DE2944498C2

DE2944498C2 - Methode zur quantitativen Bestimmung von Acyl-Coenzym A und Reagens hierfür

Info

Publication number: DE2944498C2
Application number: DE19792944498
Authority: DE
Inventors: Hiromichi Hirakawa; Heihachiro Hirakata Osaka Kinoshita; Koji Osaka Mizuno; Mitsuyoshi Kyoto Toyosato
Original assignee: Nippon Shoji Kaisha Ltd
Current assignee: Azwell Inc
Priority date: 1978-11-06
Filing date: 1979-11-03
Publication date: 1985-08-29
Also published as: DE2944498A1; JPS5564800A; JPS5729998B2

Description

25 Die Erfindung betrifft eine Methode zur quantitativen Bestimmung von Acyl-Coenzym A und ein für die Bestimmung verwendetes Reagens sowie die Verwendung dieser Methode der einfachen und schnellen quantitativen Bestimmung der Menge von Acyl-Coenzym A (nachstehend als »Acyl-CoA-« bezeichnet) zur Messung von freien Fettsäuren im Blut im klinischen Test.

Freie Fettsäuren im Blut haben bekanntlich eine enge Beziehung zum Kohlenhydratstoffwechsel und Lipid-30 Stoffwechsel im Körper, so daß die Messung freier Fettsäuren im Blut sehr nützlich für die Diagnose verschiedener Krankheiten, beispielsweise Leberkrankheiten, Endokrinopathie, Krankhaften mit anomalem Stoffwechsel von Kohlenhydraten und Lipiden (z. B. Diabetes) sowie außerdem für die Bewertung des Fortschritts der Behandlung dieser Krankheiten lsi. Es ist jedoch nie eine genügende klinische Testmethode für diesen Zweck gefunden worden.

r» Vor kurzem wurde für die Öesti: ,inung der Menge freier Fettsäuren im Blut eine Methode vorgeschlagen, bei der man Acyl-CoA-Synihetase (En/.ym Nr. 6.2.1 J) mit einer Fettsäure (RCOOH) in Gegenwart von Adenosintriphosphat (nachstehend als »ΛΤΡ« bezeichnet) und Cocnzym A (nachstehend als CoA bezeichnet) umsetzt. I wobei Acyl-CoA, Pyrophosphorsäure (nachstehend als »PPi« bezeichnet) und Adcnosinmonophosphat (nachsie-

f? hend als »AM P« bezeichnet) gemäß dem folgenden Reaktionsschema gebildet werden:

i RCOOH ₊ ATP₊CoA Acyl-CoA-SynthcUre _Acyl._{CoA + PPi + AMP (i)}

;.;·'■ Die Konzentration des gebildeten AMP wird dann gemessen (siehe japanische Patentveröffentlichung [nicht

')", 45 geprüft] 17 085/1977). Eine vergleichbare Methode zur Bestimmung freier Fettsäuren im Blutserum bei Bcslim-

V; mung des nach Reaktionsschema (I) entstehenden AMP in Folgereaktionen offenbaren auch US-PS 40 71 413

[i" und JP-A-50 92 134. Diese Methoden können als klinische Testmethode angewendet werden, weil die Bestim-

-.1 mung nach diesen Methoden verhältnismäßig schnell durchgeführt werden kann. Sie sind jedoch noch mit

!,;.! Problemen in bezug auf die Genauigkeit der Messung von AMP und die Qualität der Acyl-CoA-Synthetasc

y'j so behaftet. Von der Anmelderin wurde erwogen, daß diese Probleme durch Messen eines anderen Produkts im

ir'i vorstehenden Reaktionsschema (I). nämlich Acyl-CoA, gelöst werden kann.

$ Für die Messung von Acyl-CoA sind bereits einige Methoden bekannt, beispielsweise eine Methode, bei der

a] Acyl-CoA in Hydroxamsäure umgesetzt und diese nach einer Methode von Lipmann und Tuttle (F. Lipmann und

f"i C. L Tuttle, J. Biol. Chem. 159 [1945], 21) gemessen wird; eine UV-Absorptionsmethode, bei der der Unterschied

fi 55 der Wellenlänge maximaler UV-Absorption zwischen CoA und Acyl-CoA ausgenutzt wird, und eine Methode,

)■» beider Acyl-CoA hydrolysiert, CoA isoliert und das hierbei isolierte CoA mit Nitroprussid oder 5,5'-Dithiobis-

K. benzoesäure gemessen wird.

-; Diese Methoden weisen jedoch eine geringe Empfindlichkeit auf oder sind als Folge der Extraktion mit einem

'■■X organischen Lösungsmittel sehr kompliziert durchzuführen, so dal.i sie sich für einen klinischen Test, der schnell,

ι; M) leicht und genau durchführbar sein muß, nicht eignen.

|'_;-j Von den Erfindern wurden eingehende Untersuchungen mit dem Ziel der Entwicklung einer verbessern

f(? Methode zur Messung von Acyl-CoA durchgeführt.

ä»^: Kürzlich wurde berichtet, daß eine Acyl-CoA-Oxidase in einem Leberperoxizom der Ratte vorhanden ist und

'$ das Enzym Wasserstoffperoxid durch Verwendung von Acyl-CoA als Substrat zu bilden vermag (Osumi et al,

i?:« 65 20th Proceedings of Japanese Conference of the Biochemistry of Lipids, Subject No. 11-29. Juni 1978.Tokyo und:

fij Osumi et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 83. 479—485 [1983]). Von der Anmeldcrin wurde ferner gefunden,

M daß eine Aeyl-CoA-Oxida.sc in dem von Fukui el al beschriebenen /weiten Sediment vorhanden ist (Anh.

Wj Microbiol.. Bd. 112 [1977], 1). Auf der Grundlage dieser Feststellung wurden von der Anmelderin IJniersiichun·

gen mit dem Ziel durchgeführt, die Menge von Acyl-CoA zu messen, indem zuerst Wasserstoffperoxid durch Oxidation von Acyi-CoA mit einer Acyl-CoA-Oxidase gemäß dem Reaktionsschema

Acyl-CoA + O₂ Acyl-CoA-Oxidase_{) 2 3}._transinoy, CoA+Η,Ο, (II)

gebildet und das hierbei gebildete Wasserstoffperoxid einer Farbreaktion unterworfen wird, indem eine Peroxidasc im gleichen Reaktionssystem darauf zur Einwirkung gebracht wird, wie durch das folgende Reakiionssehema dargestellt:

.... ... Peroxidasc _r. ..

ΙΙ,Ο., + I-arbreagens > Farbreaktion. (Ill)

Diese Methode ist jedoch hinsichtlich der Genauigkeit und Empfindlichkeit der Bestimmung unbefriedigend.

In weiteren eingehenden Untersuchungen durch die Anmelderin wurde überraschenderweise gefunden, daß. wenn die vorstehend genannte Reaktion (II) in Gegenwart eines SH-Reagens durchgeführt wird, die Bestimmungsgenauigkcit und -empfindlichkeit der Reaktion bedeutend verbessert wird, da, wie aus: Hoffmann-Ostenhof; Enzymologie, Springer-Verlag Wien, 1954, S. 143—147 bekannt, das SH-Reagens spezifisch auf eine SH-Gruppe in einem Molekül einwirkt und die Acyl-CoA-Oxidase eine SH-Gruppe enthält, und somit anzunehmen ist, daß die Oxidase durch das SH-Reagens deaktiviert wird.

Ferner wurde gefunden, daß, wenn die vorstehenden Reaktionen (II) und (III) mit der vorstehend genannten Reaktion (I) kombiniert und diese Reaktionen kontinuierlich in Gegenwart des SH-Reagens durchgeführt werden, die freien Fettsäuren im Blut leicht und schnell ohne Störung durch nicht umgesetztes CoA als Folge der Anwesenheit des SH-Reagens gemessen werden können.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß eine verbesserte Methode zur Messung von Acyl-CoA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß man in Gegenwart von Acyl-Coenzym-A-ÜAidase Acyl-Coenzym A, das in einer Testprobe enthalten ist, mit Sauerstoff umsetzt und die hierbei gebildete Wasserstoffperoxidmenge mißt, wobei man der Reaktion ein SH-Reagens zusetzt, das aus der Gruppe Maieimid, N-Methylmaleimid, N-Ethylmaleimid, N-Phenylmaleimid, N.N'-o-Phenylendimaleimid. Ν,Ν'-p-Phenylendimaleimid, N-(4-Dimethylamino-3.5-dinitrophcnyl)maleimid, lcdaceiamid und 4,4'-Bis-dimethylaminobenzhydrol oder deren Mischungen ausgewählt ist. jo

Gegenstand der Erfindung ist auch ein für die Messung von Acyl-CoA geeignetes Reagens, das eine Acy!-Coen/.ym-A-Oxidasc, ein SH-Rcagens, Peroxidasc oder Kaialasc und ein Farbreagens enthält, sowie die Verwendung der Methode zur Messung von Acyl-Cocnzym A zur Messung von freien Fettsäuren im Blut, wobei die in derTeslprobc enthaltene Fettsäure durch Acyl-Cocnzym-A-Synihetase in Gegenwart von Adenosintriphosphal und Cocn/.ym A zu Acyl-Cocnzym A umgesetzt und dessen Konzentration in der Testprobe quantitativ bc- j5 siimmt wird.

Gemäß der Erfindung kann die Messung von Acyl-CoA durchgeführt werden, indem in der Testiösung enthaltenes Acyl-CoA mit einer Acyl-CoA-Oxidase in Gegenwart eines SH-Reagens oxidiert und das hierbei gebildete Wasserstoffperoxid dann gemessen wird.

Die für cie Zwecke der Erfindung verwendete Acyl-CoA-Oxidase kann durch Kultivieren von Candida tropicalis und Abtrennen von der zweiten Fraktion des Sed^:ments hergestellt werden (Fukui et al. Arch. Microbiol. 112 [1977] 1 —8). Die Menge dieses Enzyms ist nicht entscheidend wichtig. Die geeignete Menge wird in Abhängigkeit von seiner Aktivität, von der Art und Menge der Testprobe u. dgl. ausgewählt, jedoch beirägt sie vorzugsweise 5 bis 100 μg/Test(als Enzymprotein).

Als SH-Reagenz, das für die Zwecke der Erfindung verwendet wird, eignen sich beispielsweise Meieimid und seine Derivate, z. B. N-Methylmakimid, N-Äthylmaleimid, N-Phenylmaleimid, N.N'-o-Phenylendimaleimid, Ν,Ν'-p-Phenylendimaleimid, N-(4-Dimethylamino-3,5-dinitrophenyl)-maleimid, Jodacetamid und 4,4'-Bisdimethylaminobenzhydrol. Bevorzugt werden Maieimid und seine Derivate. Die Menge des SH-Reagens ist nicht entscheidend wichtig, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von 0,02 bis ΙΟμΜοΙ/Test.

Die Testlösung wird in, allgemeinen mil einer geeigneten Pufferlösung, die keinen unerwünschten Einfluß auf die Aktivität der Enzyme und die Farbreaktion hat, beispielsweise Tris-HCI· Puffer, Kaliumphosphatpuffer, Bicinpufferund Imidazolpuffer, auf einen geeigneten pH-Bereich eingestellt.

Die Messung von Wasserstoffperoxid kann nicht nur unter Verwendung von Peroxidase gemäß dem vorstehenden Re'iktionsschcma (III), sondern auch nach beliebigen anderen üblichen Methoden erfolgen, beispielsweise nach einer Methode, bei der Katalase an Stelle von Peroxidase verwendet wird und nach einer Methode, bei de eine Elektrode verwendet wird (The Japanese Journal of Medical Technology 20 [1976], 1416). FLr den klinischen Test ist die Methode, bei der Peroxidase oder Katalase verwendet wird, vorzuziehen. Bevorzugt als Reagens für die Messung von Acyl-CoA gemäß der Erfindung werden somit eine Acyl-CoA-Oxidase, ein SH-Rcageris, ein aus Peroxidase und Katalase ausgewähltes Enzym und ein Far'jreagens.

Wie bereits erwähnt, kann die Bestimmung von Wasserstoffperox'd nach beliebigen üblichen Methoden durchgeführt werden. Im Falle der optischen Analyse unter Verwendung von Peroxidase öder Katalase können alle im Handel erhältlichen Peroxidasen und Katalasen verwendet werden. Die Peroxidase wird gewöhnlich in einer Menge von 1,0 bis 20 Einheiten/Test und die Katalase gewöhnlich in einer Menge von 100 bis 4000 Einheiten/Test verwendet. Bei Verwendung von Katalase wird diese vorzugsweise in Form eines Gemisches mit Ammoniumacetat (50 bis 400 mg/Test), Acetylaceton (0,8 bis 6 mg/Test) uid ,-/!ethanol (70 bis 600 mg/Test) verwendet.

Als Farbreagens, das 'ür die Zwecke der Erfindung verwendet wird, eignet sich beispielsweise eine Kombination von 4-Aminoantipyrin und Phenol, eine Kombination von 4-Aminoantipyrin und 2,4-Dichlorphenol und eine

Kombination von 4-Aminoantipyrin und Ν,Ν-Dimethylanilin, Orthodianisidin allein und eine Kombination von N,N-Dimethylanilin und 3-Methyl-3-benzothiazolinonhydrazon (MBTH). Bei Verwendung der Kombination von 4-Aminoantipyrin und Phenol oder Ν,Ν-Dimethylanilin wird das 4-Aminoantipyrin in einer Menge von 0,05 bis 1,2 mg/Test verwendet, und das Phenol und das Ν,Ν-Dimethylanilin werden in äquimolarer Menge, d. h. 0,2 bis 1,5 mg/Test bzw. 0.1 bis 2,0 mg/Test verwendet. Im Falle von Orthodianisidin wird dieses in einer Menge von 30 bis 250 μg/Test verwendet. Im Falle der Kombination von N.N-Dimethylanilin und MBTH wird das N.N-Dimethylanilin in einer Menge von 0,5 bis 10 mg/Test und das MBTH in einer Menge von 100 bis 800 μg/Test verwendet. Die Kombination von 4-Aminoantipyrin und Phenol oder Ν,Ν-Dimethylanilin wird bevorzugt, weil die Methode kontinuierlich durchgeführt werden kann.

Das Reagens für die Messung von Acyl-CoA gemäß der Erfindung enthält eine Acyl-CoA-Oxidase, ein SH-Reagens, Peroxidase oder Katalase und ein Farbreagens und gegebenenfalls außerdem eine Pufferlösung. Diese Bestandteile werden in solchen geeigneten Mengen verwende!, daß die gewünschte Konzentration und der gev.-üpschte pH-Wert erhalten werden. Beispielsweise werden für einen Test 0,OJ bis 1,67 μΜοΙ eines .SH-Rcagens.0,33 bis 5,0 Einheiten Peroxidase oder 33 bis 1333 Einheiten Katalase. 0.017 bis 0,4 mg4-Aminoanlipyrin und 0,06 bis 0,5mg Phenol oder 0,033 bis 0.7 mg Ν,Ν-Dimethylanilin pro bug (als En/ymprotcm) der Acyl-CoA-Oxidase verwendet

Das Reagens gemäß der Erfindung kann in Form eines Kits mit einem Siandard-Aeyl-CoA für die Messung eines Acyl-CoA oder eines Kiits mit einer Acyl-CoA-Synthetase und einer Standardfettsäure für die Messung von freier Fettsäure im Blut verwendet werden.

το Die Bestimmung von Acyl-CoA nach der Methode gemäß der Erfindung wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt:

Zu einer zu testenden reinen wäßrigen Lösung oder wäßrigen Dispersion, die in geeigneter Weise verdünnt oder unverdünnt sein kann, gibt man eine Acyl-CoA-Oxidase, ein SH-Rcagens. das aus der Gruppe Maleimid, N-Methylmaleimid, N-Ethylmaleimid, N-Phenylmaleimid, N.N'-o-Phenylendimaleimid, N.N'-p-Phenylendima-

leimid, N-(4-Dirr.ethylamino-3,5-dinitrophenyl)maleimid, Jodaceiamid und 4.4'Bisdimethy!aminobenzhydroi oder deren Mischungen ausgewählt werden kann, Peroxidase oder Katalase und ein Farbreagens gleichzeitig oder getrennt, während der pH-Weri der Lösung oder Dispersion im Bereich von 7,0 bis 8,5 gehalten wird. Das Gemisch wird 5 bis 60 Minuten bei 37°C an der Luft erhitzt, worauf ,iie optische Dichte des Gemisches bei einer für die Farbreaktion geeigneten Wellenlänge, beispielsweise 400 bis 600 nm, gegen ein Blindreagens gemessen

wird. Die Menge des Acyl-CoA wird aus einer Eichkurve berechnet, die aus den Daten gezeichnet wird, die durch Behandlung einer Lösung, die ein Standard-Acyl-CoA enthält, in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten wurden.

Der Effekt eines SH-Rcagens im Rahmen der Erfindung wurde durch die nachstehend beschriebenen Versuche bestätigt

Versuch 1

Zu einer wäßrigen Lösung von Palmitoyl-CoA (0,1 ml. 200 nMol Palmiloyl-CoA/Tesl) wurde eine trisHC'l-Pufferlösung (pH 7,6, 3 ml) gegeben, die eine Acyl-CoA-Oxidase (Enzymprotein 18 mg/Test). Peroxidase (5 Ein-

heiten/Test), N-Äthylmaleimid (ein SH-Reagens, 0 bis i0 μΜο'ι/Test), Phenol (0.5 mg/Test) und 4-Aminoantipyrin (0,25 mg/Test) enthielt. Diis Gemisch wurde 30 Minuten bei 37⁰C erhitzt, worauf seine optische Dichte bei einer Wellenlänge von 500 nm gegen ein Blindreagens gemessen wurde. Die optische Dichte (in %) für jede Konzentration von N-Mhylenmaleimid wurde auf der Grundlage der optischen Dichte ohne Zusatz, von N-Äthylmaleimid (100%) berechnet. Die Ergebnisse sind in F i g. 1 dargestellt.

Fig. 1 zeigt ehe graphische Darstellung des Einflusses der Zugabe eines SH-Reagens. wobei die optische Dichte als Ordinate und die Konzentration von N-Äthylmaleimid als Abszisse aufgetragen ist. Wie die Darstellung in Fig. 1 zeigt, wird die Empfindlichkeit der Messung durch Zusatz des SH-Reagens (N-Äthylmaleimid) verbessert, und bei einer bestimmten Konzentration (0,1 μΜοΙ/Test oder höher) kann die Messung mit fast konstanter Empfindlichkeit durchgeführt werden.

Versuch 2

Auf die unter »Versuch 1<:< beschriebene Weise wurde die optische Dichte einer wäßrigen Lösung von

Palmitoyl-CoA (200 nMol/Test). der verschiedene SH-Rcagentien (5 μΜοΙ) zugesetzt waren, gemessen. Der

Wert (%) der optischen Dichte in jedem Fall der Zugabe der SH-Reagentien wurde auf der Grundlage der

optischen Dichte (100%) für den Fa!!, indem kein SH-Reagens zugesetzt wurde, berechnet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

Tabelle 1

SH-Reagentien Optische

Dichte

- 100

Maleimid 196

N-Methy!maleimid 200

N-Äthylmaleimid 195

Forisel/iiiig

SI I-Kcii^onlicn Optische

Dichte

N-Phenylmaleimid 200

Ν,Ν'-o-Phenylendimaleimid 203

N.N'-p-Phenylendimaleimid 201

N-(⁴-Dimethylamino-3.5-dinitrophenyl)- 197

maleimid

lodoacctamid 130

4,4'-Bisdimethylaminobenzhydrol 107

Wie Tabelle I zeigt, wird die Empfindlichkeit der Messung durch Zusatz aller dieser SH-Reagcntien verbessort. Ferner wurden gleiche Versuche unter Verwendung verschiedener Konzentration dieser SH-Reagenlien durchgeführt. I lierbei wurden ähnliche Ergebnisse, wie sie in I" i g. 1 dargestellt sind, erhalten.

Versuch J

Auf die unter »Vesuch 1« beschriebene Weise wurde die optische Dichte von wäßrigen Lösungen, die l'iilmitoyl-CoA und N-Alhylmaleimid (SU-Reagens. 5 μΜοΙ/Test) in verschiedenen Konzentrationen enthielten, gemessen. Als Bezug wurden ferner wäßrige Lösungen, die kein SH-Rcagens enthielten, in der gleichen Weise getestet. Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt.

F i g. 2 zeigt eine graphische Darstellung des Effekts der Zugabe eines SH-Rcagcns. wobei die optische Dichte bei 500 nm als Ordinate und die Konzentration von Palmitoyl-CoA (nMol/Test) als Abszisse aufgetragen ist. Die Kurve A stellt den mit Zusatz von N-Äthylmaleimid durchgeführten Test und die Kurve Öden ohne Zusatz von N-Äthylmaleimid durchgeführten Test dar. Wie die Darstellung zeigt, verbessert der Zusatz eines SH-Reagens nicht nur die Empfindlichkeit der Messung, sondern auch die Genauigkeit der Bestimmung.

Di«· Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1
Herstellung der Reagentien

I) Reagens A

50 mg Phenol werden in 100 ml einer 0,2-molarenTris-HCl-Pufferlösung (pH 7,6) gelöst, wobei das Reagens A erhallen wird.

II) Reagens B

50 mg4-Aminoantipyrin und 1000 Einheiten Peroxidase werden in 100 ml einer 0,02-molarenTris-HCI-Pufferlö.sung (pH 7,6) gelöst, wobei das Reagens B erhalten wird.

III) ReagensC

62,6 mg N-Äthylmaleimid werden in 10 ml gereinigtem Wasser gelöst, wobei das Reagens C erhalten wird.

IV) Reagens D

18 mg einer Acyl-CoA-Oxidase (als Enzymprotein) werden in 0.2-molarer Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7.6) in einer solchen Menge gelöst, daß insgesamt 100 ml Lösung, die das Reagens D darstellt, erhalten werden.

V) PaImitoyl-CoA-Standardlösung(2mMol)

236,7 g Palmitoyl-CoA (Hersteller Sigma Co, Molekulargewicht 1006, Reinheit 85%) werden in gereinigtem Wasser in einer solchen Menge gelöst, daß insgesamt 100 ml Palmitoyl-CoA-Standardlösung erhalten werden.

Methode bo

Eine Testprobe (Palmitoyl-CoA-Standardlösung, 0,1 ml). Reagens A (1,0 ml). Reagens B (0,5 ml). Reagens C (0.1 ml) und gereinigtes Wasser (1,2 ml) werden gemischt und 3 bis 5 Minuten bei 37"C erhitzt, woraui 0,1 ml Reagens D zugesetzt wird. Das Gemisch wird weitere 15 Minuten bei 37° C erhitzt, worauf d'- optische Dichte des Gemisches bei 500 nm gemessen wird.

Der vorstehend beschriebene Versuch wird unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der Palmitoyl-CoA-Standardlösung wiederholt Auf der Grundlage der hierbei ermillcltcn Werte wird eine Eichkurvc

gezeichnet (siehe Fig.2, Kurve A). Die in der Testprobe vorhandene Menge an Acyl-CoA wird auf der Grundlage der Eichkurve berechnet.

Im Falle von Beispiel 1 beträgt die optische Dichte 0,210. Wenn dieser Versuch wiederholt wird, wobei jedoch

gereinigtes Wasser (0,1 ml) an Stelle von Reagens C (SH-Reagens) (Bezugsbeispiel) verwendet wird, beträgt die optische Dichte 0,108. Im Falle von Beispiel 1 gemäß der Erfindung ist somit die optische Dichte 1.94mal höher

■ als im Falle der Bezugsbeispiels. Dies bedeutet, daß die Meßempfindlichkeit gemäß der Erfindung höher ist als

im Falle des Bezugsbeispiels.

In der vor-cehend beschriebenen Weise wird eine Testprobe, die Acyl-CoA in unbekannter Konzentration enthält, getestet. Hierbei wird eine optische Dichte von 0,208 ermittelt. Die Konzentralion von Acyl-CoA in der Testprobe wird auf der Grundlage der Eichkurve mit 1,98 mMol (als Palmitoyl-CoA) berechnet. Wenn bei dem vorstehend beschriebenen Versuch kein Reagens C verwendet wird, beträgt die optische Dichte 0.10b.

Beispiel 2
Herstellung der Reagentien

Die gemäß Beispiel 1 hergestellten Reagentien A bis D und gereinigtes Wasser werden im Volumenverhältnis von 10:5:1 :1 : 12 gemischt, wobei ein Reagensgemiseh für die Messung erhalten wird.

Methode

Zu 0,1 ml einer Testprobe (die gemäß Beispiel 1 hergestellte Palmitoyl-CoA-Standardlösung) werden 2,9 ml : des in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten Reagensgemisches für die Messung gegeben. Das

Gemisch wird auf die in Beispiel I beschriebene Weise behandelt. (Die Eichkurve wird unter Verwendung der gleichen Reagentien, die für die Messung der Testprobe in allen Beispielen verwendet wird, angefertigt.)
• Die optische Dichte im Falle von Beispiel 2 beträgt 0,205. Wenn dagegen die Bestimmung ohne Verwendung

von Reagens C (SH-Reagens) durchgeführt wird, beträgt die optische Dichte 0,104. Die optische Dichte im Falle von Beispiel 2 gemäß der Erfindung isi somit l,97mal höher als im Falle der Bestimmung ohne SH-Reagcns, und \ der Versuch gemäß der Erfindung kann mit höherer Empfindlichkeit der Messung durchgefühlt werden.

^;: Beispiel 3

_r;_: Herstellung der Reagentien

ti 35 I) Reagens A

u Das Reagens A wird durch Auflösen von 100 mg Ν,Ν-Dimethylanilin in 100 ml 0.2-molarerTris-HCI-Puff crlö-

: sung (pH 7,6) erhalten.

11) Reagens B

·/ Das Reagens B wir! durch Auflösen von 75 mg 4-Aminoantipyrin und 1000 Einheiten Peroxidase in 100 ml

0,02-molarerTris-HCl-Pufferlösung(pH 7,6) erhalten.

(J 45 HI) ReagensC

ψ Das Reagens C wird durch Auflösen von 27 mg N,N'-o-Phenylendimaleimid in 100 ml gereinigtem Wasser

ψ erhalten.

w IV) Reagens D

Das gleiche Reagens wie in Beispiel 1 wird verwendet.

V) Paimitoyl-CoA-Standardiösung(1 mMol)

1 JS..4 mg Palmitoyl-CoA werden in gereinigtem Wasser in einer solchen Menge gelöst, daß insgesamt 100 ml Palmitoyl-CoA-Standardlösung erhalten werden.

Methode

Eine Testprobe (0,1 ml Palmitoyl-CoA-Standardlösung), 1,0 ml Reagens A, 0,5 ml Reagens B, 1,0 ml Reagens C-, 0,1 ml Reagens D und 03 ml gereinigtes Wasser werden gemischt und 15 Minuten bei 37°C erhitzt, worauf die optische Dichte des Gemisches bei 550 nm gemessen wird. Die Menge des Acyl-CoA in der Testprobe wird auf der Grundlage einer Eichkurve berechnet, die unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der Standardlösung in gleicher Weise angefertigt worden ist

Im Falle von Beispiel 3 beträgt die optische Dichte 0,262. Wenn der Versuch unter Verwendung von 1,0 ml gereinigtem Wasser an Stelle des Reagens C (SH-Reagens) (Bezugsbeispiel) wiederholt wird, beträgt die optische Dichte 0,132. Die optische Dichte im Falle von Beispiel 3 gemäß der Erfindung ist somit 1.98m^l höher

;ils im Falle des BezugsbeispieK und der Test gemäß der Erfindung kann mit höherer Empfindlichkeit der Messung durchgeführt werden.

H c i s ρ i c 1 4

I IcrstclliiMg der Rea^entien Die gemiiß Beispiel I verwendeten gleichen Reagentien Λ bis D werden verwendet.

Myristoyl-CoAStandardlösung(2 mMol)

Diese Lösung wird durch Auflösen von 217,3 mg Myristoyl-CoA (Hersteller Sigma Co., Molekulargewicht 977,9, Reinheit 90%) in gereinigtem Wasser in einer solchen Menge hergestellt, daß insgesamt 100 ml Lösung erhalten werden.

Methode

F.ine Testprobe (0,1 ml Myristo; !-CoA-Standardlösung) wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behände!;. Hierbei wird eine optische Dichte des Reaktionsgemische mn 0 207 gemessen. Wenn andererseits der Test ohne Verwendung von Reagens C (SH-Reagens) durchgeführt wird, beträgt die optische Dichte 0,103. Die optische Die >tc im Falle von Beispiel 4 gemäß der Erfindung ist somit 2,01 mal höber als die optische Dichte bei Durchführung der Messung ohne SH-Reagens. Ferner ist die Empfindlichkeit der Messung höher.

Beispiel 5

Herstellung der Rcagcntien 1) Rcagentien Λ, B und D Die gleichen Reagentien wie in Beispiel 1 werden verwendet. JO

II) Reagens C

Das Reagens C wird durch Auflösen von 92,5 mg Jodaceiamidin 10 ml gereinigtem Wasser erhalten.

Methode

0,1 ml Testprobe (Palmitoyl-CoA-Standardlösung wie in Beispiel 1) wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt. Hierbei wird eine optische Dichte des Reaktionsgemisches von 0,134 ermittelt. Wenn andererseits der Test ohne Verwendung von Reagens C (SH-Reagens) durchgeführt wird, beträgt die optische Dichte 0,10b. Die optische Dichte im Falle von Beispie! 5 gemäß der Erfindung ist somit l,26mal höher als die optische Dichte bei Durchführung des Tests ohne SH-Reagens. Die Meßempfindlichkeit ist somit höher.

Beispiel 6

45 Herstellung der Reagentien

I) Reagentien A, B und D

Die gleichen Rcagentien wie in Beispiel 1 werden verwendet. ■> <)

II) ReagensC

Das Reagens C wir durch Auflösen von 86,6 mg N-Phenyl-Maleimid in 10 ml gereinigtem Wasser hergestellt. Diese Reagentien A bis D und gereinigtes Wasser werden im Volumenverhältnis von 10:5:1 :1 :12 gemischt, wobei ein Reagens für die Messung erhalten wird.

Methode

0,1 ml Testprobe (Palmitoyl-CoA wie in Beispiel 1) werden mit 2,9 ml des in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten Reagens für die Messung gemischt Das Gemisch wird der in Beispiel 1 beschriebenen Behandlung unterworfen. Hierbei wird eine optische Dichte des Reaktionsgemisches von 0,208 gemessen. Wenn andererseits der Test ohne Reagens C (SH-Reagens) durchgeführt wird, beträgt die optische Dichte 0,103. Die optische Dichte im Falle von Beispiel 6 gemäß der Erfindung ist somit 2,02mal höher als die optische Dichte bei Durchführung des Tests ohne SH-Reagens, so daß die Empfindlichkeit der Messung höher ist.

Beispiel 7
Herstellung der Reagentien

Die gleichen Reagentien A bis D wie in Beispiel 3 werden mit gereinigtem Wasser im Volumenverhältnis von

10 :5 :10 :1 :3 gemischt, wobei ein Reagens für die Messung erhalten wird.

Myristoyl-CoA-Standardlösung (1 mMol)

Diese Lösung wird durch Auflösen von 108,7 mg Myristoyl-CoA in gereinigtem Wasser in einer solchen Menge, daß insgesamt 100 ml Lösung erhalten werden, hergestellt.

Methode

0,1 ml Testprobe (Myristoyl-CoA-Standardlösung) werden mit 2.9 mi des in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten Reagens für die Messung gemischt Das Gemisch wird der in Beispiel 3 beschriebenen Behandlung unterworfen. Hierbei wird eine optische Dichte des Reaktionsgemisches von 0270 gemessen. Wenn andererseits der Test ohne Reagens C (SH-Reagens) durchgeführt wird, beträgt die optische Dichte 0,131. Die optische Dichte im Falle von Beispiel 7 gemäß der Erfindung ist somit 2,06mal höher als die optische Dichte bei Durchführung des Tests ohne SH-Reagens, so daß erfindungsgemäß die Empfindlichkeit der Messung hoher ist.

Beispiel 8

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wird wiederholt, wobei jedoch 100 ml einer Lösung von 40 g Ammoniumacetal, 052 g Acetylaceton, 5,6 g Methanol und 280 000 Einheiten Katalasc in gereinigtem Wasser an Stelle des Reagens B verwendet werden. Die optische Dichte des Reaktionsgemische* wird bei 410 nm gemessen. Hierbei werden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Beispiel 9
30

Anwendung zur Messung freier Fettsäuren

Herstellung der Reagentien I) Reagens I

101,7 mg Magnesiumchloridhexahydrat, 106.6 mg CoA und 275,6 mg ATPJNa werden in 125 mMol Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,6) in einer solchen Menge gelöst, daß insgesamt 100 ml Reagens I erhalten werden.

U) Reagens II

(Lösung eines synthetischen Acyl-CoA-Enzyms)

Eine Fraktion von Acyl-CoA-Synlhetase I wird von Candida lipolytica nach der Methode von Numa et al (Etir. J. Biochem. 82 [1978], 347) erhallen. Diese Fraktion wird durch Säulcnchromatographic an DEAK-Celliilose 4^r> gereinigt. Das gereinigte Enzym (8.4 mg. als Enzymprotein) wird in 10 ml gereinigtem Wasser gelöst, wobei tl;is Reagens Il erhallen wird.

Ill) Reagens III
(Reagens für die Messung von Acyl-CoA)

5()

Das Reagens 111 wird erhalten, indem das in Beispiel I verwendete Reagens C. die in Beispiel 3 verwendeten Reagentien A, B und D und gereinigtes Wasser im Volumenverhältnis von 1 : 10 : 5 : I : 3 gemischt werden.

IV) Standardlösung von freien Fettsäuren (Lösung von 1 mMol Oleinsäure)

28,2 mg Oleinsäure werden in 0,5%iger wäßriger Lösung der oberflächenaktiven Verbindung »Triton X-100« in einer solchen Menge gelöst, daß insgesamt 100 ml der Standardlösung erhalten werden.

Methode

Zu 0,1 ml einer Testprobe (Standardlösung der freien Fettsäuren) werden 0.8 ml Reagens I und 0,1 ml Reagan

11 gegeben. Das Gemisch wird 15 bis 30 Minuten bei 37°C gehalten. Dem Gemisch werden 2,0 ml Reagens Il /.ugcscl/.l. Das Gemisch wird weitere 15 Minuten bei J7"C gehalten, worauf die optische Dichte des Rcaktious

n', gemisches bei WO nm gegen Blindrcagcns gemessen wird. Die in der Testprobe enthaltene Menge der frcici !•'sM'.säuren wird auf der Grundlage der lüchku'VL' berei'hiici, die :ui<; den Weilen angefertigt wurde, die nach de Methode unter Verwendung von Standardlösungen der freien Fettsäuren mit verschiedenen Konzenlrationei ermittelt wurden. Als Ergebnis wird eine optische Dichte des Reaktionsgemische.¹« von 0.275 iTmillell. Wem

andererseits der Test unter Verwendung der gleichen Menge gereinigten Wassers an Stelle von Reagens C im Reagens III durchgeführt wird, beträgt die optische Dichte 0,135. Die optische Dichte im Falle von Beispiel 9 gemäß der Erfindung ist somit 2,04mal höher als die optische Dichte im Falle des Tests, bei dem gereinigtes Wasser an Stelle des Reagens C verwendet wird, so daß die Empfindlichkeit der Messung höher ist.

Beispiel 10
Messung von freien Fettsäuren im Blut

Herstellung der Reagentien

1) Reagens 1

Dieses Reagens wird erhalten, indem 10,2 mg Magnesiumchloridhexahydrat, 40,1 mg CoA.Li und 121 mg ATP.2Na in einer 200 mMol Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,6) in einer solchen Menge gelöst werden, daß insgesamt 100 ml Reagens 1 erhalten werden.

II) Reagens II (Lösung von Acyl-CoA-Synthetase)

10 mg Acyl-CoA-Synthetase (50 mU/mg), hergestellt aus einem Mikroorganismus nach der Methode von Yamada et al (The Agricultural Chemical Society of japan, Kansai and Nishi-Nippon Blanch Meeting, the Subject Nos.3-11 und 12, 14.10. 1978), werden in 20%iger Glycerinlösung in einer solchen Menge gelöst, daß insgesamt 20 ml Reage.is Il erhalten werden.

III) Reagens 111

50 mg 4-Aminoantipyrin. 25 mg 2.4-Dichiorphenol und 25 mg N-Älhylmaleimid werden in gereinigtem Wasser in einer selchen Menge gelöst,daß insgesamt 100 ml Reagens III erhallen werden.

IV) Reagens IV jo

20 Einheiten Peroxidase und 40 Einheiten Acyl-CoA-Oxidase werden in 20%iger Glycerinlösung in einer solche* Menge gelöst, daß insgesamt 17 ml Reagens IV erhalten werden.

Herstellung der Eichkurve

Durch Auflösen von Palmitinsäure in 0,5%iger Lösung der oberflächenaktiven Verbindung »Triton X-100« werden Standardlösungen mit verschiedenen Konzentrationen der Palmitinsäure hergestellt. Zu 0,1 ml jeder Standardlösung werden 1,0 ml Reagens I und 0,1 ml Reagens Il gegeben. Das Gemisch wird 15 bis 30 Minuten bei 37°C gehalten. Nach Zusatz von 1,0 ml Reagens III zum Gemisch wird das Gemisch gerührt. Dem Gemisch werden ferner 0,1 ml Reagens IV und 0,55 ml gereinigtes Wasser zugesetzt, worauf das Gemisch 15 Minuten bei 37°C gehalten wird. Anschließend wird die optische Dichte jedes Reaktionsgemisches bei 505 nm gegen das Blindreagens gemessen. Auf der Grundlage dieser Werte wird eine Eichkurve, wie sie in Fig.3 dargestellt ist, gezeichnet. Hierbei ist die optische Dichte als Ordinate und die Konzentration der Palmitinsäure als Abszisse aufgetragen.

Messung der freien Fettsäure im Blut

Zu Blutsera A, B und C (je 50 μΙ), die von drei Personen gewonnen worden sind, wird je 0,1 ml einer 5%igen Lösung des oberflächenaktiven Mittels »Triton X-100« gegeben. Das Gemisch wird gut gerührt. Das Gemisch ■» wird in der gleichen Weise, wie vorstehend für die Anfertigung der Eichkurvc beschrieben, unter Verwendung von 1.0 ml Reagens 1, 0,1 ml Reagens II. 1,0 ml Reagens III, 0,1 ml Reagens IV und 0,5 ml gereinigtem Wasser behände!:. Die optische Dichte des Reaklionsgemisches wird bei 505 rim gegen ein Blindreagens (gereinigtes Wasser [0,1 ml] anstelle von Reagens II) gemessen. Hierbei wird für das Blutserum A eine optische Dichte von 0.118. für das Blutserum B eine optische Dichte von 0,184 und für das Blutserum C eine optische Dichte von 0,255 M ermittelt. Auf der Grundlage der Eichkurve wird die Menge freier Fettsäuren (als Palmitinsüure) in jedem Tcstbluiserum berechnet. Hierbei ergeben sich die folgenden Mengen freier Fettsäuren (in Α 415 für das Blutserum A, 648 für das Blutserum B und 898 für das Blutserum C

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Methode zur quantitativen Bestimmung von Acyl-Coenzym A, dadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart von Acyl-Coenzym-A-Oxidase Acyl-Coenzym A, das in einer Testprobe enthalten ist, mit

5 Sauerstoff umsetzt und die hierbei gebildete Wasserstoffperoxidmenge mißt, wobei man der Reaktion ein SH-Reagens, das aus der Gruppe Maleimid, N-Methylmaleimid, N-Ethylmaleimid, N-Phenylmaleimid, N,N'-o-Phenylendimaleimid, Ν,Ν'-p-PhenylendimaIeimid, N-(4-Dimethylamino-3,5-dinitrophenyl)-maleimid, Jodacetamid und 4,4'-Bisdimethylaminobenzhydrol oder deren Mischungen ausgewählt ist, zusetzt

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion der Acyl-Coenzym-A-Or'da-IG se 5 bis 60 Minuten bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0 und einer Temperatur von 37° C durchführt.

3. Reagens für die Messung von Acyl-Coenzym A nach der Methode gemäß Ansprüchen 1 und 2, enthaltend eine Acyl-Coenzym-A-Oxidase, ein SH-Reagens, Peroxidase oder Katalase und ein Farbreagens.

4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als SH-Reagens Maleimid, N-Methylmaleimid, N-Äthylmaleimid, N-Phenylmaleimid. N,N'-o-Phenylendimaleimid, N.N' p-Phenylcndimaleimid. N-

15 (4-Dimethylamino-3,5-dinitrophenyI)ma!eimid, Jodaceiamid und/oder 4,4'-Bisdimeihylaminobcnzhydrol cnthält.

5. Verwendung der Methode nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Fettssure, wobei die in der Testprobe enthaltene Fettsäure durch Acyl-Coenzym-A-Synthetase in Gegenwart von Adcnosintriphosphat und Cocnzym A zu Acyl-Coenzym A umgesetzt und dessen Konzentration in der Testprobe quantitativ besiimml

20 wird.