JPH0686694A - Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性検出用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式［１］ 【化１】 で示される化合物、一般式［２］ 【化２】 で示されるジアゾニウム塩及びｐＨ4.0〜6.0を保持し得
る緩衝剤を含んで成る試薬組成物を、吸収性担体又はフ
ィルム上に保持させて成るＮ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼ検出用試験片。 【効果】尿中Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダー
ゼ活性をワンステップで簡便に測定し得る方法を提供す
るものであり、本発明に係るＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニダーゼ活性測定用試験片は、それ自体の外観
の色調が淡色で且つ尿中の共存物質に起因する発色も生
じないので、測定可能な範囲が極めて広く、且つ感度及
び精度も極めて高い点に顕著な効果を奏する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＮ-アセチル-β-Ｄ-グル
コサミニダーゼ活性測定用試験片に関する。

【０００２】

【発明の背景】Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコサミニダーゼ
（以下ＮＡＧと略記する。）は、腎尿細管上皮に多く含
まれるライソゾ−ム中の糖質分解酵素の１つである。尿
中のＮＡＧ活性は腎障害により上昇することが知られて
おり、その測定は各種腎疾患の診断及び経過観察に、腎
移植後の拒絶反応の早期診断に、また、薬物の腎毒性を
調べる上で有用な情報を与えるものとして臨床的意義が
高い。尿中成分の測定法として一般に行われている方法
は、溶液中で酵素反応等を行わせることにより目的成分
を測定する方法（以下、溶液法と略記する。）と、必要
な試薬類を、瀘紙等の吸収性担体やフィルムに保持させ
た試験片を用いて目的成分を測定する方法（以下、ドラ
イケミストリー法と略記する。）とに大別される。

【０００３】ＮＡＧ活性の溶液法による測定方法として
は、これまで基質としてｐ-ニトロフェニル -Ｎ-アセチ
ル-β-Ｄ-グルコサミニド（バイオケミカル プレパレ
イションズ Vol.10，118（1963））或は 4-メチルウン
ベリフェリル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコサミニド（ク
リニカ キミカ アクタ，Vol.69，85（1976））を用い
る方法が一般に広く行われてきたが、何れの方法も、尿
中の共存物質に起因する発色が生じるため尿中ＮＡＧ活
性を測定する際には尿のブランク値を測定する必要があ
り、且つ測定原理が反応停止液を用いるワンポイント法
であるため、測定操作が煩雑でしかも時間がかかるとい
う欠点を有していた。そのため、ソジオ-ｍ-クレゾール
スルホンフタレイニル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコサミ
ニド等を基質として用いる測定方法（特公昭63-7196号
公報）、2-クロロ-4-ニトロフェニル-Ｎ-アセチル-β-
Ｄ-グルコサミニド等を基質として用いる測定方法（特
開昭61-112092号公報）、ソジオ-3,3'-ジクロロフェノ
ールスルホンフタレイニル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコ
サミニドを基質として用いる測定方法（特開昭63-30919
9号公報）等、尿のブランク値の測定が不要な方法が開
発され、汎用されるようになってきている。しかしなが
ら、これらの方法に於ても測定操作が煩雑なため測定に
時間がかかるという問題点については未だ充分に解決が
なされたとは言い難い。

【０００４】一方、ドライケミストリー法はワンステッ
プで測定が可能な為、上記した如き溶液法によるＮＡＧ
測定法をドライケミストリー法へ応用できれば簡便で迅
速な測定方法となる可能性がある。しかし、上記の如き
溶液法に使用されているＮＡＧ活性測定用試薬を用いて
試験片を調製すると、基質自体が着色しているため得ら
れた試験片の外観が濃く呈色したり、或は測定時に尿中
の共存物質に起因して尿のブランク値が高くなる等の現
象が生じ、結果的にＮＡＧ活性の測定可能な範囲が狭く
なるので、何れもドライケミストリー法には応用し難
い。

【０００５】また、組織化学の分野に於ては、基質とし
て5-ブロモ-3-インドリル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコサ
ミニドを用い、組織中に存在するＮＡＧ活性により遊離
した5-ブロモインドキシルを、ヘキサゾ化ｐ-ローズア
ニリン（hexazotized p-rosaniline）、ファーストブル
ーＢ、ファーストガーネットＧＢＣ等のジアゾニウム塩
と反応させて着色させることにより組織中のＮＡＧの分
布を検出する方法が実施されている（ヒストケミストリ
ー Vol.55，159（1978））。しかしながら、この方法
に於て用いられているジアゾニウム塩は尿中の共存物質
と反応して色素を生成するため、この方法を尿中ＮＡＧ
活性測定に応用した場合にも、尿のブランク値が高くな
ってＮＡＧ活性の測定可能な範囲が狭くなるという問題
があった。

【０００６】

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑み成さ
れたもので、ワンステップで簡便に尿中のＮＡＧ活性測
定が可能な、それ自体の着色が少なく、且つ尿中の共存
物質に起因する発色が生じないＮＡＧ活性測定用試験片
を提供することを目的とする。

【０００７】

【発明の構成】本発明は、一般式［１］

【化３】 （式中Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は夫々独立して水素原子、
ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アルキルア
ミノ基、ジアルキルアミノ基、アシルアミノ基、ニトロ
基、アルカリ金属塩となっていてもよいカルボキシル
基、又はアルカリ金属塩となっていてもよいスルホン酸
基を表す。）で示される化合物、一般式［２］

【化４】 （式中Ｒ'₁、Ｒ'₃及びＲ'₅は夫々独立して水素原子、ア
ルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アルキルアミ
ノ基、ジアルキルアミノ基、フェニルアミノ基、アシル
アミノ基、モルホリノ基、ピロリジノ基、ピペラジノ基
又はピペリジノ基を表し、Ｒ'₂及びＲ'₄は夫々独立して
水素原子、ハロゲン原子、アルキル基又はアルコキシ基
を表し、Ｘは安定化アニオンを表す。但し、Ｒ'₁、
Ｒ'₃、及びＲ'₅のうち少なくとも一つはアルコキシ基、
ヒドロキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ
基、フェニルアミノ基、アシルアミノ基、モルホリノ
基、ピロリジノ基、ピペラジノ基又はピペリジノ基であ
る。また、Ｒ'₁とＲ'₂又は／及びＲ'₄とＲ'₅は夫々互い
に結合して芳香環を形成していてもよい。）で示される
ジアゾニウム塩及びｐＨ4.0〜6.0を保持し得る緩衝剤を
含んで成る試薬組成物を、吸収性担体又はフィルム上に
保持させて成るＮＡＧ活性測定用試験片の発明である。

【０００８】即ち、本発明者らは、上記目的を達成すべ
く鋭意研究を行った結果，ＮＡＧの基質として一般式
［１］で示される化合物を用い、また、該基質からＮＡ
Ｇの作用により遊離されるインドール誘導体とカップリ
ングさせるジアゾニウム塩として一般式［２］で示され
る化合物を用いた場合には、ＮＡＧ活性測定をＮＡＧの
至適ｐＨであるｐＨ4.0〜6.0で実施することができ、し
かもこれらを用いてＮＡＧ活性測定用試験片を調製した
場合には、それ自体の着色が少なく、且つ尿中の共存物
質に起因する発色が殆どない試験片が得られることを見
出し、本発明を完成するに至った。

【０００９】本発明に係る一般式［１］で示される化合
物に於て、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄としては夫々独立して
水素原子、例えばフッ素原子，塩素原子，臭素原子，ヨ
ウ素原子等のハロゲン原子、例えばメチル基，エチル
基，プロピル基，ブチル基，アミル基等のアルキル基
（直鎖状、分枝状何れにても可）、例えばメトキシ基，
エトキシ基，プロポキシ基，ブトキシ基，アミルオキシ
基等のアルコキシ基（直鎖状、分枝状何れにても可）、
例えばメチルアミノ基，エチルアミノ基，プロピルアミ
ノ基，ブチルアミノ基，ペンチルアミノ基等のアルキル
アミノ基（直鎖状、分枝状何れにても可）、例えばジメ
チルアミノ基，ジエチルアミノ基，ジプロピルアミノ
基，ジブチルアミノ基，ジペンチルアミノ基等のジアル
キルアミノ基（直鎖状、分枝状何れにても可）、例えば
ホルムアミド基，アセトアミド基，プロピオニルアミノ
基，ブチリルアミノ基，ペンタノイルアミノ基等のアシ
ルアミノ基、ニトロ基、例えばナトリウム塩，カリウム
塩等のアルカリ金属塩となっていてもよいカルボキシル
基、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属
塩となっていてもよいスルホン酸基が挙げられる。

【００１０】本発明に係る一般式［２］で示されるジア
ゾニウム塩に於て、Ｒ'₁、Ｒ'₃及びＲ'₅としては、夫々
独立して水素原子、例えばメチル基，エチル基，プロピ
ル基，ブチル基，アミル基等のアルキル基（直鎖状、分
枝状何れにても可）、例えばメトキシ基，エトキシ基，
プロポキシ基，ブトキシ基，アミルオキシ基等のアルコ
キシ基（直鎖状、分枝状何れにても可）、ヒドロキシ
基、例えばメチルアミノ基，エチルアミノ基，プロピル
アミノ基，ブチルアミノ基，ペンチルアミノ基等のアル
キルアミノ基（直鎖状、分枝状何れにても可）、例えば
ジメチルアミノ基，ジエチルアミノ基，ジプロピルアミ
ノ基，ジブチルアミノ基，ジペンチルアミノ基等のジア
ルキルアミノ基（直鎖状、分枝状何れにても可）、フェ
ニルアミノ基、例えばホルムアミド基，アセトアミド
基，プロピオニルアミノ基，ブチリルアミノ基，ペンタ
ノイルアミノ基，ベンズアミド基等のアシルアミノ基、
モルホリノ基、ピロリジノ基、ピペラジノ基、ピペリジ
ノ基等が挙げられるが、Ｒ'1、Ｒ'3及びＲ'5の少なくと
も一つはアルコキシ基、ヒドロキシ基、アルキルアミノ
基、ジアルキルアミノ基、フェニルアミノ基、アシルア
ミノ基、モルホリノ基、ピロリジノ基、ピペラジノ基又
はピペリジノ基である。

【００１１】また、Ｒ'₂及びＲ'₄としては夫々独立して
水素原子、例えばフッ素原子，塩素原子，臭素原子，ヨ
ウ素原子等のハロゲン原子、例えばメチル基，エチル
基，プロピル基，ブチル基，ペンチル基等のアルキル基
（直鎖状、分枝状何れにても可）、例えばメトキシ基，
エトキシ基，プロポキシ基，ブトキシ基，ペンチルオキ
シ基等のアルコキシ基（直鎖状、分枝状何れにても可）
等が挙げられ、Ｘとしてはテトラフルオロボレートイオ
ン、テトラクロルジンケートイオン、パークロレートイ
オン等の安定化アニオンが挙げられる。またＲ'₁とＲ'₂
又は／及びＲ'₄とＲ'₅は夫々互いに結合して例えばベン
ゼン環、ナフタレン環等の芳香環を形成していてもよ
い。

【００１２】本発明に係る一般式［１］で示される化合
物からＮＡＧの作用により生じる化合物は、一般式
［３］

【化５】 （式中、Ｒ₁〜Ｒ₄は前記に同じ。）で示されるインドー
ル誘導体であるが、その具体例としては、例えば3-ヒド
ロキシインドール、4-クロロ-3-ヒドロキシインドー
ル、5-クロロ-3-ヒドロキシインドール、6-クロロ-3-ヒ
ドロキシインドール、7-クロロ-3-ヒドロキシインドー
ル、4-ブロモ-3-ヒドロキシインドール、5-ブロモ-3-ヒ
ドロキシインドール、6-ブロモ-3-ヒドロキシインドー
ル、7-ブロモ-3-ヒドロキシインドール、3-ヒドロキシ-
4-ヨードインドール、3-ヒドロキシ-5-ヨードインドー
ル、3-ヒドロキシ-6-ヨードインドール、3-ヒドロキシ-
7-ヨードインドール、5,7-ジクロロ-3-ヒドロキシイン
ドール、5,7-ジブロモ-3-ヒドロキシインドール、5,7-
ジヨード-3-ヒドロキシインドール、5-ブロモ-4-クロロ
-3-ヒドロキシインドール、3-ヒドロキシ-4-メチルイン
ドール、3-ヒドロキシ-5-メチルインドール、3-ヒドロ
キシ-6-メチルインドール、3-ヒドロキシ-7-メチルイン
ドール、3-ヒドロキシ-4-メトキシインドール、3-ヒド
ロキシ-5-メトキシインドール、3-ヒドロキシ-6-メトキ
シインドール、3-ヒドロキシ-7-メトキシインドール、3
-ヒドロキシ-5-ジメチルアミノインドール、3-ヒドロキ
シ-5-アセチルアミノインドール、3-ヒドロキシ-4-ニト
ロインドール、3-ヒドロキシ-5-ニトロインドール、3-
ヒドロキシ-6-ニトロインドール、3-ヒドロキシ-7-ニト
ロインドール、3-ヒドロキシインドール-5-カルボン酸
ナトリウム、3-ヒドロキシインドール -5-スルホン酸ナ
トリウム等が挙げられる。

【００１３】また、一般式［２］で示されるジアゾニウ
ム塩の具体例としては、例えば4-メトキシベンゼンジア
ゾニウム−テトラフルオロボレ−ト、2,4-ジメトキシベ
ンゼンジアゾニウム-テトラフルオロボレ−ト、4-メト
キシナフタリン-1-ジアゾニウム-テトラフルオロボレ−
ト、4-ヒドロキシベンゼンジアゾニウム-テトラフルオ
ロボレ−ト、4-ジメチルアミノベンゼンジアゾニウム-
テトラフルオロボレ−ト、 2,5-ジメトキシ-4-ジメチル
アミノベンゼンジアゾニウム−テトラフルオロボレ−
ト、4-ベンズアミド-2-メトキシ-5-メチルベンゼンジア
ゾニウム-テトラクロロジンケ−ト、2-メトキシ-4-モル
ホリノベンゼンジアゾニウム-テトラクロロジンケ−
ト、2-メトキシ-4-ピロリジノベンゼンジアゾニウム-テ
トラフルオロボレ−ト、2-メトキシ-4-ピペラジノベン
ゼンジアゾニウム-テトラフルオロボレ−ト、2-メトキ
シ-4-ピペリジノベンゼンジアゾニウム-テトラフルオロ
ボレ−ト等が挙げられる。

【００１４】本発明に係る一般式［１］で示される化合
物は、例えば、下記構造式［Ａ］

【化６】 （式中、Ａｃはアセチル基を表わす。）で示される1-ク
ロロ-1-デオキシ-2,3,4,6-テトラ-Ｏ-アセチル-α-Ｄ-
グルコサミン（以下、化合物［Ａ］と略記する。）と一
般式［４］

【化７】 （式中、Ｒ₁〜Ｒ₄及びＡｃは前記に同じ。）で示される
インドール誘導体とを常法により縮合した後、常法によ
り脱アセチル化することにより容易に得られる。即ち、
例えばテトラヘドロン，Vol.12，236（1961）、メソッ
ド イン カルボハイドレイト ケミストリ−IIに記載
された方法等に準じて、化合物［Ａ］と、該化合物１モ
ルに対して１〜１.２モルの一般式［４］で示される化
合物とをアセトン等の溶媒中、アルカリ（NaOH、KOH
等）存在下、0℃〜室温で8〜50時間撹拌下に反応させ
る。反応終了後は、例えば酢酸等の酸を用いて中和し、
常法に従って抽出、洗浄、乾燥、濃縮等の後処理を行
い、必要に応じて生成物をカラムクロマトグラフィー、
再結晶等により生成すれば、一般式［１］で示される化
合物のインドール骨格のＮ位がアセチル基で置換された
化合物が得られる。次いで該化合物をメタノール等の溶
媒に溶解し、これにナトリウムメチラート等の金属アル
コラートを適当量添加し、0℃〜室温で8〜30時間反応さ
せて脱アセチル化した後、反応液を酢酸等の酸で中和
し、溶媒を留去して得られた残渣を常法に従って処理す
ることにより一般式［１］で示される化合物を得ること
ができる。

【００１５】化合物［Ａ］は公知化合物であり、例えば
オルガニック シンセシスV に記載されている公知の方
法、即ちＮ-アセチルグルコサミンと塩化アセチルとを
反応させる方法により容易に得ることができる。

【００１６】また、一般式［４］で示されるインドール
誘導体のうち、Ｒ1〜Ｒ4がすべて水素である化合物は、
Ｎ-カルボキシメチルアントラニル酸を、例えば無水酢
酸ー酢酸ナトリウムと反応させて3-アセトキシ-1-アセ
チル-インドールとした後、亜硫酸ナトリウムで脱アセ
チルすることにより容易に得ることができるし、その他
の一般式［４］で示される化合物もこの方法に準じて容
易に合成することができる。

【００１７】本発明に係る一般式［１］で示される化合
物の試験片中の保持量としては、目的とするＮＡＧ活性
を測定し得る量であれば特に限定することなく挙げられ
るが、例えば、本発明に係る試薬組成物を吸収性担体に
保持させるために用いられる含浸液中の濃度としては、
通常0.1〜100ｍＭ、好ましくは1〜30ｍＭが挙げられ
る。

【００１８】また、本発明に係る一般式［２］で示され
るジアゾニウム塩の試験片中の保持量も、目的とするＮ
ＡＧ活性を測定し得る量であれば特に限定されることな
く挙げられるが、例えば本発明に係る試薬組成物を吸収
性担体に保持させるために用いられる含浸液中の濃度と
しては、通常0.1〜100ｍＭ、好ましくは1〜30ｍＭ が挙
げられる。

【００１９】これら一般式［２］で示されるジアゾニウ
ム塩は、ジアゾ基のオルト位又はパラ位に例えばアルコ
キシ基、ヒドロキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキル
アミノ基、フェニルアミノ基、アシルアミノ基、モルホ
リノ基、ピロリジノ基、ピペラジノ基、ピペリジノ基等
の電子供与性基が導入されているため、ジアゾ基自体の
親電子性が低いので、ｐＨ4.0〜6.0に於ては尿中成分と
は殆ど反応しないが、一般式［１］で示される化合物か
らＮＡＧの作用により遊離するインドール誘導体とは迅
速且つ選択的に反応するという性質を有している。従っ
て、ジアゾニウム塩としてこれら一般式［２］で示され
るものを使用することにより、尿中ＮＡＧ活性測定時に
於ける尿中の共存物質に起因するブランク値の上昇を回
避することができる。

【００２０】本発明で用いられる緩衝剤としてはＮＡＧ
の至適ｐＨである4.0〜6.0を保つことができるものであ
れば如何なるものでもよいが、例えばクエン酸、コハク
酸、フタル酸、酢酸等の有機酸の塩やリン酸塩等が好ま
しく挙げられる。また、これら緩衝剤の試験片中の保持
量としては、ＮＡＧ活性測定時のｐＨを4.0〜6.0に保持
し得る量であれば特に限定されることなく挙げられる
が、例えば本発明に係る試薬組成物を吸収性担体に保持
させるために用いられる含浸液中の濃度としては、通常
0.1〜1Ｍが挙げられる。

【００２１】本発明の試験片は、一般式［１］で示され
る化合物、一般式［２］で示されるジアゾニウム塩、及
びｐＨを4.0〜6.0に保持し得る緩衝剤と、更に要すれば
通常ドライケミストリーの分野で用いられる例えば界面
活性剤や、例えばシクロデキストリン等の安定化剤等の
試薬類を含んで成る試薬組成物を常法により吸収性担体
に含浸、乾燥させることにより保持させるか、或は該試
薬組成物を常法に従いフィルム上に塗布又はコーティン
グして保持させることにより容易に調製し得る。

【００２２】本発明の試験片の調製方法を、吸収性担体
を用いる場合を例にとり、より具体的に示すと以下の如
くになる。即ち、一般式［１］で示される化合物、一般
式［２］で示されるジアゾニウム塩、ｐＨ4.0〜6.0に保
持し得る緩衝剤、更に要すれば界面活性剤等の必要な試
薬類を、水或は例えばメタノール，エタノール等のアル
コール、アセトン，ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等
の極性溶媒、若しくはこれら極性溶媒と水との混合溶媒
中に適宜組み合わせて溶解して、１種又は２種以上の含
浸液を調製し、適当な吸収性担体を該含浸液中に１乃至
数回浸漬、乾燥した後、必要に応じて適宜所定の大きさ
に切断すれば、本発明の試験片を得ることができる。こ
のようにして得られた試験片はそのまま使用しても良い
し、例えばポリ塩化ビニル，ポリスチレン等のフィルム
片等の支持体の一端に接着して使用しても良い。

【００２３】本発明の試験片を調製するために使用され
る吸収性担体やフィルムとしては、ドライケミストリー
の分野で通常用いられているものであれば特に限定され
ることなく挙げられるが、吸収性担体としては例えば瀘
紙、不織布、ガラス繊維等が好ましく挙げられ、フィル
ムとしては厚さ３００μｍ前後のポリスチレンシート等
が好ましく挙げられる。

【００２４】また、本発明の試験片中に保持されていて
も良い例えば界面活性剤、例えばシクロデキストリン等
の安定化剤等の試薬類としては、通常ドライケミストリ
ーの分野で用いられるものの中から適宜選択して用いれ
ば良く、その使用濃度も通常この分野で用いられる範囲
から適宜選択すれば足りる。

【００２５】本発明の試験片をフィルムを用いて調製す
る際、必要な試薬を保持した薄膜を形成するためには、
適当な膜形成剤を用いることが必要となる。これらの膜
形成剤としては、通常ドライケミストリーの分野で用い
られているものであれば特に限定されることなく挙げら
れるが、例えばポリビニルアルコール樹脂，ポリビニル
ピロリドン樹脂，ポリアクリルアミド樹脂，ポリエチレ
ンオキサイド樹脂，若しくはポリ酢酸ビニル樹脂などの
水溶性合成樹脂、メチルセルロース，ヒドロキシエチル
セルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチル
セルロース等の水溶性セルロース誘導体、デンプン，多
糖類，ゼラチン，カゼイン，アラビアゴム，若しくはア
ルギン酸ナトリウム等の天然高分子等が挙げられる。

【００２６】尚、本発明に係る試薬組成物は、これを試
験片に保持させて使用する以外にも、例えばこれを直接
検体中に添加溶解して測定に供するとか、該試薬組成物
を含有する溶液中に検体を添加して測定を行う等も可能
なので、このようにしてＮＡＧ活性測定を実施しても良
い。以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明する
が、本発明はこれらによって何等限定されるものでな
い。

【００２７】

【実施例】

実施例１ ［試験片の調製］ （含浸液１） クエン酸一水和物 １．０２ｇ リン酸二ナトリウム（無水） １．４６ｇ 蒸留水 全量１００ｍｌ（ｐＨ
５．０） （含浸液２） 5-ブロモ-3-インドリル 2-アセトアミド-2-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシド （一般式［１］に於てＲ₁、Ｒ₃及びＲ₄が水素原子、Ｒ₂が臭素原子である化合物 。以下5-Ｂｒ-Ｉｎｄ-ＧｌｃＮＡｃと略記する.) ０．４１５ｇ 2-メトキシ-4-モルホリノベンゼンジアゾニウム-テトラクロロジンケ−ト ０．３２４ｇ メタノ−ル 全量１００ｍｌ （操作法）濾紙を上記の含浸液１中に浸漬した後乾燥
し、次いで上記の含浸液２中に浸漬した後乾燥して、外
観が微黄白色の試験片を作製した。 ［結果］得られた試験片は、ＮＡＧを含まない尿（以
下、ブランク尿と略記する。）と反応させてた場合には
殆ど着色が見られなかったが、ＮＡＧ（人胎盤由来、シ
グマ社製）を添加した尿と反応させた場合には、その添
加濃度に応じた青紫色を呈した。また、プレテスタ−Ｒ
Ｍ−４０５（和光純薬工業(株)社製）を用い、所定濃度
のＮＡＧを含む尿と反応させた試験片の測定波長５６５
ｎｍ（参照波長７６０ｎｍ）における反射率を測定し
た。結果を図１に示す。これらの結果より本発明を利用
した試験片は、ワンステップで簡便に検体中のＮＡＧ活
性を測定できることが判る。

【００２８】比較例１． ［試験片の調製］実施例１の含浸液２中の2-メトキシ-4
-モルホリノベンゼンジアゾニウム-テトラクロロジンケ
ートの代りに、ヘキサゾ化ｐ-ローズアニリン０．５８
６ｇを用いた以外は実施例１と同じ試薬を用い、同様の
操作により試験片を作製した。 ［結果］得られた試験片は黄褐色の外観を有し、且つブ
ランク尿と反応させた場合に橙色を呈した。これらの結
果から、ジアゾニウム塩としてヘキサゾ化ｐ−ローズア
ニリンを用いて作製された試験片は、尿中のＮＡＧ活性
測定用としては不適当なものであることが判る。

【００２９】比較例２． ［試験片の調製］実施例１の含浸液２中の2-メトキシ-4
-モルホリノベンゼンジアゾニウム-テトラクロロジンケ
ートの代りに、ファーストガーネットＧＢＣ塩０．３３
６ｇを用いた以外は実施例１と同じ試薬を用い、同様の
操作により試験片を作製した。 ［結果］得られた試験片は黄褐色の外観を呈し、且つブ
ランク尿と反応させた場合に茶褐色を呈した。これらの
結果から、ジアゾニウム塩としてファーズトガーネット
ＧＢＣ塩を用いて調製された試験片も、尿中のＮＡＧ活
性測定用として不適当なものであることが判る。

【００３０】実施例２ ［試験片の調製］含浸液として下記のものを用いた以外
は、実施例１と同様の操作により試験片を作製した。 （含浸液１）実施例１の含浸液１と同じ。 （含浸液２） 5-ヨード-3-インドリル 2-アセトアミド-2-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシド （一般式［１］に於てＲ₁、Ｒ₃及びＲ₄が水素原子、Ｒ₂がヨウ素原子である化合 物。） ０．４６２ｇ 2-メトキシ-4-モルホリノベンゼンジアゾニウム−テトラクロロジンケ−ト ０．３２４ｇ メタノ−ル 全量１００ｍｌ ［結果］得られた試験片は、微黄白色の外観を有し、ブ
ランク尿と反応させた場合には殆ど着色せず、ＮＡＧを
添加した尿と反応させた場合にはその添加濃度に応じた
青紫色を呈した。また、実施例１と同じ条件で所定濃度
のＮＡＧを含む尿と反応させた該試験片の反射率を測定
した。結果を図２に示す。これらの結果より本発明を利
用した試験片は、ワンステップで簡便に検体中のＮＡＧ
活性を測定できることが判る。

【００３１】実施例３ ［試験片の調製］含浸液として下記のものを用いた以外
は、実施例１と同様の操作により試験片を作製した。 （含浸液１） クエン酸一水和物 １．２９ｇ リン酸二ナトリウム（無水） １．０９ｇ 蒸留水 全量１００ｍｌ（ｐ
Ｈ４．０） （含浸液２） 3-インドリル 2-アセトアミド-2-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシド（一般式［ １］に於てＲ₁〜Ｒ₄が全て水素原子である化合物。） ０．３３６ｇ 2,4-ジメトキシベンゼンジアゾニウム−テトラフルオロボレ−ト ０．３２４ｇ メタノ−ル 全量１００ｍｌ ［結果］得られた試験片は微橙白色の外観を有し、ブラ
ンク尿と反応させた場合には殆ど着色せず、ＮＡＧを添
加した尿と反応させた場合にはその添加濃度に応じた桃
色を呈した。

【００３２】実施例４ ［試験片の調製］含浸液として下記のものを用いた以外
は、実施例１と同様の操作により試験片を作製した。 （含浸液１）実施例３の含浸液１と同じ。 （含浸液２） 5-Ｂｒ-Ｉｎｄ-ＧｌｃＮＡｃ ０．４１５ｇ 4-ベンズアミド-2-メトキシ-5-メチルベンンゼンジアゾニウム-テトラクロロジ ンケ−ト ０．３７２ｇ メタノ−ル 全量１００ｍｌ ［結果］得られた試験片は微橙白色の外観を有し、ブラ
ンク尿と反応させた場合には殆ど呈色せず、ＮＡＧを添
加した尿と反応させた場合にはその添加濃度に応じた赤
紫色を呈した。

【００３３】実施例５ ［試験片の調製］含浸液として下記のものを用いた以外
は、実施例１と同様の操作により試験片を作製した。 （含浸液１）実施例１の含浸液１と同じ。 （含浸液２） 5-クロロ-3-インドリル 2-アセトアミド-2-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシド （一般式［１］に於てＲ₁、Ｒ₃及びＲ₄が水素原子、Ｒ₂が塩素原子である化合物 。） ０．３７１ｇ 2-メトキシ-4-モルホリノベンゼンジアゾニウム-テトラクロロジンケート ０．３２４ｇ メタノ−ル 全量１００ｍｌ ［結果］得られた試験片は微黄白色の外観を有し、ブラ
ンク尿と反応させた場合には殆ど着色せず、ＮＡＧを添
加した尿と反応させた場合にはその添加濃度に応じた青
紫色を呈した。

【００３４】実施例６ ［試験片の調製］含浸液として下記のものを用いた以外
は、実施例１と同様の操作により試験片を作製した。 （含浸液１）実施例１の含浸液１と同じ。 （含浸液２） 6-クロロ-3-インドリル 2-アセトアミド-2-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシド （一般式［１］に於てＲ₁、Ｒ₂及びＲ₄が水素原子、Ｒ₃が塩素原子である化合物 。） ０．３７１ｇ 2-メトキシ-4-モルホリノベンゼンジアゾニウム-テトラクロロジンケート ０．３２４ｇ メタノ−ル 全量１００ｍｌ ［結果］得られた試験片は微黄白色の外観を有し、ブラ
ンク尿と反応させた場合には殆ど着色せず、ＮＡＧを添
加した尿と反応させた場合にはその添加濃度に応じた青
紫色を呈した。

【００３５】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は尿中ＮＡＧ活
性をワンステップで簡便に測定し得る方法を提供するも
のであり、本発明のＮＡＧ活性測定用試験片を使用すれ
ば、それ自体の外観の色調が淡色で且つ尿中の共存物質
に起因する発色も生じないので、測定可能な範囲が極め
て広く、且つ感度及び精度も極めて高い点に顕著な効果
を奏する。

【００３６】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１に於て得られた試験片を、所
定濃度のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ
（以下、ＮＡＧと略記する。）を含む尿と反応させて得
られた反射率の測定結果を示す。

【図２】図２は、実施例２に於て得られた試験片を、所
定濃度のＮＡＧを含む尿と反応させて得られた反射率の
測定結果を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１２月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００３

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００３】ＮＡＧ活性の溶液法による測定方法として
は、これまで基質としてｐ-ニトロフェニル -Ｎ-アセチ
ル-β-Ｄ-グルコサミニド（バイオケミカル プレパレ
イションズ Vol.10，118（1963））或は 4-メチルウン
ベリフェリル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコサミニド（ク
リニカ キミカ アクタ，Vol.69，85（1976））を用い
る方法が一般に広く行われてきたが、何れの方法も、尿
中の共存物質により、正誤差が生じるため尿中ＮＡＧ活
性を測定する際には尿のブランク値を測定する必要があ
り、且つ測定原理が反応停止液を用いるエンドポイント
法であるため、測定操作が煩雑でしかも時間がかかると
いう欠点を有していた。そのため、ソジオ-ｍ-クレゾー
ルスルホンフタレイニル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコサ
ミニド等を 基質として用いる測定方法（特公昭63-7196
号公報）、2-クロロ-4-ニトロフェニル-Ｎ-アセチル-β
-Ｄ-グルコサミニド等を基質として用いる測定方法（特
開昭61-112092号公報）、ソジオ-3,3'-ジクロロフェノ
ールスルホンフタレイニル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコ
サミニドを基質として用いる測定方法（特開昭63-30919
9号公報）等、尿のブランク値の測定が不要な方法が開
発され、汎用されるようになってきている。しかしなが
ら、これらの方法に於ても測定操作が煩雑なため測定に
時間がかかるという問題点については未だ充分に解決が
なされたとは言い難い。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００４】一方、ドライケミストリー法はワンステッ
プで測定が可能な為、上記した如き溶液法によるＮＡＧ
測定法をドライケミストリー法へ応用できれば簡便で迅
速な測定方法となる可能性がある。しかし、上記の如き
溶液法に使用されているＮＡＧ活性測定用試薬を用いて
試験片を調製すると、基質自体が着色しているため得ら
れた試験片の外観が濃く着色したり、或は測定時に尿中
の共存物質に起因して尿のブランク値が高くなる等の現
象が生じ、結果的にＮＡＧ活性の測定可能な範囲が狭く
なるので、何れもドライケミストリー法には応用し難
い。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１４】本発明に係る一般式［１］で示される化合
物は、例えば、下記構造式［Ａ］

【化６】 （式中、Ａｃはアセチル基を表わす。）で示される1-ク
ロロ-1-デオキシ-2,3,4,6-テトラ-Ｏ-アセチル-α-Ｄ-
グルコサミン（以下、化合物［Ａ］と略記する。）と一
般式［４］

【化７】 （式中、Ｒ₁〜Ｒ₄及びＡｃは前記に同じ。）で示される
インドール誘導体とを常法により縮合した後、常法によ
り脱アセチル化することにより容易に得られる。即ち、
例えばテトラヘドロン，Vol.12，236（1961）、メソッ
ド イン カルボハイドレイト ケミストリ−IIに記載
された方法等に準じて、一般式［４］で示される化合物
と、該化合物１モルに対して１〜１.２モルの化合物
［Ａ］とをアセトン等の溶媒中、アルカリ（NaOH、KOH
等）存在下、0℃〜室温で8〜50時間撹拌下に反応させ
る。反応終了後は、例えば酢酸等の酸を用いて中和し、
常法に従って抽出、洗浄、乾燥、濃縮等の後処理を行
い、必要に応じて生成物をカラムクロマトグラフィー、
再結晶等により生成すれば、一般式［１］で示される化
合物のインドール骨格のＮ位がアセチル基で置換された
化合物が得られる。次いで該化合物をメタノール等の溶
媒に溶解し、これにナトリウムメチラート等の金属アル
コラートを適当量添加し、0℃〜室温で8〜30時間反応さ
せて脱アセチル化した後、反応液を酢酸等の酸で中和
し、溶媒を留去して得られた残渣を常法に従って処理す
ることにより一般式［１］で示される化合物を得ること
ができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式［１］ 【化１】 （式中Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は夫々独立して水素原子、
   ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アルキルア
   ミノ基、ジアルキルアミノ基、アシルアミノ基、ニトロ
   基、アルカリ金属塩となっていてもよいカルボキシル
   基、又はアルカリ金属塩となっていてもよいスルホン酸
   基を表す。）で示される化合物、一般式［２］ 【化２】 （式中Ｒ'₁、Ｒ'₃及びＲ'₅は夫々独立して水素原子、ア
   ルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アルキルアミ
   ノ基、ジアルキルアミノ基、フェニルアミノ基、アシル
   アミノ基、モルホリノ基、ピロリジノ基、ピペラジノ基
   又はピペリジノ基を表し、Ｒ'₂及びＲ'₄は夫々独立して
   水素原子、ハロゲン原子、アルキル基又はアルコキシ基
   を表し、Ｘは安定化アニオンを表す。但し、Ｒ'₁、Ｒ'₃
   及びＲ'₅のうち少なくとも一つはアルコキシ基、ヒドロ
   キシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、フェ
   ニルアミノ基、アシルアミノ基、モルホリノ基、ピロリ
   ジノ基、ピペラジノ基又はピペリジノ基である。また、
   Ｒ'₁とＲ'₂又は／及びＲ'₄とＲ'₅は夫々互いに結合して
   芳香環を形成していてもよい。）で示されるジアゾニウ
   ム塩及びｐＨ4.0〜6.0を保持し得る緩衝剤を含んで成る
   試薬組成物を、吸収性担体又はフィルム上に保持させて
   成るＮ-アセチル-β-Ｄ-グルコサミニダーゼ活性測定用
   試験片。