JPH0242096A

JPH0242096A - フエノールインドー３’−アザフエニル−β−Ｄ−グルコシド誘導体、その製法及びβ−グルコシダーゼ活性測定用試薬への利用

Info

Publication number: JPH0242096A
Application number: JP19069588A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Tokutake; 昌一徳武
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1988-08-01
Filing date: 1988-08-01
Publication date: 1990-02-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はフェノールインド−３１−アザフェニル−β−
Ｄ−グルコシド誘導体、その製法、β−グルコシダーゼ
活性の測定法及びβ−グルコシダーゼ活性の測定用試薬
に関する。

β−グルコシダーゼは高等植物の葉、根、稲子、菌類、
細菌、動物の臓器等に広く存在し、特に哺乳類の肝、腎
、腸粘膜等のりソゾーム内に局在することが知られてい
る。本酵素の活性測定は食品分析、工業用試験、臨床面
で有用であり、特に臨床面の応用において、リソシーム
のβ−グルコシダーゼの先天性欠損に由来すると言われ
るゴーシュ病あるいは血清中のβ−グルコシダーゼ活性
が上昇すると言われている糖尿病等の診断において意義
が大きい。従来、β−グルコシダーゼ活性の測定用基質
としては、例えばｐ−二トロフェニル−β−〇−グルコ
シドが知られている（　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　８６
．３６１〜３３５　（１９６２）：］。

しかし、前記のｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシ
ドをβ−グルコシダーゼ活性測定用基質として用いる場
合は、生成するｐ−二）。

フェノール（着色物質）を測定する際の波長が約４００
　ｎｍ付近であるため、試料自体の黄色物質による阻害
を受け、したがって測定精度が著しく低下することのほ
か、前記基質より酵素作用によって生成したｐ−ニトロ
フェノールを充分解離させる際、反応液のｐＨを１０〜
１１程度と言う高アルカリ性とするため、酵素反応を停
止させねばならないので、酵素活性の測定を連続的に行
うことが著しく困難となる等の欠点がある。

本発明者／は、従来技術の欠点を改善するため研究を進
めた結果、新規なフエノールインド−３フーアザフエニ
ルーβ−Ｄ−グルコシド誘導体を創製し、この化合物が
β−グルコシダーゼ活性の測定用試薬としてきわめて有
用であることを見出した。

本発明は、次式（式中Ｒは水素原子又はアシル基、ＸｌないしＸ。

は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アジ
ド基、アシル基、スルホン酸基、ニトロソ基、スルホニ
ル基、スルホキシル基、チオシアノ基、インチオシアノ
基、イソニトリル基、イミノ基、アゾ基、ジアゾ基、ア
ルキル基、アリル基又はアリール基を意味し、ｘ４とＸ
、及び／又はｘ６とＸ、は連結して縮合芳香環を形成し
てもよく、またｘ２又はＸ、はそれぞれｘ４又はｘ６と
エーテル結合を形成してもよい）で表わされるフェノー
ルイン）”−３’−７ザフエニルーβ−Ｄ−グルコシド
誘導体である。

式■のフェノールインド−３′−アザフェニル−β−Ｄ
−グルコシド誘導体としては、例えば下記の化合物が挙
げられる。フェノール／インｔドー５７−クロロ−６′
−アザフェニル−β−り一グルコシト、フェノールイン
ド−２’、５’−シクロｏ　’　　３／−アザフェニル
−β−Ｄ−ｆルコシト、フエノールインド−３′−アザ
フェニル−β−り一りルコシド、テトラアセチル−（フ
ェノールインド−５′−クロロ−６′−アザフェニル）
−β−Ｄ−グルコシド、テトラアセチル−（フェノール
インド−２’ｓ　５’　−シクロロー３′−アザフェニ
ル）−β−Ｄ−グルコシド、テトラアセチル−（フェノ
ールインド−ｓ／−アザフェニル）−β−Ｄ−グルコシ
ド、テトラアセチル−（２，５−ジメチル−フェノール
インド−３′−アザフェニル）−β−Ｄ−クルコシド、
テトラアセチル−（１−ｆフトールイン）’−３’−ア
ザフェニル）−β−Ｄ−グルコシドなど。

式Ｉのフエノールインド−３′−アザフェニル−β−Ｄ
−グルコシド誘導体は、次式り製造することができる。

化合物■は、どのような方法で合成してもよ〜・が、例
えば公知化合物であるテトラアセチル−α−Ｄ−ｆルコ
シルプロマイトニ、次式（式中Ｒ、Ｘ＋　、Ｘｌ及びＸ
、は前記の意味を有する）で表わされる５−アミノ−２
−ピリジニルオキシ−β−Ｄ−グルコシド誘導体に、次
式（’ｘ＋ないしＸ、は前記の意味を有する）で表わさ
れる２−ハイドロキシ−５−二トロビリジン誘導体を酸
化銀等の触媒の存在下に作用させ（Ｋｏｅｎｉｇｓ　−
Ｋｎｏｒｒ法）、次式（式中Ｘ、ないしｘ７は前記の意
味を有する）で表わされるキノン誘導体を作用させるこ
とによＲ（式中Ｒ，Ｘ、ないしＸ、は前記の意味を有する）で表
わされる５−ニトロ−２−ピリジニルオキシーβ−Ｄ−
グルコシド誘導体に得たのち、これを原料として、常法
に従って例えばラネーニッケルを触媒に用い接触還元に
よってニトロ基なアミン基に変換させることにより化合
物■を合成することができる（　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｈ
ｅｍ、　３８巻３６３頁１９６０年）。

化合物■としては例えば５−アミノ−２−ピリジニルオ
キシ−β−Ｄ−グルコシド、テトラアセチル−（５−ア
ミノ−６−クロロ−２−ピリジニルオキシ）−β−Ｄ−
グルコシド、５−アミノ−３，４−ジクロロ−２−ピリ
ジニルオキシ−β−Ｄ−グルコシド、５−アミノ−６−
ブロモ−２−ピリジニルオキシ−β−Ｄ　−’ｆルコシ
ド、５−アミノ−３，６−ジフルオロ−２−ピリジニル
オキシ−β−Ｄ−グルコシド、テトラクロロアセチル−
（５−アミノ−６−ヨード−２−ピリジニルオキシ）−
β−Ｄ−グルコシド等が挙げられる。

化合物■としては例えばｐ−キノン、２−クロロ−ｐ−
キノン、２，６−ジクロロ−ｐ−キノン、２，５−ジメ
チル−ｐ−キノン、２．５，５，６−テトラクロロ−ｐ
−キノン（クロラニル）、１．４−ナフトキノン、アン
スラキノン等が挙げられる。

目的物質である化合物Ｉを製造するに際しては、化合物
■を無水条件下で、中性有機溶媒に溶解し、中性脱水剤
を共存させ、触媒量の強酸を加えたのち、化合物■を作
用させることが好ましい。

化合物■の使用量は、化合物Ｈの１０〜５０倍モル当量
好ましくは１５〜２５倍モル当量である。

中性有機溶媒としては、エーテル類例えばジエチルエー
テル、ＴＨＦ　、ジオキサン等、炭化水素類例エバノル
マルヘキサン、ベンゼン、トルエン等、ハロゲン化炭化
水素類例えばジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロ
エタン、四塩化炭素等、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
　）、ジメチルアセトアミド（’ＤＭＡ　）　、ヘキサ
ホスホラミド（ＨＭＰＡ　）、ジメチルスルホキー／ド
（ＤＭＳＯ）などが挙げられ、これらを組み合わせて用
いてもよい。Ｒが水素原子である化合物■の場合は、溶
媒としてはジオキサン、ＤＭＦなどが好ましく、Ｒがア
シル基である化合物Ｈの場合は、ジクロロメタン、トル
エンなどが好ましい。溶媒の量は、化合物■の重量の１
０〜１００倍程度好ましくは４０〜６０倍である。

中性脱水剤としてはモレキュラシープ、Ａ１□０１．５
１０２、無水Ｎａ２ＳＯ４ｓ無水ＭｇＳＯ４等が挙げら
れ、これらを組み合わせて用いてもよい。その量は、化
合物■の重量の０．５〜５倍好ましくは０．８〜１．５
倍である。強酸としてはトリフルオロ酢酸、トリクロロ
酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、発
煙硫酸、ＡＩ　Ｃ１３、ＢＦ、／Ｅｔ２ｏ。

ＴｉＣｌ４、ＦｅＣｌ３等が挙げられ、これらを組み合
わせて用いてもよい。その量は化合物■の０．０１〜０
．１倍モル当量好ましくは０．０２〜０．０４倍モル当
量である。

反応温度及び反応時間は、化合物■、化合物■、溶媒及
び強酸の種類によって異なるが、通常反応温度は１５〜
２５℃であり、０．５〜４時間反応を継続して行うこと
により反応は終了する。

Ｒが水素原子である化合物Ｉは、β−グルコシダーゼ活
性の測定に用いることができる。

したがって本発明は、次式（式中Ｘ１ないしｘ７は前記の意味を有する）で表わさ
れるフェノールインド−３′−アザフェニル−β−〇−
グルコシド誘導体及び緩衝剤を含有するβ−グルコシダ
ーゼ活性の測定用試薬である。

定量のための有利な系は１〜２０　ｍＭのフェノールイ
ン）”−３’−アザフェニル−β−Ｄ−グルコシド誘導
体及び２〜１００　ｍＭの緩衝剤を含有する系である（
ｐＨ４〜１０）。緩衝剤としては、リン酸塩、酢酸塩、
炭酸塩、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル酸塩等が用
いられる。また必要に応じて溶解補助剤、安定化剤とし
てグリセリン、牛血清アルブミン、トリトンＸ１００等
を加えてもよい。

本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した形で存在して
よく、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙等に含
浸されていてもよい。本試薬を用いることにより、各種
の試料に含有されるβ−グルコシダーゼの活性を、簡単
な操作で正確に、しかも高感度で測定することができる
。

次ニ、本発明のβ−グルコシダーゼ活性の測定法につい
て説明する。

まずβ−グルコシダーゼを含む試料に、フェノールイン
）”−３’−アザフェニル−β−Ｄ　−４”ルコシド誘
導体（■′）を１〜２０　ｍＭ、好ましくは２〜６　ｍ
Ｍ程度加え、更に緩衝剤を加え、３０〜６０℃、ｐＨ４
〜１０好ましくはｐＥ（６〜８で６分間以上、好ましく
は５〜１２０分間酵素反応させ、生成する青色色素（フ
ェノールインド−３′−アザフェノール誘導体）を５８
５〜６．５０ｎｍ１好ましくは６００〜６２０　ｔａｎ
の吸収波長で、連続的もしくは断続的に吸光度値を測定
し、あらかじめ測定したβ−グルコシダーゼ標品の吸光
度値と対比させて試料中のβ−グルコシダーゼ活性を算
出する。

本発明に用いられるβ−グルコシダーゼ含有試料として
は、β−グルコシダーゼを含有するものであれば何れを
用いてもよく、具体的には微生物の培養液、植物の抽出
液、動物の体液、組織及びそれらの抽出液等が挙げられ
る。

また緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩
、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ホウ
酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル酸塩等が挙げられ
る。

本発明の測定法によれば、試料に含まれる例エバグルコ
ース、ビリルビン、ヘモグロビン等の影響を受けること
なく、簡易に、β−グルコシダーゼ活性を自動分析法、
用手法゛等により精度良く測定することができる。

実施例１テトラアセチル（フエノールインド−３′−アザフェニ
ル）−β−Ｄ−グルコシドの製造＋１）　　テトラアセ
チル−α−Ｄ−グルコシルブロマイド３．４６　、！ｉ
’　（８，４２ｍＭ）をアセトニトリル１５０ｍＡ！に
溶解し、２−ハイドロキシ−５−ニトロピリジン４．５
６７！　（３２，６ｍＭ）及びトリエチルアミｙ３．２
９．！ｉ’（３２，６ｍＭ）を加え、３５°Ｃで１５時
間攪拌しながら反応させた。反応終了後、アセトニトリ
ルを留去し、残有をシリカゲルクロマトグラフィにより
精製し、メタノール−ジクロロメタン混液（容量比１　
二９９）で溶出した目的区分を濃縮し、メタノール−水
から再結晶すると、テトラアセチル−（５−ニトロ−２
−ピリジニルオキシ）−β−Ｄ−グルコシドが１．２２
　、！ｌｉ＋　（２，５６ｍＭ、　　６０．４％）得ら
れる。

融点：１４５．５〜１４６．５°Ｃ紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長〔λｍａ
ｘ　）　（ｎｍ）　＝２０７，２８２赤外線吸収スペク
トル（ｍ−リ：１７４６．１６０６．１５８２．１５２
４．１４７２．１６８２．１６５０．１３０６．１２１
８．１０７６．１０３４．９０４．８４２．７６８．６
９４核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＦＩＺ）（アグリコン
部分のみ）　ｐｐｆｆｉ：　（ＣＤＣｌ２）９、０７　
（Ｉ　Ｈ，ｄ、　Ｊ　＝２．７Ｈｚ）、８．４４　（Ｉ
　Ｈ，ｄｄ、　Ｊ　＝９．０Ｈｚ、　２．７Ｈｚ）、６
．９５　（Ｉ　ＨＳａ、　Ｊ　＝９．０Ｈｚ）シリカゲ
ル薄層クロマトグラフィ（展開溶媒：メタノール／ジク
ロロメタン＝　２　：　８　）　：Ｒｆ＝０．２６（２
）　　（１）で得たテトラアセチル−（５−ニトロ−２
−ピリジニルオキシ）−β−Ｄ−グルコシド６５８　＝
９　（１，４０ｍＭ）を１，４−ジオキサン６０ｍ１に
溶解し、１０％パラジウム−カーボン１６３　＝９を加
え、常圧下に水素ガスを導入しながら室温で２４時間、
強攪拌下反応させた。次いで、パラジウム−カーボンを
戸別し、ν液の１，４−ジオキサンを留去したのち、シ
リカゲルクロマトグラフィにより精製し、メタノール−
ジクロロメタン混液（容量比２：９８）で溶出した目的
区分を濃縮し、メタノールから再結晶すると、テトラア
セチル−（５−アミノ−２−ピリジニルオキシ）−β−
Ｄ−グルコシドが５７２ｍ９（１，３０ｍＭ、９２．９
％）得られる。

融点：　１８５．５〜１８６．５°Ｃ（分解）紫外部・
可視部吸収スペクトル：吸収極大波長〔帖ａｘ：］（ｎ
ｍ）　＝２０４．２６２．３０７赤外線吸収スペクトル
（Ｃｍ″）：３３９０．６６６０．１７５２．１６２４
．１５８６．１４９０．１４２２．１６７０．１２３０
．１０６６．９０６．８２８、核磁気共鳴スペクトル（
２００ＭＨｚ）（アグリコン部分のみ）　ｐｐＩｌ：　
　（ＤＭｓｏ−ａ、）７、６２　（Ｉ　Ｈ，ｄｄ、　Ｊ
　＝２．９Ｈｚ、　０．５Ｈｚ）、７、０３　（Ｉ　Ｈ
，ｄｄ、　Ｊ　＝８．５Ｈｚ、２．９Ｈｚ）、６．６５
　（Ｉ　Ｈｌｄｄ、　Ｊ　＝８．５に、　０．５Ｈｚ）
シリカゲル薄層クロマトグラフィ（展開溶媒：メタノー
ル／ジクロロメタン＝　５　：　９７）　：Ｒ，＝０．
２１（３）ｐ−ベンゾキノン１４０ｇ（１３，０ｍＭ）
を１゜４−ジオキサン’１５ｍ１に溶解し、さらにトリ
フルオロ酢酸Ｑ、　２ｒａｔ及びモレキュラシープ（４
Ａ）（和光紬薬社製）ｓ、ｏ、７を加え、混和してお（
。

これに実施例１（２）で得たテトラアセチル−（５−ア
ミノ−２−ピリジニルオキシ）−β−Ｄ−グルコシド５
７２ｍ９（１，３０ｍＭ）を加え、室温で４．５時間攪
拌しながら反応させる。次いで反応液に無水炭酸カリウ
ムを反応液の液性が中性になるまで加えたのち、この炭
酸カリウムを戸別し、涙液の１，４−ジ′オキサンを留
去する。この残有をシリカゲルクロマトグラフィにより
精製し、メタノール−ジクロロメタン混液（容量比２　
：　９８　）で溶出した目的区分をメタノールから再結
晶すると、テトラアセチル−（フェノールインド−３’
−アザフェニル）−β−Ｄ−４ルコシドが５２３ｍ９（
０，９８７ｍＭ、　７０．５％）得られる。

融点：１７６．５〜１７８．５°Ｃ紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長〔λｍａ
ｘ〕（ｎｍ）　＝２２２　（ｓｈ）、２５８．２８８．
４４８赤外線吸収スペクト＃　（Ｃｒｎ′″″１）　：
　ｔ　７４８．１６４０．１５８２．１４７０．１６６
６．１２６０．１０６２．１０６２．９０４．８７０．
８３０．５９８核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨ２）
（アグリコン部分のみ）ｐ四：　（ＣＤ３ｏＤ）７、７４　（Ｉ　Ｈ，ｄ、　Ｊ＝２．７Ｈｚ）、７、６
４　（Ｉ　ＨＳｄｄ、　Ｊ　＝８．４ｆ（ｚ、　２．７
Ｈｚ）、７、５０　（Ｉ　ＨＳｄｄ、　Ｊ　＝ｆ　Ｏ，
ＯＨｚ、　２．７Ｈｚ）、７、１４　（Ｉ　Ｈ，ｄｄ、
　Ｊ＝１０．５Ｈｚ１２．７Ｈｚ）、６．９１　（Ｉ　
Ｈ，ｄ、　Ｊ＝８．４Ｈｚ）、６．７１　（Ｉ　Ｈ，ｄ
ｄ、　Ｊ　＝１０．０Ｈｚ、　２．２Ｈｚ）、６．６０
　（Ｉ　Ｈ，ｄｄ、　Ｊ　＝１０．３Ｈｚ、２．５　Ｈ
ｚ　）シリカゲル薄層クロマトグラフィ（展開溶媒：メ
タノール／ジクロロメタン＝　３　：　９７　）　：Ｒ
，＝０．５０実施例２ｐ−ベンゾキノン１９．０＆　（１７６ｍＭ）を１．４
−ジオキサン１００ｍ１に溶解し、さらにトリフルオロ
酢酸０．５　ｍｌ及びモレキュラシープ（４Ａ）１９０
ｇを加え、混和してお（。これに実施例１（２）で得た
テトラアセチル−（５−アミノ−２−ピリジニルオキシ
）−β−Ｄ−１”ルコシドを無水炭酸カリウム−無水メ
タノールを用いて脱アセチル化して得た５−アミノ−２
−ピリジニルオキシ−β−Ｄ−グルコシド２．４７９（
８，８２ｍＭ　）を加え、室温下３時間攪拌しながら反
応させる。この反応液をそのままシリカゲルクロマトグ
ラフィにより精製し、メタノール−ジクロロメタン混液
（容量比１：４）で溶出した目的区分を濃縮し、メタノ
ールから再結晶すると、フェノールインド−３′−アザ
フェニル−β−り一グルコシドが２．０７　ｇ（５，７
２ｍＭ、　６４．８％）得られる。

融点：１１７．Ｏ〜１２３．０℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長〔λｍａ
ｘ　：］（ｎｍ）＝２２２．２６８．２８７（ｓｈ）、
赤外線吸収スペクトル（ｃ１′ｎ−り：３３９０．１６
３８．１５８２．１４７０．１３７２．１２７０．１０
６６．８６６．８６０核磁気共鳴スペクトル（２ｏｏＭＨ２）（アグリコン部
分のみ）解：　　（ＤＭＳＯ−ｄ、）７．８６　（Ｉ　Ｈ，ｄ、　Ｊ　＝２．２Ｈｚ、）、７
、５２　（Ｉ　Ｈ，ｄｄ、　Ｊ　＝８．８Ｈｚ、２．２
　Ｈｚ　）、７、３８　（Ｉ　Ｈ，ｄｄｌＪ　＝１０．
０Ｈｚ、　２．４Ｈｚ）、７、２２　（Ｉ　Ｈｌｄｄ、
　Ｊ　＝＝１０．４Ｈｚ、　２．４Ｈｚ）、６．９８　
（Ｉ　Ｈ，ａ、　Ｊ　＝８．８Ｈｚ）、６．７５　（Ｉ
　Ｈ，ｄｄ、　Ｊ　＝１０．０Ｈｚ、　２．１Ｈｚ）、
６．６３　（Ｉ　Ｈ，ｄｃｌ、　Ｊ＝Ｉ　Ｏ，４Ｈｚ、
２．１Ｈｚ）シリカゲル薄層クロマトグラフィ（展開溶
媒二メタ、／−ル／ジクロロメタン＝１＝４）：Ｒｆ＝
０．４５なお、このフエノールインド−３′−アザフェ
ニル−β−Ｄ−グルコシドは実施例１（３）で得られた
テトラアセチル−（フエノールインド−３′−７ｆフエ
ニル）−β−Ｄ−グルコシドヲ無水炭酸カリウム−無水
メタノールを用いて脱アセチル化しても得ることができ
る（７２．９％）。

実施例３ β−グルコシダーゼ活性の測定法Ａ（ｅｎｄｏ−ｐａ　
ｉｎ　を法）（１）基質液の調製フエノールインド−３１−アザフェニル−β−Ｄ−グル
コシド５　ｍＭをとり、１０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
＝６．０）を加えて全量を１−ｅとして基質液とする。

（２）標品β−グルコシダーゼ液の調製市販のアーモン
ド由来のβ−グルコシダーゼを０．０５％ウシ血清アル
ブミン含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）に加
え、それぞれ０．１．２．６．４及び５１１９／４３の
濃度に溶解して標品β−グルコシダーゼ液とする。

（６）試料液の調製 β−グルコシダーゼ活性測定用試料１０〜を精密に秤量
し、０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０　ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）を加えて全量を１００ｍ１と
して試料液とする。

（４）検量線の作成基質液１Ｔｎｌに各濃度の標品β−グルコシダーゼ液０
．５　ｍｌを加え、３７℃で１５分間加温する。

これに２００　ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液２　ｍｌをと
吸光度の関係より検量線を作成する。

東洋紡社製β−グルコシダーゼ（１２，Ｏｕ／ｍ９）を
使用した場合、検量線の式はσ＝９５．５・Ａ　−３６
，７４（Ｕ　：酵素活性ｕ〃、Ａ：吸光度）となる。そ
のグラフを第１図に示す。

（５）試料液中のβ−グルコシダーゼ活性の測定基質液
１ｒｎｌに試料液０．５　ｍＡ’を加え、６７℃で１５
分間加温する。これに２００　ｍＭ炭酸ナトリウム水溶
液２ｍｌを加え、ただちに６１０　ｎｍにおける吸光度
を測定する。こ・の吸光度の値と（４）で作成した検量
線から算出して試料液中のβ−グルコシダーゼ活性の測
定を行うことができる。

なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲（０〜
６０　ｕ７１３　）を越えた場合は０．０５％ウシ血清
アルブミン含有１０　ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ＝　６
．０　）を用いて相当する倍数の希釈を行ったのち、再
測定を行う。

実施例４ β−グルコシダーゼ活性の測定法Ｂ（ｒａｔｅ−ａｓｓ
ａｙ法）（１）基質液の調製フエノールインド−３フーアザフエニルーβ−Ｄ−グル
コシド５　ｍＭをとり、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝
　７．０　）を加えて全量を１沼として基質液とする。

（２）標品β−グルコシダーゼ液の調製市販のアーモン
ド由来のβ−グルコシダーゼを０．０５％ウシ血清アル
ブミン含有１０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に
加え、０．１．２．３．５．１０ｍ９μの濃度に溶解し
て標品β−グルコシダーゼ液とする。

（３）試料液の調製 β−グルコシダーゼ活性測定用試料１０■を精密に秤量
し、０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０　ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を加えて全量を１ｏｏｍｌと
して試料液とする。

（４）検量線の作成基質液１ｍｌを６７°Ｃで６分間加温したのち、各濃度
の標品β−グルコシダーゼ液０．５　ｍｌを加え、６７
℃で２．５分間加温後からの１分間の６１０　ｎｍにお
ける吸光度の変化量を測定する。

このときの標品β−グルコシダーゼ液液性性吸光度の変
化量の関係より検量線を作成する。

東洋紡社製β−グルコシダーゼ（１２，０ｕ／ｍ９　）
を使用した場合、検量線の式はＵ＝１７．ＩＦ・（△Ａ
）×１０３（Ｕ二酵素活性ｕ　／４３、△Ａ：吸光吸光
度変化量／色なるそのグラフを第２図に示す。

（５）試料液中のβ−グルコシダーゼ活性の測定基質液
’ｌ　ｒｎｌを６７℃で３分間加温したのち、試料液１
　ｍｌを加え、６７°Ｃで２．５分間加温後からの１分
間の６１０　ｎｍにおける吸光度の変化量を測定する。

この吸光度変化量と（４）で作成した検量線から算出し
て試料液中のβ−グルコシダーゼ活性の測定を行うこと
ができる。

なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲（０〜
１２０ｕ／、、ｇ）を越えた場合は０゜０５％ウシ血清
アルブミン含有１０　ｍＭ　リン酸緩衝液（Ｉ）Ｈ＝７
．ＣＩ）を用いて相当する倍数の希釈を行ったのち、再
測定を行う。

実施例５測定用試薬（１）試薬の組成含有物試薬Ａ：フェノールインドー６′−アザフェニル−β−
Ｄ−グルコシドリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．ｏ　）精製水試薬Ｂ：炭酸ナトリウム精製水濃度５．０ｍＭ１０．０ｍＭ２００　ｍＭ試薬Ｃ：ウシ血清アルブミン０．０５％リン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０　）１０．０ｍＭ精製水（２）測定法まず、測定用試料１０ｍ９を精密に秤量し、試薬Ｃを加
えて全量を１００ｍ１とし、これを試料液とする。次い
で試薬Ａ　ｊ　ｍｅに試料液Ｊ’　０．５　ｒｎｌを加
え、６７°Ｃで１５分間加温する。これに試薬Ｂを２　
ｍｌ加え、ただちに６１０　ｎｍにおける吸光度を測定
する。この吸光度の値とあらかじめ作成した検量線から
算出して試料液中のβ−グルコシダーゼ活性の測定を行
うことができる。

なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲を越え
た場合は試薬Ｃを用いて相当する倍数の希釈を行ったの
ち、再測定を行う。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３におけるβ−グルコシダーゼ活性と生
成する青色色素の波長６１０ｎｍにおける吸光度の関係
を示すグラフ、第２図は実施例４におゆるβ−グルコシ
ダーゼ活性と生成する青色色素の波長６１０ｎｍにおけ
る吸光度の変化量の関係を示すグラフであって、図中の
直線はそれぞれの検量線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）（式中Ｒは水素原子又はアシル基、Ｘ＿１ないしＸ＿７
は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アジ
ド基、アシル基、スルホン酸基、ニトロソ基、スルホニ
ル基、スルホキシル基、チオシアノ基、イソチオシアノ
基、イソニトリル基、イミノ基、アゾ基、ジアゾ基、ア
ルキル基、アリル基又はアリール基を意味し、Ｘ＿４と
Ｘ＿５及び／又はＸ＿６とＸ＿７は連結して縮合芳香環
を形成してもよく、またＸ＿２又はＸ＿３はそれぞれＸ
＿４又はＸ＿６とエーテル結合を形成してもよい）で表
わされるフエノールインド−３′−アザフェニル−β−
Ｄ−グルコシド誘導体。２、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II）（式中Ｒ、Ｘ＿１、Ｘ＿２及びＸ＿３は後記の意味を有
する）で表わされる５−アミノ−２−ピリジニルオキシ
−β−Ｄ−グルコシド誘導体に、次式▲数式、化学式、
表等があります▼（III）（式中Ｘ＿４ないしＸ＿７は後記の意味を有する）で表
わされるキノン誘導体を作用させることを特徴とする、
次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）（式中Ｒは水素原子又はアシル基、Ｘ＿１ないしＸ＿７
は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アジ
ド基、アシル基、スルホン酸基、ニトロソ基、スルホニ
ル基、スルホキシル基、チオシアノ基、イソチオシアノ
基、イソニトリル基、イミノ基、アゾ基、ジアゾ基、ア
ルキル基、アリル基又はアリール基を意味し、Ｘ＿４Ｘ
＿５及び／又はＸ＿６とＸ＿７は連結して縮合芳香環を
形成してもよく、またＸ＿２又はＸ＿３はそれぞれＸ＿
４又はＸ＿６とエーテル結合を形成してもよい）で表わ
されるフエノールインド−３′−アザフェニル−β−Ｄ
−グルコシド誘導体の製法。３、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ′）（式中Ｘ＿１ないしＸ＿７は水素原子、ハロゲン原子、
ニトロ基、シアノ基、アジド基、アシル基、スルホン酸
基、ニトロソ基、スルホニル基、スルホキシル基、チオ
シアノ基、イソチオシアノ基、イソニトリル基、イミノ
基、アゾ基、ジアゾ基、アルキル基、アリル基又はアリ
ール基を意味し、Ｘ＿４とＸ＿５及び／又はＸ＿６とＸ
＿７は連結して縮合芳香環を形成してもよく、またＸ＿
２及びＸ＿３はＸ＿４及びＸ＿５とエーテル結合を形成
してもよい）で表わされるフエノールインド−３′−ア
ザフェニル−β−Ｄ−グルコシド誘導体を有効成分とす
るβ−グルコシダーゼ活性の測定用試薬。４、β−グルコシダーゼ含有試料に、第３請求項に記載
のフエノールインド−３′−アザフェニル−β−グルコ
シド誘導体（ I ′）を加え、酵素反応によつて生成す
る青色色素を５８５〜６５０ｎｍの波長で測定すること
を特徴とする、β−グルコシダーゼ活性の測定法。