JPS59151899A - 測定用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルコース、　　ＡＴＰ、クレアヂンホスボ
キナーゼ（以下ＣＰＫという。）、その他の各種ホスホ
トランスフェラーゼ、各種グリコシダーセなどの測定用
組成物に関するものである。

従来、グルコキナーゼ（以下ＧＫという。）とグルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６ＰＤＩＩという。

）とを共役酵素とする方法、いわゆるＧＫ／Ｇ６ＰＤＨ
系酵素が臨床検査分野において、グルコースやＣＰＫの
測定に用いられている。

その測定原理は。

で示される。

（上記略号はＣＰ：クレアチンリン酸、Ｃ：クレアチン
、　　へ０Ｐ：アデノシンー５′−二リン酸。

へＴＰ：アデノシンー５′−三リンＩＩ、　　Ｇ６Ｐニ
ゲルコース−６−リン酸、　　ＮＡＤ（Ｐ）　ＩＩ　：
還元型ニコチンアミトアデニンジヌクレチド（リン酸）
　、　　６−ＰＧＡ　：　６−ホスホグルコン酸を表す
。）上記反応式け）、　（２）及び（３）を触媒する酵
素がおのおのＣＰＫ、　ＧＫ、　Ｇ６ＰＤｌ＋である。

従来のＩＩＫ／　Ｇ６ＰＤＨ系酵素によるグルコース又
はＣＰＫ測定用組成物は、溶液状態での室温保存安定性
が乏しく、液状化してからの試薬の室温（１８〜３５℃
）での寿命は非密に短かった。このため１本出願人は特
開昭５６−１２４３９７号公報や特開昭５６−１６９５
９８号公報で耐熱性のＧＫや耐熱性のＧ６ＰＤＩ＋を用
いた定量用組成物を提案した。この組成物は、たしかに
従来の組成物に比べて、室温保存安定性が改善されたも
のである。しかしながら、その組成物に含まれるカップ
リング酵素の不安定性及びＳｌ＋化合物の不安定性から
、その安定性はいまだ十分とはいえず、しかも長期間安
定に保つためには。

比較的多量の酵素が必要であった。

そこで２本発明者らはかかる観点から、酵素の使用量を
少なくしても室温で長期間保存することができる経済性
に優れた測定用組成物を提供することを目的として鋭意
研究した結果９組成物中にカリウムイオン又はアンモニ
ウムイオンを含有させると、上記の目的がすべて達成し
うろことを見い出し５本発明を完成した。

すなわち１本発明はグルコキナーセとグルコース−６−
リン酸脱水素酵素とからなる測定用組成物において、カ
リウムイオン又はアンモニウムイオンを含有することを
特徴とする測定用組成物である。

本発明に用いられるＧＫ及びＧ６ＰＤＨとしては、微生
物由来のもの、動物由来のものなど各種のものを使用す
ることができるが、なかでも最適生育温度が５０℃ない
し８５°Ｃである微生物の産生ずるものが安定性の面か
ら好ましい。そのような微生物としては２例えばバチル
ス・ステアロザーモフイルス、バチルス・サーモブロテ
オリテイクス、バチルス・アシドカルダリウスなどのバ
チルス属２号−モアクチノマイセス属、サーマス属、サ
ーモミクロビウム属、カルテリア属なとの微生物があげ
られる。これらの中でも特に好ましい微生物としては、
バチルス・ステアロ号−モフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）があげら
れ。

具体例としては、　　ＡＴＣＣ７９３３，７９５４，８
００５，１０１９４゜１２９８０、Ｎ、ＣＡ　１５０３
などがある。

Ｇ６Ｐ叶についてもＧＫと同様に、給源が限定されるも
のではないが、好ましくは補酵素としてＮＡ叶だけでは
なく　　ＮＡＤにも作用するＧ６ＰＤＨ（例えばＬｅｕ
ｃｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来
）、さらに好ましくはＮＡＤ、ＮＡＤＰ共に作用できか
つ、安定性、保存性に冨む好熱性細菌由来の耐熱性Ｇ６
ＰＤ）ｌが望ましい。

また５　これらＧＫ、　　Ｇ６ＰＤ１１を製造する場合
は、抽出、精製法などについて、公知技術を適宜組合せ
ればよい。

本発明の組成物にはカリウムイオン又はアンモニウムイ
オンを含有させることが必要である。カリウムイオン又
はアンモニウムイオンの含有量は組成物に対し０．１ｍ
Ｍ以上、さらには０．２ｍＭ以上、特に０．５ｍＭ以上
であることが好ましい。含有量が０．１ｍＭ未満の場合
は本発明の効果が発現しにくい。一方、２Ｍをこえる場
合は１本発明の効果がそれより向上せず、むしろ不経済
になる１頃向がある。組成物にカリウムイオン又はアン
モニウムイオンを含有させるには、水に熔解することに
よりカリウムイオン又はアンモニウムイオンを生成する
化合物を用いることができる。そのような化合物として
は１例えば炭酸、塩酸、硝酸、リン酸、ホウ酸など無１
ａ酸の塩、酢酸、プロピオン酸などのモノカルホン酸、
マロン酸、コ／’％り酸などのジカルボン酸、グリシン
、アラニンなどのアミノ酸、グリコール酸、乳酸などの
オキシ酸、グリセロリン酸などの有機リン酸の塩など水
に熔解することによりカリウムイオン又はアンモニウム
イオンを生成するものであればいかなるものでも使用で
きる。これらの化合物は単独で用いることもできるし、
２種以上混合して使用することもできる。したがって２
組成物はカリウムイオン又はアンモニウムイオンを単独
で含むものであってもよいし１両者を含むものであって
もよい。

本発明の測定用組成物は、　ＧＫとＧ６ＰＤＨとからな
り、かつカリウムイオン又はアンモニウムイオンを含む
ものであり２例えばグルコース、　　ＣＰＫ。

ＡＴＰ　、その他の生体成分のホリ定に用いることがで
きる。したがって１組成物の他の構成成分は、これらの
目的とする測定物の種類により適宜選んで配合すればよ
い。組成物中の各成分の濃度は公知技術を適応すればよ
いが、一般には次のような濃度が好ましい。例えば、　
ＧＫを０．１〜２０ユニット／ｍｌ、　Ｇ６ＰＤｔｌを
０．１〜２０ユニット／ｍｌ、測定すべきホスホトラン
スフェラーゼの基質（リン酸供与体）を０〜４０ｍＭ、
測定ずべきグリコシダーゼの基質を０〜４０ｒｎＭ、　
　へ叶を０〜２０ｍＭ、　　八ＴＰを０〜２０ｍ　Ｍ　
、グルコースを０〜４０ｍ　Ｍ　、　　ＮＡＤあるいは
ＮＡ肝を０，１〜］、ＯｍＭ、マグネシウムを含む塩を
１〜１０ｍＭさらにカリウムイオン又はアンモニウムイ
オンを０．１ｍＭ〜２Ｍとなるようにそれぞれ１０〜５
００ｒｎＭのトリス−塩酸、イミダゾール酢酸などの緩
徂ｉ液（ｐＨ５〜１０）にン容解させればよい。

本発明の組成物は、前述のように臨床検査分野におりる
重要測定項目であるグルコース、　　ＣＰＫ。

ＡＴＰなどの測定ばかりでなく、ホスホトランスフェラ
−セ、あるいはグルコースを遊離するグリコシダーゼな
どの活性測定への応用も可能である。

本発明の組成物は、カリウムイオン又はアンモニウムイ
オンが共役酵素反応を活性化するため。

／Ｊｌ＋１定用試薬に用いる酵素量を減少することがで
き。

さらに測定用試薬の溶液状態での室温安定性を高めるこ
とができるようになったので、一度に大量の試薬を調製
しておくことができ７作業効率が改善される他、余剰の
試薬を廃棄する頻度も減少させることが可能となる。

次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１．比較例１ バチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ−１５０３か
ら得られた耐熱性のＧＫ２ユニット／ｍ＋、同一菌体か
ら得られた耐熱性のＧ６ＰＤＩ（２ユニツト／　ｍＬＮ
ＡＤＰ・ナトリウム塩２ｍＭ、　　ＡＴＰ・ニナトリウ
ム塩２　ｍＭ、　ＭｇＣｌ２２　ｍＭ、塩化カリウム５
ＱｍＭ。

アジ化ナトリウム１０ｍＭ、　　）リス−塩酸緩衝液（
ｐＨ８，５）　１００　ｗＭの濃度のグルコース測定用
組成物を作製した（実施例１）。

この組成物でグルコース濃度が既知の標準面漬を被検液
としてエンドポイント法グルコース濃度をδ、り定した
。なお、標準器）青としては、標準血清中のグルコース
濃度が２００ｍｇ／　ｄｌ有するものを用いた。

測定方法としては、上記組成物を３０°Ｃに保温し。

その０．６〜］を光路長１　ｃｍのセルに入れ、セル室
を同じ＜３０℃の恒温に保った分光光度計にて３４０ｎ
ｍの吸光度（Ａｎ　）を測定した。

次にグルコース検体４μｌをセルに添加し、酵素反応を
進行させ、１０分後の３４０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定
した。

試料中のグルコース濃度は次式により算出した。

グルコース濃度（ｍｇ／旧）　−４３７（Ａ　−Ａｏ　
）また、上記の組成−物を２５℃の恒温槽に保存し１週
間後及び１力月後にこの保存組成物を用い、上記標準血
清中のグルコース測定を実施した。

比較のため、塩化カリウムを添加せず、他は実施例１と
同様に行った（比較例１）。

それらの結果を表１にしめすが、実施例１においては、
調製当日及び２５℃保存１週間後及び１力月後とも同じ
値が得られ９本発明による安定化効果を示している。

実施例２．比較例２ 実施例１のＧＫ及びＧ６ＰＤ１１濃度を３分の１に減し
た以外は実施例１と同様に行った（実施例２）。

また、比較のためジメチルスルフオキシドを添加せず、
他は上記と同様に行った（比較例１）。

その結果を表１に示す。

表１より、実施例２は実施例１とほぼ同一の測定値が得
られ、酵素濃度を減少せしめることが可能であることが
明らかである。

表１ 実施例３〜４．比較例３〜４ 実施例１で用いた耐熱性のＧＫ３ユニット／ｍｌ。

同しく耐熱性のＧ６ＰＤ１１３ユニツト／ｍｌ　　八〇
Ｐ・ニナトリウム塩１ｍＭ、　グルコース１２ｍ　Ｍ　
、　ＮＡＤＰ　・ナトリウム塩１．６ｍＭ、酢酸マグネ
シウム５ｍＭ。

４肝・ニナトリウム塩４　ｍ　Ｍ　、　　ジチオスレイ
ト−）Ｌｉ　１０ｍ　Ｍ　＋アジ化ナトリウムｌ　Ｑ　
ｒｎ　Ｍ　＋　クレアチンリンＭ２０ｍＭ、硫酸アンモ
ニウム２０ｍ　Ｍ　、イミダゾール−酢酸緩衝液（ｐＨ
６，７）　１００　ｍＭよりなるＣＰＫ測定用組成物を
作製した（実施例３）。

また、比較のため硫酸アンモニウムを添加せず。

他は上記と同様に行って組成物を作製した（比較例３）
。さらにＧＫ、　ｃｅｐｏｉ＋の濃度を３分の１に減ら
した以外は実施例３と同様に行って測定用組成物を作製
した（実施例４）。また、比較のため硫酸アンモニウム
を添加せず、他は実施例４と同様に行って組成物を作製
したく比較例５）。

次に上記各組成物を３０℃に保温し、その０．６ｍｌを
光路長１ｃｍのセルに入れ１次に市販標準血清４０μＩ
を添加し、セル室を同じ＜３０℃の恒温に保った分光光
度計にて３４０ｎｍの吸光度変化より検体中のＣＰＫ活
性の測定を実施した。

次に、」二記各組成物を２５℃の恒温槽に保存し６日、
　１０日、１４日後にこれら組成物及びそれぞれの日に
新たに調製した実施例３の組成物を用い。

ＣＰＫを含む標準血清中のＣＰＫの活性測定を実施した
。それぞれの日に一新たに調製しノこ実施例３の組成物
による測定値を１００％とし、２５°Ｃ保存の組成物に
よる測定値の相対比を示したものが第１図である。図中
の１は、実施例３．２は実施例４，３は比較例３，４は
比較例４を示すものである。

第”１図より本発明の組成物が長期間にわたって安定で
あることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種ＣＰＫ測定用組成物を用いて横軸に示す
保存日数後の標準血清のＣＰＫ活性測定を実施し、その
実施日に新たに作製した実施例３の測定組成物により得
られた標準血清のＣＰＫ活性値に対する相対比を縦軸に
示したものであって、１は実施例３．２は実施例４，３
は比較例３．４は比較例４を示す。 特許出願人　ユ＝子力株式会社 手続補正書（１釦 １．事件の表示 特願昭５８−２５２４９号 ２、発明の名称 測定用組成物 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　兵庫県尼崎市東本町１丁目５０番地〒５４１ 住所　　大阪市東区北久太部町４丁目６８番地名称　　
ユニ子力株式会社　特許部 電話　０６−２８１−５２５８　　（ダイヤルイン）４
、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１）明細書第２頁第１行目の「系酵素」を「共役酵素
系Ｊと訂正する。 （２）同書同頁第５行目（反応式（２））の［１１Ｋ又
はＧＫＪをｒ　ＧＫＪと訂正する。 （３）同書同頁下から第８行目の「リン酸、」とｒＮＡ
Ｄ（Ｐ）トｌ」との間に［Ｎ＾１３（Ｐ）：酸化型ニコ
チンアミドアテニンシヌクレオチド（リン酸）」を挿入
する。 （４）同書同頁下から第３行目のｒ　ＨＫ／　Ｇ６ＰＤ
ＩＩ系酵の後に「硫酸、」を挿入する。 （６）同書第１０頁第１行目の「ジメヂルスルフォキシ
ド」を「塩化カリウム」と訂正する。 ６０３

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルコキナーゼとグルコース−６−リン酸脱水素
   酵素とからなる測定用組成物において。 カリウムイオン又はアンモニウムイオンを含有すること
   を特徴とする測定用組成物。
2. （２）グルコキナーゼが、最適生育温度が５０℃ないし
   ８５℃である微生物の産生ずるグルコキナーゼである特
   許請求の範囲第１項記載の測定用組成物。