DE1598067A1

DE1598067A1 - Verfahren und diagnostische Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose

Info

Publication number: DE1598067A1
Application number: DE19511598067
Authority: DE
Inventors: Hans Moellering; Bergmeyer Dr Rer Nat Ha Ulrich
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1951-01-28
Filing date: 1951-01-28
Publication date: 1970-03-26
Also published as: DE1598067B2; BE685538A; NL6611550A; GB1108770A; JPS503674B1; NO117818B; SE337492B; CH488186A; US3509025A; DE1598067C3

Description

/6 m b ft Mannheim ^₀** 1J569

Verfahren und diagnostische Mittel zur enzymatlsohen Bestimmung von Glucose

Enzymatisoh-analytische Methoden zeichnen sich allgemein durch ihre hohe Substrat-Spezifität aus und gestatten die exakte Bestimmung der Substrate in Gegenwart der meisten konstitutionsmäßig ähnlichen Begleitstoffe, die bei nicht-enzymatischen Methoden stoeren würden, fi^cu für die Bestimmung der Glucose sind bereits enzymatisch» Methoden ausgearbeitet und in die Praxis" eingeführt worden, z.B. die Umsetzung der Glucose mit Glucöse-uxydase zu D-Gluconsäure und Wasserstoffperoxyd oder die Umsetzung mit Hexokinaee und Adenosintriphosphat zu Glucose-6-phöSphat, wobei die Folgeprodukte Wasserstoffperoxyd bzw. Glucose-6-phoiphat in einer gekoppelten weiteren Reaktion in oolorimetrisöh oder photometrisch meßbare Produkte umgewandelt werden (Μ·)ί· S^ein* in» H.Ü» Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, 1962, S. 117, und H.U. Bergmeyer und E. Bernt, ebda., S. 122). ^A»n sichersten erschien bis heute die Hexokinase-Methode:

Hexokinase

(1) Glucose 4- ATP -* > G-6-P + ADP

0-6-PDH

(2) 0-6-P + TPN⁺ > 6-PO + TPNH + H⁺

(Es bedeuten: ATP · Adenosin-5'-triphosphorsäure,

ADP · Adenoain-S'-diphosphorsäure, G-6-P -> Glucose-6-phosphor-

säure, TPN und TPNR » Triphosphopyridinnucleotid und dessen

reduzierte Form, 6-PG = 6-Phosphogluconsäure, G-6-PDH = Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase.)

Trotz ausgezeichneter Empfindlichkeit und Genauigkeit hat das genannte Verfahren den Nachteil, daß extrem reine und damit teure Enzympräparate eingesetzt werden müssen; denn Hexokinase setzt auch Fructose zu Fructose-6-phosphat und Mannose zu Mannose-6-phosphat um. Enthalten nun die Enzympräparate z.B. auch nur Spuren des Enzyms Phosphohexose-Isomerase, so wird Fructose-6-phosphat in Glucose-6-phosphat überführt und Fructose täuscht so in der Analyse Glucose vor.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß das von M.Y. Kamel und R.L. Anderson kürzlich beschriebene Enzym aus Aerobacter aerogenes (J. Biochem. 239, PC 3607, 1964) ausgezeichnet zur enzymatischen Bestimmung der Glucose geeignet ist. Dieses Enzym reagiert im Gegensatz zur Hexolcinase praktisch nicht mit Fructose. Die relative Umsatzgeschwindigkeit des neuen Enzyms mit Fructose gegenüber Glucose ist nur ca. 0,6 %, d.h., selbst bei großem Fructose-Uberschuß wird die Fructose praktisch nicht phosphoryliert. Auch Mannose, Galactose, Glucosamin und N-Acetyl-glucosamin reagieren nicht gemäß Gleichung (j5) und (4); vgl. hierzu S. 9. Da obendrein das neue Enzym bereits bei der Herstellung ziemlich frei von Phosphohexose-Isomerase anfällt and im Vergleich zur Hexokinase wesentlich einfacher von diesem und anderen stoerenden Begleitenzymen (z.B. Gluthathion-Reduktase, TFNH-Oxydase, Glucose-Dehydrogenase) befreit werden kann, eignet es sich viel besser zur enzymatischen Analyse d-?r fllucose als Hexokinase.

Als Phosphatdona te.:;-' für das neue Enzym kom^t tmch unseren Befunden nicht :n:··' oäe von X&/;-eJ ^r- &:.... gene--nte Acetylphoepfcat in Frage,, seeds:·:-..: al'...·?· .?·-,,;..s^j>^n-. ■■■· ύνζ- Fcrr?¹.?!

BAD

tff ö ΐ -3 >' <*i & β %

Q ·
R-C-0-P0,H_o (I) ,

in der R einen orgenischen Rest bedeutet, der keine negative Ladung in unmittelbarer Nachbarschaft zur Phosphatgruppe besitzt. Dem neuen Enzym wäre daher der Name "AcylphosphatxGlucose-Transferase" zuzuordnen.

In der folgenden Tabelle 1 sind die relativen Geschwindigkeiten der durch AcylphosphatiGlucose-Transferase katalysierten Reaktion von Glucose mit den verschiedensten Phosphatdonatoren zu Glucose-6-phosphat zusammengestellt.

BAD ORIGINAL

009813/0901

Tabelle 1:

Phosphat-Donator	(i J ^o-_P	relative Um* satzge-
Acyl-phosphate:
Benzoyl-phcsphat	0	160
Nicotoyl-phosphat	OTT ΓΙΙ7 /~l &* 3 2 -.o-p	110
Acetyl-phC'Sphat	Q-C'- NH-CH₂-C^₀._p	100
Propionyl-phosphat	^H2^N-⁰^0-p	100
N-Benzoyl-glyooyl- phosphat	HOOC-CH₂-CH₂-CH₂-C ^₀__p	90
Carbamyl-phosphat
Glutaroyl-phosphat	ii

Suocinyl-phosphat

HOOC-CH₂-CH₂-C

0-p

3-Phosphoglycerinsäure-1-phosphat

^o

•-0-p

009813/09Ot

3098

Phosphat-Donator (ρ . -PO₃H₂) relative Um-

satzge-

sohwindigk.

: SS SS SSSS SSS SSS2SS SSSe=SS= IS SKS SSSSSSaSSSSaSSaEBBSBa=SSXSS=SSSaBSaSSrS ESA 3SS= SS=SS

Zuckerphosphate s

Pructose-6-phosphat

_va.o, γ VCH₂OH

4,5

P-O-CH_2Ό CH₂-O-P Fructose-1,6-diphosphat

1,7

P-O-CH₂

Ribose-5-phosphat

LJ 0,7

Glycerin-1-phoBphat CH₂(OH)-CH(OH)-CH₂-O-P 0,3

0 H

Gluoose-1-phosphat

0-p

Glycerinsäure-S-phoB- HOOC-CH-CH₀OH phat I *

Glycerinsäure-3-phos· phat

HOOC-CH(OH)-CH₂-O-P

Phospho-enol-pyruvat

HOOC-C^CH₂ 0-p

BAD ORlölNAL .

mk

ι Phosphat-Donator (ρ = -PO₃H₂) Nucleosid-phosphate:	relative Um satzge schwindigkeit
H₂N Adenosin-5^f -monophosphat ι Tj IJ SkNt ₀ CH₂-O-P	0,;
H^N Adenosin-5'-diphosphat N r. Jj ^N-^N^ CH₂-O-P-P	0
H₂N _N<^V N Adenosin-5⁽-triphosphat ι i\| Ij ^N-^N CH₀-O-P-P-P Ö	0

009B13/0901

0 9B

Phosphat-Donator (ρ = -PO₃H₂) Sonstige Phosphorsäure-Derivate:	relative Um- satzge- schwindigk.
Creatin-phosphat HN=C ^N-CH_n-COOH I ² CH₃	0
Natriumpyrophosphat Na-p-p	0
H₀C-(CHOH),-CH₀ p-O-C-CH, _n Riboflavin-5'- \| acetyl-phosphat ^^ *^^^^f°* G

Aus der obigen Tabelle wird ersichtlich, daß die AcylphosphattGlucose-Transferase vorzugsweise mit solchen Phosphat-Donatoren reagiert, bei denen der Einfluß einer gegebenenfalls vorhandenen negativen Ladung auf die Bindung Phosphatdonator-Enzym am geringsten ist; siehe z.B. Glutaroyl-phosphat, Suecinyl-phosphat und jJ-Phosphoglycerinsäure-l-phosphat im Vergleich zu Benzoylphosphat. Mit letzterem als^Phosphat-Donator reagiert das Enzym sogar 60 % schneller als mit Acetylphosphat.

009813/0901

BAD ORIGINAL

Diese hohe Affinität der AcylphosphattGlucbse-Transferase zu Phosphat-Donatoren der Formel I war überraschend, da die bekannten Phospho-Transferasen, wie z.B. die übliche Hexokinase und Fhosphoglycerat-Kini.se, nur mit Nucleosid-triphosphaten reagieren. Weiterhin war nicht vorherzusehen, daß das neue Enzym so leicht von den bei Glucose-Bestimmungen stoerenden Begleitenzymen wie Phcsphohexose-Isomerase, Glutathion-Reduktase, TPNH-Oxydase, Glucose-Dehydrogenase etc. zu reinigen ist und sich deshalb besonders für das erfindungsgemäße Verfahren eignet.

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Verfahren zur

encymatischen Bestimmung von Glucose mittels eines Phosphatdonators und einer Transferase, welche Glucose in Glucose-6-phosphat überführt, worauf man das Glucose-6-phusphat mittels Triphosphopyridin-nucleotid (TPN) in Gegenwart von G-6-P-Dehydrogenase in 6-Phosphogluconßäure und reduziertes Triphosphopyridinnucleotid überführt und letzteres spektrophotometrisch bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phosphatdunatoren Substanzen der Formel

0
R-C-O-PO H₂ (I) ,

in der R einen organischen Rest bedeutet, der keine negative Ladung in unmittelbarer Nachbarschaft zur Phosphatgruppe besitzt und als Transferase eine Acylphosphat:Glucose-Transferase verwendet.

Die Reaktionsfolge des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch folgende Gleichungen charakterisiert werden:

BAD ORIGINAL

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»ι ill !

-9-

Acylphosphat:Glucose 3.) R-COOPO₃H₂ + Glucose -rF

^R-^C0°^H

4.) G-6-P + TPN

^-6-P-Dehydrogenage

Da3 erfindungsgemäße diagnostische Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose besteht demnach aus einem Phosphatdonator, einer Transferase, Glucose-ö-Phosphat-Dehydrogenase und Triphosphopyridinnucleotid sowie gewünschtenfalls einem Puffer und ist dadurch gekennzeichnet, daß als Phosphatdonator eine Substanz der Formel I und als Transferase eine AoylphosphatrGlucose-TranSferase verwendet werden.

Zur Durchführung des, erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu untersuchende Probe mit dem Acylphosphat (I), Triphosphopyridinnuoleotid (TPN), einem Puffer (beispielsweise Glycokoll- oder '^i?f'^ Aoetatpuffer) und Gluooae-6-Phosphat-Dehydrdgenaße versetzt. Eventuell vorhandene© Glucose-6-Phosphat wird bereite jetat um- -

und kann vorweg bfwtimmt werden. Anschließend wird die AoylphoephltttGluoose-Traneferase zugegeben und nach einigen Minuten die Glucose anhand dee entstandenen reduzierten Triphosphopyridinnuoleotid* (TPNH) photometrisch bestiegt. .

D* dl· wiaarigen Loeaungen der Acylphoaphate I' nur begrenat _ ';' kind - eft handelt aich j» um gemiaobte Säureanbydride -

verwend*ft4e AoylphoajJbiit für den RoutinegetoTaueh un«ittelbe.r vor öer Glwooae-^eatiaewng in einer vor- ^ '. ' ^ feaohalfceken enzymatiMhen Reaktion innerhalb der' MeS-küvette

_; aynthttiaiert werdenj z.B_t erxeugt mn Acetylphosphat au* eine« ;_; »labilen AeeUfe und ATP mittels Acetat-Kina.ee b*w.

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Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bisher bekannten Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose 1st die hohe Substratspezifität der Kombination von Acylphosphat:Glucose-Transferase mit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase. Wie man der Tabelle 2 entnehmen kann, liegen für die Acylphosphat:Glucose-Transferase die Miehaeliskonstanten [K^], die ein Maß für die Affinität zum Substrat darstellen, hinsichtlich Glucose und Fructose um 3 Zehnerpotenzen auseinander und sind im Vergleich zur Michaellskonstante der Hexokinase (K·. = ca. 10~²) um etwa 2 Zehnerpotenzen besser.

Tabelle 2:

Phosphatdonator	[IC-] Glucose	[Kjj] Fructose
Acetylphosphat Ben?, oyl phospha t Carbamylphosphat Nlcotoylphoephat	0,9 . 10"⁴M 1,8 . 10"⁴M 2,31 . 10"⁴M 1,0 . 10""⁴M	2000 . 10"⁴M 2000 . 10"⁴M 2000 . 10"⁴M 2000 ♦ 10~*M

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in d#n folgenden Beispielen näher erläutert*

ßAD

001113/eitl /

"■ W" ^¹"¹" J"¹?"!¹!¹ JH'S'f!"!T¹Pi !¹If"¹¹:,.. '

Beispiel 1; Glucose-Bestimmung mit Carbamylphosphat

Fruchtsaft (schwarze Johannisbeere) wird auf Glucose analysiert. Reagentier: Endkonzentration

2,50 ml Glyeokoll-Puffer vom pH = 9,0 (200 mM) I65 mM

0,10 ml TPN (11 nH; IO rag/ml) 0,37 mM

0,10 ml Carbamyl-phosphat (l40 mM; 20 mg/ml) 4,7 mM

0,01 ml einer 1:10 verdünnten Probe

ad 2,97 ml mit Wasser

0,01 ml Glucose-ö-Fhosphat-Dehydrogenase 0,47 U/ml

(1 mg/ml, 140 U/ras)

Es reagiert eventuell vorhandenes G-6-P. Dann startet man mit

0,02 ml Acylphosphat-Transferase (1 mg/ml,40 U/mg) 0,26 U/ml

Der Endwert ist in ca. 5 Minuten erreicht. Bei 366 mu wird Glucose °'°⁸² «^e^^ssen·

Nach der üblichen Berechnungsformel gilt:

GS-J = «Hol/ml

f . d . ν

C= Extinktionskoeffizient von TPNH: 6,22 ²

340 mn 3,5

366 IMi

d = Schichtdicke der Küvette (1 cm)

V = Testvoluaen (3 ml)

ν = Voluoen der eingesetzten Probe

Für die Bestimmung von Glucose, gemessen bei 366 χψ, gilt also "Wose · 3 ■

Im vorliegenden Fall ergibt sich folgendes:

^{10 fe}" J3,5 ag Glucose/ml Fruchtsaft

009,813/0901

BAD ORIGINAL

Beispiel 2: Glueöse-Bestimmung mit Benzoylphosphat

Es wird analog Beispiel 1 gearbeitet, jedoch statt Carbamylphosphat Benzoylphosphat (Endmolarität = 3>3 mM) eingesetzt.

Der Endwert nach dem Start mit Acylphosphat-Transferase ist, wie in Beispiel l,nach 5 Minuten erreicht. Es wird die gleiche Extinktion gefunden.

Beispiel J: Glucose-Bestimmung mit Nicotoylphosphat

Das Meßverfahren wird, wie Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit Nicotoylphosphat (Endmolarität = 3,3 mM). In diesem Falle wird w eine 0,01 M a-D-Glucose-Loesung hergestellt und analysiert. Ein gesetzt zur Glucose-Bestimmung werden davon 0,02 ml (= 0,2 μΜοΙ 0,036 mg Glucose). Nach dem Start mit Acylphosphat-Transferase wird der Endwert nach 5 Minuten mit όΕ=0,222 ermittel.

^Glucose · °'¹⁶⁴

= mg Glucose/ml

= 1,82 mg Glucose/ml der ein-

' gesetzten Loesung

das entspricht O,Oj564 mg Glucose/eingesetzte ml. Man findet also 101 % wieder.

Beispiel 4; Glucose-Bestimmung mit Acetyl-Phosphat-Bildung in der Küvette.

Reagentien: Endmolarität

2,40 ml Glycokoll-Acetatpuffer (pH 9,0) l60 mM Glycin

120 mM Acetat

0,10 ml TPN (11 mM; 10 mg/ml) ^l 0,37 mM 0,10 ml ATP (80 mM; 50 mg/ml) 2,7 mM ■

o,10 mg MgCl₂(IOO mM) 3*3 mM

, 0,02 ml eines 1:10 verdünnten Diät-Fruchtsaftes (schwarze Johannisbeere)

00 9813/0901

ad 2,96 ml mit Wasser

0,01 ml Acetatkinase (5 mg/ml 700 U/ml)

0,01 ml Ofluoose-6-Phosphat-Dehydrogenase (1 mg/ml, 140 U/mg)

Man startet mit

0,02 ml Acylphosphat-Transferase (I mg/ml,

40 U/mg)

Endmolaritat

2,3 U/ml 0,47 U/ml

0,26 U/ml

Der Endwert für Glucose wird nach 8 Minuten erreicht. ä%iueose ^bei 366 11^:0,170, _Dle Berechnung nach Beispiel 1 ergibt? » ■

0,170 t 0Ί64 . ίο = 13,9 mg Qluoose/ml Fruchtsaft.

Beispiel 5:QlucoBe-Bestimmungen im Blut mit Aoetylphosphat

Zur Enteiweißung werden 10 verschiedene Blutproben zu je 0,1 ml mit je 1 ml Perchlorsäure 0,33 M versetzt. Nach Zentrifugatlon werden zum Testansatz 0,2 ml Probe eingesetzt. Dann wird wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch kommt statt Carbamylphosphat Aoetylphosphat (Endmolaritat 4 mM) als P-Donator zur Anwendung. Berechnet nach Beispiel 1 werden folgende Werte gefunden (in Klammern sind zum Vergleich die Glucose-Werte der gleichen Probe nach der Hexolcinase-ZWisohenferment-Method« angegeben):

■:■■■♦ '

BAD

mmsm

Glucose im Blut

mit Acylphosphat- mg# mit HK/G-6-PDH Abweichung Transferase

1	105,5	(105,5)	* 0 %
2	92	(91)	+ 1 ja
	88,5	(86)	+ 2,9 %
4	95	(94)	+ 1 %
5	125	(127)	- 1,6 %
6	82	(82)	±0 %
7	99	(97,5)	+ 1,5 #
8	102	(102)	- O %
9	75,5	(76)	- 0,7 i?
10	105	(106)	- 1 %

BAD ORIGINAL

OO&10/O9O1

Claims

1b98067

Patentansprüche

1.) Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose mittels eines Phosphatdonators und einer Transferase, welche Glucose in Glucose-6-phosphat überführt, worauf man das Glucose-6-phosphat mittels Triphosphopyridin-nucleotid (TPN) in Gegenwart von G-6-P-Dehydrogenase in 6-Phosphogluconsäure und reduziertes Triphosphopyridin-nucleotid überführt und letzteres spektrophotometriseh bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phosphatdonatoren Substanzen der Formel

0
R-C-O-PO₃H₂ (I) ,

in der R einen organischen Rest bedeutet, der keine negative Ladung in unmittelbarer Nachbarschaft zur Phosphatgruppe besitzt

und als Transferase eine AeylphosphatzGlucose-Transferase verwendet.

2.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Phosphatdonator durch vorgeschaltete enzymatische Reaktion unmittelbar vor der eigentlichen Bestimmung erzeugt.

5.) Diagnostisches Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, bestehend aus einem Phosphatdonator, einer Transferase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und Triphosphopyridin-nucleotid sowie gewünschtenfalls einem Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß als Phosphatdonator eine Substanz der Formel

008^13/0901 BAD0RI3.NAL

und als Transferase eine Acylphosphat:Glucose-Transferase verwendet wird.

4.) Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle des Phosphatdonators I ein Gemisch aus Adenosintriphosphat (ATP), Acylat-ionen und einer Acylatphosphokinase verwendet wird.

Ofl/Gi_NAL 009813/0901