포함하는, 디바이스.
제2항의 디바이스와,
디바이스의 출력부에 접속되어, 센서로부터의 신호를 처리하기 위한 데이터 처리 유닛
을 포함하는, 시스템.
검체의 상태를, 디바이스 및 데이터 처리 유닛을 포함하는 시스템에 의해 평가하기 위한 프로그램으로서,
디바이스가,
검체에 유산 데히드로게나아제를 작용시키기 위한 작용부와,
유산 데히드로게나아제를 작용시킨 검체의 상태를 감지하기 위한 센서로서, 작용부에서의 검체의 상태를 감지하는 것이 가능하도록 배치되는 센서와,
센서로부터의 신호를 출력하기 위한 출력부
를 포함하고,
데이터 처리 유닛이, 디바이스의 출력부에 접속되어, 센서로부터의 신호를 처리하도록 구성되고,
프로그램이, 디바이스에 대하여,
센서에 의해, 유산 데히드로게나아제를 작용부에 있어서 작용시킨 검체의 상태를 감지하여 측정하고, 신호로 변환하기 위한, 측정 처리와,
상기 측정 처리에서 얻어진 신호를 출력부로부터 데이터 처리 유닛에 대하여 전송하기 위한, 전송 처리
를 실행시키고,
프로그램이, 상기 데이터 처리 유닛에 대하여, 상기 측정 처리에서 얻어진 신호에 대하여 소정의 처리를 하기 위한, 데이터 처리를 실행시키는, 프로그램.
제1항 또는 제2항에 기재된 디바이스, 또는 제3항에 기재된 시스템을 사용하는, 검체의 상태를 평가하는 방법.
제5항에 있어서,
검체가, 인간 및 비인간 생물의 체액, 간질액, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 피부, 근육, 안구, 각막, 위액, 음식품, 양조물, 화성품, 물, 토양을 포함하는 유산 함유 조성물인, 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서,
검체의 상태가, 운동 부하에 대한 신체 상태, 질병 상태, 유산량의 변화를 수반하는 양조물의 양조 상태, 유산량의 변화를 수반하는 음식품의 숙성·추숙 정도, 유산량의 변화를 수반하는 화성품 제조의 유산 함유 비율, 유산량의 변화를 수반하는 물, 토양 중의 유산량인, 방법.
검체의 상태를 모니터링하기 위한 디바이스로서, 디바이스는, 검체에,
(A) 용액 중에서, 37℃에서 10일간 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제,
(B) 용액 중에서, 37℃에서 3일간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제, 또는
(C) 용액 중에서, 37℃에서 15시간 이상 경과시켰을 때, 초발 활성의 약 20％ 이상을 유지하고 있는 플라빈 의존성 유산 데히드로게나아제
를 작용시키기 위한 작용부를 포함하는, 디바이스.
제8항에 기재된 디바이스가 추가로 출력부를 포함하고, 그 출력부가 데이터 처리 유닛에 접속되는, 시스템.
제8항에 기재된 디바이스 또는 제9항에 기재된 시스템을 사용하는, 검체의 상태를 모니터링하는 방법.
서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 110 내지 502위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 113 내지 505위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 112 내지 503위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 12로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 102 내지 499위의 아미노산 서열 또는 그것과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유산 데히드로게나아제.
제11항에 있어서,
서열 번호 4, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 그것과의 동일성이 70％ 이상인 아미노산 서열을 갖는, 유산 데히드로게나아제.
제11항 또는 제12항에 기재된 유산 데히드로게나아제를 코딩하는 핵산.
제13항에 기재된 핵산을 갖는 숙주 세포.
제14항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 유산 데히드로게나아제의 제조 방법.
검체의 상태를 평가하기 위한 방법으로서,
i) 제11항 또는 제12항에 기재된 유산 데히드로게나아제와 검체를 접촉시키는 공정, 및
ii) 유산을 측정하는 공정
을 포함하는, 방법.