JPH0155880B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素を含むグルコース測定用組成物
に関する。

尿や血液など体液中のグルコースの定量は、各
種疾患の診断、たとえば糖尿病の診断や治療、経
過の観察あるいは低血糖症の発見に利用されるき
わめて重要な臨床検査項目の一つである。

従来から、生体試料中のグルコースの定量法と
しては、グルコースの還元力を利用した各種の化
学的方法が利用されて来たが、反応試薬が発癌性
を有すること等のために、最近では酵素法が繁用
されるに至つた。

酵素法としては、グルコースオキシダーゼ法お
よびヘキソキナーゼなどが用いられている。然し
酵素は一般にきわめて不安定であり、水溶液の測
定状態で保持する時、グルコースオキシダーゼ法
の市販のキツトを用いた場合は３日間程度、ヘキ
ソキナーゼ法の市販のキツトを用いた場合は１日
しか有効に活性を保持し得ない。

従つて、マルチチヤンネルの自動分析機にかけ
た試薬溶液を、頻繁に交換しなければならず、煩
雑で手間がかかり且つ試薬のロスも大きい。それ
故これらの欠点を解決する方策が強く望まれてい
る。

本発明者等は、かかる要請に答える為、安定性
の高い、長期間保存可能な試薬を探索した結果、
前記特許請求の範囲第１項に記載の組成物を、水
溶液の状態で別に保存したNADP水溶液及び検
体とグルコース濃度測定の際に混合し、室温にて
一定時間放置後340nｍの吸光度を測定すること
により、グルコースの正確な定量が可能であり、
且つ該組成物の水溶液の室温における寿命が、従
来の市販のキツトの場合に比し延長されることを
見出し、本発明に到達した。

なお、前記本発明の組成物と混合して用いる別
に保在されるNADPの水溶液は、殺菌剤を加え
たものを使用すると、その保存安定性が増大し、
寿命が伸びて好ましい。

一方、従来のヘキソキナーゼ法の市販キツト
は、これに含まれる成分を、ただ単にNADPの
水溶液（これをＡ液と呼ぶ）とヘキソキナーゼを
含む他の成分の水溶液（これをＢ液と呼ぶ）に、
別々に調製しそれぞれ別々に保存しても、Ｂ液は
調製後１日を越えてはその活性を保持出来ない。
従つて、Ｂ液を毎日新しく調製しＡ液と混合して
分析に供しなければならない問題があつた。

本発明者らは、ヘキソキナーゼ法に用いる試薬
の保存安定性を改良すべく、ヘキソキナーゼを含
む各種組成物について検討を行い、本発明に到達
した。

即ち、本発明は、「NADPと組み合わせてグル
コース測定用に供する為のものであつて、スルフ
ヒドリル化合物及び／又はキレート剤並びに
ATP、Mgイオン、HK、G6PDH、殺菌剤及び
PH緩衝剤の各成分を含む水溶液であることを特徴
とし、上記スルフヒドリル化合物は１〜50ｍＭ濃
度、キレート剤は0.1〜20ｍＭ濃度である組成物」
である。

但し上記のNADPは、酸化型ベータニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドフオスフエート
を、ATPはアデノシントリフオスフエートを、
HKはヘキソキナーゼを、G6PDHはグルコース
−６−燐酸デヒドロゲナーゼを意味する。

本発明の目的は、水に溶解後室温においても寿
命の長いグルコース定量用の組成物（Ｂ液）を提
供し、グルコース定量を能率化するにある。

本発明の組成物の各成分の好ましい濃度は、次
の通りである。PH緩衝剤0.025〜0.25M濃度、
ATP0.4〜５ｍＭ濃度、Mgイオン１〜25ｍＭ濃
度、HK0.3〜5u／ml、G6PDH0.3〜5u／ml、殺菌
剤0.1〜30ｍＭ濃度、スルフヒドリル化合物１〜
50ｍＭ濃度、キレート剤0.1〜20ｍＭ、又さらに
使用時に非イオン性界面活性剤を０〜0.1重量％
添加することが好ましい。

この他に本発明の組成物にアルブミン等の蛋白
質、糖、糖アルコール及びグリセロールの如きポ
リオール類、等の凍結乾燥安定剤を加えることも
出来る。本発明の組成物に加えるPH緩衝剤は使用
時においてPH6.5〜8.5の範囲の一部または全部に
緩衝能のあるものが好ましい。

本発明の思想は、異つた観点からは前記の本発
明組成物の水溶液を使用して、検体中のグルコー
スを分析する方法として把握することも出来る。

本発明に係わるグルコース定量の原理を、式で
示せば次の通りである。

グルコース＋ATPグルコース−６−燐
酸＋ADP ↑ ヘキソキナーゼ グルコース−６−燐酸＋NADP６−ホス
ホグルコン酸＋NADPH ↑ グルコース−６−燐酸デヒド
ロゲナーゼ 上記の反応式においてNADPは、酸化型ベー
タニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフオス
フエートを表す。又NADPHは、還元型ベータ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフオスフ
エートを表す。

上記の反応によりグルコースが消費れ、グルコ
ースの減少はNADPHの生成量に等しい。従つ
てNADPHの示す、340nｍにおける吸光度増加
量を分光光度計により測定し、検体中のグルコー
ス濃度を測定することが出来るのである。

上記のグルコース測定方法は、ヘキソキナーゼ
法（HK法と略称される）と呼ばれ、グルコース
定量法として、 グルコースに対する特異性が高い。

正確で検量線を必要としない。

妨害が少ない。

迅速に行える。

等の長所を有する優れた測定法である。然しなが
ら、測定に使用される液の組成が不安定で、室温
において長時間保存出来ない大きな欠点があつ
た。

この課題を見事に解決したのが本発明であつ
て、スルフヒドリル化合物及び／又はキレート剤
並びに殺菌剤及びPH緩衝剤を存在させることによ
り、上記分析用の液の保存安定性が顕著に改善さ
れ、室温における寿命が延長された。

従来、一般に酵素を生体より精製する際に、各
種のスルフヒドリル化合物、あるいはキレート剤
が使用されてきている。これは、冷却下に生体細
胞を摩砕して酵素を取出す際、及び酵素の精製、
保存時酵素が破壊されることを防ぐ為に用いられ
るのである。従つて、この様に酵素製造時にスル
フヒドリル化合物又はキレート剤が使用されるこ
とが知られていても、グルコースをヘキソキナー
ゼ法により定量する際に、測定液（Ｂ液）の寿命
を延長する効果を有することは全く予想されなか
つたことである。

又スルフヒドリル化合物又はキレート剤を、酵
素を製造する際に使用することがあるので、本発
明の組成物に用いられるヘキソキナーゼ又は
G6PDHに、これらの化合物が随伴する可能性が
考えられないでもない。然しながら、実際上は酵
素を製造する際に使用されるこれら化合物の量
は、酵素の量に見合う程度の量であり、これらを
用いてグルコース測定用組成物を調製する場合に
は、スルフヒドリル化合物及び／又はキレート剤
は、他の成分により希釈されて本発明の組成物に
おいて必要な濃度の範囲外になり、本発明組成物
の如き寿命を延長する効果は見出されない。この
ことは、市販の多数のHK法グルコース分析用キ
ツトにつき、ランダムに調べた結果裏付けられ
た。

本発明の効果は、第１に当該組成物が室温状態
において、長時間寿命を保つ点にある。本発明の
第２の効果として、ブランクの吸光度が安定して
いて、測定精度を向上させる特長があるが、これ
も重要である。ヘキソキナーゼ法でグルコースを
分析する場合、スルフヒドリル化合物及び／又は
キレート剤が存在しないと、試薬ブランクの吸光
度が大きく経時的に変化し測定値がバラつく原因
となる。

本発明においては、スルフヒドリル化合物又は
キレート剤の何れかが存在するだけでもよいが、
両者が存在する場合が特に効果が著しい。又本発
明の組成物の使用時におけるスルフヒドリル化合
物及びキレート剤の好ましい濃度は、前述の如く
それぞれ0.1〜200ｍＭ濃度及び0.01〜100ｍＭ濃
度であるが、前者は更に好ましくは１〜50ｍＭ濃
度、後者は更に好ましくは0.1〜20ｍＭ濃度であ
る。

本明細書に記載されている室温とは、特に記載
がない限り０〜30℃を意味する。

本発明の組成物を使用して、検体中のグルコー
スを測定する原理については既に述べた。実際グ
ルコースを測定するには、本発明の組成物の水溶
液と、別途保存された好ましくは殺菌剤入つた
NADP水溶液（グルコース測定時にNADP0.3〜
５ｍＭとなる濃度が好ましい）及び検体とを混合
して、室温で一定時間放置後、生成する
NADPHの340nｍの吸光度を測定する。

従つて本発明の組成物に用いる諸化合物、殺菌
剤、PH緩衝剤等は、勿論添加される非イオン性界
面活性剤、凍結乾燥安定剤等に340nｍの吸光度
測定を著しく妨害するものがあつてはならない。
勿論、これらの諸成分において340nｍに吸収が
あつても、ブランクテスト値を差し引くことによ
り、グルコース分析値の測定に実際上影響を及ぼ
さぬ範囲であれば差し支えない。

本発明の組成物に加える好ましい殺菌剤の例と
しては、アルカリ金属のアジ化合物、メチレング
ルタロニトリルの臭化物等が挙げられる。本発明
の組成物に用いられるスルフヒドリル化合物を例
示すれば、還元型グルタチオン、システイン、Ｎ
−アセチルシステイン、チオラクトイルグリシ
ン、チオリンゴ酸、チオグリセロールである。又
本発明の組成物に用いられるキレート剤を例示す
れば、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、
EGTA（エチレングリコールエーテルジアミン四
酢酸）である。これらの例示化合物は、いずれも
340nｍにおけるグルコース測定に大きな妨害を
与えない。

本発明に使用されるヘキソキナーゼ及び
NADPを補酵素とするG6PDHは、Bergmyer編、
Method of Enzymatic Analysis 2nd.Engl.Ed.1
巻p473、p459 Academic Press（1974）に準拠し
て測定することが出来る。この測定法は、今日当
業者が常時使用するありふれたものである。

本発明のヘキソキナーゼ及びG6PDHのデータ
は、上記の測定法によつて裏付けられたものであ
る。但し測定は30℃を用いた。

なお本発明の組成物の実際の状態は、水溶液で
ある。以下実施例及び比較例をあげ、本発明を具
体的に示す。又これらの実施例及び比較例の或る
ものについては、それらの組成物を使用して検体
のグルコースを測定した結果等を述べる。

実施例 １ ATP2ｍＭ濃度、酢酸マグネシウム10ｍＭ濃
度、還元型グルタチオン10ｍＭ濃度、EDTA1ｍ
Ｍ濃度、アジ化ナトリウム３ｍＭ濃度、酵母型ヘ
キソキナーゼ1u／ml及び酵母型G6PDH1u／mlを
含む0.1M濃度のトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩酸緩衝液（PH7.5）を実施例１の組
成物とする。これを第１試薬と呼ぶ。次に
NADP17ｍＭ濃度およびアジ化ナトリウム３ｍ
Ｍ濃度を含む0.1M濃度の燐酸緩衝液（PH6.2）を
用意し、これを第２試薬と呼ぶ。

第１試薬を第２試薬と共に室温（26℃）に保存
した。測定時に第１試薬2.88ml、第２試薬0.12ml
を混合し、さらに検体20μを添加し、室温（26
℃）にて10分後に、340nｍの吸光度を測定し、
上記液体試薬の340nｍの吸光度（ブランク値）
を差引いて検体中のグルコース濃度を測定した。
なおこの測定法を終末法と呼ぶことがある。

その結果を第１図及び第２図のNo.１にそれぞれ
示す。

このNo.１の線に示される通り、10日以上にわた
つて測定値は同一の値を示した。この際の試薬ブ
ランク値を、第１図のNo.２に示す。このブランク
値も、10日以上にわたつて一定の測定値を示し安
定であつた。

比較例 １ 市販のヘキソキナーゼ法グルコース定量用試薬
キツト（藤沢メデイカルサプライ社製uv用グル
コース；スルフヒドリル化合物及びキレート剤の
いずれも有効量は含まれていない）、を所定の水
に溶解しこれにアジ化ナトリウムを３ｍＭ濃度に
なる様に添加した組成物を、室温（26℃）にて保
存した。この液を用いて、実施例１と同様にして
グルコースを測定した。その結果は、第１図のNo.
３の線に示されている。この線によると３日迄に
測定値は大きく減少している。その際の試薬ブラ
ンクは、第１図のNo.４の線により示される様に10
日迄に急上昇している。

比較例 ２ 上記実施例１の第１試薬、第２試薬をそれぞれ
2.88mlと0.12mlの割合で混合し比較例２の組成物
（液体）とする。これを室温（26℃）に保存し、
実施例１の場合と同じ検体につき、実施例１と同
様にしてグルコースを測定した。その結果は、第
２図の破線（No.５）に示される通りであり、３日
以降の測定値は始めの値より大きく減少してい
る。これは、上記第１試薬と第２試薬を混合して
貯蔵すると、その活性が次第に劣化する（安定性
がない）ことを示している。

参考例 １ 前記の実施例１の組成物を使用し、種々のグル
コース濃度の検体につき、実施例１の場合と同様
にしてグルコースの量を測定し、そのデータをグ
ラフにプロツトした。その結果、吸光度と濃度と
の間に第３図に示す通りの直線関係を得た。

又種々のグルコース濃度の検体につき、本発明
の組成物を使用した場合と、比較例１で用いたの
と同じ市販のヘキソキナーゼ法グルコース定量用
キツトを使用した場合の、測定値を比較した結果
を第４図に示す。但し上記市販のキツトを使用し
た場合は、グルコース分析用の液体組成物を調製
したあと、数時間以内に全ての測定を終了してい
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の組成物又は比較試薬を用い
て行つた、グルコースの測定値及び試薬ブランク
の経日変化を示す図である。第２図は、本発明の
組成物又は比較試薬を用いて行つたグルコースの
測定値の経日変化を示す図である。第３図は、実
施例１の組成物を使用して測定した、検体中のグ
ルコース濃度（横軸）と340nｍ吸光度（縦軸）
の間の直線性を示す図である。第４図は、本発明
の組成物を使用した場合（縦軸）と、市販ヘキソ
キナーゼ法グルコース定量キツトを使用して得た
吸光度（横軸）、の相関を示す図である。なお、
第１〜４図において、第１図のNo.２及びNo.４以外
の吸光度は試薬ブランクを差し引いた値である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ NADPと混合してグルコース測定用に供す
   る為のものであつて、スルフヒドリル化合物及
   び／又はキレート剤並びにATP、Mgイオン、
   HK、G6PDH、殺菌剤及びPH緩衝剤の各成分を
   含む水溶液であることを特徴とし、上記スルフヒ
   ドリル化合物は１〜50ｍＭ濃度、キレート剤は
   0.1〜20ｍＭ濃度である組成物。 但し上記のNADPは酸化型ベータニコチンア
   ミドアデニンジヌクレオチドフオスフエートを、
   ATPはアデノシントリフオスフエートを、HK
   はヘキソキナーゼを、G6PDHはグルコース−６
   −燐酸デヒドロゲナーゼを意味する。