JPH10513063A - 安定化された補酵素溶液、並びにアルカリ性環境下でのデヒドロゲナーゼ及び基質の測定のためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 安定化された補酵素水溶液であって、約60 mMまでの重金属塩、及び任意に重金属塩に対して特定の比率の錯化剤を含む前記水溶液、並びにアルカリ性環境下でのデヒドロゲナーゼ、特に乳酸デヒドロゲナーゼまたは対応する基質の測定のためのその使用。

Description

【発明の詳細な説明】 安定化された補酵素溶液、並びにアルカリ性環境下での デヒドロゲナーゼ及び基質の測定のためのその使用 本発明は、水素転移酵素の補酵素の安定化された水溶液、並びに還元型の対応 する被検体（基質）または対応するデヒドロゲナーゼの酵素活性を測定するため のその水溶液の使用に関する。前記の安定化された溶液は重金属塩及び任意の別 の成分として錯化剤を含み、これによりアルカリ性環境中、好適にはpH 8.5〜10 .0における測定を可能にするものである。 酵素活性（または基質濃度）の測定、特に血清または血漿中におけるそのよう な測定は臨床的な化学的診断において重要な役割を果たしている。酵素活性の測 定には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド("NAD")またはニコチンアミド アデニンジヌクレオチドリン酸("NADP")の還元、及びこの過程で起こる紫外波長 領域(λ＝334，340または365 nm)における吸光度変化の分光検出に基づく試験方 法が使用されることが多い。試験条件を適切に選択すれば、この変化は測定すべ き酵素活性（または基質濃度）に対して直線的に比例する。 Eur．J．Chin．Chem．Chin．Biochem．31，897(1994)及びEur．J．Chin．Chem ．Chin．Biochem．32，639(1994)に記載されている方法は、例えば乳酸デヒドロ ゲナ−ゼ(LDH，E.C．1.1.1.27)の酵素活性を測定するために現在一般に推奨され ている。試験原理は、乳酸が、NADやNADPからNADHやNADPHへの変化といった補酵 素の同時還元を伴ってピルビン酸へ酸化されることにある。このような変化は、 この場合例えばLDHにより触媒され、アルカリ媒質中(pH 9.4)、即ちNADあるいは NADPが不安定であることが知られている条件下で起こる。この不安定性は測定に 関連する波長範囲における吸光度の比較的迅速な増加（いわゆる試薬ブランク） として現れ、その結果、試薬を組合せたものは冷蔵保存(2℃〜8℃)しても短期間 （３ヶ月）で使用できなくなってしまう。これは、日常業務においてできるだけ 簡単にそして信頼性のある分析を可能とすることを目的とする、長期の安定性を 備えた直ぐに使用できる状態の液体試薬の製造に対して特に問題となる。 キレート剤やアジドを用いた水性補酵素を安定化するための方法がJP 84/8239 8より知られている。しかしこの方法の不利な点は、発癌性を有するとされ、そ の上多くの酵素に対して阻害効果を有するアジドを添加する必要があるというこ とである。さらに、この安定化方法は比較的高いpH値および温度では明らかに限 界を有する。 従って本発明の目的は、デヒドロゲナ−ゼ活性または対応する基質の測定に適 する水素転移酵素の補酵素を含む改善された安定な液体試薬を提供することであ る。 本発明は、重金属塩を約1〜60 mM、好ましくは2〜10 mM の濃度で含む水溶液 により達成される。対応する使用溶液のpH値はアルカリ性域であり、好適にはpH 8.5以上、特に好ましくはpH 8.5〜10.0である。本発明でいう使用溶液とは、安 定化された補酵素溶液がアルカリ性域で緩衝作用を有する物質（バッファー）か ら実質的になる溶液と混合されることを意味する。安定剤のバッファーに対する 比率は約1:5であることが有利であると判明している。例えばCu²⁺及び／またはC o²⁺のような重金属イオンを含む酸の水溶性塩、さらに例えば鉄、マンガン、亜 鉛、ニッケル、銀、マグネシウム、カルシウムあるいはパラジウムのようなその 他の重金属を含む酸の水溶性塩も重金属塩として適していることが明らかになっ た。当業者に知られている通常の酸の酸残基を対イオン、即ちいわゆる酸アニオ ンとして挙げることができる。このようなものとしては例えば、硫酸イオン、リ ン酸イオン、カルボン酸残基及びハロゲン化物イオンがある。銅とコバルトの硫 酸塩及び／または対応する塩化物が特に適していることが明らかになった。 バッファーとして適する物質は、約8.5と10.0の間のpH値で良好な緩衝能を有 するものであり、例えば、いわゆる良バッファー（トリシン、ビシン、TAPS、AM PSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS）、アルカリ金属イオンの炭酸塩、MEG、TRIS、並 びにホウ酸またはリン酸バッファー等である。これらのバッファーの混合物も本 発明の溶液に適することが判った。バッファーの濃度は10〜1000 mM 、特に好ま しくは400〜600 mMが適当であることが明らかになった。 溶液が錯化剤、即ち二座あるいはそれ以上の配位位置を有する配位子をさらに 含む場合、溶液の安定性をさらに改善することができる。この場合、エチレンジ アミンのような二座配位子、及びエチレンジアミン-N,N,N,N-四酢酸(EDTA)のよ うな四座及び多座配位子、及びそれぞれの塩、特に二ナトリウム塩、クラウンエ ーテル、あるいはクリプタンドが有利であることが明らかになった。特に錯化剤 を重金属塩の濃度に対して特定の比率で加え、それぞれの重金属塩を過剰に存在 させると安定化効果を観察することができる。金属イオンと錯化剤との比率は好 適には２対１である。これは約0.5〜30 mM、好ましくは1.0〜5.0 mMの錯化剤の 濃度に相当する。 本発明の意味における補酵素の範囲にある補酵素は、特にNADまたはNADPであ るが、例えばチオNAD(P)あるいはNHxDP(＝ニコチンアミドヒポキサチン−ジヌク レオチドリン酸)のような修飾された補酵素であってもよい。この場合補酵素は 約1.0〜60 mMの濃度で存在させることができ、5.0〜15.0 mM の範囲が好ましい 。 安定化された補酵素溶液（即ち重金属塩のみを含むもの、並びに錯化剤をさら に含むもの）は、好ましくは凍結乾燥物の形態で用いられる。しかし、顆粒、粉 末混合物、水溶液のようなすぐに使用できる状態の試薬も長期にわたって安定で ある。即ち、２℃〜８℃の温度では、15ヶ月間試薬の分解は全く見られない。約 35℃で2週間、続いて約42℃で１日保存するといったストレス下でも、重金属塩 を含む溶液は約60 mMまで変化せず、即ち安定なままである。 本発明の別の主題は、水素受容補酵素の存在下での水素転移被検体または対応 するデヒドロゲナ−ゼの測定方法であって、該補酵素が上記のような安定化され たアルカリ水溶液中に含まれているものである。試験における重金属塩の最終濃 度は、この場合、好ましくは0.1〜1.0 mMであり、任意に添加される錯化剤の最 終濃度は好適には約0.05〜5 mMである。 測定は特に、全血、血清もしくは血漿または母乳あるいはその他のヒトまたは 動物起源のもの、または植物抽出物のような生物起源のサンプルにおいて実施さ れる。サンプルは生理的食塩水を用いて調製することができる。この場合、0.9% NaCl溶液を対照値として用いる。 例えば乳酸デヒドロゲナ−ゼのようなデヒドロゲナ−ゼの酵素活性を測定する 場合には、例えば乳酸溶液のような基質溶液を、約pH 9.4(37℃)で緩衝作用を 有する物質（混合物）中で用いる。この場合、基質は当業者に知られる通常の濃 度、好適には40〜80 mMの範囲で用いることができる。 例えば乳酸のような水素転移被検体を測定するため、例えばLDHのようなそれ ぞれのデヒドロゲナーゼを、pH 8.5〜10.0で緩衝作用を有する物質に最初に添加 する。通常は約70〜500 U/l、好ましくは110〜220 U/lの量のデヒドロゲナ−ゼ が適当である。測定は通常約37℃で行う。 例として挙げた乳酸(lactate)の他に、適当な補酵素依存性デヒドロゲナ−ゼ により変換することができるグルタミン酸(glutamate)もしくはアンモニア、ア ルコール、グリセルアルデヒド-3-リン酸、グルコースまたはその他のパラメー タを同様に測定することが可能である。このようなデヒドロゲナ−ゼの酵素活性 の測定も同様である。 本発明の別の主題は、酵素または被検体の測定を実施するためのいわゆる試験 キットである。このキットは本質的には二つの試薬からなる。第一の試薬は、デ ヒドロゲナ−ゼの活性を測定する場合には、pH8.5〜10.0の間で緩衝作用を有す る適当な系中に水素転移被検体（基質）を含むものである。第二の試薬は、例え ばNADあるいはNADPのような水素転移酵素の補酵素、及び約1.0〜60mMの濃度の水 溶性の重金属塩を含むものである。さらに、第二の試薬は0.5〜30 mMの濃度で錯 化剤を含むことができる。乳酸のような被検体または基質を測定する場合には同 様の第二の試薬を使用する。 略語： AMP ＝ 2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール AMPSO ＝ 3-[(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシルエチル)アミノ-2-ヒドロキシプロパ ンスルホン酸 ビシン＝ N,N-ビス[2-ヒドロキシルエチル]グリシン CAPS ＝ 3-[（シクロヘキシルアミノ］-1-プロパンスルホン酸 CAPSO ＝ 3-[シクロヘキシルアミノ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸 CHES ＝ 2-[N-シクロヘキシルアミノ]エタンスルホン酸 MEG ＝ N-メチルグルカミン TAPS ＝ N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸 トリシン＝ N-トリス[ヒドロキシメチル]メチルグリセロール TRIS ＝ 2-アミノ-2-（ヒドロキシメチル）-1,3-プロパノール さらに以下の実施例により本発明を説明する。実施例１ 試薬１：390 mmol/lのN-メチルグルカミン、pH9.4(37℃); 60 mmol/lのL-乳酸 リチウム。 試薬２：凍結乾燥物として60 mmol/l のNAD(P)＋5 mmol/lの硫酸銅(II)、粉末 混合物、顆粒あるいは水溶液 インキュベーション温度：37±0.1℃；測定波長340±2 nm；光路長7 mm； プレインキュベーション：５分；遅滞期：２分；測定時間：２分 試薬１＝250μl；試薬２＝50μl；サンプル7μlのNaCl溶液(0.9%w/v)a)5 mmol/l の銅(II)の試薬２への添加： mA/分で表した試薬ブランク値 b)5 mmlol/l の銅(II)＋EDTAの試薬２への添加： mA/分で表した試薬ブランク値 実施例２ 実施例１からの試薬１及び２を、以下に示すように、銅(II)の濃度を変えて、 また硫酸コバルト(II)と共に用いた。a ）0〜60 mmol/lの銅(II)の試薬２への添加： mA/分で表した試薬ブランク値 x mol/l Cu(II)のNDA水溶液添加 b ）3 mmol/lのコバルト(II)の試薬２への添加 mA/ 分で表した試薬ブランク値 c ）5 mmol/lの銅(II)の試薬２への添加(NADP) １．ストレス下(42℃) mA/分で表した試薬ブランク値 ２．ストレスなしでの安定性(20℃)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．水素転移酵素の補酵素の安定化された水溶液であって、使用溶液が少なくと も8.5のpH値を有し、酸化型もしくは還元型のNAD、NADPまたは適当な誘導体、並 びに1.0〜60 mMの水溶性重金属塩を含む、前記水溶液。 ２．補酵素がNADまたはNADPである請求項１に記載の安定化された溶液。 ３．溶液がさらに錯化剤を含む請求項１または２に記載の安定化された溶液。 ４．水溶性重金属塩が錯化剤に対して過剰に存在する請求項３に記載の安定化さ れた溶液。 ５．重金属塩が約2.0〜10.0 mMの濃度で存在し、錯化剤が1.0〜5.0 mMの濃度で 存在する請求項３または４に記載の安定化された溶液。 ６．重金属塩が銅、コバルト、鉄、マンガン、亜鉛、ニッケル、銀またはパラジ ウムのカチオン及び酸アニオンからなり、エチレンジアミン、エチレンジアミン -N,N,N,N-四酢酸もしくは対応する二ナトリウム塩、クラウンエーテル、または クリプタンドが錯化剤として用いられる請求項１〜５のいずれかに記載の安定化 された溶液。 ７．水素受容補酵素の存在下での水素転移被検体または対応するデヒドロゲナー ゼの測定方法であって、補酵素が請求項１〜６のいずれかに記載の安定化された アルカリ性水溶液中に添加されている前記測定方法。 ８．被検体である乳酸、グルタミン酸、アンモニア、アルコール、グリセルアル デヒド-3-リン酸またはグルコースを、乳酸、グルタミン酸、アルコール、グリ セロール-3-リン酸またはグルコースデヒドロゲナーゼの存在下で測定する請求 項７に記載の測定方法。 ９．pH値が8.5〜10.0の範囲であり、重金属塩の最終濃度が0.1〜1.0 mMである請 求項７または８に記載の方法。 10．乳酸デヒドロゲナーゼの存在下、約9.4のpH値で乳酸を測定する請求項７〜 ９のいずれかに記載の方法。 11．サンプル中の水素転移被検体の測定用キットであって、以下の成、 - pH 8.5〜10.0で緩衝作用を有する適当な系中にデヒドロゲナーゼを含む試薬、 及び、 - 水素転移酵素の補酵素及び1.0〜60 mMの濃度の水溶性重金属塩を含む試薬、を 含む前記キット。 12．サンプル中のデヒドロゲナーゼの酵素活性の測定用キットであって、以下の 成、 - pH 8.5〜10.0で緩衝作用を有する適当な系中に水素転移被検体を含む試薬、及 び、 - 水素転移酵素の補酵素及び1.0〜60 mMの濃度の水溶性重金属塩を含む試薬、を 含む前記キット。 13．第二の試薬がさらに0.5〜30 mMの濃度の錯化剤を含む請求項11または12に記 載のキット。 14．補酵素が、酸化型もしくは還元型のNADまたはNADPまたは対応する誘導体で ある請求項11〜13のいずれかに記載のキット。