DE19543493A1

DE19543493A1 - Stabilisierte Coenzym-Lösungen und deren Verwendung zur Bestimmung von Dehydrogenasen bzw. deren Substrate im alkalischen Milieu

Info

Publication number: DE19543493A1
Application number: DE19543493A
Authority: DE
Inventors: Ralf Dipl Chem Ing Zielenski
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-11-22
Filing date: 1995-11-22
Publication date: 1997-05-28
Also published as: JPH10513063A; DE59603563D1; EP0804610B1; EP0804610A1; ES2140144T3; WO1997019190A1; US6162615A

Description

Die Erfindung betrifft stabilisierte wäßrige Lösungen eines Coenzyms für wasserstoff übertragende Enzyme sowie deren Verwendung zur Bestimmung eines entsprechenden Analyten (Substrates) in reduzierter Form oder der Enzymaktivität einer entsprechenden Dehydrogenase. Die stabilisierte Lösung enthält ein Schwermetallsalz und gegebenen falls als weitere Komponente einen Komplexbildner und ermöglicht dadurch die Be stimmung im alkalischen Milieu, bevorzugt bei einem pH-Wert von 8,5 bis 10,0.

Die Bestimmung von Enzymaktivitäten (od. Substratkonzentrationen), insbesondere in Blut-Serum oder -Plasma, spielt eine wichtige Rolle in der klinisch chemischen Diagno stik. Häufig werden dazu Testverfahren verwendet, die auf der Reduktion von Nicotina mid-adenin-dinucleotid ("NAD") bzw. Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat ("NADP") und der photometrischen Erfassung der dabei erfolgenden Änderung des Ab sorptionsverhaltens im ultravioletten Wellenlängenbereich (λ=334, 340 oder 365 nm) beruhen. Bei der Wahl geeigneter Testbedingungen ist diese Änderung linear propor tional zu der zu bestimmenden Enzymaktivität (bzw. Substratkonzentration).

Zur Bestimmung der Enzymaktivität von beispielsweise Lactatdehydrogenase (LDH, E.C.1.1.1.27) wird heute allgemein das in Eur. J. Chin. Chem. Chin. Biochem., 897 (1994) und Eur. J. Chin. Chem. Chin. Biochem. 32, 639 (1994) beschriebene Verfahren empfohlen. Das Testprinzip sieht die Oxidation von Lactat zu Pyruvat unter gleichzei tiger Reduktion eines Coenzyms wie NAD oder NADP zu NADH bzw. NADPH vor. Eine solche - wie hier beispielsweise von LDH katalysierte - Umsetzung findet im alka lischen Medium (pH 9,4) statt, d. h. unter Bedingungen, unter denen NAD bzw. NADP bekanntermaßen instabil ist. Diese Instabilität äußert sich in einem verhältnismäßig raschen Extinktionsanstieg (dem sog. Reagenzleerwert) im, die Messung betreffenden Wellenlängenbereich, so daß bereits nach kurzer Zeit (3 Monate) auch bei Kühllagerung (2° bis 8°C) die Reagenzkombination unbrauchbar wird. Dieses Problem stellt sich im besonderen Maße für die Herstellung gebrauchsfertiger, langzeitstabiler Flüssigreagen zien, die dem Anwender eine möglichst einfache und sichere Durchführung von Ana lysen in der täglichen Routine ermöglichen sollen.

Ein Verfahren zur Stabilisierung von wäßrigen Coenzymen unter Verwendung von Chelatbildnern und Aziden ist aus JP 84/82398 bekannt. Nachteilig an diesem Verfahren ist jedoch, daß der Zusatz von Azid erforderlich ist, da Azid zum einen heute als Can cerogen eingestuft ist und zudem auf viele Enzyme eine inhibierende Wirkung hat. Darüber hinaus zeigt dieses Stabilisierungsverfahren bei höheren pH-Werten und Temperaturen deutliche Grenzen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes ein Coenzym für wasserstoffübertragende Enzyme aufweisendes stabiles Flüssigreagenz, welches zur Bestimmung von Dehydrogenase-Aktivität bzw. entsprechender Substrate geeignet ist, zur Verfügung zu stellen.

Die Erfindung wird gelöst durch eine wäßrige Lösung, welche ein Schwermetallsalz in einer Konzentration von ungefähr 1 bis 60 mM, bevorzugt in einer Konzentration von 2 bis 10 mM aufweist. Der pH-Wert entsprechender Arbeitslösungen liegt dabei im alkali schen Bereich, bevorzugt oberhalb von pH 8,5, besonders bevorzugt zwischen pH 8,5 und 10,0. Unter Arbeitslösungen wird erfindungsgemäß verstanden, daß die stabilisierte Coenzymlösung mit einer Lösung vermischt wird, die im wesentlichen aus einer im al kalischen Bereich puffernden Substanz besteht. Als vorteilhaft hat sich erwiesen, wenn das Verhältnis von Stabilisator zu Pufferlösung ca. 1 : 5 beträgt. Als Schwermetallsalz haben sich wasserlösliche Salze von Säuren mit den Schwermetallionen wie z. B. Cu²⁺ und/oder Co²⁺, aber auch die anderer Schwermetalle wie beispielsweise Eisen, Mangan, Zink, Nickel, Silber, Magnesium, Calzium, oder Palladium als geeignet erwiesen. Als Gegenion, d. h. sogenanntes Säureanion kommen die dem Fachmann bekannten Säure reste gängiger Säuren in Betracht, wie beispielsweise Sulfat, Phosphat, die Säurereste von Carbonsäuren und Halogenide. Insbesondere haben sich hier Kupfer bzw. Kobalt sulfat und/oder die entsprechenden Chloride als geeignet erwiesen.

Als Puffer sind solche Substanzen geeignet, die eine gute Pufferkapazität zwischen ca. pH 8,5 und 10,0 aufweisen, wie beispielsweise die sogenannten Good-Puffer (Tricine, Bicine, TAPS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS), Carbonate von Alkalimetall ionen, MEG, TRIS sowie Borat- oder Phosphatpuffer. Auch Mischungen der genannten Puffersubstanzen haben sich für die erfindungsgemäße Lösung als geeignet erwiesen. Als geeignet hat sich erwiesen, wenn die Pufferkonzentration zwischen 10 und 1000 mM, bevorzugt zwischen 400 und 600 mM beträgt.

Die Stabilität der Lösungen kann zudem weiter verbessert werden, wenn zusätzlich ein Komplexbildner, d. h. ein Ligand, welcher zwei oder mehr Koordinationsstellen aufweist, in der Lösung enthalten ist. Es haben sich hier sowohl zweizähnige Liganden wie z. B. Ethylendiamin und vier- bzw. mehrzähnige Liganden wie Ethylendiamin-N,N,N,N- tertraessigsäure (EDTA) bzw. entsprechende Salze, insbesondere das Dinatriumsalz, Kronenether oder Kryptanden als vorteilhaft erwiesen. Der Stabilisierungseffekt konnte insbesondere beobachtet werden, wenn der Komplexbildner in einem bestimmten Ver hältnis zur Konzentration des Schwermetallsalzes zugegeben wird, wobei das jeweilige Schwermetallsalz im Überschuß vorliegt. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis Metallion zu Komplexbildner 2 zu 1. Dies entspricht einer Konzentration des Komplexbildners von ungefähr 0,5 bis 30 mM, vorzugsweise von 1,0 bis 5,0 mM.

Als Coenzyme im Sinne der vorliegenden Erfindung kommen insbesondere NAD bzw. NADP, aber auch modifizierte Coenzyme, wie beispielsweise thioNAD(P) oder NHxDP (=Nicotinamidhypoxanthin-dinukleotidphosphat) in Betracht. Die Coenzyme können in einer Konzentration von ungefähr 1,0 bis 60 mM vorliegen, bevorzugt ist hier ein Be reich von 5,0 bis 15,0 mM.

Die stabilisierten Coenzym-Lösungen, d. h. sowohl mit einem Schwermetallsalz allein als auch zusammen mit dem Komplexbildner werden bevorzugt in Form von Lyophili saten verwendet. Das gebrauchsfertige Reagenz ist darüber hinaus aber auch als Gra nulat, Pulvermischung sowie als wäßrige Lösung über einen weiten Zeitraum hin stabil. So konnten bei Temperaturen von 2° bis 8°C innerhalb von 15 Monaten keinerlei Zerset zungserscheinungen des Reagenzes festgestellt werden. Unter Belastung, d. h. bei einer Temperatur von ca. 35°C für 2 Wochen und anschließende Behandlung bei ca. 42°C für einen Tag konnte gezeigt werden, daß die Lösung mit Schwermetallsalz bis zu ungefähr 60 mM unverändert, d. h. stabil bleibt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, ein Verfahren zur Bestimmung eines wasser stoffübertragenden Analyten bzw. einer entsprechenden Dehydrogenase in Gegenwart eines wasserstoffaufnehmenden Coenzyms, wobei das Coenzym in einer stabilisierten wäßrigen alkalischen Lösung wie oben beschrieben vorliegt. Die Endkonzentration des Schwermetallsalzes im Test beträgt dabei vorzugsweise zwischen 0,1 und 1,0 mM; die Endkonzentration des gegebenenfalls zugesetzten Komplexbildner bevorzugt ca. 0,05 bis 5 mM.

Die Bestimmung erfolgt insbesondere in Proben biologischen Ursprungs wie beispiels weise Vollblut, Serum oder Plasma, oder Milch bzw. anderen menschlichen bzw. tieri schen Quellen oder in pflanzlichen Extrakten. Die Probe kann mit physiologischer Kochsalzlösung aufbereitet werden. Als Kontrollwert dient in einem solchen Fall vorteil hafterweise eine 0,9% NaCl-Lösung.

Für den Fall, daß die Enzymaktivität einer Dehydrogenase wie beispielsweise Lactatde hydrogenase bestimmt werden soll, wird eine Substratlösung, beispielsweise eine Lactat lösung, in einer bei ca. pH 9,4 (37°C) puffernden Substanz(mischung) verwendet. Das Substrat kann dabei in den üblichen, dem Fachmann bekannten Konzentrationen einge setzt werden, vorzugsweise in einem Bereich von 40 bis 80 mM.

Für die Bestimmung eines wasserstoffübertragenden Analyten wie beispielsweise Lactat, wird die jeweilige Dehydrogenase, wie beispielsweise LDH in einer zwischen pH 8,5 und 10,0 puffernden Substanz vorgelegt. In der Regel ist eine Menge an Dehydrogenase von ungefähr 70 bis 500 U/l, bevorzugt von 110 bis 220 U/l ausreichend. Die Bestimmung wird üblicherweise bei ca. 37°C durchgeführt.

Neben dem beispielhaft angeführten Lactat können in analoger Weise Glutamat bzw. Ammoniak, Alkohol, Glycerinaldehyd-3-phosphat, Glucose oder andere Parameter, welche durch eine geeignete Coenzymabhängige Dehydrogenase umgesetzt werden können, bestimmt werden. Entsprechendes gilt für die Bestimmung der Enzymaktivität solcher Dehydrogenasen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein sogenannter Testkit zur Ausführung der Enzym- bzw. Analytbestimmung. Der Kit besteht im wesentlichen aus zwei Reagenzien. Das erste Reagenz beinhaltet - für den Fall der Bestimmung der Aktivität einer Dehydro genase - einen wasserstoffübertragenden Analyten (Substrat) in einem geeigneten zwi schen pH 8,5 und 10,0 puffernden System. Das zweite Reagenz weist ein Coenzym für wasserstoffübertragende Enzyme, wie beispielsweise NAD bzw. NADP und ein wasser lösliches Schwermetallsalz in einer Konzentration von ca. 1,0 und 60 mM. Das zweite Reagenz kann darüber hinaus einen Komplexbildner in einer Konzentration von 0,5 bis 30 mM enthalten. Ein analoges zweites Reagenz ist für den Fall der Analyt- bzw. Sub stratbestimmung, wie beispielsweise von Lactat, zu verwenden.

Abkürzungen

AMP = 2-Amino-2-methyl-1-propanol
AMPSO = 3-[(1,1-Dimethyl-2-hydroylethyl)amino-2-hydroxypropansulfonsäure
Bicine = N,N-Bis[2-Hydroxyethyl]glycin
CAPS = 3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure
CAPSO = 3-[Cyclohexylaminoj-2-hydroxy-1-propansulfonsäure
CHES = 2-[N-Cyclohexylamino]ethansulfonsäure
MEG = N-Methylglucamin
TAPS = N-Tris[Hydroxymethyl]methyl-3-aminopropansulfonsäure
Tricine = N-Tris[Hydroxymethyl]methylglycerin
TRIS = 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanol

e folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

Beispiel 1

Reagenz 1: N-Methylglucamin 390 mmol/l pH 9,4 (37°C); Lithium-L-Lactat 60 mmol/l.

Reagenz 2: NAD(P) 60 mmol/l + Kupfer (II) Sulfat 5 mmol/l als Lyophilisat, Pul vermischung, Granulat oder wäßrige Lösung.

Inkubationstemperatur 37 ± 0,1°C; Meßwellenlänge 340 ± 2 nm; Schichtdicke 7 mm;
Vorinkubation: 5 Minuten; Lag phase: 2 Minuten; Meßzeit: 2 Minuten.

Reagenz 1 = 250 µl; Reagenz 2 = 50 µl; Probe 7 µl NACl-Lösung (0,9% w/v).

a) Zusatz von 5 mmol/l Kupfer (II) Reagenz 2

Reagenzleerwert in mE/min

b) Zusatz von 5 mmol/l Kupfer (II) + EDTA zu Reagenz 2

Reagenzleerwert in mE/min

Beispiel 2

Es wurden die Reagenzien 1 und 2 aus Beispiel 1 mit den im folgenden beschriebenen geänderten Konzentratin an Kupfer (II)- bzw. Kobalt (II)-Suflat verwendet.

a) Zusatz von 0-60 mmol/l Kupfer (II) Reagenz 2

Reagenzleerwert in mE/min
NAD wäßrige Lösung Zusatz von x mmol/l Cu (II)

b) Zusatz von 3 mmol/l Kobalt (II) Reagenz 2

Reagenzleerwert in mE/min

c) Zusatz von 5 mmol/l Kupfer (II) zu Reagenz 2 (NADP)

Reagenzleerwert in mE/min

Claims

1. Stabilisierte wäßrige Lösung eines Coenzyms für wasserstoffübertragende Enzyme, dadurch gekennzeichnet daß die Arbeitslösung einen pH-Wert von mindestens 8,5 aufweist und NAD, NADP oder ein entsprechendes Derivat in oxidierter oder redu zierter Form sowie 1,0 bis 60 mM eines wasserlöslichen Schwermetallsalzes enthält.

2. Stabilisierte Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Coenzym NAD oder NADP ist.

3. Stabilisierte Lösung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß die Lö sung zusätzlich einen Komplexbildner enthält.

4. Stabilisierte Lösung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das wasser lösliche Schwermetallsalz im Verhältnis zum Komplexbildner im Überschuß vorliegt.

5. Stabilisierte Lösung nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Schwermetallsalz in einer Konzentration von ca. 2,0 bis 10,0 mM und der Komplexbildner in einer Konzentration von ca. 1,0 bis 5,0 mM vorhanden ist.

6. Stabilisierte Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Schwermetallsalz aus Kupfer-, Kobalt-, Eisen-, Mangan-, Zink-, Nickel-, Silber- oder Palladiumkationen und aus einem Säureanion besteht und als der Komplexbildner Ethylendiamin, Ethylendiamin-N,N,N,N-tetraessigsäure bzw. das entsprechende Dinatriumsalz, Kronenether oder Kryptanden verwendet werden.

7. Verfahren zur Bestimmung eines wasserstoffübertragenden Analyten oder einer ent sprechenden Dehydrogenase in Gegenwart eines wasserstoffaufnehmenden Coen zyms dadurch gekennzeichnet, daß das Coenzym in einer stabilisierten wäßrigen alkalischen Lösung gemäß der Ansprüche 1 bis 6 zugesetzt wird.

8. Verfahren zur Bestimmung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Ana lyt Lactat, Glutamat, Ammoniak, Alkohol, Glycerinaldehyd-3-phosphat oder Glu cose in Gegenwart einer Lactat-, Glutamat-, Alkohol-, Glycerin-3-phosphat- oder Glucose-Dehydrogenase bestimmt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der pH- Wert in einem Bereich von 8,5 bis 10,0 liegt und die Endkonzentration des Schwer metallsalzes zwischen 0,1 und 1,0 mM beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Lactat in Gegenwart von Lactatdehydrogenase bei einem pH-Wert von ungefähr 9,4 bestimmt wird.

11. Kit zur Bestimmung eines wasserstoffübertragenden Analyten in einer Probe beste hend aus folgenden Komponenten:

- einem Reagenz, welches eine Dehydrogenase in einem geeigneten zwischen pH 8,5 und 10,0 puffernden System enthält, und
- einem Reagenz, welches ein Coenzym für wasserstoffübertragende Enzyme und ein wasserlösliches Schwermetallsalz in einer Konzentration zwischen 1,0 und 60 mM enthält.

12. Kit zur Bestimmung der Enzymaktivität einer Dehydrogenase in einer Probe beste hend aus folgenden Komponenten:

- einem Reagenz, welches einen wasserstoffübertragenden Analyten in einem ge eigneten zwischen pH 8,5 und 10,0 puffernden System enthält, und
- einem Reagenz, welches ein Coenzym für wasserstoffübertragende Enzyme und ein wasserlösliches Schwermetallsalz in einer Konzentration zwischen 1,0 und 60 mM enthält.

13. Kit nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Reagenz zusätzlich einen Komplexbildner in einer Konzentration von 0,5 bis 30 mM enthält.

14. Kit nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Co enzym um NAD bzw. NADP oder ein entsprechendes Derivat in oxidierter Form oder reduzierter Form handelt.