JP3470099B2

JP3470099B2 - デヒドロゲナーゼまたはその基質を測定するための安定化補酵素溶液およびその使用

Info

Publication number: JP3470099B2
Application number: JP2001005618A
Authority: JP
Inventors: ラルフ，ジレンスキ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-01-15
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2003-11-25
Anticipated expiration: 2021-01-12
Also published as: ES2340020T3; US20050136505A1; JP2001238697A; EP1120468A2; DE50115357D1; EP1120468A3; ATE458829T1; EP1120468B1; DE10001529A1; US7300769B2; US20010044128A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、水素転移酵素のた
めの補酵素の安定化水性溶液ならびに還元型の対応する
アナライト(基質)を測定するか、または対応するデヒド
ロゲナーゼの酵素活性を測定するための該溶液の使用に
関する。該安定化溶液は、1.5〜6.0のpKa値を有する有
機化合物またはその適当な塩、および／またはヒドロキ
シルアミン誘導体を含有する。

【０００２】

【従来の技術】特に血清または血漿における酵素活性
(または基質濃度)の測定は、臨床化学診断において重要
な役割を果たす。このためには、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（「NAD」）またはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（「NADP」）の還元と、そ
の結果得られる紫外線波長域(λ＝334、340または365 n
m)における吸光現象の変化の光度測定検出とに基づく試
験方法を採用することが多い。適当な試験条件が選択さ
れていれば、この変化は、測定しようとする酵素活性
(または基質濃度)に直線的に比例する。

【０００３】現在、例えば乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH、
E.C.1.1.1.27)などの酵素活性の測定には、Eur. J. Cli
n. Chem. Clin. Biochem. 31, 897 (1994)およびEur.
J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 32, 639 (1994)に記載
された方法が一般的に推奨されている。この試験の原理
には、乳酸のピルビン酸への酸化が含まれ、その間、NA
DもしくはNADPなどの補酵素が同時にNADHもしくはNADPH
に還元される。かかる変換は、この場合には、例えば、
LDHによって触媒され、アルカリ性媒質(pH 9.4)中で起
こる。この不安定性の結果として、測定波長域における
吸光度(いわゆる試薬ブランク)が相対的に急速に上昇
し、従ってこの試薬の組合せは、冷蔵室(2〜8℃)中に保
存したときでさえ、短時間(3ヶ月)のうちにもう使用に
適さなくなってしまう。こうしたことは、使用者が簡便
で信頼できるやり方で日課として分析を行うことができ
るようにと意図された、長期の貯蔵寿命を有する即使用
可能な液体試薬の製造の場合に特に問題となる。

【０００４】キレート化剤およびアジドを用いて水性補
酵素を安定化させる方法が、JP 84/82398から知られて
いる。しかし、この方法の不利な点は、今日では癌原性
であると分類され、しかも多くの酵素に対する阻害作用
を有するとされるアジドを添加する必要があることであ
る。

【０００５】また、補酵素溶液は重金属塩(例えば、銅
(II)イオンの形態)を添加することによって安定化さ
れ、試薬ブランクの上昇を防止することができることも
知られている(DE 195 43 493またはEP 0 804 610)。し
かし、長期間の保存や高温(10℃を超える温度)での保存
の間に分解生成物が形成され、かかる分解生成物は測定
しようとするデヒドロゲナーゼ酵素を阻害するため、測
定値が低すぎるという結果をもたらす。一定の品質で長
期間(3ヶ月以上)にわたって安定化させることができ、
特にキャリブレーションを繰り返す必要のない試薬は、
現在のところ入手不可能である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、デヒドロゲナーゼ活性または対応する基質を測定す
るのに適した水素転移酵素のための補酵素を含有する、
改良された安定な液体試薬を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この目的は、酸化型もし
くは還元型(いわゆる再生システム)のNAD、NADPまたは
適当な誘導体などの水素転移酵素のための補酵素、およ
び1.5〜6.0のpKa値を有する１種以上の有機化合物もし
くはそれから誘導された塩および／または下記の一般式
(I)： [式中、残基R¹、R²およびR³は、同一でも異なっていて
もよく、水素を表すか、あるいは飽和もしくは不飽和ア
ルキル基またはアリール基である]を有する窒素化合物
を含有する水性溶液によって達成される。

【０００８】

【発明の実施の形態】好適なアルキル基は、特に1〜10
個の炭素原子を有するものである。さらに、このアルキ
ル基は、直鎖状または分枝状であってもよい。本発明に
よる好適なアリール基は、置換または非置換フェニル基
であり、場合によっては1〜8個の炭素原子を有してもよ
いアルケニル基を介して結合している。前記一般式(I)
の窒素化合物、すなわち、特にヒドロキシルアミン、1
〜6個の炭素原子を有するO-もしくはN-アルキルヒドロ
キシルアミン、またはO-ベンジルヒドロキシルアミンな
どのヒドロキシルアミン誘導体またはそれらの塩(硫酸
塩、リン酸塩もしくはアンモニウム塩など)が、本発明
に従うと特に好適であることが証明された。さらに好適
なヒドロキシルアミン誘導体は、補酵素の分解生成物に
対して錯化作用を有する点に特徴がある。

【０００９】さらに、該溶液が錯化剤、すなわち２個以
上の配位座を有する配位子をさらに含有する場合、該溶
液の安定性をより改善することができる。エチレンジア
ミンなどの二座配位子、およびエチレンジアミン−N,N,
N,N-四酢酸(EDTA)またはその適当な塩(特にジナトリウ
ム塩)、クラウンエーテル、もしくはクリプタンドなど
の四座または多座配位子が、有利であることが証明され
た。これは、約0.5〜30mM、好ましくは1.0〜5.0 mMの錯
化剤の濃度に相当する。

【００１０】本発明に従って添加される約1.5〜6.0のpK
a値を有する有機化合物またはその塩は、特に、錯化作
用および1.0〜7.0のpH範囲の緩衝化作用を有する有機
酸、例えば、クエン酸およびその水溶性の塩である。

【００１１】本発明に従って添加される有機化合物、そ
の塩またはヒドロキシルアミン誘導体の濃度は、広範囲
で変化し、すなわち約0.001〜1.0 Mであり得る。クエン
酸またはクエン酸塩については、約5〜200 mMの濃度が
特に好適であることがわかった。多くの場合、約50 mM
のクエン酸またはクエン酸塩が望ましい効果を奏した。
適当なpKa値を有する有機化合物の存在下または非存在
下で添加される本発明によるヒドロキシルアミン誘導体
の好ましい濃度範囲は、約2〜300 mMである。該安定化
水性溶液のpH値は、1.0〜7.0の間であってよく、約2.0
〜4.0の間のpH値または約3.0のpH値が特に有利であると
わかった。

【００１２】さらに、NADもしくはNADPを含有する試薬
が、ヒドロキシルアミン誘導体および場合によってはさ
らにクエン酸塩を含有するとき、ならびにホウ酸もしく
はホウ酸塩が、特にN-メチルグルカミン(MEG)などの測
定に必要な緩衝液、基質および場合によっては他の補助
物質を含む、対応する水素転移アナライトを測定するの
に必要な、任意の別の試薬中にさらに存在するとき、特
に有益であることが証明された。上記で説明した濃度も
この特定の実施形態に適用することができる。さらに、
クエン酸塩もしくはクエン酸については約20〜200 mM、
それぞれのヒドロキシルアミン誘導体については約10〜
150 mMが特に有利であるとわかった。ホウ酸誘導体につ
いては約50〜200 mMの濃度範囲が特に好適であると判明
した。このホウ酸誘導体は、NADもしくはNADPを含有し
ない基質溶液(いわゆる試薬１)に添加されるのが好まし
い。

【００１３】いわゆるGood緩衝液(トリシン、ビシン、T
APS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS)、アルカリ金属
イオンの炭酸塩、MEG、TRISおよびリン酸緩衝液などのp
H約8．5〜10．0の優れた緩衝能を有する物質は、基質を
含有する試薬のための緩衝液として基本的には好適であ
る。前記緩衝物質の混合物も、本発明による溶液にとっ
て好適であることがわかった。さらに、緩衝液の濃度
が、約10〜1000 mM、好ましくは200〜600 mMである場合
に有益であることが証明された。さらに、ホウ酸もしく
はその可溶性の塩および誘導体を、主として実効pH値を
決定するアルカリ性緩衝溶液(試薬１)に添加することが
有利であるとわかった。好適なホウ酸成分の濃度は、好
ましくは約50〜200 mM、特に好ましくは約100 mMであ
る。

【００１４】本発明の意図する好適な補酵素は、特にNA
DおよびNADPであり、チオNAD(P)もしくはNHxDP(＝ニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸)など
の改変された補酵素も好適である。該補酵素は、反応容
器中に約1．0〜100 mMの濃度で存在し得るが、5．0〜1
5．0 mMの範囲が好ましい。

【００１５】本発明による安定化補酵素溶液は、水溶液
の形態で使用されるのが好ましい。さらに、本発明の即
使用可能な試薬は、顆粒、粉末混合物および凍結乾燥物
としても長期間にわたって安定である。従って、試薬の
分解の兆候は、温度2〜8℃で15ヶ月以内には全く認めら
れない。ストレス下、すなわち約35℃で2週間、または
約42℃で5日間処理しても、本発明に従って１種以上の
添加剤を含有する溶液は、質的に未変化、すなわち安定
な状態を保った。

【００１６】本発明のさらなる主題は、上記のように安
定化された水性溶液中に存在する水素受容補酵素の存在
下で、水素転移アナライトまたは対応するデヒドロゲナ
ーゼを測定するための方法である。

【００１７】この測定は、特に全血、血清もしくは血
漿、または他のヒトもしくは動物起源、あるいは植物抽
出物などの生物由来のサンプルにおいて実施される。こ
のサンプルは、生理食塩水を用いて調製することができ
る。その場合、対照値として0．9％のNaCl溶液を用いる
ことが有利である。

【００１８】乳酸デヒドロゲナーゼなどのデヒドロゲナ
ーゼの酵素活性を測定しようとする場合、約pH9．4(37
℃)で緩衝化する物質(混合物)中の乳酸溶液などの基質
溶液を用いる。この場合、該基質は、好ましくは40〜80
mMの範囲の当業者に公知の通常の濃度で用いることが
できる。

【００１９】乳酸などの水素転移アナライトを測定する
ためには、例えばLDHなどのそれぞれのデヒドロゲナー
ゼを、pH8．5〜10．0で緩衝化する物質中にまず添加す
る。通常、デヒドロゲナーゼの量は、約70〜500 U/l、
好ましくは110〜220 U/lで十分である。この測定は、通
常約37℃で行われる。

【００２０】例として記載した乳酸に加えて、グルタミ
ン酸もしくはアンモニア、アルコール、グリセルアルデ
ヒド-3-リン酸、グルコースまたは適当な補酵素依存性
デヒドロゲナーゼによって変換され得る他のパラメータ
ーを同様に測定することもできる。これは、対応する様
式でデヒドロゲナーゼの酵素活性の測定に用いられる。

【００２１】本発明のさらなる主題は、酵素またはアナ
ライトの測定を実施するためのいわゆる試験キットであ
る。このキットは、本質的に２つの部分試薬から構成さ
れる。これをデヒドロゲナーゼの活性を測定するのに用
いる場合、第１試薬は、pH 8.5〜10．0で緩衝化する適
当な系中に水素転移アナライト(基質)を含有する。第２
試薬は、NADもしくはNADPなどの水素転移酵素のための
補酵素および1．5〜6．0のpKa値を有する有機化合物お
よび／または本発明によるヒドロキシルアミン誘導体を
含有する。この第２試薬は、重金属塩または錯化剤など
の他の補助物質をさらに含有してもよい。これは、乳酸
などのアナライトまたは基質の測定にも同様に適用する
ことができる。略語 AMP ＝2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール AMPSO ＝3-[(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)アミ
ノ-2-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸ビシン＝N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]グリシン CAPS ＝3-[シクロヘキシルアミノ]-1-プロパンスル
ホン酸 CAPSO ＝3-[シクロヘキシルアミノ]-2-ヒドロキシ-1-
プロパンスルホン酸 CHES ＝2-[N-シクロヘキシルアミノ]エタンスルホン
酸 MEG ＝N-メチルグルカミン TAPS ＝N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミ
ノプロパンスルホン酸トリシン＝N-トリス[ヒドロキシメチル]メチルグリシン TRIS ＝2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパ
ノール

【００２２】

【実施例】本発明を下記の実施例によりさらに説明す
る。実施例１試薬１： 390 mmol/l N-メチルグルカミン pH 9.4(37
℃)；60 mmol/l L-乳酸リチウム試薬２： 60 mmol/l NAD(P)(凍結乾燥物、粉末混合
物、顆粒または水性溶液として) インキュベーション温度： 37±0．1℃；測定波長 340
±2 nm；経路の長さ 7mm；プレインキュベーション： 5分；ラグ相：2分；測定時
間：2分試薬１＝250μl；試薬２＝50μl；サンプル＝7μl NaCl
溶液(0．9％ w/v) 以下の測定を行った(IFCC：乳酸塩、NAD/NADPおよびN-
メチルグルカミン、pH9.4を含有するLDH測定用の認知さ
れた標準品；Eur. J. Clin. Chem. Biochem. vol. 32,
p. 639-655(1994))。表１を参照。

【００２３】

【表１】結果：部分試薬１および／または部分試薬２中に適当な
添加剤を含有する本発明の配合物は、特にストレス(5日
間、42℃)下で、IFCC標準方法と比較して、ほとんど変
化しないキャリブレーターブランク値と共にかなり改善
したブランク値を示す。

【００２４】実施例２実施例１に記載した初期溶液と、対応する手順を用い
た。クエン酸塩および／または異なる濃度および組合せ
の種々のヒドロキシルアミン誘導体を試薬２に添加した
(表２)。

【００２５】

【表２】結果：本発明の試薬２に添加した全ての化合物および塩
は、IFCC試薬と比較してストレス(5日間、42℃)後にも
向上した回収をもたらした。

【００２６】実施例３本発明による配合物を用いて、種々のイソ酵素の回収を
も実証した。これは、認知されたIFCC推奨の回収に一致
する必要がある(表３)。測定は、実施例１に記載された
IFCC試薬(従来技術)を用いて行い、本発明による試薬と
比較した。

【００２７】

【表３】結果：５種のLDHイソ酵素の回収を、本発明による試薬
を用いて実証した。

【００２８】前記改変を該配合物に加えれば、保存中
(＞12ヶ月)および輸送中(8℃を超える温度においてさ
え)に安定な状態で維持される液体LDH試薬を提供するこ
とが可能である。得られる利点は、使用者にとって自明
であり、本発明の明細書に示されている。

フロントページの続き (56)参考文献特開昭62−93662（ＪＰ，Ａ) 特開平７−59566（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/32 ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】酸化型または還元型のNAD、NADPおよび
それらの誘導体からなる群から選択される水素転移酵素
のための補酵素を水溶液中で安定化するための安定化剤
であって、クエン酸もしくはその水溶性の塩、および／
または一般式（I）：【化１】 [式中、残基R¹、R²およびR³は、同一でも異なっていて
もよく、水素を表すか、あるいは飽和もしくは不飽和ア
ルキル基またはアリール基を表す]を有する窒素化合物
を含有することを特徴とする、前記安定化剤。
【請求項２】クエン酸またはその水溶性の塩と、前記
一般式（I）を有する窒素化合物とを含有することを特
徴とする、請求項１に記載の安定化剤。
【請求項３】ヒドロキシルアミン、O-もしくはN-アル
キル-ヒドロキシルアミン、O-ベンジルヒドロキシルア
ミン、および／またはホウ酸誘導体を含有することを特
徴とする、請求項１または２に記載の安定化剤。
【請求項４】酸化型または還元型のNAD、NADPおよび
それらの誘導体からなる群から選択される水素転移酵素
のための補酵素を水溶液中で安定化するための方法であ
って、該補酵素を含む水溶液中に請求項１〜３のいずれ
か１項に記載の安定化剤を添加することを含む、前記方
法。
【請求項５】前記安定化剤を添加した後の前記水溶液
のpH値が1.0〜7.0であることを特徴とする、請求項４に
記載の安定化方法。
【請求項６】水素受容補酵素の存在下で水素転移アナ
ライトまたは対応するデヒドロゲナーゼを測定する方法
であって、該補酵素が請求項４または５に記載の方法に
より安定化されていることを特徴とする、前記方法。
【請求項７】乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセ
ロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼまたはグルコースデ
ヒドロゲナーゼの存在下で、乳酸、グルタミン酸、アン
モニア、アルコール、グリセルアルデヒド-3-リン酸ま
たはグルコースであるアナライトを測定することを特徴
とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】 pH値が8.5〜10.0の範囲であり、且つ、
クエン酸塩、ホウ酸、および／またはヒドロキシルアミ
ン誘導体の最終濃度がそれぞれ2〜50 mMである条件下で
測定を行うことを特徴とする、請求項６または７に記載
の方法。