JPS60217900A - メルカプト基含有化合物の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はメルカプト基（”−３Ｈ）を含む化合物の定量
方法及び定量用組成物に関する。

従来メルカプト基（−ＬＳＩ）を有する化合物（以下Ｓ
Ｈ化合物という）の定量は■ｐ−クロロマーキュリ安息
香酸（以下ＰＣＭＢ）等の有機水銀化合物を用いて滴定
する方法　■ニトロプルシドナトリウムを用いて比色定
置する方法■５．５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸）（以下ＤＴＮＢ）をはじめとするエールマン試薬類
を用いて比色定量する方法が知られている。

これらの方法において、■の方法は有機水銀を用い、さ
らに紫外部での吸光度測定であるため、測定対象が生体
試料である場合、夾雑成分の影響を受けやすい。

■の方法は、発色液が温度等に不安定であり、測定波長
が低い。

■の方法は、測定波長が低く、生体試料を測定するには
適さない。

より精度良く、簡便にＳＨ化合物を定量する方法の開発
が望まれており、この目的のため検討の結果、後述の一
般式（Ｉ）に示す化合物とＳＨ化合物とを反応させて生
成する色素は極大吸収波長が６００ｎｍ前後にあり、試
料中特に生体成分中の成分の影響を受けにくいこと、可
視部における測定が可能であること、感度が優れており
、試料が少量で定量できること、水溶性であるため取扱
い易いこと等の優れた性質を有することが見出された。

本発明によればＳＨ化合物はペルオキシダーゼもしくは
チオールオキシドリダクターゼの存在下下記一般式（１
）で表される化合物〔以下、化合物（Ｉ）という〕と反
応させて生成する色素を定量することにより定量される
。

一般式（Ｉ） ７′ Ｒ２−Ｃ−Ｒ３（１，） ■ 式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、Ｒ＋　、Ｒ
−、Ｒ３は同一もしくは異なってよく、下記一般式（Ｉ
Ｉ）、（Ｉｌｌ）又は（１’Ｖ）で表される基を示す。

Ｚは水素、ヒドロキシル、アミノ、置換アミノ。

アルキル、置換アルキル、アルケニル、アリール。

置換アリール、アシル、ハロゲン原子、ニトロ。

スルホ、カルボキシル、アルコキシを示す。ｎは１．２
又は３を示し、Ｒ，、Ｒ２，Ｒ３の少なくとも１つのＺ
はヒドロキシル、アミノ又は置換アミノである。又、Ｚ
ｎにおける各Ｚは同一もしくは異なってもよい。

上記各定義においてアルキルは炭素数１〜５のアルキル
を包含し、メチル、エチル、プロピル。

ブチル、ペンチル等を示し、アルケニルは炭素数２〜５
の基を包含し、ビニル、プロピレン、ブチレン等が例示
される。アルコキシは炭素数１〜４の基を包含し、メト
キシ、エトキシ、プロポキシ。

ブトキシ等が例示される。

アリールとしては、フェニル、ナフチルが例示される。

アシルは炭素数２〜５のアシルを包含し、アセチル、プ
ロピオニル、ブチリル等が例示される。

ハロゲンは塩素原子、臭素原子、フッ素原子を包含する
。

置換アミノ、置換アルキル、置換アリールにおける置換
基としては、アルキル、アルケニル、アリール、アルコ
キシ、ヒドロキシル、カルボキシル、スルホ、スルホニ
ル、ハロゲン原子、アミノ。

アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカルボニル、
アミノアルキル、アシル、ニトロ等が例示される。

該置換基中のアルキル、アルケニル、アリール。

アルコキシ、ハロゲン、アシル等は前記と同義を有する
。

本発明方法で定量できるＳＨ化合物としては一３Ｈ基を
構造式に含む化合物であればいずれも含まれ、例えばＬ
−システィン、グルタチン、補酵素Ａ（ＣｏΔ）、メタ
ネチオール、ジヒドロリポアミド、チオコリン等である
。

本発明を実施するに際しては一般に緩衝液例えばグツド
バッファー、リン酸バッファー、ホウ酸バッファー、酢
酸バッファー、トリスバッファー等にパーオキシダーゼ
又はチオールオキシドリダクターゼ及び化合物（−１）
を加えて試薬液とする。

試料に試薬液を加え３０〜５０℃の酵素が失活しない温
度で反応させ、生成した色素によって着色した反応液の
吸収を色素の極大吸収波長で試薬ブランクを対照として
測定し、あらかじめ既知量についてのテストからめた検
量線から試料中のＳＨ化合物を定量することができる。

本発明方法は後述の如く反応によってＳＨ化合物を生成
する反応系に係る反応物質あるいは酵素活性を定量する
方法に適用できる。定量されるべき因子が化合物である
場合には一般に上記吸収測定に際して反応を約５〜１０
分行わせた後反応液の吸収を比色によって測定すること
によって目的因子を定量できる。因子が酵素活性である
場合には一般に反応開始後の適当な時間における色素生
成速度を反応液の吸光度の変化からめることによって該
活性が定量できる。

緩衝液は１０ｍＭ〜ＩＭの濃度で用いられる。

ペルオキシダーゼ、チオールオキシドリダクターゼは１
〜５０００／ｍｌで用いられる。化合物（Ｉ）は反応す
るＳＨ化合物と等モル以上、通常０．００１〜ｌｆｆ１
ｇ／ｌ１１１で用いられる。

反応に際してＳＨ化合物は通常試料中の濃度が０、００
１〜１ｍｇ／ｍｌとなる様に試薬液もしくは蒸留水で調
整される。

ＳＨ化合物を生成する反応系で本発明が適用される場合
には、反応に関与する基質のような反応物質、酵素１等
は、測定すべき対象であるか否かによって用いられる量
が異なる場合が多いが、一般にそれぞれ０．０００１−
１００　ｍｇ／ｍｌ、　１０−１０００口／ｍ＋で用い
られる。

又、必要に応じてＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００等の界面活
性剤が用いられる。

本発明で用いられる化合物（Ｉ）の具体例とその極大吸
収波長（Ａｍａｘ　）　、感度が第１〜４表に示される
。

表中の略号は下記基を示す。又第１〜３表において○内
は位置を示し、基の表示のない位置はいずれも水素を示
す。

第４表におけるＡｍａｘ　、感度の測定は試料２０μｌ
に対して試薬液３ｍｌの割合で混合し、反応後者々のＡ
ｍａｘにおけるＯＤ値を測定する。感度−の数値はエー
ルマン試薬としてＳＨ基の定量に広く用いられている５
、５′−ジチオビス（２ニニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）
を色分体として用いた場合のＯＤ値を１００としたとき
の相対値である。

試料：Ｌ−システィン水溶液 Ｌ−システィン塩酸塩を２０ｍｇ／ｄｉとなるように蒸
留水に溶解する。用時調整。

試薬液：５０ｍＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，０にペルオキ
シダーゼ１００／ｍｌ、）リドンＸ−１００を０．１％
の濃度となるように加え、各発色剤を０．２ｍｇ／ｍｌ
となるよう溶解する。

ＭニーＣＨ３ＥニーＣ２Ｌ　Ｐｈ：※■Ａ、　：’−１
ｉ　（−［：ＩｆべＱ　）２　Ａ＋ニーＮｉ１（−Ｃｌ
ｌ、Ｘ■８０”、Ａｓ　：　＝Ｎ（ＣＪ５）Ｃ）Ｉ２べ
■　Ａ６：　−Ｎ（ＣＨｓ）ＣＬＩ八、：　−Ｎ　（＋
１：Ｌ　Ｊ　）２　八８　：　−ＮＩＩＣ山八−：へＮ
’ｕ＜シ〉→口ＣＪｓ　八、。　：　−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）
ＣＨ２Ｃｌ、ＳＯＪ＾、ｓ　：　−ｕｎ＋ｃｕ。

第　１　表 第　２　表 第　３　表 第　４　表 本発明で用いられる化合物（Ｉ’　）は染料合成の中間
体として公知の化合物であるが第１〜３表に記載の化合
物は例えば以下の方法によって合成できる。

■　下記表に記載の化合物Ｎｏの化合物については４、
４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロールと目的
化合物における下記に示される置換ベンゼンもしくは置
換ナフタレンとを等モルづつ約原料の２〜１０倍量の６
０％硫酸中で反応させる。反応は５０〜１００℃で攪拌
して行われ２〜３時間で完了する。さらに反応液の５〜
６倍の５℃前後の冷水を加えて一夜攪拌を続ける。

反応物を濾過し、８％硫酸で洗浄後真空乾燥して目的物
を得る。アルカリ例えば水酸化ナトリウムを反応液に加
えることによって沈澱が生成し易くなるので必要に応じ
て加える。

上記以外の位置はいずれも水素を示す。

■　下記表に掲げる各化合物Ｎｏに対応する公知の色素
を原料とし、原料色素を色素重量の８０倍量の蒸留水で
溶解する。この色素溶液を攪拌しながら、原料色素の２
倍ｍｏｌ量の水素化ホウ素す）　ＩＪウムを徐々に添加
し、還元反応を行う。

室温で約２時間攪拌後、この反応液をロータリーエバポ
レーターで濃縮乾固する。次にこの乾固物を溶解しつる
最低必要量の蒸留水にて溶解する。この溶解液の１５〜
２０倍容量のレジンＨＰ−２０をガラスカラムに充填し
、コンディショニング後、前述の溶解液を充填し、使用
レジンの３〜４倍容量の蒸留水を流し、残存する水素化
ホウ素ナトリウムを除去する。この時目的物はＨＰ’−
２０に吸着されている。次にメタノール／蒸留水−１／
１の展開溶媒を流し、溶出液を適量づつ分取する。溶出
液中の目的物をＵ■モニターあるいはＴＬＣにて確認後
、必要なフラクションを集め、ロータリーエバポレータ
ーで濃縮乾固し、目的物を得る。

■　化合物Ｎｏ、９．１０．６７、６８の製法４．４′
−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロールとクロルベ
ンゼン（化合物Ｎｏ、９．１０　）あるいはｌ−ナフト
ール−３，５−ジスルホン酸（化合物Ｎｏ、６７．６８
　）とを６０％硫酸を用いて前述■の方法にて縮合させ
る。得られた化合物を適量の酢酸に溶解し、酸化鉛を触
媒として、ジメチルアミノ基の２つのメチル基の一方を
脱離させ、目的物を得る。

■　化合物Ｎｏ、１１．’　１２の製法２−メチル−５
−ニトロベンズアルデハイドとα−（Ｎ−メチルアニリ
ノ）　−ｍ−トルエンスルホン酸とをモル比１：２で原
料化合物総重量の１０倍量の硫酸に加え、１００℃前後
で１２０時間攪拌する。沈澱を熱いままグラスフィルタ
ーにて濾過し、５％硫酸で濾洗後真空乾燥を行い目的物
を得る。

■　化合物Ｎｏ、１９．２０の製法 ２−ヒドロキシベンズアルデハイドとＮ、Ｎ−ジメチル
アニリンおよびＮ−フェニル−ジベンジルアミンとをモ
ル比１１：１で原料化合物総重量の１０倍量の８０％硫
酸に加え、１９０℃前後で１２０時間攪拌する。沈殿を
熱いままグラスフィルターにて濾過し、５％硫酸で濾洗
後真空乾燥を行い、目的物を得る。

■　化合物Ｎｏ、２１．２２の製法 ２．５−ジクロロベンズアルデハイドとα−（Ｎ−メチ
ルアニリノ）−ｍ−）ルエンスルホン酸とをモル比１：
２で原料化合物総重量の１０倍量の硫酸に加え、１００
℃前後で１２０時間攪拌する。沈殿を熱いままグラスフ
ィルターにて濾過し、５％硫酸で濾洗後真空乾燥を行い
、目的物を得る。

■　化合物Ｎα２３．２４．２５．２６の製法２−ヒド
ロキシベンズアルデハイドとＮ−フェニルジベンジルア
ミン（Ｎｏ、２３．２４）　、あるいはＮ−ブチル−０
−）ルイジン（Ｎｏ、２５．２６）とをモル比１：２で
原料化合物総重量の１０倍量の硫酸に加え、１００℃前
後で１２０時間攪拌する。

沈殿を熱いままグラスフィルターにて濾過し、５％硫酸
で濾洗後真空乾燥を行い目的物を得る。

上記以外の化合物についても、上記の方法において原料
を目的化合物に応じて選ぶことによっであるいは公知文
献例えばＣｏ１ｏｒ　Ｉｎｄｅｘ　４巻に記載の方法に
よって製造できる。

本発明方法は、反応によってＳＨ化合物を化学量論的に
生成する反応系における反応物質あるいは酵素活性の測
定に適用できる。かかる物質としてＬ−アスパラギン酸
、クロラムフェニコール。

ゲンタマイシンＣｌ　Ｍ　＋ゲンタマイシンＣ１、コリ
ン、コレステロール、Ｌ−メチオニン、ＮＡＤＨ等があ
げられる。また酵素活性が測定できる酵素としでは、コ
リンエステラーゼ、アミノ酸アセチルトランスフェラー
ゼ等があげられる。これらの反応系が図式的に次に示さ
れ、反応系における基質、酵素活性が測定できる。

Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸十ＣｏＡ２ｏ　クロ
ラムフェニコール クロラムフェニコール３−アセテート十Ｃ０１３、ゲン
タマイシンＣ＋　ａ ゼ Ｎ２−アセチルゲンタマイシンＣ＋　＋［：ｏＡ４、　
ゲンタマイシンＣ１ ゼ Ｎ３−アセチルゲンタマイシンＣ十ＣｏＡコリン＋７−
１！ナルしＯＡ　ｆ！ナルコリン十シＯＡ６、　コレス
テロール コレステロール＋ＣｏＡ ＋メタネチオール十Ｎ８３ ８、ＮＡＤＨ Ｎムロ１＋ロシ−ジヒドロリポアミト′ｌＯ，アミノ酸
アセチルトランスフェラーゼＮ−アセチル−Ｌ−グルタ
ミン酸＋Ｃ〇八本発明で用いられるＳＨ化合物定量用組
成物は（イ）ペルオキシダーゼ又はチオールオキシドリ
ダクターゼ　（ロ）化合物（Ｉ）からなり、これらが前
述の量比に調製されたものは使用に便利である。

さらに必要に応じて緩衝剤をこの組成物に組合せること
ができる。

測定されるべき因子によって必要な基質あるし゛は酵素
を加えた組成物あるいは別に用意して組合せたキットは
種々の物質もしくは酵素活性の定量に極めて便利で有用
である。

以下に本発明の態様を実施例によって示す。

実施例１．　コリンエステラーゼ活性の測定５０ｍＭ）
リス緩衝液（ｐＨ７，５）　１．００ｍｌにペルオキシ
ダーゼ１０００単位、ブチリルチオコリン３００ｍｇ、
）リドンＸ−１００を１００ｍｇ、および発症化合物と
して■化合物Ｎｏ、４１を２０ｍｇ、■化合物Ｎｏ、５
３を２０ｍｇ、■化合物Ｎ０５９を２０ｍｇ、■イ［合
物Ｎｏ、６３を２０ｍｇをそれぞれ溶解し試薬液とする
。

試薬液を予め３７℃で１０分間加温した後、匍清１０μ
βを添加し、正確に２分後と５分後の吸光後を発色剤の
λｍ−において試薬盲検を対照として測定する。５分後
と２分後の吸光度差を計算し、予め作成した検量線より
、血清中のコリンエテラーゼ活性を算出する。

試薬液として上記緩衝液にベルオキシダーセ。

ブチリルチオコリン、３９０ｍｇのＤＴＮ日を溶解した
液を用いる他は上記と同様に実施する。結果をオルソト
ルオイルコリンを基質とし、コリンオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼを使用した系（Ａ）で測定した数値と対比
して第５表に併記する。なお第５表の数値はＡｐＨ法に
換算した数値である。

第　５　表 特許出願人　協和メデックス株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記一般式（１）で表される化合物とメルカプト
   基含有化合物とをペルオキシダーゼ又はチオールオキシ
   ドリダクターゼの存在下に反応させて生成する色素を定
   量することを特徴とするメルカプト基含有化合物の定量
   方法 一般式（Ｉ） ｐ。 式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、Ｒ，、Ｒ，
   、Ｒ，は同一もしくは異なってよく下記一般式（ｎ）、
   （１）又は（ＩＶ）で表されＺは水素、ヒドロキシル、
   アミノ、置換アミノ。 アルキル、置換アルキル、アルケニル、アリール、［換
   アリール、アシル、ハロゲン、ニトロ。 スルホ、カルボキシル、アルコキシを示す。ｎは１．２
   又は３を示し、Ｒ＋　、Ｒ２，Ｒ３の少なくとも１つの
   ２はヒドロキシル、アミノ又は置換アミノである。又、
   Ｚｎにおける各Ｚは同一も、シ＜は異なっていてもよい
   。 （２） （イ）ペルオキシダーゼ又はチオールオキシドリダクタ
   ーゼ （０）　一般式（１）で表される化合物からなるメルカ
   プト基含有化合物定量用組成物。