JP2001204493A - 測定試薬および測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】酵素および共役酵素の関与する反応系を利用し
て試料中に存在する測定物質を定量するとき、試薬のブ
ランク反応を有効に軽減することができ、従って、測定
値の正確さ・信頼性をより高めることができる測定試
薬、並びに、この試薬を用いた測定方法を提供する。 【解決手段】基質を含む試薬１と、酵素を含む試薬２よ
り構成され、上記の反応系を利用する定量用の測定試薬
において、共役酵素および補酵素（ＮＡＤ）を試薬１に
含有させてなる。好ましくは、試薬１をｐＨ３．０〜
６．５の酸性に調節するか、マグネシウムイオンを好適
には１〜１６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で試薬１に共存させる
か、またはカルボン酸もしくはその塩、好適には酢酸、
シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、
クエン酸もしくはこれらの塩を好適には４〜６０ｍｍｏ
ｌ／Ｌの濃度で試薬１に添加することにより、試薬１中
に生成しうるＮＡＤＨが消去されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査の分野に
おいて利用される、基質を含む試薬１と酵素を含む試薬
２より構成される二試薬系の測定試薬、および、該試薬
を用いて試料中の測定すべき物質を定量する測定方法に
関する。より詳しくは、本発明は、酵素および共役酵素
を用い、これら酵素の関与する反応系を利用して試料中
に存在する測定物質を定量するところの測定試薬および
測定方法であって、試薬のブランク反応を軽減し、測定
の正確さおよび信頼度の一層の向上を図ることができる
測定試薬および測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、酵素および共役酵素を用い、これ
ら酵素の関与する反応系を利用して、試料中に存在して
いるかもしれない測定物質を定量する技術は、臨床検査
の分野においてあるいは生化学の分野などにおいて、い
ろいろと研究され、そして特許公開公報などに提案され
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一般に、酵素および共
役酵素を用いて試料中の測定物質を定量するとき、何ら
かの原因で共役酵素の基質が試薬中に不可避的に混在す
る場合あるいはそれが試薬中に経時的に生成する場合が
あり、それらの場合において、余剰に共存する共役酵素
の基質は最終生成物にまで変換されるので、試薬の測定
結果としてブランク値が増大し、よって測定値の正確さ
を低下せしめることになる。例えば、次の図式に示すよ
うな、酵素および共役酵素の関与する反応系をここで考
えてみる。

【化１】 この反応系は、まず酵素Ｅ_１の作用により、試料中に存
在する測定物質Ｓと基質ＡＰとが反応して中間生成物Ｓ
ＰとＡとが生成し、次いで共役酵素Ｅ_２の作用により、
共役酵素Ｅ_２の基質Ａと補酵素ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略することもある）と
が反応して最終生成物Ａ’とニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨと略することもあ
る）が生成するという二段階の酵素反応系であり、ＮＡ
ＤＨの生成量を例えば光学的に測定することにより、試
料中の測定物質Ｓを定量するものである。そして、この
反応系において、仮に共役酵素Ｅ_２の基質Ａが当初の基
質ＡＰ中に既に混在していると、測定物質Ｓの存在の有
無に関係なく、酵素反応が進行して、計測対象のＮＡＤ
Ｈが生成することになり、従って、それだけ試薬のブラ
ンク反応値が増加する。また、とりわけ液状の測定試薬
にあっては、その保存の間に、基質ＡＰの非酵素的分解
が進行し共役酵素Ｅ_２の基質Ａが経時的に生成する傾向
にある。従って、たとえ測定試薬を冷蔵保存したとして
も、長期の保存の後において、試薬のブランク反応値の
著しい増加が見られることがしばしばある。測定試薬の
ブランク反応値が増加する原因は、上述の他、いろいろ
と存在するけれども、いずれの機序によるものであって
も、ブランク反応値の増大は測定試薬の性能の低下を招
く原因であり、重大な問題である。より詳しく述べる
と、臨床検体の測定においては、測定試薬のブランク反
応がまったく起きないことが理想的なことであるが、実
際の測定においては、種々の原因によりブランク反応が
進行しうる。試薬のブランク反応値がより高くなればな
るほど、測定値の正確度（精度）がより低くなる。特に
測定物質が低い濃度でしか試料中に存在せず、測定物質
の反応量がブランク反応量に比して小さいとき、測定値
の正確さは著しく悪いものになる。また、測定物質が高
い濃度で、即ち分光光度計などの測定機器の測定限界
（上限）に達する程の濃度域で存在するとき、試薬のブ
ランク反応が著しいと、ブランク反応値の上積みによっ
て、測定不能に陥ることになる。仮に測定できたとして
も、その測定値は十分に正確な値といえず、信頼性に欠
けるものになる。したがって、従来、試薬のブランク反
応に影響されずに、試料中の測定物質を正確に定量する
ことができるところの測定試薬および測定方法の開発が
求められていた。

【０００４】本発明は、上述した従来の事情を考慮して
なされたものであって、その課題とするところは、酵素
および共役酵素を用い、これら酵素の関与する反応系を
利用して試料中の測定物質を定量するための二試薬系の
測定試薬であって、試薬のブランク反応を有効に軽減す
ることができ、よって測定値の正確さと高い信頼性を担
保することができるところの測定試薬を提供することに
ある。また、本発明は、酵素および共役酵素を用い、こ
れら酵素の関与する反応系を利用して試料中に存在する
測定物質を定量するとき、試薬のブランク反応を有効に
軽減することができ、従って、測定値の正確さおよび信
頼度を一層高めることができるところの測定方法を提供
することにある。本発明のその他の課題は、特許請求の
範囲を含む明細書の記載を参照することにより、理解さ
れる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の技
術的課題を解決するべく鋭意研究した結果、基質を含む
試薬１と酵素を含む試薬２より構成される測定試薬を用
い、酵素および共役酵素の関与する反応系を利用して試
料中の測定物質を定量するにあたって、共役酵素および
補酵素（ＮＡＤ）を、基質を含む試薬１に添加すると、
ブランク反応の原因となる共役酵素の基質が、たとえ当
初より試薬中に混在していてもあるいは経時的に生成さ
れるとしても、実質総て消費されてＮＡＤＨに変換さ
れ、測定の際のブランク反応の発生が著しく軽減される
ことを見い出した。そして、本発明者らは、さらに研究
を鋭意続けた結果、酵素および共役酵素の関与する上記
の反応系において、 ｉ）基質を含む試薬１をｐＨ３．０〜６．５の酸性に調
節することにより、生成しうるＮＡＤＨを不安定にさせ
るか、もしくは ｉｉ）二価の金属イオンとりわけマグネシウムイオン
（Ｍｇ^２＋）を、基質を含む試薬１に、好ましくは１〜
１６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で、共存させることにより、生
成しうるＮＡＤＨの分解を促進するか、もしくは ｉｉｉ）酢酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク
酸、リンゴ酸、クエン酸またはこれらの塩からなる群よ
り少なくとも一種選択されたカルボン酸またはその塩
を、基質を含む試薬１に、好ましくは４〜６０ｍｍｏｌ
／Ｌの濃度で、添加することにより、生成しうるＮＡＤ
Ｈの分解を促進すると、生成しうるＮＡＤＨが反応系よ
り消去され、従って、試薬のブランク反応がより完全に
軽減されることを見い出し、本発明を完成した。

【０００６】したがって、本発明は、より明確には、基
質を含む試薬１と、酵素を含む試薬２より構成され、該
酵素および共役酵素の関与する反応系を利用して、試料
中に存在する測定物質を定量する測定試薬において、前
記共役酵素および補酵素（代表的にはＮＡＤ）を前記試
薬１に含有させてなることを特徴とする、測定試薬に関
する。本発明のより好ましい態様は、上記の測定試薬で
あって、試薬１をｐＨ３．０〜６．５の酸性に調節する
ことにより、該試薬１中に生成しうるＮＡＤＨが消去さ
れている測定試薬に関する。また、本発明のより好まし
い態様は、上記の測定試薬であって、二価の金属イオン
好ましくはマグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）を、好まし
くは１〜１６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で試薬１に共存させる
ことにより、該試薬１中に生成しうるＮＡＤＨが消去さ
れている測定試薬に関する。さらに、本発明のより好ま
しい態様は、上記の測定試薬であって、酢酸、シュウ
酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン
酸またはこれらの塩からなる群より少なくとも一種選択
されたカルボン酸またはその塩を、好ましくは４〜６０
ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で試薬１に添加することにより、該
試薬１中に生成しうるＮＡＤＨが消去されている測定試
薬に関する。

【０００７】また、本発明は、上述の原理（ブランク反
応の軽減効果）を利用した測定方法に関する。すなわ
ち、本発明は、基質を含む試薬１と、酵素を含む試薬２
より構成される測定試薬を用い、該酵素および共役酵素
の関与する反応系を利用して、試料中に存在する測定物
質を定量する測定方法において、前記共役酵素および補
酵素（代表的にはＮＡＤ）は前記試薬１に添加させてお
くことを特徴とする、測定方法に関する。本発明のより
好ましい態様は、上記の測定方法であって、試薬１をｐ
Ｈ３．０〜６．５の酸性に調節することにより、該試薬
１中に生成しうるＮＡＤＨを予め消去することを特徴と
する測定方法に関する。また、本発明のより好ましい態
様は、上記の測定方法であって、二価の金属イオン好ま
しくはマグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）を、好ましくは
１〜１６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で試薬１に共存させること
により、該試薬１中に生成しうるＮＡＤＨを予め消去す
ることを特徴とする測定方法に関する。さらに、本発明
のより好ましい態様は、上記の測定方法であって、酢
酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ
酸、クエン酸またはこれらの塩からなる群より少なくと
も一種選択されたカルボン酸またはその塩を、好ましく
は４〜６０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で試薬１に添加すること
により、該試薬１中に生成しうるＮＡＤＨを予め消去す
ることを特徴とする測定方法に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、酵素および共役酵素の
関与する反応系全般に適用されうる。その代表的な例と
して、以下の図式に示す尿素窒素の定量のための反応系
を取り上げて、本発明を説明する。

【化２】 この反応系は、まず、酵素ウレアアミドリアーゼ（ＵＲ
Ｌ）の作用により、試料中の尿素が基質アデノシン５’
−三リン酸（ＡＴＰ）と反応して、アンモニアと二酸化
炭素に分解され、同時にＡＴＰはアデノシン５’−二リ
ン酸（ＡＤＰ）に変換され、続いて、共役酵素ヘキソキ
ナーゼ（ＨＫ）の作用により、変換されたＡＤＰとグル
コースとが反応して、グルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）と
アデニル酸（ＡＭＰ）を得、さらに、共役酵素グルコー
ス６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の作用によ
り、生じたグルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）と補酵素（Ｎ
ＡＤ）とが反応して、グルコノラクトン６リン酸とＮＡ
ＤＨとを生成するという三段階の酵素反応系であり、従
って、生成したＮＡＤＨの生成量を光学的に、例えば波
長３４０ｎｍにおける吸光度の増加量の計測により測定
することにより、試料中の測定物質（尿素窒素）を定量
することができる。

【０００９】尿素窒素の定量用試薬は、一般に、基質ア
デノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）を含む試薬１と、酵
素ウレアアミドリアーゼ（ＵＲＬ）を含む試薬２より構
成されるが、本発明に従う測定試薬にあっては、共役酵
素ヘキソキナーゼ（ＨＫ）とグルコース６リン酸デヒド
ロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、および補酵素（ＮＡＤ）が
ともに、試薬１に含有されている。そして、本発明に従
う測定試薬は、さらに、基質を含む試薬１がｐＨ３．０
〜６．５の酸性に調節されているか（酸性調節）、もし
くは二価の金属イオン就中マグネシウムイオン（Ｍｇ
^２＋）が試薬１に適当な濃度で共存しているか（金属イ
オン共存）、もしくは酢酸、シュウ酸、マロン酸、フマ
ル酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸またはこれらの塩
からなる群より少なくとも一種選択されたカルボン酸ま
たはその塩が試薬１に適当な濃度で添加されている（カ
ルボン酸添加）。したがって、基質アデノシン５’−三
リン酸（ＡＴＰ）を含む試薬１に、共役酵素（ＨＫ）の
基質（ＡＤＰ）が不可避的に混在する場合、その試薬を
用いて尿素窒素の測定を行なうと、混在するＡＤＰに由
来する酵素反応も進行し、計測対象のＮＡＤＨが余剰に
生成し、結果として、試薬のブランク反応値が増大する
ことにある。これに対して、本発明の測定試薬において
は、たとえ共役酵素の基質ＡＤＰが当初より試薬１に混
在していても、共役酵素ＨＫおよびＧ６ＰＤＨ並びに補
酵素ＮＡＤが試薬１に含有されているので、尿素窒素の
測定以前に、上述の酵素反応が進行し、混在ＡＤＰに由
来する分の生成物ＮＡＤＨが既に試薬１中に生成され、
さらに試薬１には上記の酸性調節、金属イオン共存また
はカルボン酸添加の処理が為されることにより、混在Ａ
ＤＰに由来する分のＮＡＤＨは試薬１より消去される。
従って、本発明の測定試薬および測定方法にあっては、
試薬のブランク反応値が著しく軽減され、測定値の正確
さおよび信頼性が担保される。また、基質のＡＴＰは水
溶液中で非酵素的に加水分解され易いため、ＡＴＰを含
む試薬を液状の形態で保存した場合、加水分解によって
リン酸が遊離し、同時にＡＤＰが試薬中に生じる。然し
ながら、測定試薬が液状の試薬であって、その保存の間
に、基質ＡＴＰの非酵素的分解により共役酵素の基質Ａ
ＤＰが経時的に生成する傾向にあるときも、酵素反応系
の作用に関して上記と同様の原理が成り立つ。すなわ
ち、本発明の測定試薬は、共役酵素ＨＫおよびＧ６ＰＤ
Ｈ並びに補酵素ＮＡＤを、基質ＡＴＰを含む試薬１に含
ませるものであるので、液状試薬化によってＡＤＰが分
解生成しても、ＮＡＤＨにまで変換され、さらに試薬１
に対する上記の酸性調節、金属イオン共存またはカルボ
ン酸添加により、ＮＡＤＨは試薬より消去される。従っ
て、本発明の測定試薬および測定方法にあっては、試薬
のブランク反応が有効に軽減され、よって、測定値の正
確さおよび信頼性が一層高まる。

【００１０】上述した本発明に従う尿素窒素の定量用試
薬は、代表的には、基質ＡＴＰの他、グルコース、共役
酵素ＨＫおよびＧ６ＰＤＨ、補酵素ＮＡＤ、および緩衝
液などよりなる試薬１と、酵素ＵＲＬおよび緩衝液など
よりなる試薬２とから構成される。試薬１もまた試薬２
も、およそｐＨ７．０の中性液に調節される。本発明に
従う尿素窒素の定量用試薬にあっては、試薬１、２に含
まれる酵素ＵＲＬ、共役酵素ＨＫおよびＧ６ＰＤＨ、並
びに補酵素ＮＡＤの各添加量は、試料（検体）中に含ま
れる尿素窒素の濃度に依存して、適宜変更される。例え
ば、検体として、濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌの尿素溶液を測
定する場合には、ＵＲＬは１ｕ／ｍＬ以上の濃度で、Ｎ
ＡＤは０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で、ＨＫは０．１
ｕ／ｍＬ以上の濃度で、そしてＧ６ＰＤＨは０．２ｕ／
ｍＬ以上の濃度で、それぞれ、試薬１または試薬２に含
まれていることが望ましい。緩衝液としては、定量用試
薬において通常使用されているものであれば、いずれも
使用可能であるが、共役酵素ＨＫの基質ＡＤＰの生成を
抑える作用効果を奏するものが、特に好ましい。その例
としては、酢酸、クエン酸、トリス−ヒドロキシメチル
−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ＡＤＡおよびＢｉｃｉｎ
ｅなどが挙げられる。これらの緩衝液は、尿素窒素の定
量用試薬に限定されるものでなく、本発明に従う測定試
薬全般に適用しうるものである。また、上記の試薬１
は、好ましくは、塩酸などの添加により、ｐＨ３．０〜
６．５の酸性の溶液に調節される。または、好ましく
は、マグネシウム塩例えば塩化マグネシウムの添加によ
り、試薬１には、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）が特
に２ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で共存するように調製され
る。あるいは、好ましくは、試薬１には、カルボン酸ま
たはその塩、特に酢酸、シュウ酸、マロン酸、フマル
酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸またはこれらの塩が
添加される。カルボン酸またはその塩は、二種類以上の
ものを添加してもよく、また、その濃度は、１０ｍｍｏ
ｌ／Ｌ以上の濃度であるのがより好ましい。さらに、マ
グネシウム塩とカルボン酸またはその塩とは、同時に併
用して、試薬１に添加してもよい。試薬１に対するこれ
らの処理により、測定以前において、試薬１中に生成し
うるＮＡＤＨを予め消去することができ、従って、ブラ
ンク反応が軽減され、測定の正確さが担保される。

【００１１】従って、本発明の測定試薬および測定方法
によると、試薬のブランク反応を有効に軽減し、測定値
の正確さおよび信頼性をより向上させることができる
が、この作用効果は、例えば、次の場合において、効果
的にかつ有利に発揮される。 １．複数段階の酵素反応からなる一連の酵素反応系のう
ち、第一の酵素反応に用いられる基質（上記の例で言え
ば、ＡＴＰ）の製品の純度が低く、共役酵素の基質（上
記の例で言うと、ＡＤＰ）がその製品中に混在している
可能性が高い場合。 ２．複数段階の酵素反応からなる一連の酵素反応系のう
ち第一の酵素反応に用いられる基質が不安定な物質であ
って、粉末などの固体形態にあっても、空気酸化とか吸
湿などによって容易に分解し、共役酵素の基質が生成さ
れる可能性が高い場合。 ３．複数段階の酵素反応からなる一連の酵素反応系のう
ち第一の酵素反応に用いられる基質を水溶液中に保存す
る液状試薬であって、その基質が加水分解などにより経
時的に分解されて共役酵素の基質が必然的に生成し混在
してくるため、その共役酵素の基質を試薬中より消去す
る必要がある場合。

【００１２】

【実施例】以下、本発明の最良の実施形態と思われる実
施例を説明することにより、本発明をより明確なものに
する。

【００１３】実施例１ 本実施例は、尿素窒素の定量用試薬およびそれを用いた
定量方法に関する。この測定試薬は、試薬１をヒトの尿
などの試料に添加し、続いて試薬２を添加し、そしてそ
の反応液について波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定
することにより、試料に含まれる尿素窒素の量を測定す
るものである。まず、以下の組成を有する試薬１および
試薬２よりなる測定試薬Ｉ（共役酵素／試薬１）をそれ
ぞれ調製した。測定試薬Ｉでは、共役酵素ＨＫおよびＧ
６ＰＤＨが試薬１に含有されている。 試薬１ Ｔｒｉｓ １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤ ４ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ ２ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース ６ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＫ １ｕ／ｍＬ Ｇ６ＰＤＨ ３ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ７ ．０に調節されている。 試薬２ Ｔｒｉｓ ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＵＲＬ ４．５ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ ７．１に調整されている。 注）Ｔｒｉｓ＝トリスヒドロキシメチルアミノメタン また、比較例として、共役酵素ＨＫおよびＧ６ＰＤＨが
試薬２に含有されている測定試薬ＩＩ（共役酵素／試薬
２）をも調製した。 試薬１ Ｔｒｉｓ １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤ ４ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ ２ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース ６ｍｍｏｌ／Ｌ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ ７．０に調節されている。 試薬２ Ｔｒｉｓ ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＵＲＬ ４．５ｕ／ｍＬ ＨＫ ３ｕ／ｍＬ Ｇ６ＰＤＨ ６ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ ７．１に調整されている。 注）Ｔｒｉｓ＝トリスヒドロキシメチルアミノメタン しかして、実際の臨床検体の代わりに、濃度１０ｍｍｏ
ｌ／Ｌの尿素水溶液を試料として用い、試料中の尿素窒
素の量を次の手順に従い測定した。実施例の測定試薬Ｉ
および比較例の測定試薬ＩＩについて、調製直後の試薬
１および試薬２を吸光度自動分析装置Ｈ７１７０型（株
式会社日立製作所 製）にそれぞれ組み込み、エンド法
に基づいて試料中の尿素窒素を定量した。すなわち、試
料２．４μｌに試薬１ ２４０μｌを加え、その後これ
を３７℃にて５分間加温し、次いで、試薬２ ８０μｌ
を更に添加し、そして、試料液の３４０ｎｍにおける吸
光度を上記の自動分析装置にて測定した。また、各々の
測定試薬（試薬１）を３７℃にて７日間保存し、しかる
後、その保存された各測定試薬を用い、また上記の試料
と同じものを使用して、調製直後の場合と同様の分析測
定をそれぞれ行なった。しかして、その結果を図１にま
とめて示す。同図より、共役酵素ＨＫおよびＧ６ＰＤＨ
が試薬１に含有されている実施例の測定試薬Ｉ（共役酵
素／試薬１）は、共役酵素ＨＫおよびＧ６ＰＤＨが試薬
２に含有されている比較例の測定試薬ＩＩ（共役酵素／
試薬２）と比較して、長期間の保存の後も、吸光度の変
動（とくに上昇）が殆どなく、試薬のブランク反応がか
なり軽減されていることがわかる。むしろ、実施例の測
定試薬Ｉにあっては、長期保存の後、吸光度が減少して
おり、ブランク反応が生じにくい試薬に変化していると
いえる。

【００１４】実施例２ 以下の組成を有しそしてｐＨ６．０ないしｐＨ７．５の
範囲で液性が調節されている試薬１と、以下の組成を有
する試薬２よりなる７種類の測定試薬を調製した。 試薬１ アセトアミドイミノ二酢酸 １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤ ４ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ ２ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース ２ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＫ １．５ｕ／ｍＬ Ｇ６ＰＤＨ ４．５ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐ Ｈ６．０〜ｐＨ７．５の範囲に調節されている。 試薬２ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＵＲＬ ４．５ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ７．１ に調節されている。 そして、実施例１で使用されたのと同じ尿素水溶液を試
料として用い、その試料中の尿素窒素の量を測定するた
めに、吸光度自動分析装置Ｈ７１７０型（株式会社日立
製作所 製）を使用して、実施例１と同様の手順に従
い、試薬１（ｐＨ６．０〜ｐＨ７．５の範囲にある種々
の試薬）および試薬２を試料に添加した後の吸光度の値
をそれぞれ測定した。そして、調製直後（保存前）の試
薬１を用いた場合と、３７℃にて７日間保存した後の試
薬１を用いた場合とについて、それぞれ、３４０ｎｍに
おける吸光度の値を測定し、対比することとした。しか
して、その結果を図２にまとめて示す。同図より、試薬
１のｐＨ値をより低い値に、つまり試薬１をより酸性側
に調節すればするほど、長期間（３７℃で７日間）の保
存後における吸光度がより減少し、測定試薬のブランク
反応がより大きく軽減されることがわかる。とりわけ、
試薬１をｐＨ６．５以下の酸性に調節すると、測定試薬
のブランク反応は、それを長期間保存しても、保存前の
場合と比較して、まったく増大しないことが判明した。

【００１５】実施例３ 以下の組成を有しそして塩化マグネシウム（ＭｇＣ
ｌ_２）を種々の濃度で含む試薬１、並びに、以下の組成
を有する試薬２よりなる各種の測定試薬（対照として塩
化マグネシウムを含まない測定試薬を含む。）を調製し
た。 試薬１ トリスヒドロキシメチルアミノメタン １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤ ４ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ ２ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース ６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２ ０〜１６ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＫ １ｕ／ｍＬ Ｇ６ＰＤＨ ３ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐ Ｈ７．０に調節されている。 試薬２ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＵＲＬ ４．５ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐ Ｈ７．１に調節されている。 そして、実施例１で使用されたのと同じ尿素水溶液を試
料として用い、その試料中の尿素窒素の量を測定するた
めに、吸光度自動分析装置Ｈ７１７０型（株式会社日立
製作所 製）を使用して、実施例１と同様の手順に従
い、試薬１（塩化マグネシウムを０〜１６ｍｍｏｌ／Ｌ
の濃度で含む種々の試薬）および試薬２を試料に添加し
た後の吸光度の値をそれぞれ測定した。そして、調製直
後（保存前）の試薬１を用いた場合と、３７℃にて７日
間保存した後の試薬１を用いた場合とについて、それぞ
れ、３４０ｎｍにおける吸光度の値を測定し、対比する
こととした。しかして、その結果を図３にまとめて示
す。同図より、マグネシウムイオンを試薬１中に共存さ
せると、保存前の場合における吸光度は減少して、測定
試薬のブランク反応が軽減され、また、とりわけ長期間
（３７℃で７日間）の保存後における吸光度は著しく減
少し、測定試薬のブランク反応が格段に大きく軽減され
ることがわかる。特に、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度でマ
グネシウムイオンを試薬１中に共存させると、測定試薬
のブランク反応は、それを長期間保存しても、保存前の
場合と比較して、まったく増大しないことが判明した。

【００１６】実施例４ 以下の組成を有しそしてクエン酸を種々の濃度で含む試
薬１、並びに、以下の組成を有する試薬２よりなる各種
の測定試薬（対照としてクエン酸を含まない測定試薬を
含む。）を調製した。 試薬１ アセトアミドアミノ二酢酸 １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤ ４ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ ２ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース ２ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸 ０〜１６ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＫ １．５ｕ／ｍＬ Ｇ６ＰＤＨ ４．５ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ ７．０に調節されている。 試薬２ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＵＲＬ ４．５ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ ７．１に調節されている。 そして、実施例１で使用されたのと同じ尿素水溶液を試
料として用い、その試料中の尿素窒素の量を測定するた
めに、吸光度自動分析装置Ｈ７１７０型（株式会社日立
製作所 製）を使用して、実施例１と同様の手順に従
い、試薬１（クエン酸を０〜１６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で
含む種々の試薬）および試薬２を試料に添加した後の吸
光度の値をそれぞれ測定した。そして、調製直後（保存
前）の試薬１を用いた場合と、３７℃にて３日間保存し
た後の試薬１を用いた場合とについて、それぞれ、３４
０ｎｍにおける吸光度の値を測定し、対比することとし
た。しかして、その結果を図４にまとめて示す。同図よ
り、クエン酸をより高い濃度で試薬１中に添加すればす
る程、長期間（３７℃で３日間）の保存後における吸光
度がより減少し、測定試薬のブランク反応がより大きく
軽減されることがわかる。特に、保存後における吸光度
は全体にわたって保存前における吸光度よりもより大き
くなる傾向が見られ、測定試薬のブランク反応をより効
果的に軽減するためには、試薬１へのクエン酸の添加濃
度はより高い濃度で、少なくとも１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上
の濃度に設定することがより望ましい点が判明した。

【００１７】実施例５ 以下の組成を有しそして各種のカルボン酸を含む種々の
試薬１、並びに、以下の組成を有する試薬２よりなる各
種の測定試薬（対照としてカルボン酸を含まない測定試
薬を含む。）をそれぞれ調製した。本例におけるカルボ
ン酸として、酢酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コ
ハク酸、リンゴ酸およびクエン酸の７種のカルボン酸を
採用した。 試薬１ アセトアミドアミノ二酢酸 １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤ ４ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ ２ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース ２ｍｍｏｌ／Ｌ カルボン酸^ａ） ＨＫ １．５ｕ／ｍＬ Ｇ６ＰＤＨ ４．５ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ ７．０に調節されている。 ａ）添加されるカルボン酸の濃度： 酢酸：６０ｍｍｏｌ／Ｌ シュウ酸：３０ｍｍｏｌ／Ｌ マロン酸：３０ｍｍｏｌ／Ｌ フマル酸：３０ｍｍｏｌ／Ｌ コハク酸：３０ｍｍｏｌ／Ｌ リンゴ酸：３０ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸：２０ｍｍｏｌ／Ｌ 試薬２ トリスヒドロキシメチルアミノメタン ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＵＲＬ ４．５ｕ／ｍＬ １ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ ７．１に調節されている。 そして、実施例１で使用されたのと同じ尿素水溶液を試
料として用い、その試料中の尿素窒素の量を測定するた
めに、吸光度自動分析装置Ｈ７１７０型（株式会社日立
製作所 製）を使用して、実施例１と同様の手順に従
い、試薬１（各種のカルボン酸を含む７種の試薬および
含まない対照の試薬）および試薬２を試料に添加した後
の吸光度の値をそれぞれ測定した。そして、調製直後
（保存前）の試薬１を用いた場合と、３７℃にて７日間
保存した後の試薬１を用いた場合とについて、それぞ
れ、３４０ｎｍにおける吸光度の値を測定し、対比する
こととした。しかして、その結果を図５にまとめて示
す。同図より、これらカルボン酸を試薬１に添加する
と、保存前の場合における吸光度は減少して、測定試薬
のブランク反応が軽減され、また特に、長期間（３７℃
で７日間）の保存後における吸光度は相当に減少し、測
定試薬のブランク反応が大きく軽減されることがわか
る。特に、酢酸またはクエン酸を試薬１に添加したとき
は、長期間の保存後における吸光度はより大きく減少
し、測定試薬のブランク反応がより大きく軽減されるこ
とが判明した。

【００１８】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
酵素および共役酵素を用い、これら酵素の関与する反応
系を利用して試料中の測定物質を定量するための二試薬
系の測定試薬であって、試薬のブランク反応を有効に軽
減することができ、よって、測定値の正確さと高い信頼
性を担保することができるところの測定試薬が提供され
る。しかも、本発明の測定試薬によれば、試薬の各ロッ
ト間における混在不純物の濃度の差によって、試薬のブ
ランク反応が変動しないため、基質の質的な影響を受け
にくい安定した性能の試薬が提供されるという効果が得
られる。また、本発明によれば、本発明の測定試薬を用
いて、酵素および共役酵素の関与する反応系を利用して
試料中に存在する測定物質を定量するとき、試薬のブラ
ンク反応を有効に軽減することができ、従って、測定値
の正確さおよび信頼性を一層高めることができるという
効果が得られる。したがって、本発明に従う測定試薬お
よび測定方法は、ヒトの臨床検査における測定値の正確
さおよび信頼性の向上に寄与することができるという利
益を有するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、尿素窒素定量用の実施例の測定試薬Ｉ
（共役酵素／試薬１）および比較例の測定試薬ＩＩ（共
役酵素／試薬２）と、これらを用いた測定より得られる
波長３４０ｎｍにおける吸光度値との関係をそれぞれ示
し、各試薬のブランク反応の経時的変動を表わすグラフ
である。図中、白抜き棒グラフは、試薬の調製直後の測
定値を表わし、また、黒塗り棒グラフは、試薬を３７℃
で７日間保存した後の測定値を表わす。

【図２】図２は、尿素窒素定量用の実施例の測定試薬に
おいて、試薬１の液性（ｐＨ値）と、該測定試薬を用い
た測定より得られる波長３４０ｎｍにおける吸光度値と
の関係を示し、試薬１の酸性化に依るブランク反応の経
時的変動を表わすグラフである。図中、白抜きの〇印
は、試薬の調製直後（保存前）の測定値を表わし、ま
た、黒塗りの●印は、試薬を３７℃で７日間保存した後
の測定値を表わす。

【図３】図３は、尿素窒素定量用の実施例の測定試薬に
おいて、試薬１中に共存する塩化マグネシウムの濃度
と、該測定試薬を用いた測定より得られる波長３４０ｎ
ｍにおける吸光度値との関係を示し、マグネシウムイオ
ンの共存濃度に依るブランク反応の経時的変動を表わす
グラフである。図中、白抜きの〇印は、試薬の調製直後
（保存前）の測定値を表わし、また、黒塗りの●印は、
試薬を３７℃で７日間保存した後の測定値を表わす。

【図４】図４は、尿素窒素定量用の実施例の測定試薬に
おいて、試薬１に添加されるクエン酸の濃度と、該測定
試薬を用いた測定より得られる波長３４０ｎｍにおける
吸光度値との関係を示し、クエン酸の添加濃度に依るブ
ランク反応の経時的変動を表わすグラフである。図中、
白抜きの〇印は、試薬の調製直後（保存前）の測定値を
表わし、また、黒塗りの●印は、試薬を３７℃で３日間
保存した後の測定値を表わす。

【図５】図５は、様々なカルボン酸を試薬１に含有する
尿素窒素定量用の実施例の各種の測定試薬と、これら測
定試薬を用いた測定より得られる波長３４０ｎｍにおけ
る吸光度値との関係を示し、これら測定試薬におけるブ
ランク反応の経時的変動を、カルボン酸を含まない同測
定試薬の場合と対比して表わすグラフである。図中、白
抜き棒グラフは、試薬の調製直後（保存前）の測定値を
表わし、また、黒塗り棒グラフは、試薬を３７℃で７日
間保存した後の測定値を表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 合田 保 茨城県笠間市稲田字弥六内３−５ 株式会 社カイノス笠間研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 BA11 DA16 FB01 4B063 QA01 QQ03 QQ64 QQ87 QR04 QR07 QR42 QR44 QR47 QR50 QS20 QS28 QX01

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 基質を含む試薬１と、酵素を含む試薬２
   より構成され、該酵素および共役酵素の関与する反応系
   を利用して、試料中に存在する測定物質を定量する測定
   試薬において、前記共役酵素および補酵素を前記試薬１
   に含有させてなることを特徴とする、測定試薬。
2. 【請求項２】 前記補酵素は、ニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチドである、請求項１記載の測定試薬。
3. 【請求項３】 前記試薬１をｐＨ３．０〜６．５の酸性
   に調節することにより、該試薬１中に生成しうるニコチ
   ンアミドアデニンジヌクレオチド還元型が消去されてい
   ることを特徴とする、請求項２記載の測定試薬。
4. 【請求項４】 二価の金属イオンを前記試薬１に共存さ
   せることにより、該試薬１中に生成しうるニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチド還元型が消去されていること
   を特徴とする、請求項２記載の測定試薬。
5. 【請求項５】 前記二価の金属イオンは、マグネシウム
   イオン（Ｍｇ^２＋）であることを特徴とする、請求項４
   記載の測定試薬。
6. 【請求項６】 前記二価の金属イオンは、１〜１６ｍｍ
   ｏｌ／Ｌの濃度で試薬１に共存することを特徴とする、
   請求項４記載の測定試薬。
7. 【請求項７】 酢酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、
   コハク酸、リンゴ酸、クエン酸またはこれらの塩からな
   る群より少なくとも一種選択されたカルボン酸またはそ
   の塩を前記試薬１に添加することにより、該試薬１中に
   生成しうるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元
   型が消去されていることを特徴とする、請求項２記載の
   測定試薬。
8. 【請求項８】 前記カルボン酸またはその塩は、４〜６
   ０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で試薬１に含まれていることを特
   徴とする、請求項７記載の測定試薬。
9. 【請求項９】 基質を含む試薬１と、酵素を含む試薬２
   より構成される測定試薬を用い、該酵素および共役酵素
   の関与する反応系を利用して、試料中に存在する測定物
   質を定量する測定方法において、前記共役酵素および補
   酵素は前記試薬１に添加させておくことを特徴とする、
   測定方法。
10. 【請求項１０】 前記補酵素は、ニコチンアミドアデニ
    ンジヌクレオチドである、請求項９記載の測定方法。
11. 【請求項１１】 前記試薬１をｐＨ３．０〜６．５の酸
    性に調節することにより、該試薬１中に生成しうるニコ
    チンアミドアデニンジヌクレオチド還元型を予め消去す
    ることを特徴とする、請求項１０記載の測定方法。
12. 【請求項１２】 二価の金属イオンを前記試薬１に共存
    させることにより、該試薬１中に生成しうるニコチンア
    ミドアデニンジヌクレオチド還元型を予め消去すること
    を特徴とする、請求項１０記載の測定方法。
13. 【請求項１３】 前記二価の金属イオンは、マグネシウ
    ムイオン（Ｍｇ^２＋）であることを特徴とする、請求項
    １２記載の測定方法。
14. 【請求項１４】 前記二価の金属イオンは、１〜１６ｍ
    ｍｏｌ／Ｌの濃度で試薬１に共存することを特徴とす
    る、請求項１２記載の測定方法。
15. 【請求項１５】 酢酸、シュウ酸、マロン酸、フマル
    酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸またはこれらの塩か
    らなる群より少なくとも一種選択されたカルボン酸また
    はその塩を前記試薬１に添加することにより、該試薬１
    中に生成しうるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
    還元型を予め消去することを特徴とする、請求項１０記
    載の測定方法。
16. 【請求項１６】 前記カルボン酸またはその塩は、４〜
    ６０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で試薬１に含まれていることを
    特徴とする、請求項１５記載の測定方法。