KR100301268B1 - 글루코오스측정용시약 - Google Patents

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Abstract

7.5 내지 9.5의 pH를 갖고 적어도 글루코키나제 또는 헥소키나제, 글루코오스 6-인산 탈수소효소 및 아데노신 5'-삼인산을 함유하는 제 1 액상 시약, 및 3내지 5의 pH를 갖고 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산을 함유하는 제 2 시약을 포함하는 글루코오스 측정용 시약. 이 시약은 그 자체로 상온 또는 저온에서 광과 접촉시키면서 또는 접촉시키지 않으면서 장기간에 걸쳐 안정하게 저장될 수 있어서, 임상 실험 현장에서 장기간동안 저장될 수 있으며 사용하기 전에 용해시킬 필요 없이 자동분석기에 사용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
글루코오스 측정용 시약
[기술분야]
본 발명은 글루코오스 측정용 시약에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 장기간에 걸쳐 안정한 글루코오스 측정용의 개선된 액상 시약에 관한 것이다.
[배경기술]
혈액 및 뇨 등의 생체액중 글루코오스의 측정은, 당뇨병 및 저혈당증 등의 다양한 질병의 진단 및 치료경과의 관찰에서 중요한 항목중 하나이다. 현재, 임상검사에 있어서 글루코오스의 측정법은 환원법,효소법,축합법과 간이측정법 등으로 크게 분류된다. 이들중 환원법은 글루코오스 이외에 다른 환원물질 등도 측정되기 때문에 1950년대부터는 특이성 면에서 우수한 효소법(글루코오스옥시다제법)이 도입되었다. 또한, 보다 특이적인 글루코오스 측정법으로서는 헥소키나제(이하, HK로 표기함)와 글루코오스-6-인산 탈수소효소(이하, G6PDH로 표기함)를 사용하는 HK-G6PDH법이 표준법으로서 채용되고 있다.
이 HK-G6PDH법은 정확한 글루코오스 측정치를 얻을 수 있는 유용한 측정법이지만, 시약구성성분이 불안정한 물질로 구성되어 있기 때문에 장기보존이 어렵다. 따라서, 일반적으로 효소 및 기질 등은 동결건조품으로서 공급되고 사용시에 완충액 등으로 용해시켜 사용하여 왔다. 그러나,작업성 및 비용 면에서 볼 때에도 용해 후 시약이 안정해야 하며, 예를 들어 일본국 특허 공개 공보 제 81-140899호와 같이 글루코오스 측정용 시약의 안정성에 관한 기술이 개시되어 있다.
상기 특허 공개 공보 제 81-140899호에는 설피드릴 화합물(예컨대 환원형 글루타치온, N-아세틸시스테인) 및/또는 킬레이트제(예컨대 EDTA, EGTA) 모두에 살균제 및 pH완충제를 존재시킴으로써 시약을 안정화시키고자 한 기술이 기재되어 있다. 이 기술은, 기본적으로는 동결건조품을 용해시켜 혼합시킨 시약을 목표로 하여 구성되어 있으며, 보조 효소 이외의 성분의 수용액(B액)의 안정성을 개선시키는 것으로 그 안정성은 겨우 10일 정도이다.
또한, 일본 특허 공개 공보 제 88-24900호에는 장기간(1년 이상) 보존가능한 글루코오스 정량용 안정화 액체 효소 조성물에 관한 기술이 개시되어 있다. 이것은 시약구성을 효소시약(헥소키나제 및 G6PDH)과 보조효소시약(ATP 및 NAD)의 2개 시약계로 하여, 효소시약에는 약 20 내지 40%(v/v)의 폴리올 유기용매, 안정제계의 EDTA, 알부민 및 폴리비닐피롤리돈 등의 산화방지제 및 아지드화나트륨 같은 미생물억제제를 첨가하고 pH를 약 7.5로 조정한다. 또한 보조효소시약에는 약 5 내지 20%(v/v)의 폴리올 유기용매를 첨가하고 pH를 7.5로 조정한다.
그러나, 폴리올(글리세린 등)함유 시약 자체가 점성을 가지며 또한 산화방지제로서 폴리비닐피롤리돈을 병용하면 시약의 점성이 높아져서, 자동분석장치에 있어서 시약 주입 정밀도의 저하 같은 문제가 발생될 뿐만 아니라 특히 보조효소 NAD, ATP의 안정성이 불충분한 점등의 문제가 있다.
최근, 특히 시약형태를 공급할 때부터 액상으로 하고 사용자의 작업성을 향상시키고자 하는 요구가 있어왔다. 또한 이들 시약은 많은 경우 자동분석기에서 사용되기 때문에 시약구성을 2개의 시약계로하고 시약조성물의 안정성을 장기 간(예컨대 반년 내지 1년) 유지시킬 필요가 있다.
이 때, HK-G6PDH법의 반응식은 하기와 같다:
상기 식에서,
ATP는 아데노신 5'-삼인산이고,
ADP는 아데노신 5'-이인산이며,
NADP'는 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산이다.
상기 반응의 각 구성성분 각각에 상이한 안정조건이 존재하기 때문에,이들 성분을 배합함으로써 제조한 글루코오스 측정용 시약의 안정성도 각 성분의 조합에 의해 상승적으로 향상되기도 하고 반대로 불안정해지는 경우도 있었다.
또한, 종래에는 주로 수작업으로 사용하는 1개 시약계의 형태로 시료와 혼합하여 측정하였지만 자동분석기의 보급에 의해 2개 시약계가 통상적으로 되었다. 이들 2개 시약계에 있어서, 시약조성의 조합은 일반적으로 초발 효소의 기질인 ATP를 개시시약(제 2 시약)에 함유시키고 나머지 성분을 모두 제 1 시약에 함유시킨 경우가 많다. 그 외에는, 제2시약으로서 HK 또는 G6PDH(또는 두 효소 모두) 등의 효소를 사용하는 경우가 있었으나, 이 경우에는 효소의 안정성이 문제였다. 또한 제 2시약에 ATP를 사용한 경우에도 충분한 보존성을 얻을 수 없었다.
효소의 안정화에 관해서는 효소자신의 고도한 정제에 의해 함께 섞여 있는 유해한 효소를 제거함으로써, 또한 내열효소류, 예컨대 바틸루스 스테아로써모필루스(Batillus stearothermophilus) 유래의 글루코키나제(이하 GlcK로 표기함), 유전자조합에 의한 효모 유래의 HK 등 및 이들의 화학변형 효소를 사용함으로써 개선시킬 수 있으나, 액상 시약 전체로서의 보존안정성을 얻는 것은 어려웠다.
안정화된 효소류 이외의 구성성분중, 불안정화 요인의 최대 성분은 보조효소인 NADP' 및 기질 인 ATP이며, 특히 NADP+의 열화가 보존안정정을 저해하는 원인이 었다.
본 발명자 등은 이와 같은 종래의 문제점을 해소하기 위하여 예의 검토한 결과, 액상 시약으로서의 충분한 보존안정성을 갖는 시약조성을 발견하였다. 본 발명은, 이와 같은 발견을 기초로 한 것이다.
[발명의 개시]
본 발명은 적어도 글루코키나제(Glck) 또는 헥소키나제(HK), 글루코오스-6-인산 탈수소효소(G6PDH) 및 아데노신 5'-삼인산(ATP)을 함유하는 제 1 시약과 적어도 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADP')을 함유하는 제 2시약으로 이루어지며, 제 1 시약의 pH가 7.5 내지 9.5이고, 제 2 시약의 pH가 3 내지 5이며, 또한 각각 액상 시약인 것을 특징으로 하는 글루코오스 측정용 시약에 관한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 시약을 4℃에서 보존시킨 경우의 안정성을 도시한 그래프이다.
제2도는 본 발명의 시약을 10℃에서 보존시킨 경우의 안정성을 도시한 그래프이다.
제3도는 비교용 시약을 4℃에서 보존시킨 경우의 안정성을 도시한 그래프이다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일반적으로 HK 및 G6PDH를 사용한 종래의 글루코오스 측정시약은 1개 시약으로 사용되어 왔으나, 자동분석기의 발달에 따라 측정물(글루코오스)과 최초로 반응하는 HK의 보조효소(기질)인 ATP를 개시 시약으로 한 2개 액체형 시약이 많아졌다. 그 이유로서는 글루코오스와 최초로 반응하는 초발 효소인 HK와 ATP중 어느 하나를 후에 첨가함으로써 G6PDH 반응 이하의 검체 블랭크를 없앨 수 있기 때문이다. 또한, ATP를 사용하는 이유로서는 단백질인 HK에 비해 취급하기가 용이하기 때문이었다.
이러한 방법은 효소의 정제도가 불량했던 시대에는 특히 일반적이었다. 그러나,고도로 정제한 효소 및 기질 표준제품을 획득할 수 있는 현재에 있어서는 보다 안정한 조건을 설정하는데 중점을 둘 수 있는 것이다. 따라서,종래에는 전혀 고려되지 않았던 시약조성의 조합이 개발된 것이다.
본 발명의 글루코오스 측정용 시약은
(1) GlcK 또는 HK, G6PDH 및 ATP를 함유하며 pH가 7.5 내지 9.5인 액상 제 1 시약, 및
(2) NADP+를 함유하며 pH가 3 내지 5인 액상 제 2 시약으로 구성된다.
제 1 시약에 함유되는 ATP는 PH 7.5 내지 10 정도의 알칼리 완충액중에서 안정하기 때문에, 제 1 시약은 pH 7.5 내지 9.5의 완충액에 용해시킨다. pH 9.5를 초과하는 pH는 효소안정성 관점에서 바람직하지 않다. 또한 완충액으로서는 상기 범위의 pH값에서 통상 사용되는 임의의 완충액, 예컨대 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(이하, 트리스로 표기함) 완충액(pH 9.0)을 사용할 수 있다.
HK 및 Glck로서는 약알칼리 (pH 7 내지 9.5)에서 pH에 대해 안정한 효소,예컨대 효모 유래의 HK 및 바틸루스 스테아로써모필루스(Batillus stearothermophilus) 유래의 GlcK 등을 사용하는 것이 바람직하며, 배합량은 효소활성을 발현시키는 양을 첨가하는 것이 좋고 적어도 0.2U 이상 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다. 상한은 특별히 한정되어 있지 않지만, 비용 등을 고려하여 0.2내지 100u의 범위에서 사용하는 것이 좋다.
G6PDH로서는 약알칼리(pH 7 내지 9.5)에서 pH에 안정한 효소, 예컨대 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 효소가 적합하며, 배합량은 효소활성을 발현시키는 양을 첨가하는 것이 좋고 적어도 0.5U 이상 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다. 상한은 특정되어 있지 않지만, 비용 등을 고려하여 0.5 내지 100U 범위에서 사용하는 것이 좋다.
ATP는 바람직하게는 0.5 내지 5mM, 더욱 바람직하게는 1 내지 3mM의 양으로 배합한다. 제 1 시약에는 그외 필요에 따라 마그네슘 염 및 킬레이트제 [예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(이하, EDTA로 표기함)] 등을 첨가하여도 된다.
제2시약에 첨가되는 NADP+는 산성 완충액 중에서 안정하기 때문에, NADP+를 pH 3내지 5의 완충액에 용해시켜 제 2시약을 제조할 수 있다. 또한 완충액으로서는 상기 범위의 pH값에서 통상적으로 사용되는 임의의 완충액, 예컨대 아세트산 완충액(pH 4.0)을 사용할 수 있다. NADP+는 바람직하게는 1 내지 20mM, 더욱 바람직하게는 5 내지 10mM의 양으로 배합할 수 있다. 제 2 시약에는 그외 필요에 따라 마그네슘 염을 첨가하여도 된다. 제 1 시약과 제 2 시약을 혼합한 후 혼합액이 약 pH 7.5 내지 8.5로 되도록 하는 것이 바람직하고, 제 1 시약과 제 2 시약의 완충액 농도 및 그 혼합비는 적절하게 설정 할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들이 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
(1) 이하의 조성을 갖는 제 1 시약 및 제 2시약을 제조하였다:
제 1 시약
(2) 안정성
상기 (1)에서 제조한 제 1 시약 및 제 2 시약을 각각 4℃ 또는 10℃에서 보존하고, 일정기간 경과 후에 글루코오스의 자동분석에 사용하였다. 측정실시까지의 보존기간은 제 1 도 및 제 2 도에 도시된 바와 같고, 4℃ 보존 시약의 경우 제조 직후, 1주일 후, 2주일 후, 1개월 후, 3개월 후, 6개월 후, 9개월 후, 12개월 후, 13개월 후, 15개월 후 및 18개월 후이며, 10℃ 보존 시약의 경우 제조 직후, 2주일 후, 1개월 후, 3개월 후, 6개월 후, 9개월 후, 12개월 후, 13개월 후 및 15개월 후였다.
또한 검체로서는 4종의 글루코오스 수용액 [즉, 760mg/d1 글루코오스 수용액(도면중 □ ), 570mg/dl 글루코오스 수용액(도면중 △), 380mg/dl 글루코오스 수용액(도면중 ○) 또는 190mg/dl 글루코오스 수용액(도면중 * )], 및 2종의 혈청 (도면중 ● 및 ▲)을 사용하였다.
측정 조작은, 검체 3㎕에 제 1 시약 320㎕를 첨가하고 37℃에서 5분간 가온시킨 후 제 2시약 80㎕를 첨가하고 37℃에서 5분간 가온한 후에 340nm의 흡광도를 측정하였다.
각각의 측정결과를 제1도(4℃ 보존 시약) 및 제2도(10℃ 보존 시약)에 도시한다.
[비교예]
(1) 하기 조성으로 된 비교용의 제 1 시약 및 제 2시약을 제조하였다:
(2) 안정성
비교용으로서 상기 (1)에서 제조한 제 1 시약 및 제 2시약을 10℃에 보존하고, 제조 직후, 2주일 후, 1개월 후, 2개월 후, 3개월 후, 4개월 후, 5개월 후 및 6개월 후에 상기 실시예와 동일한 방식으로 실험하여 시약의 안정성을 확인하였다. 결과를 제 3도에 나타낸다. 검체로서는, 2종의 글루코오스 수용액[즉, 760mg/d1 글루코오스 수용액(도면중 □), 380mg/dl 글루코오스 수용액(도면중 ○)], 및 2종의 혈청(도면중 ● 및 ▲)을 사용하였다.
[산업상의 이용분야]
본 발명의 글루코오스 측정시약은 액상인 그대로 암소 또는 밝은 장소에서 상온 또는 저온에서 장기간(적어도 2년 정도)에 걸쳐 안정하게 저장될 수 있다. 따라서, 임상검사를 실시하는 현장에서 장기간 보존할 수 있으며, 사용시에는 용해조작이 필요하지 않으며 그 자체로 자동분석기 등에 삽입될 수 있다.
이상, 본 발명을 특정 태양에 의해 설명하였지만, 당해 분야의 숙련자에게 자명한 변형은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (8)

  1. 클루코키니제 또는 헥소키나제, 글루코오스-6-인산 탈수소 효소 및 아데노신 5'-삼인산을 포함하는 제 1 시약, 및 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산을 포함하는 제 2 시약으로 이루어지며; 제 1 시약의 pH가 7.5 내지 9.5이고, 제 2 시약의 pH가 3내지 5이며; 또한 상기 시약이 각각 액상 시약인 것을 특징으로 하는 글루코오스 측정용 시약.
  2. 제1항에 있어서, 제 1 시약이 글루코키나제 또는 헥소키나제를 0.2U 이상 포함하는 시약.
  3. 제1항에 있어서, 제 1 시약이 글루코오스-6-인산 탈수소효소를 0.5U 이상 포함하는 시약.
  4. 제1항에 있어서, 제 1 시약이 아데노신 5'-삼인산을 0.5 내지 5mM 포함하는 시약.
  5. 제1항에 있어서, 제 1시약이 마그네슘 염 또는 킬레이트제를 추가로 포함하는 시약.
  6. 제1항에 있어서, 제 2시약이 산화형 니오틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산을 1 내지 20mM 포함하는 시약.
  7. 제1항에 있어서, 제 2 시약이 마그네슘 염을 추가로 포함하는 시약.
  8. 제1항에 있어서, 제 1 시약과 제 2 시약의 혼합액의 pH가 7.5 내지 8.5로 되도록 제 1 시약 및 제 2 시약의 완충액 농도를 조정한 시약.
KR1019950701532A 1993-08-25 1994-08-24 글루코오스측정용시약 KR100301268B1 (ko)

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