JP2722874B2

JP2722874B2 - 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体及びこれを基質に用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定法

Info

Publication number: JP2722874B2
Application number: JP3193152A
Authority: JP
Inventors: 勝昌黒岩; 勝博片山; 俊英三浦; 健長澤
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1991-08-01
Filing date: 1991-08-01
Publication date: 1998-03-09
Anticipated expiration: 2013-03-09
Also published as: JPH0559083A; US5399488A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一般式（Ｉ）

【化２】（式中、Ｒ₁，Ｒ₂はそれぞれ水素原子、メチル基又は
エチル基を表わす）で表わされる新規Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン誘導体及びこれを基質に用いたＮ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定法に関
する。本発明は新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ン誘導体及びこれを基質に用いた測定法であり、本発明
によればＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活
性を正確かつ簡便に測定することができ、Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性を測定するための臨
床検査用測定法として医学的治療や臨床検査の分野にお
いて極めて重要である。

【０００２】

【従来の技術】Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ（以下ＮＡＧと略す）は、腎の近位尿細管に由来す
るライソゾーム酵素で、尿細管障害により尿中に逸脱す
ることから腎障害の指標とされている。また尿中ＮＡＧ
活性は、薬剤による腎障害、ネフローゼ症候群、糸球体
腎炎など種々の腎疾患においても増加することが知ら
れ、さらに糖尿病性腎症においては尿中ばかりでなく血
清中ＮＡＧも増加するとされており、これらの疾患の早
期診断にも利用されている。

【０００３】従来、ＮＡＧ活性測定法については、以下
に示すように種々の合成基質を使用する方法が報告され
ており、また日常の臨床検査に実用化されているものも
ある。（ａ）４−ウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニドを基質とする方法ＮＡＧの加水分解によって生じた４−ウンベリフェロン
の蛍光強度を蛍光光度計により測定する〔Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，２４，１８３（１９６
９）〕。（ｂ）ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニドを基質とする方法ＮＡＧの加水分解によって生じたｐ−ニトロフェノール
をアルカリによって発色させ比色測定する〔Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．，２７，１１８０（１９８１）〕。（ｃ）ソジオ−ｍ−クレゾールスルホンフタレイニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ −グルコサミニドを基質とする方法ＮＡＧの加水分解に
よって生じたｍ−クレゾールスルホンフタレインをアル
カリによって発色させ比色測定する〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．，２９，１７１３（１９８３）〕。

【０００４】（ｄ）２−クロル−４−ニトロフェニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質とする
方法ＮＡＧの加水分解によって生じた２−クロル−４−ニト
ロフェノールの黄色の色調を４００ｎｍ付近の波長で比
色測定する〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３４，２１４０
（１９８８）〕。（ｅ）ソジオ−３，３′−ジクロロフェノールスルホ
ンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ドを基質とする方法ＮＡＧの加水分解によって生じたクロロフェノールレッ
ドをそのまま波長５７５ｎｍで比色測定する〔特開昭６
３−３０９１９９〕。（ｆ）ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニドを基質としＮＡＧによって生じたＮ−ア
セチルグルコサミンを酸化酵素で処理する方法ＮＡＧの
加水分解によって生じたＮ−アセチルグルコサミンにＮ
−アセチルグルコサミンオキシダーゼを作用させ過酸化
水素を発生させ、この過酸化水素をパーオキシダーゼ存
在下発色剤と反応させ、生じる緑色色素を７５５ｎｍで
比色定量する〔機器・試薬，１３，８８７（１９９
０）〕。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】これらの測定法には種
々の問題点があり、測定の不便さ、測定値の不正確さの
原因となっている。例えば、（ａ）では測定に蛍光光度
計のような特殊な機器が必要であるという問題点を有す
る。（ｂ）では検体ブランクが必要であり、またＮＡＧ
の至適ｐＨである酸性域で反応させた後、カセイソーダ
水溶液等でアルカリ性にしないと色原体であるｐ−ニト
ロフェノールが発色せず、酵素活性を測定するのに最も
適当な方法とされるレートアッセイが出来ない。さらに
測定波長が４００ｎｍ付近であり、体液中のビリルビン
や溶血ヘモグロビンなどの生体成分の影響を受け易く、
測定値の誤差原因になっている。（ｃ）は（ｂ）と同様
ＮＡＧの加水分解によって生じたｍ−クレゾールスルホ
ンフタレインをアルカリ性下で測定する必要があるた
め、レートアッセイが不可能である。（ｄ）は呈色反応
を必要とせず、レートアッセイが可能である。しかし、
基質である２−クロル−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミニドが水に難溶性であるた
め、溶解するのに界面活性剤を必要とし、且つそれでも
完全に溶解するのに数分を要するという欠点を有してい
る。また、測定波長が４００ｎｍ付近であるので（ｂ）
と同様生体成分の影響を受け易い。（ｅ）もレートアッ
セイが可能である。しかし、水解生成物であるクロロフ
ェノールレッドのｐＫ_a（ｐＫ_a＝−ｌｏｇＫ_a，
Ｋ_a：酸解離定数）が５．８であり、測定ｐＨ（６．
０）でも解離が不十分なため、溶液中の僅かなｐＨの変
動で分子吸光係数も変動する。そのため、測定値に誤差
が生じやすいという問題点を有している。また、基質の
溶解後の安定性が冷蔵保存で１週間しかなく、使用する
側が長期間使用可能な試薬を要望しているという点では
問題である。また、この基質溶解後の安定性は（ａ），
（ｃ），（ｄ）でも１週間以下であり、（ｅ）と同様に
これらの方法の共通の欠点となっている。（ｆ）の方法
もレートアッセイが可能である。しかし酸化酵素を使用
しているため、ビリルビン等の還元性物質やヘモグロビ
ン、金属、糖などの反応系の共存物質が高濃度に存在す
ると影響を受ける問題点がある。また、試薬調製後の安
定性も２週間であり、必ずしも満足できるものではな
い。

【０００６】

【課題を解決するための手段】我々は従来法の問題点を
解決すべく鋭意研究し本発明に到達した。即ち一般式
（Ｉ）で示される新規化合物を合成し、かかる化合物を
基質として用いるＵＶレートアッセイ法によるＮＡＧ活
性測定法について検討したところ、この方法は測定波長
として３２０〜３８０ｎｍを使用する事が出来、また基
質溶液が非酵素的加水分解に対して極めて安定であるこ
となどの知見を得た。従って本基質を用いることにより
極めて簡便に短時間で、しかも生体成分の影響を受ける
ことなく体液中のＮＡＧ活性を正確に測定することが可
能となり、その他、基質の溶解性が良好で、また基質溶
液が冷蔵保存で少なくとも１カ月という長期間使用可能
であるなど種々の利点を有する測定が可能になった。即
ち、本発明は一般式（Ｉ）

【化３】（式中、Ｒ₁，Ｒ₂はそれぞれ独立に水素原子、メチル
基又はエチル基を表わす）で表わされる新規Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体及びこれを基質に用い
たＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定
法を要旨とする。基質として用いられる新規Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体はＮＡＧの加水分解作
用により下記一般式（ＩＩ）で示される２−ピリジンチ
オール誘導体を遊離する。遊離した２−ピリジンチオー
ル誘導体は基質とは異なったスペクトル吸収を示す。

【化４】（式中、Ｒ₁，Ｒ₂はそれぞれ独立に水素原子、メチル
基又はエチル基を表わす）

【０００７】このような２−ピリジンチオール誘導体と
しては、例えば２−ピリジンチオール、３−メチル−２
−ピリジンチオール、４−メチル−２−ピリジンチオー
ル、５−メチル−２−ピリジンチオール、６−メチル−
２−ピリジンチオール、３−エチル−２−ピリジンチオ
ール、４−エチル−２−ピリジンチオール、５−エチル
−２−ピリジンチオール、６−エチル−２−ピリジンチ
オール、３，４−ジメチル−２−ピリジンチオール、
３，５−ジメチル−２−ピリジンチオール、３，６−ジ
メチル−２−ピリジンチオール、４，５−ジメチル−２
−ピリジンチオール、４，６−ジメチル−２−ピリジン
チオール、５，６−ジメチル−２−ピリジンチオール、
３，４−ジエチル−２−ピリジンチオール、３，５−ジ
エチル−２−ピリジンチオール、３，６−ジエチル−２
−ピリジンチオール、４，５−ジエチル−２−ピリジン
チオール、４，６−ジエチル−２−ピリジンチオール、
５，６−ジエチル−２−ピリジンチオール、３−エチル
−４−メチル−２−ピリジンチオール、３−エチル−５
−メチル−２−ピリジンチオール、３−エチル−６−メ
チル−２−ピリジンチオール、４−エチル−５−メチル
−２−ピリジンチオール、４−エチル−６−メチル−２
−ピリジンチオール、５−エチル−６−メチル−２−ピ
リジンチオール、４−エチル−３−メチル−２−ピリジ
ンチオール、５−エチル−３−メチル−２−ピリジンチ
オール、６−エチル−３−メチル−２−ピリジンチオー
ル、５−エチル−４−メチル−２−ピリジンチオール、
６−エチル−４−メチル−２−ピリジンチオール、６−
エチル−５−メチル−２−ピリジンチオール等が挙げら
れる。

【０００８】新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン
誘導体は例えば以下に示す反応スキームにより容易に合
成することができる。

【化５】（式中、Ａｃはアセチル基、Ｍｅｔはアルカリ金属、Ｒ
はアルキル基及びＲ₁，Ｒ₂はそれぞれ独立に水素原
子、メチル基又はエチル基を表わす）

【０００９】即ち、化合物（Ｖ）はＯｒｇ．Ｓｙｎ．，
４６，１（１９６６）等に記載の公知物質である１−ク
ロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラアセチル
−α−Ｄ−グルコサミン（ＩＩＩ）と２−ピリジンチオ
ール誘導体のナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩
（ＩＶ）をアセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
等の溶媒中でカップリングさせＳ−グリコシド結合を形
成させることにより得られる。又、上記以外でも化合物
（ＩＩ）と（ＩＩＩ）を塩基の存在下直接反応させる方
法によっても化合物（Ｖ）を得ることができる。さら
に、その他の方法でも、通常のグリコシド結合を形成す
る反応であればこの場合に応用可能である。

【００１０】次に化合物（Ｖ）に水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム等の金属の水酸化物〔Ｍｅｔ^+-ＯＨ〕又は
ナトリウムメチラートやナトリウムエチラート等の金属
のアルコラート〔ＲＯ^-+Ｍｅｔ〕などのアルカリを作用
させＯ−アセチル基を脱離することにより本発明の化合
物である（Ｉ）を得ることができる。これらの反応はい
ずれもそれ自体公知の反応であり、反応条件は公知の反
応と同様である。

【００１１】次に、新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミン誘導体を用いる本発明のＮＡＧ活性測定法につい
て６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ
−β−Ｄ−グルコサミニド（以下６ＭｅＰＴ−ＮＡＧと
略す）を例にとって説明する。図１に酸性緩衝液中（ｐ
Ｈ４．５）での６ＭｅＰＴ−ＮＡＧ（ａ）と６−メチル
−２−ピリジンチオール（ｂ）のＵＶスペクトルを示し
た。６ＭｅＰＴ−ＮＡＧがＮＡＧの作用で加水分解する
とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと６−メチル−２−
ピリジンチオールを生成する。Ｎ−アセチル−Ｄ−グル
コサミンと６ＭｅＰＴ−ＮＡＧは３２０ｎｍ以上ではＵ
Ｖ吸収はほとんどない。６−メチル−２−ピリジンチオ
ールは３８０ｎｍ以下でＵＶ吸収する。従って、ＵＶレ
ートアッセイ法によりＮＡＧ活性を測定する方法におい
て６ＭｅＰＴ−ＮＡＧを基質として使用し、測定波長３
２０〜３８０ｎｍで反応を追跡することができ、この場
合他の生体成分の干渉を受けることが少ない。従って、
６−メチル−２−ピリジンチオールの増加を正確に追跡
することができ、ＮＡＧ活性を正確に測定することが可
能である。又、後述するごとく６ＭｅＰＴ−ＮＡＧは多
くの優れた利点を有する。

【００１２】従って、一般式（Ｉ）の新規Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミン誘導体を用いたＮＡＧ活性測定
法として、具体的には例えば次の測定法が提供される。
即ち、ＮＡＧを含む検体と一般式（Ｉ）で表わされる新
規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体とを混合
し、次いで吸光度、特に３２０〜３８０ｎｍでの吸光度
を測定することによりＮＡＧ活性を測定する方法であ
る。

【００１３】前述の２−クロル−４−ニトロフェニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として用
いる方法（ｄ）では、ＮＡＧの至適ｐＨである酸性域で
レートアッセイできるが、測定波長が４００ｎｍ付近に
あるので、生体成分であるビリルビンやヘモグロビンの
干渉を強く受ける。これに対し、本発明の測定波長３２
０〜３８０ｎｍではほとんど干渉を受けないので至適な
測定条件が容易である。また、本発明の新規Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体例えば６ＭｅＰＴ−Ｎ
ＡＧが加水分解されて生じる６−メチル−２−ピリジン
チオールは３４０ｎｍ付近に極大吸収をもち、従って測
定波長をピークに設定することができる。このことは分
析装置の波長精度の問題から発生する分子吸光係数の違
いなどが非常に小さくなり測定値の分析装置機種間差な
どが非常に小さくなることを示している。

【００１４】さらに、本発明の新規基質は任意の割合で
容易に水に溶解する。このことは前述の２−クロル−４
−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニドの基質のように溶解に界面活性剤等の添加剤を必要
としないことを意味する。従って、本発明の基質を用い
れば、極めて簡便に短時間で基質溶液を調製することが
可能である。また、本発明の基質溶液は非酵素的加水分
解に対して極めて安定である。例えば、冷蔵保存下の６
ＭｅＰＴ−ＮＡＧ溶液を用いて同一検体のＮＡＧ活性を
３０日間断続的に測定したところ、測定値の変動はほと
んどなく（図８参照）、試薬ブランクの上昇もわずかで
測定限界を低下させない範囲であった（図９参照）。こ
のことは、６ＭｅＰＴ−ＮＡＧを基質とすれば、基質溶
液は、調製後冷蔵保存で少なくとも１カ月というこれま
での基質にはない長期間使用可能なことを示している。

【００１５】本発明の基質を用いるＮＡＧ活性測定を行
なうに際してｐＨを一定に保持するための緩衝剤とし
て、クエン酸、酢酸、コハク酸、フタル酸及びその塩類
等が使用できる。上記以外の緩衝剤でもｐＨ３．０〜
７．０の間において緩衝能を維持できるものであれば用
いることが可能である。さらに、本発明の試薬には、必
要により安定化剤、溶解補助剤、防腐剤を添加すること
が可能であり、その例としては、サイクロデキストリン
類、ウシ血清アルブミン、ＥＤＴＡ・２ナトリウム、塩
化ナトリウム等の塩類、トリトンＸ−１００等の界面活
性剤などが挙げられる。

【００１６】

【発明の効果】本発明のＮＡＧ活性測定法は種々の点で
従来法の問題点が解決されている。本発明の利点を記す
と次のごとくである。（１）測定波長を３２０〜３８０ｎｍの紫外領域に設
定できるため、測定の際、ビリルビンやヘモグロビン等
の生体試料中の共存物質の影響を受けにくい。（２）ピークの波長（３４０ｎｍ）で測定が可能であ
るため、測定値の誤差が少なくなる。（３）基質が水溶性に優れているので、基質溶液の調
製が容易である。（４）基質溶液が安定であり、冷蔵保存で長期間に渡
って測定に使用できる。（５）レートアッセイが可能なため、自動分析装置に
簡単に適用できる。以上のごとく、本発明のＮＡＧ活性測定法は従来法の有
する問題点を解決し、多くの利点や特徴を有し、正確か
つ簡便にＮＡＧ活性を測定でき、日常の臨床検査におけ
るＮＡＧ活性測定に十分貢献できるものである。

【００１７】

【実施例】以下に実施例により、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるも
のではない。実施例１６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−
β−Ｄ−グルコサミニドの合成６−メチル−２−ピリジンチオールのナトリウム塩１．
４７ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）と１−クロロ−１−デオキ
シ−２，３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコ
サミン４．３９ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）にジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）２０ｍｌを加え、室温で４８時間攪
拌反応させた。反応終了後反応液にクロロホルム１００
ｍｌ加え、蒸留水で３回洗浄後、無水硫酸マグネシウム
にて乾燥した。溶媒を減圧留去し得られた淡黄色の結晶
をメタノールに溶解しエーテルを加えることにより再結
晶し、白色綿状結晶の６′−メチル−２′−ピリジル−
２，３，４，６−テトラアセチル−１−チオ−β−Ｄ−
グルコサミニド１．５０ｇ（収率３１％）を得た。融点１４５℃（分解）元素分析値Ｃ₂₀Ｈ₂₆Ｎ₂Ｏ₈Ｓ・ＣＨ₃ＯＨとして、実測値％（計算値％）Ｃ：５１．８１（５１．８４），Ｈ：５．９１（６．２
１），Ｎ：５．６１（５．７６）

【００１８】次に６′−メチル−２′−ピリジル−２，
３，４，６−テトラアセチル−１−チオ−β−Ｄ−グル
コサミニド１．４５ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を無水メタノ
ール４０ｍｌに溶解し、これに２８％ナトリウムメチラ
ート０．１４８ｍｌ（０．８ｍｍｏｌ）を攪拌下加え、
氷浴で冷却下１時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー
で反応の終了を確認後、反応液に陽イオン交換樹脂であ
るアンバーリスト^TM１５Ｅを０．５ｍｌ加え２０分間さ
らに攪拌し、未反応のナトリウムメチラートを中和し
た。該樹脂をろ別し、ろ液を減圧濃縮すると白色の結晶
が得られた。これをさらに、メタノールで再結晶し、白
色粉末状の６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−
１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド０．７５ｇ（収率６
０％）を得た。融点１６５℃（分解）元素分析値Ｃ₁₄Ｈ₂₀Ｎ₂Ｏ₅Ｓ・３／２ＣＨ₃ＯＨと
して、実測値％（計算値％）Ｃ：４９．５７（４９．４５），Ｈ：６．９０（６．９
６），Ｎ：７．５５（７．４７）ＵＶスペクトル及びＩＲスペクトルをそれぞれ図１、図
２に示した。

【００１９】実施例２６−エチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−
β−Ｄ−グルコサミニドの合成６−エチル−２−ピリジンチオールのナトリウム塩１．
２０ｇ（７．５ｍｍｏｌ）と１−クロロ−１−デオキシ
−２，３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサ
ミン３．４２ｇ（９．３ｍｍｏｌ）にジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）２０ｍｌを加え、室温で４８時間攪拌反
応させた。反応終了後反応液にクロロホルム１００ｍｌ
加え、蒸留水で３回洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて
乾燥した。溶媒を減圧留去し得られた淡黄色の結晶を熱
メタノールにて再結晶し、白色綿状結晶の６′−エチル
−２′−ピリジル−２，３，４，６−テトラアセチル−
１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド１．２１ｇ（収率３
５％）を得た。融点１９３−１９６℃ 元素分析値Ｃ₂₁Ｈ₂₈Ｎ₂Ｏ₈Ｓとして、実測値％（計算値％）Ｃ：５３．６３（５３．８４），Ｈ：６．１８（６．０
２），Ｎ：５．８３（５．９８）

【００２０】次に、６′−エチル−２′−ピリジル−
２，３，４，６−テトラアセチル−１−チオ−β−Ｄ−
グルコサミニド１．２０ｇ（２．６ｍｍｏｌ）を無水メ
タノール３０ｍｌに溶解し、これに２８％ナトリウムメ
チラート０．１１９ｍｌ（０．６ｍｍｏｌ）を攪拌下加
え、氷浴で冷却下４５分間攪拌した。薄層クロマトグラ
フィーで反応の終了を確認後、反応液に陽イオン交換樹
脂であるアンバーリスト ^TM１５Ｅを０．５ｍｌ加え２０
分間さらに攪拌し、未反応のナトリウムメチラートを中
和した。該樹脂をろ別し、ろ液を減圧濃縮すると白色の
結晶が得られた。これをさらに、メタノールで再結晶
し、白色粉末状の６−エチル−２−ピリジル−Ｎ−アセ
チル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド０．６０ｇ
（収率６３％）を得た。融点１７０℃（分解）元素分析値Ｃ₁₅Ｈ₂₂Ｎ₂Ｏ₅Ｓ・ＣＨ₃ＯＨとして、実測値％（計算値％）Ｃ：５１．７１（５１．３２），Ｈ：６．６５（７．０
０），Ｎ：７．７３（７．４８）ＵＶスペクトル及びＩＲスペクトルをそれぞれ図３、図
４に示した。

【００２１】実施例３上記各実施例と同様な方法で合成した本発明の化合物の
構造及びその融点（分解点）、元素分析値を第１表に例
示するが、本発明がこれらの化合物のみに限定されるも
のではないことはいうまでもない。

【表１】

【００２２】実施例４６−エチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−
β−Ｄ−グルコサミニド（６ＭｅＰＴ−ＮＡＧ）を用い
たＮＡＧ活性測定法（１）１００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ４．５０（２５
℃）（２）検体（３）１７．４ｍＭ基質（６ＭｅＰＴ−ＮＡＧ）溶液基質溶液は６ＭｅＰＴ−ＮＡＧ３２．８４ｍｇを精秤
し、精製水５ｍｌで溶解することにより調製した。その
際、６ＭｅＰＴ−ＮＡＧは１分以内に速やかに溶解し
た。測定操作は以下の通りである。（１）の緩衝液２．０ｍ
ｌに検体０．１ｍｌを加え３分間３７℃で予加温し、そ
れに（３）の基質液０．５ｍｌを加え、同時にストップ
ウォッチをスタートさせ、正確に１分毎の３４０ｎｍに
おける吸光度を測定し、１分間当りの吸光度変化を求め
る。図５にそのタイムコースを示した。検体はウシ腎臓
由来ＮＡＧ（シグマ社製）を１０ｍＭクエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）で希釈したものを用いた。（ａ）がその
タイムコースであり、（ｂ）は検体の代りに生理食塩水
を添加した基質ブランクのタイムコースである。ＮＡＧ
活性値は下記の式により計算される。

【数１】 ¹⁾ΔＥ_aは検体及びΔＥ_bは基質ブランクの測定波長
３４０ｎｍにおける１分間当りの吸光度変化²⁾ 波長３４０ｎｍにおける６−メチル−２−ピリジンチ
オールの分子吸光係数は９０２９（１・ｍｏｌ^-1・ｃｍ
^-1）上式より、使用した液体のＮＡＧ活性は１８４ＩＵ／Ｌ
であった。図５に示したごとくタイムコースは１０分間
経時的に直線性を示した。これは自動分析装置が使用可
能なことを示している。

【００２３】実施例５６−エチル−２−ピリジルチオ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド（６ＥｔＰＴ−ＮＡＧ）を用いたＮＡ
Ｇ活性測定法実施例４の（１）の緩衝液及び（２）の検体を用い
（３）の基質を１７．４ｍＭ６ＥｔＰＴ−ＮＡＧに代
え、検体のＮＡＧ活性を実施例３と同様の方法で測定し
た。図６にそのタイムコースを示した。（ａ）が検体、
（ｂ）が基質ブランクである。実施例３の式（イ）より
使用した検体のＮＡＧ活性は１８０ＩＵ／Ｌであった
（６−エチル−２−ピリジンチオールの分子吸光係数は
９２４４（１・ｍｏｌ^-1・ｃｍ^-1））。図６のごとく、
基質を６ＥｔＰＴ−ＮＡＧとしても、タイムコースは１
０分間経時的に直線性を示した。従って、この場合も自
動分析装置が使用可能なことを示している。

【００２４】実施例６実施例４に従い、ウシ腎由来ＮＡＧの希釈率と酵素活性
の関係を調べた。検体希釈は１０ｍＭクエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）を用いて行なった。図７に示したごと
く、検体希釈と酵素活性は原点を通過する直線的な比例
関係にあり、ＮＡＧ活性が低単位から高単位まで幅広く
測定できることが明らかになった。

【００２５】実施例７ウシ腎由来ＮＡＧを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で希釈、小分けし、−２０℃の冷凍庫に凍結保存す
る。その検体を、実施例４の（３）の６ＭｅＰＴ−ＮＡ
Ｇ基質溶液を用い、基質溶液調製当日、２日目、７日
目、１５日目、２２日目、３０日目の計６回測定した。
基質溶液は２〜８℃の冷蔵庫で保存した。なお、Ｍｅｄ
ｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，６（１９９
１）によれば、ｐＨ６．０前後の溶液中でのＮＡＧ活性
は凍結保存に対して１カ月は安定である。測定値を図
８、及び基質ブランク吸光度の変化を図９に示した。こ
れらの図によれば、本法の基質溶液は、調製後冷蔵保存
（２〜８℃）すれば、少なくとも１カ月間は使用可能な
ことを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、（ａ）６ＭｅＰＴ−ＮＡＧ（０．１ｍ
Ｍ）及び（ｂ）６−メチル−２−ピリジンチオール
（０．１ｍＭ）の１００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ４．５
（２５℃）中のＵＶスペクトルを示す。

【図２】図２は６ＭｅＰＴ−ＮＡＧの臭化カリウム中で
のＩＲスペクトルを示す。

【図３】図３は、（ａ）６ＥｔＰＴ−ＮＡＧ（０．１ｍ
Ｍ）及び（ｂ）６−エチル−２−ピリジンチオール
（０．１ｍＭ）の１００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ４．５
（２５℃）中のＵＶスペクトルを示す。

【図４】図４は６ＥｔＰＴ−ＮＡＧの臭化カリウム中で
のＩＲスペクトルを示す。

【図５】図５は（ａ）６ＭｅＰＴ−ＮＡＧを基質とした
場合の反応タイムコース及び（ｂ）基質ブランクのタイ
ムコースを示す。

【図６】図６は（ａ）６ＥｔＰＴ−ＮＡＧを基質とした
場合の反応タイムコース及び（ｂ）基質ブランクのタイ
ムコースを示す。

【図７】図７はＮＡＧ希釈と酵素活性との関係を示す。

【図８】図８は３０日間に渡り冷蔵保存した６ＭｅＰＴ
−ＮＡＧ基質溶液の安定性を示すものであり、測定した
ＮＡＧ活性値（日差変動）を示す。

【図９】３０日間に渡り冷蔵保存した６ＭｅＰＴ−ＮＡ
Ｇ基質溶液の安定性を示すものであり、基質ブランク吸
光度を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼを含む検体と、一般式（Ｉ）【化１】（式中、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立に水素原子、メチ
ル基又はエチル基を表わす）で表わされる新規Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体からなるＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ測定用基質とを混合
し、次いで反応液の３４０ｎｍでの吸光度を測定するこ
とを特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ活性測定法。
【請求項２】一般式【化２】（式中、Ｒ_１及びＲ_２は水素原子、メチル基又はエチル
基を表わし、但しＲ_１とＲ_２が同時に水素原子であるこ
とはない）で表わされる新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミン誘導体からなるＮ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼ測定用基質。