DE1598067B2 - - Google Patents

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DE1598067B2
DE1598067B2 DE1598067A DE1598067A DE1598067B2 DE 1598067 B2 DE1598067 B2 DE 1598067B2 DE 1598067 A DE1598067 A DE 1598067A DE 1598067 A DE1598067 A DE 1598067A DE 1598067 B2 DE1598067 B2 DE 1598067B2
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Description

R-C-O-PO3H2
in der R einen organischen Rest bedeutet, der keine negative Ladung in unmittelbarer Nachbarschaft zur Phosphatgruppe besitzt und als Transferase eine Acylphosphat:Glucose-6-phosphat-Transferase verwendet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Phosphatdonator durch vorgeschaltete enzymatische Reaktion unmittelbar vor der eigentlichen Bestimmung erzeugt.
Enzymatisch-analytische Methoden zeichnen sich allgemein durch ihre hohe Substrat-Spezifität aus und gestatten die exakte Bestimmung der Substrate in Gegenwart der meisten konstitutionsmäßig ähnlichen Begleitstoffe, die bei nichtenzymatischen Methoden stören würden. Auch für die Bestimmung der Glucose sind bereits enzymatische Methoden ausgearbeitet und in die Praxis eingeführt worden, z. B. die Umsetzung der Glucose mit Glucose-Oxydase zu D-Gluconsäure und Wasserstoffperoxyd oder die Umsetzung mit Hexokinase und Adenosintriphosphat zu Glucose-6-phosphat, wobei die Folgeprodukte Wasserstoffperoxyd bzw. Glucose-6-phosphat in einer gekoppelten weiteren Reaktion in colorimetrisch oder photometrisch meßbare Produkte umgewandelt werden (M.W. S lein, in: H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, 1962, S. 117, und H. U. Bergmeyer und E. B er nt, ebd., S. 123). Am sichersten erschien bis heute die Hexokinase-Methode:
Glucose + ATP
G-6-P + TPN+
Hexokinase
G-6-PDH G-6-P + ADP
6-PG + TPNH + H+
(Es bedeuten: ATP = Adenosin-5'-triphosphorsäure, ADP = Adenosin-S'-diphosphorsäure, G-6-P = Glucose-6-phosphorsäure, TPN und TPNH = Triphosphopyridinnucleotid und dessen reduzierte Form, 6-PG = 6-Phosphogluconsäure, G-6-PDH = GIucose-6-phosphat-Dehydrogenase.)
Trotz ausgezeichneter Empfindlichkeit und Genauigkeit hat das genannte Verfahren den Nachteil, daß extrem reine und damit teure Enzympräparate eingesetzt werden müssen; denn Hexokinase setzt auch Fructose zu Fructose-6-phosphat und Mannose zu Mannose-6-phosphat um. Enthalten nun die Enzympräparate z. B. auch nur Spuren des Enzyms Phosphohexose-Isomerase, so wird Fructose-6-phosphat in Glucose-6-phpsphat übergeführt, und Fructose täuscht so in der Analyse Glucose vor.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die enzymatische Bestimmung von Glucose, insbesondere durch Erhöhung der Spezifität der Bestimmung, zu verbessern.
Kürzlich wurde von M. Y. Kamel und R. L. Anderson ein aus Aerobacter aerogenes isoliertes Enzym beschrieben (J. Biol. Chem. 239, PC 3607, 1964), welches Glucose mit Acetylphosphat phosphoryliert. Dieses von den Autoren Acetylphosphat zu Glucose-6-phosphat-Transferase genannte Enzym reagiert im Gegensatz zur Hexokinase praktisch nicht mit Fructose. Die relative Umsatzgeschwindigkeit des neuen Enzyms mit Fructose gegenüber Glucose ist nur etwa 0,6%, d. h., selbst bei großem Fructose-Uberschuß wird die Fructose praktisch nicht phosphoryliert. Auch Mannose, Galactose, Glucosamin und N-Acetyl-glucosamin reagieren nicht gemäß Gleichung (3) und (4); vgl. hierzu S. 5. Es wurde nun gefunden, daß dieses Enzym ausgezeichnet zur enzymatischen Bestimmung von Glucose geeignet ist und daß als Phosphatdonator nicht nur Acetylphosphat, sondern alle Substanzen der allgemeinen Formel
Il
R-C-
-0-PO3H2
60
65 in der R einen organischen Rest bedeutet, der keine negative Ladung in unmittelbarer Nachbarschaft zur Phosphatgruppe" besitzt, geeignet sind. Da das Enzym bereits bei der Herstellung ziemlich frei von Phosphohexose-Isomerase anfällt und im Vergleich zur Hexokinase wesentlich einfacher von diesem und anderen störenden Begleitenzymen (z. B. Gluthathion-Reduktase, TPNH - Oxydase, Glucose-Dehydrogenase) befreit werden kann, eignet es sich viel besser zur enzymatischen Analyse der Glucose als Hexokinase.
Die obengenannte Aufgabe wird somit gemäß dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruch 1 gelöst. Eine vorteilhafte Weiterbildung der Erfindung ist im Patentanspruch 2 beschrieben.
In der folgenden Tabelle 1 sind die relativen Geschwindigkeiten der durch Acylphosphat:Glucose-6-phosphat-Transferase katalysierten Reaktion von Glucose mit den verschiedensten Phosphatdonatoren zu Glucose-6-phosphat zusammengestellt.
Tabelle 1
Phosphat-Donator
(P=-PO3H2)		 O C N O CH3-C O-p O H2N-C O Relative Umsatz
geschwindigkeit
Acyl-phosphate
O		 CH3 CH2 C
O-p		 O
HOOC — CH2- CH2- CH2- C		 HOOC — CH2- CH2- C
O-p
Benzoyl-phosphat C O O
C-NH-CH2-C
(X 		O-p 0-PO3H2 O 160
O H2C-CH(OH)-C
O-p
Nicotoyl-phosphat 110
Acetyl-phosphat 100
Propionyl-phosphat 100
N-Benzoyl-glycoyl-phosphat 90
Carbamyl-phosphat /85
Glutaroyl-phosphat 11
Succinyl-phosphat 5
3-Phosphoglycerinsäure-1 -phosphat 1,3
Fortsetzung
Phosphat-Donator
(p = —PO.,H2)
Relative Umsatzgeschwindigkeit
Fructose-6-phosphat Fructose-1,6-diphosphat
Ribose-5-phosphat Glycerin-1 -phosphat
Glycerinaldehyd-3-phosphat
Glucose-1 -phosphat
Adenosin-5'-triphosphat
Zucker-phosphate
P-O-CH2 O
-CH2OH
P-O-CH2 O CH2-O-P
P-O-CH2 O
CH2(OH)-CH(OH)-CH2-O-P
C-CH(OH)-CH2- O-p
H
HO-CH2
Glycerinsäure-2-phosphat HOOC-CH-CH2OH H2N
O-p N ι—N
UJ
NN O CH2-O-P
V V
Glycerinsäure-3-phosphat HOOC-CH(OH)-CH2-O-P H2N
Phospho-enol-pyruvat HOOC-C=CH2 N Y-N
KX)
NN O CH2-O-P-P
O-p
Nucleosid-phosphate
Adenosin-5-monophosphat
Adenosin-5-diphosphat
KX)
NN O CH2—O-p-p-p
Fortsetzung
Phosphat-Donator
(ρ = —ΡΟ,,Η,)		 HN=C N-CH2-COOH Na-p-p O O Relative Umsatz
geschwindigkeit
Sonstige Phosphorsäure-Derivate CH3 H2C-(CHOH)3-CH2 p-0-C-CH3
NH-p CH3
A/
CH3
Creatin-phosphat NNO
/VV
NH
\ A /
N Y
O		 O
Natriumpyrophosphat O
Riboflavin-5-acetyl-phosphat O
Aus der obigen Tabelle wird ersichtlich, daß die Acylphosphat:Glucose-6-phosphat-Transferase vorzugsweise mit solchen Phosphat-Donatoren reagiert, bei denen der Einfluß einer gegebenenfalls vorhandenen negativen Ladung auf die Bindung Phosphatdonator-Enzym am gerinsten ist; siehe z. B. Glutaroyl-phosphat, Succinyl-phosphat und 3-Phosphoglycerinsäure-1-phosphat im Vergleich zu Benzoylphosphat. Mit letzterem als Phosphat-Donator reagiert das Enzym sogar 60% schneller als mit Acetylphosphat.
Diese hohe Affinität der Acylphosphat •.Glucose-6-phosphat-Transferase zu Phosphat-Donatoren der Formel I war überraschend, da die bekannten Phospho-Transferasen, wie z. B. die übliche Hexokinase und Phosphoglycerat-Kinase, nur mit Nucleosidtriphosphaten reagieren. Weiterhin war nicht vorherzusehen, daß das neue Enzym so leicht von den bei Glucose-Bestimmungen störenden Begleitenzymen wie Phosphohexose - Isomerase, Glutathion - Reduktase, TPNH-Oxydase, Glucose-Dehydrogenase etwa zu reinigen ist und sich deshalb besonders für das erfindungsgemäße Verfahren eignet.
Die Reaktionsfolge des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch folgende Gleichungen charakterisiert werden:
Acylphosphat rGlucose-6-phosphat-Transferase R-COOPO3H2 + Glucose > G-6-P + R—COOH
G-6-P-Dehydrogenase G-6-P + TPN ► 6-PG + TPNH + H+
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu untersuchende Probe mit dem Acylphosphat (I), Triphosphopyridinnucleotid (TPN), einem Puffer (beispielsweise Glycokollpuffer) und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase versetzt. Eventuell vorhandenes GIucose-6-Phosphat wird bereits jetzt umgesetzt und kann vorweg bestimmt werden. Anschließend wird die Acylphosphat: Glucose-6-phosphat-Transferase zugegeben und nach einigen Minuten die Glucose an Hand des entstandenen reduzierten Triphosphopyridinnucleotids (TPNH) photometrisch bestimmt.
Da die wäßrigen Lösungen der Acylphosphate I nur begrenzt haltbar sind — es handelt sich ja um gemischte Säureanhydride — kann das zu verwendende Acylphosphat für den Routinegebrauch auch erst unmittelbar vor der Glucose-Bestimmung in einer vorgeschalteten enzymatischen Reaktion innerhalb der Meßküvette synthetisiert werden; z. B.
erzeugt man Acetylphosphat aus einem stabilen Acetat und ATP mittels Acetat-Kinase bzw. Carbamylphosphat aus Carbaminsäure und ATP mittels der Carbamat-Phosphokinase.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bisher bekannten Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose ist die hohe Substratspezifität der Kombination von Acylphosphat: Glucose - 6 - phosphat -Transferase mit
309 539/196
Glucose-ö-phosphat-Dehydrogenase. Wie man der' Tabelle 2 entnehmen kann, liegen für die Acylphosphat:Glucose-Transferase die Michaelis-Konstanten {KM), die ein Maß für die Affinität zum Substrat darstellen, hinsichtlich Glucose und Fructose um 3 Zehnerpotenzen auseinander.
Tabelle 2
Michaelis-Konstanten für Glucose und Fructose mit verschiedenen Phosphat-Donatoren (pH = 9,5; 25° C) Für die Bestimmung von Glucose, gemessen bei 366 πΐμ, gilt also
AE
Glucose
3 ■ 180,16
3,3 -103I
AE
Glucose
0,164
= mg Glucose/ml Probe.
Im vorliegenden Fall ergibt sich folgendes:
Acyl phosphat (Κλι) Glucose (K.u) Fructose
Acetylphosphat
(2OmM)
Carbamylphosphat
(47 mM)
Benzoylphosphat
(12 mM)
Nicotoylphosphat
(25 mM) · 		4·ΙΟ"5 Μ
5·10~5 M
8·10~5 M
5·10~5 M		 5·10~2 M
3· 10~2 Μ
2 · ΙΟ""2 Μ
2·ΙΟ"2 Μ
0,082 -1,164
0,01
10 = 13,5 mg Glucose/ml.Fruchtsaft.
Beispiel 2
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in den folgenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Glucose-Bestimmung mit Carbamylphosphat
Fruchtsaft (schwarze Johannisbeere) wird auf Glucose analysiert
Reagenzien End
konzentration
2,50ml Glycokoll-Puffer vom
pH = 9,0 (200 mM) 165 mM
0,10 ml TPN(HmM; 10 mg/ml) 0,37 mM
0,10 ml Carbamyl-phosphat
(14OmM; 20mg/1).. 4,7 mM
0,01 ml einer 1:10 verdünnten
Probe
ad 2,97 ml mit Wasser
0,01 ml Glucose-6-Phosphat-
Dehydrogenase (1 mg/ml,
140 U/mg) 0,47 U/ml
Es reagiert eventuell
vorhandenes G-6-P.
Dann startet man mit
0,02 ml Acylphosphat-Transferase
(1 mg/ml, 40 U/mg) 0,26 U/ml
Glucose-Bestimmung mit Benzoylphosphat
Es wird analog Beispiel 1 gearbeitet, jedoch statt Carbamylphosphat Benzoylphosphat (Endmolarität = 3,3 mM) eingesetzt..
Der Endwert nach dem Start mit Acylphosphat-Transferase ist wie im Beispiel 1 nach 5 Minuten erreicht. Es wird die gleiche Extinktion gefunden.
25
Beispiel 3
Glucose-Bestimmung mit Nicotoylphosphat
Das Meßverfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit Nicotoylphosphat (Endmolarität = 3,3 mM). In diesem Falle wird eine 0,01 M ct-D-Glucose-Lösung hergestellt und analysiert. Eingesetzt zur Glucose-Bestimmung werden davon 0,02 ml (= 0,2μΜο1 = 0,036 mg Glucose). Nach dem Start mit Acylphosphat-Transferase wird der Endwert nach 5 Minuten mit Δ Ε = 0,222 ermittelt.
AE
Glucose
0,164
40 0,02
0,222 · 0,164
0,002
= mg Glucose/ml
= 1,82 mg Glucose/ml der eingesetzten Lösung,
das entspricht 0,0364 mg Glucose/eingesetzte Milliliter. Man findet also 101% wieder.
Beispiel 4
Glucose-Bestimmung mit Acetyl-Phosphat-Bildung in der Küvette
Der Endwert ist in etwa 5 Minuten erreicht. Bei 366 πΐμ wird Δ £ Glucose 0,082 gemessen.
Nach der üblichen Berechnungsformel gilt:
ΔΕ'ν w ι/ ι
5— = μΜοΙ/ml,
ε ■ α · υ
ε = Extinktionskoeffizient von TPNH:
6,22 αη2/μΜο1
340 ΓΠμ,
3,3 αη2/μΜο1
366 ΓΠμ,
d = Schichtdicke der Küvette (1 cm),
V = Testvolumen (3 ml),
ν = Volumen der eingesetzten Probe.
2,40 ml Reagenzien End
molarität
55
Glycokoll-Acetatpuffer
(pH 9,0) 16OmM
Glycin
6o 0,10 ml 12OmM
0,10 ml Acetat
0,10 mg TPN(HmM; 10 mg/ml) 0,37 mM
0,02 ml ATP (8OmM; 50 mg/ml) 2,7 mM
65 MgCl2 (10OmM) 3,3 mM
eines 1:10 verdünnten
Diät-Fruchtsaftes
(schwarze Johannisbeere)
Fortsetzung
Reagenzien
ad 2,96 ml mit Wasser
0,01 ml Acetatkinase (5 mg/ml
700 U/ml)
0,01 ml Glucose-6-Phosphat-
Dehydrogenase (1 mg/ml, 140 U/mg)
Man startet mit
0,02 ml Acylphosphat-Transferase (1 mg/ml, 40 U/mg)
Endmolarität
2,3 U/ml
0,47 U/ml im Beispiel 5 beschrieben. Zusätzlich wurde Fructose nach H. Klotzsch und H. U. Bergmeyer bestimmt (vgl. H. U. Bergmeyer: Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim 1962, S. 156).
Tabelle 4
Glucose- und Fructose-Bestimmungen im Blut, wobei dem Blut steigende Mengen Fructose zugesetzt wurden
0,26 U/ml
Der Endwert für Glucose wird nach 8 Minuten erreicht. zlEoiucose bei 366 πΐμ: 0,170. Die Berechnung nach Beispiel 1 ergibt:
0,170 · 0,164
•0,02
10 = 13,9mg Glucose/ml Fruchtsaft.
Beispiel 5 Glucose-Bestimmungen im Blut mit Acetylphosphat
Zur Enteiweißung werden zehn verschiedene Blutproben zu je 0,1 ml mit je 1 ml Perchlorsäure 0,33 M versetzt. Nach Zentnfugation werden zum Testansatz 0,2 ml Probe eingesetzt. Dann wird wie im Beispiel 1 gearbeitet, jedoch kommt statt Carbamylphosphat Acetylphosphat (Endmolarität 4 mM) als P-Donator zur Anwendung. Berechnet nach Beispiel 1 werden folgende Werte gefunden (in Klammern sind zum Vergleich die Glucose-Werte der gleichen Probe nach der Hexokinase-Zwischenferment-Methode angegeben):
Glucose im Blut
Fructose Glucose (mg %) Differenz
Nr. mit Acyl
phosphat- mit HK (%)
0 Transferase + 2,1
1 16,0 73 71,5 + 1
31,3 72,2 71,5 + 2,4
62,4 72,2 70,5 + 2,3
153,0 71,6 70,0 + 3,1
0 72,2 70,0 0
2 27,8 67,0 67,0 + 1,3
71,8 67,0 66,1 0
144,0 66,1 66,1 + 5,3
283,0 67,8 64,4 + 2,5
66,1 64,4
35
mg % mit Acyl mg % mit
HK/G-6-PDH		 Abweichung
phosphat-
Transferase		 (105,5) ±0%
1 105,5 (91) + 1%
2 92 (86) + 2,9%
3 88,5 (94) + 1%
4 95 (127) -1,6%
5 125 (82) ±0%
6 82 (97,5) +1,5%
7 99 (102) ±0%
8 102 (76) -0,7%
9 75,5 (106) -1%
10 105
45
Beispiel 7
Glucose-Bestimmungen in Untersuchungsmaterial mit hohem Fructosegehalt
Die Messung erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch wird statt Carbamylphosphat als P-Donator 4 mM Acetylphosphat verwendet. Besonders zu beachten ist die glatte Durchführbarkeit der Messung. Auch Spuren von Glucose in reinster Fructose sind mit der erfindungsgemäßen Methode sicher nachweisbar (vgl. Tabelle 5).
Tabelle 5
Glucose-Bestimmung im Untersuchungsmaterial mit hohem Fructose-Gehalt
Probe
55 Beispiel 6
Glucose- und Fructose-Bestimmungen im Blut, dem steigende Mengen Fructose zugesetzt werden
Zur Enteiweißung werden zehn verschiedene Blutproben mit verschiedenen Fructose-Mengen versetzt (vgl. Tabelle 4). Die weitere Arbeitsweise erfolgt wie Aprikosensaft ...
Johannisbeersaft
Kirschsaft
Apfelsaft
Apfelsaft*)
Fructose, reinst .
Fructose
2,62
4,26
4,30
6,49
26,28
etwa 100
Glucose
mit Acyl-
phosphat-
Trans-
ferase
2,99
4,18
4,61
2,87
2,59
0,003
mit HK
2,95
4,10
4,61
2,68
2,49
*) Dem Saft wurden etwa 200 mg Fructose/ml zugesetzt, dabei
geringfügig verdünnt.
**) Methode versagt in diesem Falle.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose mittels eines Phosphatdonators und einer Transferase, welche Glucose in Glucose-6-phosphat überführt, worauf man das Glucose-
6-phosphat mittels Triphosphopyridin-nucleotid (TPN) in Gegenwart von G-6-P-Dehydrogenase in 6-Phosphogluconsäure und reduziertes Triphosphopyridin-nucleotid überführt und letzteres spektrophotometrisch bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phosphatdonatoren Substanzen der Formel
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