JPH0881491A - Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬及びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】一般式 （式中のＲ¹はハロゲン原子、Ｒ²は水素原子又はハロゲ
ン原子を意味する。）で表されるＮ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミン誘導体、前記記載のＮ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミン誘導体を有効成分とするＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬及び当該
測定用試薬を用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニダーゼ活性の測定法。 【効果】一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミン誘導体をＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬と
して用いることにより、試料中に含まれるグルコース、
ビリルビン、ヘモグロビン、アルブミン、アスコルビン
酸、尿酸等の影響をうけることなく、ＮＡＧａｓｅ活性
を自動分析法、用手法等により、精度よく短時間で容易
に測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミン誘導体、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニダーゼ活性測定用試薬及びＮ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニダーゼ活性の測定法に関する。

【従来の技術】Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ（ＥＣ ３．２．１．３０、以下、ＮＡＧａｓｅと
略称する。）は腎尿細管上皮に局在するリソソーマル酵
素であり、糖蛋白やムコ多糖類の分解に関与している。
尿中Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性は
急性腎不全や糸球体腎炎等の各種腎臓疾患や腎臓の術後
においては上昇し、また糖尿病においては、尿中ばかり
ではなく血清中ＮＡＧａｓｅも上昇することが知られて
いる。こういった各種腎臓疾患の診断及び経過観察の一
助として、又、薬物の腎毒性の指標としても、臨床及び
動物実験面でＮＡＧａｓｅ活性の測定が注目されてい
る。そして従来、ＮＡＧａｓｅ活性の測定用基質として
は、例えばｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２７，１１
８０，（１９８１）〕、４−メチルウンベリフェリル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド〔Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ，２４，１８９，（１９６９）〕及び
ｍ−クレゾールスルホンフタレイニル−Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニド〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２
９，１７１３，（１９８３）〕が知られている。

【０００２】しかしながら、これらの化合物をＮＡＧａ
ｓｅ活性の測定に用いた場合は、酵素作用によって生成
したアグリコンを定量する際、反応液のｐＨを１０程度
の強アルカリ性にする必要があるために、一旦酵素反応
を停止させて酵素活性を測定するいわゆるエンドポイン
ト法しか適用できず、酵素活性測定法として最適である
酵素反応進行中に直接吸光度変化を計測するレイトアッ
セイ法を採用することができない等の欠点があった。ま
た、近年、前記レイトアッセイ法が適用可能な基質とし
て、例えば、２−クロロ−４−ニトロフェニル−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニド〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．，３４，２１４０，（１９８８）〕及びソジオ−
３，３’−ジクロロフェノールスルホンフタレイニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（特開昭６３−
３０９１９９号）が提案されている。しかしながら、こ
れらはいずれもＮＡＧａｓｅの至適ｐＨである４．５〜
５．０においては、酵素作用によって生成したアグリコ
ンが充分に解離することができず、そのため低い感度し
か得られない等の欠点があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬及びそれを用いる
測定方法の欠点を克服し、ＮＡＧａｓｅ活性を効率よ
く、かつ正確に測定し得る試薬として好適な新規化合物
を提供すると共に、これを試薬とした新規なＮＡＧａｓ
ｅ活性の測定方法を提供することを目的としてなされた
ものである。

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ＮＡＧａｓｅ
活性測定用試薬として、特定の新規なＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン誘導体が極めて好適であり、これを
用いてＮＡＧａｓｅ活性を測定することにより、その目
的を達成し得ることを見い出し、この知見に基づいて本
発明を完成するに至った。すなわち本発明は、一般式

【化２】 （Ｉ） （式中のＲ¹はハロゲン原子、Ｒ²は水素原子又はハロゲ
ン原子を意味する。）で表されるＮ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミン誘導体、該一般式（Ｉ）の化合物を有効
成分とするＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬及びＮＡＧａｓ
ｅ含有試料に該一般式（Ｉ）の化合物を添加し、酵素反
応によって生成するハロゲノ−４−アミノフェノール誘
導体を酸化酵素の共存下、トルイジン誘導体と反応さ
せ、形成される発色性化合物を定量することを特徴とす
るＮＡＧａｓｅ活性の測定法である。

【０００４】以下に、本発明について詳細に説明する。
本発明の前記一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン誘導体において、Ｒ¹はハロゲン原
子（塩素、臭素、フッ素若しくはヨウ素原子）であり、
Ｒ²は水素原子又はハロゲン原子である。そして、ＮＡ
Ｇａｓｅ活性の測定に、前記一般式（Ｉ）で表されるＮ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体を基質として
用いたときに、該一般式（Ｉ）の化合物が置換基Ｒ¹及
びＲ²を有することにより、ＮＡＧａｓｅのレイトアッ
セイ条件下で発色性化合物の形成が促進され、かつ形成
された発色性化合物の検出感度が高められる（低いｐｋ
a値、高い分子吸光係数、長波長の極大吸収をもつ）も
のである。すなわち、該一般式（Ｉ）の化合物における
置換基Ｒ¹及びＲ²の存在が、ＮＡＧａｓｅ活性を弱酸性
条件下でレイトアッセイ法により高感度、高精度で測定
することを可能とさせるのである。このような、前記一
般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミン誘導体としては、例えば２−クロロ−４−アミノフ
ェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、２−
ブロモ−４−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド、２−フルオロ−４−アミノフェニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、２−ヨード−
４−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニド、２，６−ジクロロ−４−アミノフェニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、２，６−ジブロモ
−４−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニド、２，６−ジフルオロ−４−アミノフェニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、２，６−ジヨ
ード−４−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニド、２−ブロモ−６−クロロ−４−アミノフ
ェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド等が挙
げられる。

【０００５】本発明の前記一般式（Ｉ）で表されるＮ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体は、文献未載の
新規な化合物であって、その製造方法については特に制
限はなく、任意の方法を用いることができるが、例えば
次の方法によって製造することができる。すなわち、１
−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラアセ
チル−α−Ｄ−グルコサミン〔Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，
４６，１，(１９６６)〕と一般式

【化３】 （ＩＩ） （式中のＲ¹はハロゲン原子、Ｒ²は水素原子又はハロゲ
ン原子を意味する。）で表されるハロゲノ−４−アミノ
フェノール誘導体を縮合させた後、脱Ｏ−アセチル化す
ることにより製造することができる。前記一般式（Ｉ
Ｉ）で表されるハロゲノ−４−アミノフェノール誘導体
において、Ｒ¹はハロゲン原子（塩素、臭素、フッ素若
しくはヨウ素原子）であり、Ｒ²は水素原子又はハロゲ
ン原子である。このような、前記一般式（ＩＩ）で表さ
れるハロゲノ−４−アミノフェノール誘導体としては、
例えば２−クロロ−４−アミノフェノール、２−ブロモ
−４−アミノフェノール、２−フルオロ−４−アミノフ
ェノール、２−ヨード−４−アミノフェノール、２，６
−ジクロロ−４−アミノフェノール、２，６−ジブロモ
−４−アミノフェノール、２，６−ジフルオロ−４−ア
ミノフェノール、２，６−ジヨード−４−アミノフェノ
ール等が挙げられる。

【０００６】そして、前記一般式（ＩＩ）で表されるハ
ロゲノ−４−アミノフェノール誘導体は、市販品を用い
てもよく、あるいは適宜の方法で製造して得たものを用
いてもよい。次に、前記一般式（ＩＩ）で表されるＮ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体の製造法につき
例示する。先ず、１−クロロ−１−デオキシ−２，３，
４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミンに、溶
媒及び触媒の存在下で、前記一般式（ＩＩ）で表される
化合物を作用させるのであるが、このときの該１−クロ
ロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラアセチル−
α−Ｄ−グルコサミンに対する該一般式（ＩＩ）で表さ
れる化合物の添加量は、通常１〜２０倍モル当量、好ま
しくは２〜５倍モル当量である。溶媒としては、ケトン
類、例えばアセトン、メチルエチルケトン等、ニトリル
類、例えばアセトニトリル等、ハロゲン化炭化水素類、
例えばジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン
等、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジ
メチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホラミド等が挙
げられ、中でもアセトニトリルが好ましい。又、これら
は単独又は組み合わせて用いられる。その量は、通常、
前記１−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テト
ラアセチル−α−Ｄ−グルコサミンの重量の５〜１００
倍量、好ましくは１０〜５０倍量である。触媒として
は、銀塩、例えばＡｇ₂Ｏ、ＡｇＣｌＯ₄、ＡｇＮＯ₃、
ＡｇＣＯ₃等、カリウム塩、例えばＫＯＨ、Ｋ₂ＣＯ
₃等、三級アミン類、例えばトリエチルアミン、トリブ
チルアミン等が挙げられ、中でもトリエチルアミンが好
ましい。又、これらは単独又は組み合わせて用いられ
る。その量は、通常、前記１−クロロ−１−デオキシ−
２，３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミ
ンの１〜１００倍モル量、好ましくは５〜２０倍モル量
である。反応温度及び反応時間は前記一般式（ＩＩ）で
表される化合物、溶媒及び触媒の種類によって異なる
が、通常は２０〜８０℃で１〜３０時間連続して反応さ
せる。

【０００７】こうして得られたものに塩基を作用させて
Ｏ−アセチル基を脱離させることにより、前記一般式
（Ｉ）で表されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン
誘導体が得られる。塩基としては、例えばＫＯＨ、Ｋ₂
ＣＯ₃、ＮａＯＨ、Ｎａ₂ＣＯ₃等のアルカリ金属塩、例
えばナトリウムメチラート、ナトリウムフェノラート等
のアルカリ金属のアルコラート、アンモニア等が挙げら
れ、ナトリウムメチラートが特に好ましい。次いで、こ
のようにして得られたものを常法により精製して前記一
般式（Ｉ）で表される目的化合物を得ることができる。
精製法としては、例えば適宜の有機溶媒等を用いる析出
法、シリカゲルあるいはオクタデシルシリルシリカゲル
（ＯＤＳ）等を用いるカラムクロマトグラフィ等が挙げ
られる。以上のようにして得られた前記一般式（Ｉ）で
表されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体
は、ＮＡＧａｓｅ活性の測定に極めて有用であり、この
化合物を用いてＮＡＧａｓｅ活性をレイトアッセイ法に
より高感度、高精度で測定することができる。

【０００８】本発明のＮＡＧａｓｅ活性の測定法は、前
記一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミン誘導体が、ＮＡＧａｓｅの作用により加水分解
されて、前記一般式（ＩＩ）で表されるハロゲノ−４−
アミノフェノール誘導体を生成し、このハロゲノ−４−
アミノフェノール誘導体が酸化酵素の共存下にトルイジ
ン誘導体と酸化縮合して発色性化合物を形成する原理に
基づくものである。ＮＡＧａｓｅ活性を測定するための
有利な系としては、例えば前記一般式（Ｉ）で表される
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体を０．１〜
１０ｍＭ及び緩衝剤を１０〜５００ｍＭ含有し、かつト
ルイジン誘導体を０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ及び酸化酵素
を０．０１〜１００００ｕ／ｍｌ含有する系（ｐＨ４．
５〜６．５）が挙げられる。この系に用いられるトルイ
ジン誘導体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフ
ェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳ
Ｅ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’
−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯ
ＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）等が挙げら
れる。なお、発色性化合物を形成させるために該トルイ
ジン誘導体を使用するのは、他のフェノール誘導体やア
ニリン誘導体を酸化縮合に使用するよりも発色感度及び
発色波長の上で有利となるからである。酸化酵素として
は、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＬＯＤ、ＥＣ １．
３．３．５）、カテコールオキシダーゼ（ＥＣ １．１
０．３．１）、ラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２）、
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯＤ、ＥＣ １．１
０．３．３）、ｏ−アミノフェノールオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ １．１０．３．４）、モノフェノールモノオキシゲ
ナーゼ（ＭＰＯ、ＥＣ １．１４．１８．１）、フェノ
ラーゼ、チロシナーゼ、モノフェノールオキシダーゼ、
ポリフェノールオキシダーゼ等を用いることができる。
又、これらは単独又は組み合わせて用いられる。

【０００９】緩衝剤としては、例えば燐酸塩、酢酸塩、
クエン酸塩、コハク酸塩、フタル酸塩、グッド緩衝剤
（ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ等）等が挙げ
られる。又、必要に応じて溶解補助剤、防腐剤、安定化
剤、発色促進剤として、例えばトリトンＸ−１００など
の各種界面活性化剤、クラウンエーテル類、シクロデキ
ストリン類、グライコール類、塩化ナトリウム、アジ化
ナトリウム等を適宜添加することができる。本発明の試
薬は、乾燥物あるいは溶解した形で用いてもよく、薄膜
状の担体、例えばシート、含浸性の紙等に含浸させて用
いてもよい。このような本発明の試薬を用いることによ
り、各種の試料に含有されるＮＡＧａｓｅ活性を簡単な
操作で正確に、かつ高感度で測定することができる。次
に、本発明のＮＡＧａｓｅ活性の測定方法の好適な１例
について説明する。先ず、ＮＡＧａｓｅを含む試料に、
前記一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミン誘導体０．１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜５
ｍＭ及びトルイジン誘導体０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、更
に、酸化酵素０．０１〜１００００ｕ／ｍｌを緩衝剤と
共に添加したのち、温度２０〜５０℃、好ましくは３０
〜４０℃、ｐＨ４．５〜６．５の条件にて１分間以上、
好ましくは３〜１０分間酵素反応させ、生成する発色性
化合物の吸光度を直接分光光度計を用いて測定し、単位
時間当りに吸光度の変化量を求める。そして予め同様に
して測定したＮＡＧａｓｅ標品の吸光度変化量と対比さ
せて試料中のＮＡＧａｓｅ活性を算出する。又、発色性
化合物の分子吸光係数から算出することもできる。本発
明に用いられるＮＡＧａｓｅ含有試料についてはＮＡＧ
ａｓｅを含有するものであればよく、特に制限はない
が、具体的には微生物の培養液、植物の抽出液、あるい
は動物の体液や尿や組織及びそれらの抽出液等を用いる
ことができる。

【発明の効果】本発明の前記一般式（Ｉ）で表されるＮ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体は、新規な化
合物であって、ＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬として極め
て有用であり、このものを用いることにより、試料中に
含まれるグルコース、ビリルビン、ヘモグロビン、アル
ブミン、アスコルビン酸、尿酸等の影響を受けることな
く、ＮＡＧａｓｅ活性を自動分析法、用手法等により、
精度よく短時間で容易に測定することができる。

【００１０】

【実施例】以下に実施例を示して本発明を更に詳細に説
明する。なお、実施例中の比旋光度は２５℃においてＤ
線で測定した値である。 実施例１ ２，６−ジブロモ−４−アミノフェニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニドの製造 １−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラア
セチル−α−Ｄ−グルコサミン１８．３ｇ（５０ｍｍｏ
ｌ）をアセトニトリル５００ｍｌに溶解し、これに２，
６−ジブロモ−４−アミノフェノール２６．７ｇ（１０
０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン１４０ｍｌ（１ｍｏ
ｌ）を加え、４０℃で１時間攪拌しながら反応させたの
ち、クロロホルム２ｌを添加した液を０．１Ｎ水酸化ナ
トリウム水溶液１ｌで２回、続いて蒸留水２ｌで洗浄
し、活性炭で脱色後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥さ
せた。次いで、溶媒を留去したのち、残査をエーテル−
クロロホルム混液（容積比１：１）により結晶化させ
て、２，６−ジブロモ−４−アミノフェニル−２，３，
４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド１
９．８５ｇ（３３．３ｍｍｏｌ、収率６７％）を得た。 融点：２０７．５〜２０９．０℃ 比旋光度 ［α］（ＭｅＯＨ）：−６１．９° 赤外吸収スペクトル：３２９６，１７５１，１７３６，
１６６５，１６０２，１５５８，１４７０，１３７５ｃ
ｍ^-1 紫外可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長
（ε）＝２４２（１０６００），３０９（２４００）ｎ
ｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） １．８１（３Ｈ，ｓ），１．９４（６Ｈ，ｓ），１．９
７（３Ｈ，ｓ），３．７０−３．８０（１Ｈ，ｍ），
３．９５−４．１５（３Ｈ，ｍ），４．８８（１Ｈ，
ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．
１Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５，９．
５Ｈｚ），５．３３（２Ｈ，ｂｒｓ），６．７７（２
Ｈ，ｓ），７．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）

【００１１】このようにして得られた２，６−ジブロモ
−４−アミノフェニル−２，３，４，６−テトラアセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド１０．０ｇ（１６．８ｍｍ
ｏｌ）をメタノール−アセトニトリル−クロロホルム混
液（容積比１：１：１）６００ｍｌに溶解し、これに２
８％ナトリウムメチラート−メタノール溶液０．６５ｍ
ｌ（３．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌しなが
ら反応させた。次いで、冷蔵庫に２時間放置したのち、
析出物を濾取した。この析出物を水−エタノールより再
結晶して、２，６−ジブロモ−４−アミノフェニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド４．９０ｇ（１
０．４ｍｍｏｌ、収率６２％）を得た。 融点：１９２．０〜１９５．０℃ 比旋光度 ［α］（ＭｅＯＨ）：−３３．４° 赤外吸収スペクトル：３３０４，１６３５，１５６８，
１４７２，１３８７ｃｍ^-1 紫外可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長
（ε）＝２４１（１０３００），３０８（２５００）ｎ
ｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） １．８３（３Ｈ，ｓ），２．９５−３．２０（２Ｈ，
ｍ），３．４０−３．５０（２Ｈ，ｍ），３．６０−
３．８０（２Ｈ，ｍ），３．８９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．
６Ｈｚ），４．８０−４．９５（２Ｈ，ｍ），４．８９
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），５．２８（２Ｈ，ｂｒ
ｓ），６．７７（２Ｈ，ｓ），７．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝８．８Ｈｚ）

【００１２】実施例２ ２，６−ジクロロ−４−アミノフェニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニドの製造 １−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラア
セチル−α−Ｄ−グルコサミン１８．３ｇ（５０ｍｍｏ
ｌ）をアセトニトリル５００ｍｌに溶解し、これに２，
６−ジクロロ−４−アミノフェノール１７．８ｇ（１０
０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン１４０ｍｌ（１ｍｏ
ｌ）を加え、４０℃で２時間攪拌しながら反応させたの
ち、クロロホルム２ｌを加えた。この液を０．１Ｎ水酸
化ナトリウム水溶液１ｌで２回、続いて蒸留水２ｌで洗
浄したのち、活性炭で脱色後、硫酸マグネシウムを加え
て乾燥させた。次いで、溶媒を留去したのち、残査をエ
ーテル−クロロホルム混液（容積比１：１）により結晶
化させて、２，６−ジクロロ−４−アミノフェニル−
２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニド１５．８６ｇ（３１．３ｍｍｏｌ、収率６３％）を
得た。 融点：２３１．０〜２３３．０℃ 比旋光度 ［α］（ＭｅＯＨ）：−５８．９° 赤外吸収スペクトル：３２９０，１７５２，１７３６，
１６６７，１６０２，１５６２，１４８０，１３７５ｃ
ｍ^-1 紫外可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長
（ε）＝２４１（１０３００），３０８（２５００）ｎ
ｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） １．８０（３Ｈ，ｓ），１．９４（６Ｈ，ｓ），１．９
７（３Ｈ，ｓ），３．７２−３．８２（１Ｈ，ｍ），
３．９０−４．１５（３Ｈ，ｍ），４．８８（１Ｈ，
ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．
３Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３，９．
５Ｈｚ），５．３６（２Ｈ，ｂｒｓ），６．５７（２
Ｈ，ｓ），７．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）

【００１３】このようにして得た２，６−ジクロロ−４
−アミノフェニル−２，３，４，６−テトラアセチル−
β−Ｄ−グルコサミニド１０．０ｇ（１９．７ｍｍｏ
ｌ）をメタノール−アセトニトリル−クロロホルム混液
（容積比１：１：１）６００ｍｌに溶解し、これに２８
％ナトリウムメチラート−メタノール溶液０．７６ｍｌ
（４．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌しながら
反応させた。次いで、冷蔵庫に２時間放置したのち、析
出物を濾取した。この析出物を水−エタノールより再結
晶して、２，６−ジクロロ−４−アミノフェニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド６．２５ｇ（１６．
４ｍｍｏｌ、収率８３％）を得た。 融点：２０５．０〜２０８．０℃ 比旋光度 ［α］（ＭｅＯＨ）：−３７．４° 赤外吸収スペクトル：３２９５，１６３４，１５７１，
１４８０，１３９１ｃｍ^-1 紫外可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長
（ε）＝２４５（９３００），３０８（２３００）ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） １．８２（３Ｈ，ｓ），２．９５−３．２０（２Ｈ，
ｍ），３．３５−３．５０（２Ｈ，ｍ），３．６０−
３．７５（２Ｈ，ｍ），４．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．
６Ｈｚ），４．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），
４．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．９０（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），５．３０（２Ｈ，ｂｒ
ｓ），６．５５（２Ｈ，ｓ），７．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝９．０Ｈｚ）

【００１４】実施例３ ２−クロロ−４−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニドの製造 １−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラア
セチル−α−Ｄ−グルコサミン１８．３ｇ（５０ｍｍｏ
ｌ）をアセトニトリル５００ｍｌに溶解し、これに２−
クロロ−４−ニトロフェノール１７．４ｇ（１００ｍｍ
ｏｌ）及びトリエチルアミン１４０ｍｌ（１ｍｏｌ）を
加え、４０℃で２時間攪拌しながら反応させたのち、ク
ロロホルム２ｌを添加した液を０．１Ｎ水酸化ナトリウ
ム水溶液１ｌで２回、続いて蒸留水２ｌで洗浄し、硫酸
マグネシウムを加えて乾燥させた。次いで、溶媒を留去
したのち、残査をエーテル−クロロホルム混液（容積比
１：１）により結晶化させて、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド１５．２１ｇ（３０．２ｍｍｏｌ、収率
６０％）を得た。 融点：２０６．０〜２０７．０℃ 比旋光度 ［α］（ＭｅＯＨ）：−６５．０° 赤外吸収スペクトル：３３０１，１７４９，１６６７，
１５８６，１５４２，１５２２，１３７６，１３４７ｃ
ｍ^-1 紫外可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長
（ε）＝２０８（１６１００），２８３（９０００）ｎ
ｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） １．７８（３Ｈ，ｓ），１．９６（３Ｈ，ｓ），２．０
１（３Ｈ，ｓ），２．０２（３Ｈ，ｓ），４．０５−
４．２０（４Ｈ，ｍ），４．９８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．
３Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３，９．
３Ｈｚ），５．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），
７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．００（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝９．３，２．７Ｈｚ），８．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．７Ｈｚ）

【００１５】このようにして得た２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド１０．０ｇ（１９．９ｍｍｏｌ）をジ
オキサン−エタノール混液（容積比２：１）６００ｍｌ
に溶解し、これに１０％パラジウム−活性炭素１．０ｇ
を加え、水素ガスを導入しながら、常圧、室温で６時間
攪拌しながら反応させた。次いで、不溶物を濾去したの
ち、溶媒を留去し、残査をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィにより精製し、アセトニトリル−クロロホルム混
液（容積比１：３）で溶出した区分を濃縮して、２−ク
ロロ−４−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニド６．９４ｇ（１４．７ｍｍｏｌ、収率７４
％）を得た。 融点：２０２．０〜２０４．０℃ 比旋光度 ［α］（ＭｅＯＨ）：−５７．３° 赤外吸収スペクトル：３２７４，１７４６，１６５３，
１５０５，１３７２ｃｍ^-1 紫外可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長
（ε）＝２４０（１０３００），３０２（２１００）ｎ
ｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） １．７８（３Ｈ，ｓ），１．９３（３Ｈ，ｓ），１．９
８（３Ｈ，ｓ），２．０２（３Ｈ，ｓ），３．９０−
４．２５（４Ｈ，ｍ），４．８９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．
５Ｈｚ），４．９８（２Ｈ，ｂｒｓ），５．００（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），５．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝１０．３，９．５Ｈｚ），６．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝８．８，２．７Ｈｚ），６．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．７Ｈｚ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈ
ｚ），７．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）

【００１６】このようにして得た２−クロロ−４−アミ
ノフェニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド５．０ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）をメタ
ノール−アセトニトリル−クロロホルム混液（容積比
１：１：１）３００ｍｌに溶解し、これに２８％ナトリ
ウムメチラート−メタノール溶液０．４０ｍｌ（２．１
ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌しながら反応させ
た。次いで、冷蔵庫に２時間放置したのち、析出物を濾
取した。この析出物を水−エタノールより再結晶して、
２−クロロ−４−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニド３．１５ｇ（９．１ｍｍｏｌ、収率
８６％）を得た。 融点：２０９．０〜２１２．０℃ 比旋光度 ［α］（ＭｅＯＨ）：−４８．５° 赤外吸収スペクトル：３３８２，１６３８，１５４１，
１５０５，１３７４ｃｍ^-1 紫外可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長
（ε）＝２３９（９７００），３０２（２２００）ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） １．８１（３Ｈ，ｓ），３．１０−３．８０（６Ｈ，
ｍ），４．４７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．６
８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），４．８５−４．９５
（４Ｈ，ｍ），６．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，
２．７Ｈｚ），６．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈ
ｚ），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．６
６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）

【００１７】実施例４ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法（１） （１）試薬液の調製 実施例１で得た２，６−ジブロモ−４−アミノフェニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド４７．０ｍｇ
（０．１ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフ
ェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン２００ｍ
ｇ及びビリルビンオキシダーゼ２０ｕを取り、５０ｍＭ
クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を加えて全量を１００
ｍｌとして試薬液とした。 （２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調製 市販品の酵素活性既知のＮＡＧａｓｅ［シグマ社製ＮＡ
Ｇａｓｅ（５７．６ｕ／０．５ｍｌ）］を精製水を用い
て、２８．８、５７．６、８６．４、１１５．２及び１
４４．０ｕ／ｌの活性になるように希釈して標品ＮＡＧ
ａｓｅ液とした。 （３）検量線の作成 各濃度の標品ＮＡＧａｓｅ液０．１ｍｌに予め３７℃で
２分間加温した試薬液３．０ｍｌを加えて混合し、３７
℃で２分間加温したのち、２分間の７２０ｎｍにおける
吸光度の変化量を測定した。各標品ＮＡＧａｓｅ液の活
性と、吸光度の変化量の関係により検量線を作成した。
その結果、検量線の式は、 Ｕ＝９．７１×（ΔＡ）×１０²−３．１３ （Ｕ：試料液中の酵素活性ｕ／ｌ、ΔＡ：吸光度変化量
／分）となった。そのグラフを図１に示す。 （４）試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定 試料液０．１ｍｌに予め３７℃で２分間加温した試薬液
３．０ｍｌを加えて混合し、３７℃で２分間加温したの
ち、２分間の７２０ｎｍにおける吸光度の変化量を測定
した。この測定値と（３）で作成した検量線から算出し
て、試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を行うことがで
きる。なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲
（０〜１４４ｕ／ｌ）を越えた場合は、精製水を用いて
相当する倍数の希釈を行った後、再測定を行う。

【００１８】実施例５ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法（２） （１）試薬液の調製 実施例２で得た２，６−ジクロロ−４−アミノフェニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド１１４．４ｍ
ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチル
フェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン１００
ｍｇ及びアスコルビン酸オキシダーゼ１００００ｕを取
り、５０ｍＭＰＩＰＥＳ／ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝
６．０）を加えて全量を１００ｍｌとして試薬液とし
た。 （２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調製、検量線の作成及び試
料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定は、実施例４に記載し
たと同様に行った。その結果、検量線の式は、 Ｕ＝６．６９×（ΔＡ）×１０²＋０．４０ （Ｕ：試料液中の酵素活性ｕ／ｌ、ΔＡ：吸光度変化量
／分）となった。そのグラフを図２に示す。

【００１９】実施例６ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法（３） （１）試薬液の調製 実施例３で得た２−クロロ−４−アミノフェニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド１７３．４ｍｇ
（０．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフ
ェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン１００ｍ
ｇ及びモノフェノールモノオキシゲナーゼ２０００ｕを
取り、１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／塩酸緩衝液（ｐＨ
＝５．５）を加えて全量を１００ｍｌとして試薬液とし
た。 （２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調製、検量線の作成及び試
料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定は、吸光度の測定波長
を７０５ｎｍに設定する以外は、実施例４に記載したと
同様にして行った。その結果、検量線の式は、 Ｕ＝１．９９×（ΔＡ）×１０³−２．３３ （Ｕ：試料液中の酵素活性ｕ／ｌ、ΔＡ：吸光度変化量
／分）となった。そのグラフを図３に示す。

【００２０】実施例７ ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬（１） （１）試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することによ
り、試薬を調製した。 成 分 濃 度 ２，６−ジブロモ−４−アミノフェニル−Ｎ− アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド １．０ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）− Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン ２．０ｍｇ／ｍｌ ビリルビンオキシダーゼ ０．２ｕ／ｍｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０） ５０ｍＭ （２）測定法 試料液０．１ｍｌに予め３７℃で２分間加温した試薬
３．０ｍｌを加えて混合し、３７℃で２分間加温したの
ち、２分間の７２０ｎｍにおける吸光度の変化量を測定
する。この吸光度変化量と予め作成した検量線から算出
して、試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を行うことが
できる。なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範
囲を越えた場合は、精製水を用いて相当する倍数の希釈
を行った後、再測定を行う。

【００２１】実施例８ ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬（２） （１）試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することによ
り、試薬を調製した。 成 分 濃 度 ２，６−ジクロロ−４−アミノフェニル−Ｎ− アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド ３．０ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）− Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン １．０ｍｇ／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ １００ｕ／ｍｌ ＰＩＰＥＳ／ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．０） ５０ｍＭ （２）測定法 実施例７に記載したと同様にして、ＮＡＧａｓｅ活性を
測定することができる。

【００２２】実施例９ ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬（３） （１）試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することによ
り、試薬を調製した。 成 分 濃 度 ２−クロロ−４−アミノフェニル−Ｎ− アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド ５．０ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）− Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン １．０ｍｇ／ｍｌ モノフェノールモノオキシゲナーゼ ２０ｕ／ｍｌ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／塩酸緩衝液（ｐＨ＝５．５） １００ｍＭ （２）測定法 吸光度の測定波長を７０５ｎｍに設定する以外は、実施
例７に記載したと同様にして、ＮＡＧａｓｅ活性を測定
することができる。

【００２３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例４におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定に
用いる検量線を示す図。

【図２】 実施例５におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定に
用いる検量線を示す図。

【図３】 実施例６におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定に
用いる検量線を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山次 信幸 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 山口 賢 東京都中央区入船２−１−１ 協和メデッ クス株式会社内 (72)発明者 多々納 俊雄 東京都中央区入船２−１−１ 協和メデッ クス株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中のＲ¹はハロゲン原子、Ｒ²は水素原子又はハロゲ
   ン原子を意味する。）で表されるＮ−アセチル−β−Ｄ
   −グルコサミン誘導体。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＮ−アセチル−β−Ｄ−
   グルコサミン誘導体を有効成分とするＮ−アセチル−β
   −Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬。
3. 【請求項３】 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
   ーゼ含有試料に、請求項１記載のＮ−アセチル−β−Ｄ
   −グルコサミン誘導体を添加し、酵素反応によって生成
   するハロゲノ−４−アミノフェノール誘導体を酸化酵素
   の共存下、トルイジン誘導体と反応させ、形成される発
   色性化合物を定量することを特徴とするＮ−アセチル−
   β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定法。