DE1598067C3 - - Google Patents
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Description
R-C-O-PO3H2
(I)
in der R einen organischen Rest bedeutet, der keine negative Ladung in unmittelbarer Nachbarschaft,
zur Phosphatgruppe besitzt und als Transferase eine Acylphosphat:Glucose-6-phosphat-Transferase
verwendet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Phosphatdonator
durch vorgeschaltete enzymatische Reaktion unmittelbar vor der eigentlichen Bestimmung
erzeugt.
Enzymatisch-analytische Methoden zeichnen sich allgemein durch ihre hohe Substrat-Spezifität aus
und gestatten die exakte Bestimmung der Substrate in Gegenwart der meisten konstitutionsmäßig ähnlichen
Begleitstoffe, die bei nichtenzymatischen Methoden stören würden. Auch für die Bestimmung der
Glucose sind bereits enzymatische Methoden ausgearbeitet und in die Praxis eingeführt worden, z. B.
die Umsetzung der Glucose mit Glucose-Oxydase zu D-Gluconsäure und Wasserstoffperoxyd oder die
Umsetzung mit Hexokinase und Adenosintriphosphat zu Glucose-6-phosphat, wobei die Folgeprodukte
Wasserstoffperoxyd bzw. Glucose-6-phosphat in einer gekoppelten weiteren Reaktion in colorimetrisch
oder photometrisch meßbare Produkte umgewandelt werden (M.W. Slein, in: H. U. Bergmeyer,
Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, 1962, S. 117, und H. U.
Bergmeyer und E. Bernt, ebd., S. 123). Am
sichersten erschien bis heute die Hexokinase-Methode:
Glucose + ATP
G-6-P + TPN+
Hexokinase
G-6-PDH G-6-P + ADP
6-PG + TPNH + H+
(D
(2)
(Es bedeuten: ATP = Adenosin-S'-triphosphorsäure, ADP = Adenosin-5'-diphosphorsäure, G-6-P
= Glucose-o-phosphorsäure, TPN und TPNH = Triphosphopyridinnucleotid
und dessen reduzierte Form, 6-PG = 6-Phosphogluconsäure, G-6-PDH·'= GIucose-6-phosphat-Dehydrogenase.)
Trotz ausgezeichneter Empfindlichkeit und Genauigkeit hat das genannte Verfahren den Nachteil,
daß extrem reine und damit teure Enzympräparate eingesetzt werden müssen; denn Hexokinase setzt
auch Fructose zu Fructose-6-phosphat und Mannose zu Marinose-6-phosphat um. Enthalten nun die Enzympräparate
z. B. auch nur Spuren des Enzyms Phosphohexose-Isomerase, so wird Fructose-6-phosphat
in Glucose-6-phosphat übergeführt, und Fructose täuscht so in der Analyse Glucose vor. "■
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde,. die enzymatische Bestimmung von Glucose, insbesondere
durch Erhöhung der Spezifität der Bestimmung, zu verbessern.
Kürzlich wurde von M. Y. Kamel und R. L.
Anderson ein aus Aerobacter aerogenes isoliertes
Enzym beschrieben (J. Biol. Chem. 239, PC 3607, 1964), welches Glucose mit Acetylphosphat phosphoryliert.
Dieses von den Autoren Acetylphosphat zu Glucose-6-phosphat-Transferase genannte Enzym
reagiert im Gegensatz zur Hexokinase praktisch nicht mit Fructose. Die relative Umsatzgeschwindigkeit
des neuen Enzyms mit Fructose gegenüber Glucose ist nur etwa 0,6%, d. h., selbst bei großem Fructose-Uberschuß
wird,die Fructose praktisch nicht phosphoryliert. Auch Mannose, Galactose, Glucosamin
, und N-Acetyl-glucosamin reagieren nicht gemäß
Gleichung (3) und (4); vgl. hierzu S. 5. Es wurde nun gefunden, daß dieses Enzym ausgezeichnet zur enzymatischen
Bestimmung, von Glucose geeignet ist und daß als Phosphatdonator nicht nur Acetylphosphat,
sondern alle Substanzen der allgemeinen Formel
50
■ H ■' ■ ·
R-C-O-PO3H2
in der R einen organischen Rest bedeutet, der keine negative Ladung in unmittelbarer Nachbarschaft zur
; Phosphatgruppe", besitzt, geeignet'sind. Da das Enzym
bereits bei der Herstellung ziemlich frei von Phosphohexose-Isomerase
anfällt und im Vergleich zur Hexokinase wesentlich einfacher von diesem und anderen störenden Begleitenzymen (z. B. Glutha-.
thion-Reduktase, TPNH-Oxydase, GIucose-Dehydrogenase) befreit werden kann, eignet es sich viel
besser zur enzymatischen Analyse der Glucose als Hexokinase.
Die obengenannte Aufgabe wird somit gemäß dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruch 1 gelöst.
Die obengenannte Aufgabe wird somit gemäß dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruch 1 gelöst.
Eine vorteilhafte Weiterbildung der Erfindung ist im Patentanspruch 2 beschrieben.
In der folgenden Tabelle 1 sind die relativen Geschwindigkeiten der durch Acylphosphat:Glucose-6-phosphat-Transferase
katalysierten Reaktion von Glucose mit den verschiedensten Phosphatdonatoren zu Glucose-6-phosphat
zusammengestellt.
Phosphat-Donator (P = -PO3H2) |
O | 3 2 \ | 0-p | O | H2N-C | 0-PO3H2 O | \ 0-p |
O | O | — C \ |
O | Relative Umsatz geschwindigkeit |
|
Acyl-phosphate | C-NH-CH2-C C/ |
H2C-CH(OH)-C | 0-p | \ 0-p |
|||||||||
O | O | HOOC — CH2- CH2- CH2 | O-p | ||||||||||
Benzoyl-phosphat | C (Y \ ο |
160 | |||||||||||
O | \ | ||||||||||||
Nicotoyl-phosphat | C (Y \ P |
\ | 110 | ||||||||||
{ ) °-p N |
|||||||||||||
Acetyl-phosphat | O CH3-C |
100 | |||||||||||
. 0-p | |||||||||||||
Propionyl-phosphat | 100 | ||||||||||||
N-Benzoyl-glycoyl-phosphat | 90 | ||||||||||||
Carbamyl-phosphat | 85 | ||||||||||||
Glutaroyl-phosphat | 11 | ||||||||||||
Succinyl-phosphat | 5 | ||||||||||||
. '·..-■ .:·, : ■ ■ ■■ . ■.■..··. | |||||||||||||
3-Phosphoglycerinsiiure-1-phosphat | 1,3 | ||||||||||||
Fortsetzung
Phosphat-Donator
(ρ = —PO3H2)
(ρ = —PO3H2)
Relative Umsatzgeschwindiykeit
Fructose-6-phosphat Fructose-1,6-diphosphat
Ribose-5-phosphat Glycerin-1 -phosphat
Glycerinaldehyd-3-phosphat
Glucose-1-phosphat Glycerinsäure-2-phosphat
Glycerinsäure-3-phosphat Phospho-enol-pyruvat
Adenosin-5'-monophosphat
Adenosin-5'-diphosphat
Adenosin-5-triphosphat
Zucker-phosphate
P-O-CH2 O
-CH2OH
P-O-CH2 O CH2—0-p
P-O-CH2 O
CH2(OH)-CH(OH)-CH2-O-P
C-CH(OH)-CH2- O-p
/
H
H
HO-CH2
O-p
HOOC-CH-CH2OH
O-p
HOOC-CH(OH)-CH2-O-P
HOOC-C=CH2
HOOC-C=CH2
O-p
Nucleosid-phosphate
H2N
H2N
N Ii—N
NN O CH2—O-p
NN O CH2—O-p-p
NN O CH2-O-P-P-P
Fortsetzung
Phosphat-Donator (P = -PO3H2 |
HN=C | N-CH2-COOH | Na-p-p | O O | Relative Umsatz geschwindigkeit |
|
Sonstige Phosphorsäure-Derivate | CH3 | H2C-(CHOH)3-CH2 P-O-C-CH3 | ||||
NH-p | CH3 NNO YY YY- |
|||||
Creatin-phosphat | XJ CH3 |
O | ||||
NH \ A / ν γ O |
||||||
Natriumpyrophosphat | O | |||||
Eliboflavin-5-acetyl-phosphat | O | |||||
Aus der obigen Tabelle wird ersichtlich, daß die Acylphosphat: Glucose-6-phosphat-Transferase vorzugsweise
mit solchen Phosphat-Donatoren reagiert, bei denen der Einfluß einer gegebenenfalls vorhandenen
negativen Ladung auf die Bindung Phosphatdonator-Enzym am gerinsten ist; siehe z. B. Glutaroyl-phosphat,
Succinyl-phosphat und 3-Phosphoglycerinsäure-1-phosphat
im Vergleich zu Benzoylphosphat. Mit letzterem als Phosphat-Donator reagiert das Enzym sogar 60% schneller als mit Acetylphosphat.
Diese hohe Affinität der Acylphosphat: Glucose-6-phosphat-Transferase
zu Phosphat-Donatoren der Formel I war überraschend, da die bekannten Phospho-Transferasen,
wie z. B. die übliche Hexokinase und Phosphoglycerat-Kinase, nur mit Nucleosidtriphosphaten
reagieren. Weiterhin war nicht vorherzusehen, daß das neue Enzym so leicht von den bei
Glucose-Bestimmungen störenden Begleitenzymen wie Phosphohexose - Isomerase, Glutathion -Reduktase,
TPNH-Oxydase, Glucose-Dehydrogenase etwa zu
reinigen ist und sich deshalb besonders für das erfindungsgemäße Verfahren eignet.
Die Reaktionsfolge des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch folgende Gleichungen charakterisiert
werden:
Acylphosphat :Glucose-6-phosphat-Transferase R-COOPO3H2 + Glucose
> G-6-P + R—COOH
G-6-P-Dehydrogenase G-6-P + TPN ► 6-PG + TPNH + H+
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu untersuchende Probe mit dem
Acylphosphat (I), Triphosphopyridinnucleotid (TPN), einem Puffer (beispielsweise Glycokollpuffer) und
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase versetzt. Eventuell vorhandenes Glucose-6-Phosphat wird bereits
jetzt umgesetzt und kann vorweg bestimmt werden. Anschließend wird die Acylphosphat: Glucose-6-phosphat-Transferase
zugegeben und nach einigen Minuten die Glucose an Hand des entstandenen reduzierten
Triphosphopyridinnucleotids (TPNH) photometrisch bestimmt.
Da die wäßrigen Lösungen der Acylphosphate I nur begrenzt haltbar sind — es handelt sich ja um
gemischte Säureanhydride — kann das zu verwendende Acylphosphat für den Routinegebrauch auch
erst unmittelbar vor der Glucose-Bestimmung in einer vorgeschalteten enzymatischen Reaktion innerhalb
der Meßküvette synthetisiert werden; z. B.
erzeugt man Acetylphosphat aus einem stabilen Acetat
und ATP mittels Acetat-Kinase bzw. Carbamylphosphat aus Carbaminsäure und ATP mittels der
Carbamat- Phosphokinase.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bisher bekannten Verfahren
zur enzymatischen Bestimmung von Glucose ist die hohe Substratspezifität der Kombination von
Acylphosphat: Glucose - 6 - phosphat - Transferase mit
409 616/248
Glucose-ö-phosphat-Dehydrogenase. Wie man der
Tabelle 2 entnehmen kann, liegen für die Acylphosphat:Glucose-Transferase die Michaelis-Konstanten
(KM), die ein Maß für die Affinität zum Substrat darstellen,
hinsichtlich Glucose und Fructose um 3 Zehnerpotenzen auseinander.
Michaelis-Konstanten für Glucose und Fructose mit verschiedenen Phosphat-Donatoren (pH = 9,5; 250C)
. Für die Bestimmung von Glucose, gemessen bei 366 m[i, gilt also
180,16
AE
Glucose
3,3 · 10J · 1 · ν
AE
Glucose
■0,164
= mg Glucose/ml Probe.
Im vorliegenden Fall ergibt sich folgendes:
Acylphosphat | (K,,) Glucose | (Ku) Fructose |
Acetylphosphat (2OmM) Carbamylphosphat (47 BiM) Benzoylphosphat (12 mM) Nicotoylphosphat (25 mM) |
4·ΙΟ"5 M 5· ΙΟ"5 Μ 8■10~5 M 5· ΙΟ"5 Μ |
5· ΙΟ"2 Μ 3· 10-2M 2·ΙΟ"2 M 2·ΙΟ"2 Μ |
0,082-1,164
Öfil
Öfil
•10 = 13,5 mg Glucose/ml Fruchtsaft.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in den folgenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1 Glucose-Bestimmung mit Carbamylphosphat
Fruchtsaft (schwarze Johannisbeere) wird auf Glucose analysiert
Reagenzien | End konzentration |
|
2,50 ml | Glycokoll-Puffer vom | |
pH = 9,0(20OmM) | 165 mM | |
0,10 ml | TPN(HmM; 10 mg/ml) | 0,37 mM |
0,10ml | Carbamyl-phosphat | |
-(14OmM; 20 mg/1)..:.... | 4,7 mM | |
0,01 ml | einer 1:10 verdünnten | |
Probe | ||
ad 2,97 ml | mit Wasser | |
0,01 ml | Glucose-6-Phosphat- | |
Dehydrogenase (1 mg/ml, | ||
140 U/mg)...' | 0,47 U/ml | |
Es reagiert eventuell | ||
vorhandenes G-6-P. | ||
Dann startet man mit | ||
0,02 ml | Acylphosphat-Transferase | |
(1 mg/ml, 40 U/mg) | 0,26 U/ml |
Glucose-Bestimmung mit Benzoylphosphat
Es wird analog Beispiel 1 gearbeitet, jedoch statt Carbamylphosphat Benzoylphosphat (Endmolarität
= 3,3 mM) eingesetzt.
Der Endwert nach dem Start mit Acylphosphat-Transferase ,ist wie im Beispiel 1 nach 5 Minuten
erreicht. Es wird die gleiche Extinktion gefunden. ·
25
25
Glucose-Bestimmung mit Nicotoylphosphat
Das Meßverfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit Nicotoylphosphat (Endmolarität
= 3,3 mM). In diesem Falle wird eine 0,01 M α-D-Glucose-Lösung hergestellt und analysiert. Eingesetzt
zur Glucose-Bestimmung werden. davon 0,02 ml (= 0,2 μΜοΙ ■= 0,036 mg Glucose). Nach
dem Start mit Acylphosphat-Transferase wird der Endwert nach 5 Minuten mit AE = 0,222 ermittelt.
AE
Glucose
0,164
40 0,02 ., .
0,222-0,164
0,002
0,002
= mg Glucose/ml .
=. 1,82 mg Glucose/ml der eingesetzten Lösung,
Der Endwert ist in etwa 5 Minuten erreicht. Bei 366 πΐμ wird A EGlucose 0,082 gemessen.
Nach der üblichen Berechnungsformel gilt:
A E · V
;— = μΜοΙ/ml,
ε ■ d ■ V
ε = Extinktionskoeffizient von TPNH
6,22 C2
340 ΓΠμ,
3,3 ci 366 ηΐμ,
d = Schichtdicke der Küvette (1 cm), V = Testvolumen (3 ml),
ν = Volumen der eingesetzten Probe.
ν = Volumen der eingesetzten Probe.
das entspricht 0,0364 mg Glucose/eingesetzte Milliliter. Man findet also 101% wieder.
Glucose-Bestimmung mit Acetyl-Phosphat-Bildung in der Küvette
55
60
65
ml | Reagenzien | End molarität |
|
2,40 | Glycoköll-Acetatpuffer | ||
(pH 9,0) | 16OmM | ||
Glycin | |||
12OmM | |||
ml | Acetat | ||
0,10 | ml | TPN(Il mM; 10 mg/ml) | 0,37 mM |
0,10 | mg | ATP (8OmM; 50 mg/ml) | 2,7 mM |
0,10 | ml | MgCl2 (10OmM) | 3,3 mM |
0,02 | eines 1:10 verdünnten | ||
Diät-Fruchtsaftes | |||
(schwarze Johannisbeere) | |||
Fortsetzung
Reagenzien
ad 2,96 ml mit Wasser
0,01 ml Acetatkinase (5 mg/ml
700 U/ml)
0,01 ml Glucose-6-Phosphat-
Dehydrogenase (1 mg/ml, 140 U/mg)
Man startet mit
0,02 ml Acylphosphat-Transferase (1 mg/ml, 40 U/mg)
Endmolarität
2,3 U/ml
0,47 U/ml im Beispiel 5 beschrieben. Zusätzlich wurde Fructose nach H. Klotzsch und H. U. Bergmeyer bestimmt (vgl. H. U. Bergmeyer: Methoden der
enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim 1962, S. 156).
Glucose- und Fructose-Bestimmungen im Blut, wobei dem Blut steigende Mengen Fructose zugesetzt wurden
0,26 U/ml
Der Endwert für Glucose wird nach 8 Minuten erreicht. J ^Glucose bei 366 πΐμ: 0,170. Die Berechnung
nach Beispiel 1 ergibt:
0,170-0,164
ÖÖ2
ÖÖ2
20
10 = 13,9mg Glucose/ml Fruchtsaft.
B e i s ρ i e 1 5 Glucose-Bestimmungen im Blut mit Acetylphosphat
Zur Enteiweißung werden zehn verschiedene Blutproben zu je 0,1 ml mit je 1 ml Perchlorsäure 0,33 M
versetzt. Nach Zentrifugation werden zum Testansatz 0,2 ml Probe eingesetzt. Dann wird wie im Beispiel 1
gearbeitet, jedoch kommt statt Carbamylphosphat Acetylphosphat (Endmolarität 4 mM) als P-Donator
zur Anwendung. Berechnet nach Beispiel 1 werden folgende Werte gefunden (in Klammern sind zum
Vergleich die Glucose-Werte der gleichen Probe nach der Hexokinase-Zwischenferment-Methode angegeben):
Glucose im Blut
Fructose | Glucose | (mg %) | Differenz | |
Nr. | mit Acyl | |||
phosphat- | mit HK | (%) | ||
0 | Transferase | + 2,1 | ||
1 | 16,0 | 73 | 71,5 | + 1 |
31,3 | 72,2 | 71,5 | + 2,4 | |
62,4 | 72,2 | 70,5 | + 2,3 | |
153,0 | 71,6 | 70,0 | + 3,1 | |
0 | 72,2 | 70,0 | 0 | |
2 | 27,8 | 67,0 | 67,0 | + 1,3 |
71,8 | 67,0 | 66,Γ | 0 | |
144,0 | 66,1 | 66,1 | + 5,3 | |
283,0 | 67,8 | 64,4 | + 2,5 | |
66,1 | 64,4 | |||
mg % mit Acyl | mg % mit HK/G-6-PDH |
Abweichung | |
phosphat- Transferase |
(105,5) | ±0% | |
1 | 105,5 | (91) | + 1% |
2 | 92 | (86) . | + 2,9% |
3 | 88,5 | (94) | + 1% |
4 | 95 | (127) | -1,6% |
5 | 125 | (82) | ±0% |
6 | 82 | (97,5) | +1,5% |
7 | 99 | (102) | ±0% |
8 | 102 | (76) | -0,7% |
9 | 75,5 | (106) | -1% |
10 | 105 | ||
45
Glucose-Bestimmungen in Untersuchungsmaterial mit hohem Fructosegehalt
Die Messung erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch wird statt Carbamylphosphat als P-Donator
4 mM Acetylphosphat verwendet. Besonders zu beachten ist die glatte Durchführbarkeit der Messung.
Auch Spuren von Glucose in reinster Fructose sind mit der erfindungsgemäßen Methode sicher nachweisbar
(vgl. Tabelle 5).
Glucose-Bestirhmung im Untersuchungsmaterial mit hohem Fructose-Gehalt
Probe
55 Beispiel 6
Glucose- und Fructose-Bestimmungen im Blut, dem steigende Mengen Fructose zugesetzt werden
Zur Enteiweißung werden zehn verschiedene Blutproben mit verschiedenen Fructose-Mengen versetzt
(vgl. Tabelle 4). Die weitere Arbeitsweise erfolgt wie Aprikosensaft ...
Johannisbeersaft
Johannisbeersaft
Kirschsaft
Apfelsaft
Apfelsaft*)
Fructose, reinst .
Fructose
2,62
4,26
4,30
6,49
26,28
etwa 100
Glucose
mit Acyl-
phosphat-
Trans-
ferase
2,99 4,18 4,61 2,87 2,59 0,003
mit HK
1%)
2,95 4,10 4,61 2,68 2,49 **)
*) Dem Saft wurden etwa 200 mg Fructose/ml zugesetzt, dabei
geringfügig verdünnt.
**) Methode versagt in diesem Falle.
**) Methode versagt in diesem Falle.
Claims (1)
1. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose mittels eines Phosphatdonators und
einer Transferase, welche Glucose in Glucose-6-phosphat überführt, worauf man das Glucose-
6-phosphat mittels Triphosphopyridin-nucleotid (TPN) in Gegenwart von G-6-P-Dehydrogenase
in 6-Phosphogluconsäure und reduziertes Triphosphopyridin-nucleotid überfuhrt und letzteres
spektrophotometrisch bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phosphatdonatoren
Substanzen der Formel
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