JPH06179690A - フコース誘導体、その製造方法、このものを有効成分とするα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式 【化１】 で表わされるα−Ｌ−フコース誘導体、テトラ−Ｏ−ア
セチル−Ｌ−フコースと４−ニトロフェノ−ル誘導体を
反応させたのち、脱アセチル化する前記一般式の化合物
の製造方法、これを有効成分とするα−Ｌ−フコシダー
ゼ活性測定用試薬及びα−Ｌ−フコシダーゼ含有試料
に、前記一般式の化合物を添加して酵素反応を行わせ、
遊離する４−ニトロフェノ−ル誘導体を定量してα−Ｌ
−フコシダーゼ活性を測定する方法である。 【効果】 前記一般式の化合物は新規なものであって、
α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬として極めて有用
で、これを用いることにより、α−Ｌ−フコシダーゼ活
性をレイトアッセイ法で効率よく、正確かつ容易に測定
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なα−Ｌ−フコー
ス誘導体、その製造方法、このものを有効成分とするα
−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬及び該誘導体を用い
てα−Ｌ−フコシダーゼ活性をレイトアッセイ法で効率
よく、かつ正確に測定する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】α−Ｌ−フコシダーゼ（ＥＣ３．２．
１．５１）は糖蛋白質の一種であるフコプロテインの異
化に関与するリソソーマル酵素である。そして血清α−
Ｌ−フコシダーゼ活性は肝疾患において有意に上昇する
ことが報告されており、最近、肝細胞癌のマーカーとし
て注目されている。従来、α−Ｌ−フコシダーゼ活性の
測定用基質としては、例えばｐ−ニトロフェニル−α−
Ｌ−フコシドが知られている[Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉ
ｍｉｃａＡｃｔａ，７３，３２１−３２７（１９７
６）、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，７
３，３２９−３４６（１９７６）］。

【０００３】しかしながら、該化合物をα−Ｌ−フコシ
ダーゼ活性の測定用基質として用いる場合は、いわゆる
エンドポイント法しか適用できない。すなわち、酵素活
性を測定するに際しては、先ず該酵素の至適ｐＨ５〜６
で酵素反応を行わせ、次いで、反応液のｐＨを遊離した
ｐ−ニトロフェノールの発色定量に適する１０程度の強
アルカリ性にする必要があるために、酵素反応を停止さ
せなければならない。したがって、このような基質で
は、酵素活性測定法として最適である酵素反応進行中に
直接吸光度変化を計測するレイトアッセイ法を採用する
ことができないという欠点がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定用試薬及びそれ
を用いる測定方法が有する欠点を克服し、α−Ｌ−フコ
シダーゼ活性をレイトアッセイ法で効率よく、かつ正確
に測定し得る試薬として好適な新規化合物を提供すると
ともに、これを試薬とした新規なα−Ｌ−フコシダーゼ
活性の測定方法を提供することを目的としてなされたも
のである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、α−Ｌ−フコ
シダーゼ活性測定用試薬として、特定の新規なα−Ｌ−
フコース誘導体が極めて好適であり、これを用いてα−
Ｌ−フコシダーゼ活性を測定することにより、その目的
を達成し得ることを見出し、この知見に基づいて本発明
を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、一般式

【化４】 （式中のＲはハロゲン原子又はニトロ基である）で表わ
されるα−Ｌ−フコース誘導体、一般式

【化５】 （式中のＡｃはアセチル基である）で表わされるテトラ
−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコースと、一般式

【化６】 （式中のＲはハロゲン原子又はニトロ基である）で表わ
される４−ニトロフェノール誘導体を反応させたのち、
脱アセチル化することを特徴とする一般式（Ｉ）で表わ
されるα−Ｌ−フコース誘導体の製造方法、一般式
（Ｉ）の化合物を有効成分とするα−Ｌ−フコシダーゼ
活性測定用試薬、及びα−Ｌ−フコシダーゼ含有試料
に、一般式（Ｉ）の化合物を添加して酵素反応を行わ
せ、遊離する４−ニトロフェノール誘導体を定量するこ
とを特徴とするα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法を
提供するものである。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるα−Ｌ−フコース
誘導体において、Ｒはハロゲン原子（塩素、フッ素、臭
素若しくはヨウ素原子）又はニトロ基である。このよう
な前記一般式（Ｉ）で表わされるα−Ｌ−フコース誘導
体としては、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル−
α−Ｌ−フコシド、２−フルオロ−４−ニトロフェニル
−α−Ｌ−フコシド、２−ブロモ−４−ニトロフェニル
−α−Ｌ−フコシド、２−ヨード−４−ニトロフェニル
−α−Ｌ−フコシド、２，４−ジニトロフェニル−α−
Ｌ−フコシドなどが挙げられるが、中でも特に、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドが好適で
ある。

【０００８】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるα
−Ｌ−フコース誘導体は、前記一般式（ＩＩ）で表わさ
れるテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコースと、一般式
（ＩＩＩ）で表わされる４−ニトロフェノール誘導体を
溶融条件下で縮合反応させたのち、脱アセチル化するこ
とにより製造することができる。前記一般式（ＩＩ）で
表わされるテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコースはα−
アノマー、β−アノマー、これらの混合物のいずれでも
よく、また該化合物としては市販品を用いてもよいし、
あるいは常法によりＬ−フコースを無水酢酸及びピリジ
ンを用いてアセチル化して得たもの［Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．，８０，４３３−４３５（１９６１）］などを用い
てもよい。

【０００９】また、前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる
４−ニトロフェノール誘導体において、Ｒはハロゲン原
子（塩素、フッ素、臭素若しくはヨウ素原子）又はニト
ロ基である。このような前記一般式（ＩＩＩ）で表わさ
れる４−ニトロフェノール誘導体としては、例えば２−
クロロ−４−ニトロフェノール、２−フルオロ−４−ニ
トロフェノール、２−ブロモ−４−ニトロフェノール、
２−ヨード−４−ニトロフェノール、２，４−ジニトロ
フェノールなどが挙げられる。そして、前記一般式（Ｉ
ＩＩ）で表わされる４−ニトロフェノール誘導体は、市
販品を用いてもよく、あるいは適宜の方法で製造して得
たものを用いてもよい。前記一般式（ＩＩＩ）で表わさ
れる４−ニトロフェノール誘導体の添加量は、通常、前
記一般式（ＩＩ）で表わされるテトラ−Ｏ−アセチル−
Ｌ−フコースの１〜１００倍モル当量、好ましくは５〜
２０倍モル当量である。

【００１０】このときの溶融条件としては、通常１００
〜１５０℃である。またこの縮合反応は、通常、例えば
塩化亜鉛、臭化亜鉛、塩化アルミニウム、硫酸、トルエ
ンスルホン酸など、好ましくは塩化亜鉛又は臭化亜鉛の
存在下、反応系を減圧にしながら行われる。この触媒の
添加量は、前記一般式（ＩＩ）で表わされるテトラ−Ｏ
−アセチル−Ｌ−フコースの０．５〜１０倍モル当量、
特に１〜２倍モル当量が好適である。また、この反応系
に少量の酢酸−無水酢酸混液の添加を行ってもよい。縮
合反応時間は、５〜１２０分間、好ましくは５〜３０分
間である。

【００１１】このようにして得られた一般式

【化７】 （式中のＡｃ及びＲは前記と同じ意味をもつ）で表わさ
れるトリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコース誘導体の粗
生成物又はこれを適宜の方法で精製したものに塩基を作
用させてアセチル基を脱離させることにより、前記一般
式（Ｉ）で表わされるα−Ｌ−フコース誘導体が得られ
る。塩基としては、例えばＫＯＨ、Ｋ₂ＣＯ₃、ＮａＯ
Ｈ、Ｎａ₂ＣＯ₃などのアルカリ金属塩、例えばナトリウ
ムメチラート、ナトリウムフェノラートなどのアルカリ
金属のアルコラート、アンモニアなどが挙げられ、ナト
リウムメチラートが特に好ましい。この塩基の添加量
は、通常、前記一般式（ＩＶ）で表わされるトリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｌ−フコース誘導体の０．０１〜５倍モ
ル当量である。また、この脱アセチル化反応の条件は常
法に従えばよく、例えば０〜１００℃で、１０〜１２０
分間である。

【００１２】次いで、このようにして得られたものを常
法により精製して前記一般式（Ｉ）で表わされる目的化
合物を得ることができる。精製法としては、例えば適宜
の有機溶媒などを用いる析出法、シリカゲルあるいはオ
クタデシルシリルシリカゲル（ＯＤＳ）などを用いるカ
ラムクロマトグラフィなどが挙げられる。

【００１３】以上のようにして得られた前記一般式
（Ｉ）で表わされるα−Ｌ−フコース誘導体は、α−Ｌ
−フコシダーゼ活性の測定に極めて有用であり、この化
合物を用いてα−Ｌ−フコシダーゼ活性をレイトアッセ
イ法により高感度、高精度で測定することができる。α
−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定するための有利な系とし
ては、例えば前記一般式（Ｉ）で表わされるα−Ｌ−フ
コース誘導体を１〜２０ｍＭ及び緩衝剤を０．０５〜１
Ｍ含有する系（ｐＨ５．０〜６．０）などが挙げられ
る。この系に用いられる緩衝剤としては、例えば燐酸
塩、酢酸塩、クエン酸塩などが挙げられる。また必要に
応じて溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、発色促進剤とし
て、例えばトリトンＸ−１００などの各種界面活性化
剤、クラウンエーテル類、シクロデキストリン類、グラ
イコール類、塩化ナトリウム、アジ化ナトリウムなどを
適宜添加することができる。本発明の試薬は、乾燥物あ
るいは溶解した形で用いてもよく、薄膜状の担体、例え
ばシート、含浸性の紙などに含浸させて用いてもよい。
このような本発明の試薬を用いることにより、各種の試
料に含有されるα−Ｌ−フコシダーゼ活性を簡単な操作
でレイトアッセイ法により正確に、かつ高感度で測定す
ることができる。

【００１４】次に、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼ活性
の測定法の好適な１例について説明する。先ず、α−Ｌ
−フコシダーゼを含む試料に、前記一般式（Ｉ）で表わ
されるα−Ｌ−フコース誘導体を１〜２０ｍＭ、好まし
くは２〜５ｍＭ及び緩衝剤を添加したのち、２０〜６０
℃、ｐＨ５．０〜６．０の条件にて１分以上、好ましく
は３〜１０分間酵素反応させ、遊離（生成）する発色性
化合物の４−ニトロフェノール誘導体［前記一般式（Ｉ
ＩＩ）で表わされる化合物］の吸光度を直接分光光度計
を用いて測定し、単位時間当りの吸光度の変化量を求め
る。そしてあらかじめ同様にして測定したα−Ｌ−フコ
シダーゼ標品の吸光度変化量と対比させて試料中のα−
Ｌ−フコシダーゼ活性を算出する。

【００１５】本発明に用いられるα−Ｌ−フコシダーゼ
含有試料については、α−Ｌ−フコシダーゼを含有する
ものであればよく、特に制限はないが、具体的には微生
物の培養液、植物の抽出液、あるいは動物の体液や尿や
組織及びそれらの抽出液などを用いることができる。ま
た緩衝剤としては、例えば燐酸塩、酢酸塩、クエン酸塩
などが挙げられる。

【００１６】

【発明の効果】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる
α−Ｌ−フコース誘導体は、新規な化合物であって、α
−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬として極めて有用で
あり、このものを用いることにより、試料中に含まれる
グルコース、ビリルビン、ヘモグロビンなどの影響をう
けることなく、α−Ｌ−フコシダーゼ活性を自動分析法
などにより、レイトアッセイ法で効率よく、かつ正確に
（精度よく）、しかも容易に測定することができる。

【００１７】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に
説明する。なお、実施例１の比旋光度は２５℃において
Ｄ線で測定した値である。 実施例１ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドの
製造 （１）まず、 「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，８０，４３３
−４３５（１９６１）」に記載された方法に従いテトラ
−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコースを製造した。すなわち、
無水酢酸（８４ｍｌ）−ピリジン（１０８ｍｌ）にＬ−
フコース１０ｇ（６１ｍｍｏｌ）を氷冷下、かきまぜな
がら添加したのち、０℃で２日間攪拌しつつ反応させ
た。次いで、この反応液にクラッシュドアイスを添加
し、４時間かきまぜたのち、クロロホルムで抽出を行っ
た。このクロロホルム層を水で６回洗浄後、塩化カルシ
ウムで乾燥させ、続いてこの溶媒を留去して、テトラ−
Ｏ−アセチル−Ｌ−フコ−スのα−アノマーとβ−アノ
マーの混合物１８ｇ（５４ｍｍｏｌ、収率８９％）を得
た。こうして得たテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコース
１０．０ｇ（３０ｍｍｏｌ）に市販（東京化成製）の２
−クロロ−４−ニトロフェノール５２ｇ（３００ｍｍｏ
ｌ）、酢酸１４ｍｌ、無水酢酸１ｍｌ及び塩化亜鉛４ｇ
（３０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下、１２０℃で１０分間
攪拌しながら反応させた。次いでジメチルスルホキシド
５０ｍｌ及びジクロロメタン１ｌを加えて反応物を溶解
させた。この液を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｌ
で３回、続いて飽和食塩水１ｌで３回洗浄したのち、硫
酸マグネシウムを加えて乾燥させた。さらに溶媒を留去
したのち、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに
より精製し、ヘキサン−酢酸エチル混液（容積比１：
４）で溶出した区分を濃縮し、メタノールにより結晶化
させて、２−クロロ−４−ニトロフェニル−２，３，４
−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシド８．５ｇ（１
９ｍｍｏｌ、収率６３％）を得た。

【００１８】融点：１４５．５〜１４７．０℃ 比旋光度 ［α］（ＭｅＯＨ）：−１９３゜ 赤外吸収スペクトル：１７４８，１５８６，１５１９，
１４８３ｃｍ^-1 紫外可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長
（ε）＝２８５（９２００）ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＣＤＣ
ｌ₃）：δ（ｐｐｍ） １．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．
６Ｈｚ），２．０４（３Ｈ，ｓ），２．０８（３Ｈ，
ｓ），２．２０（３Ｈ，ｓ），４．２５（１Ｈ，ｑ，Ｊ
＝６．６Ｈｚ），５．２９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．
８，３．７Ｈｚ），５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈ
ｚ），５．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．８，３．２Ｈ
ｚ），５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．２
８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．１３（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝９．３，２．７Ｈｚ），８．３０（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝２．７Ｈｚ）

【００１９】（２） このようにして得た２−クロロ−
４−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル
−α−Ｌ−フコシド８．０ｇ（１８ｍｍｏｌ）を脱水メ
タノール２００ｍｌに溶解し、これに０．１Ｎナトリウ
ムメチラート−メタノール溶液９ｍｌ（０．９ｍｍｏ
ｌ）を加え、３０分間加熱還流した。次いで溶媒を留去
したのち、残渣をＯＤＳ（ＹＭＣ・ＧＥＬ ＯＤＳ−Ａ
Ｑ １２０−Ｓ５０）カラムクロマトグラフィにより精
製し、２０％アセトニトリル−水溶液で溶出した区分を
凍結乾燥して、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−
Ｌ−フコシド４．２ｇ（１３ｍｍｏｌ、収率７２％）を
得た。

【００２０】融点：７２．０〜７８．０℃ 比旋光度 ［α］（ＭｅＯＨ）：−１７３゜ 赤外吸収スペクトル：３３６３，１５８７，１５１９，
１４８５ｃｍ^-1 紫外可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長
（ε）＝２９４（８７００）ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） １．０６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），３．６０−
３．６５（１Ｈ，ｍ），３．８０−３．９５（３Ｈ，
ｍ），４．５９（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），
４．７４（１Ｈ，ｂｒｓ），４．９８（１Ｈ，ｂｒ
ｓ），５．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），７．５
０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），８．２０（１Ｈ，
ｄｄ，Ｊ＝１０．０，２．７Ｈｚ），８．３０（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）

【００２１】実施例２ α−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法 （１）基質液の調製 実施例１で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−
Ｌ−フコシド９５．９ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）をとり、
０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．５）を加えて全量を１
００ｍｌとして基質液とした。

【００２２】（２）標品α−Ｌ−フコシダーゼ液の調製 市販品の酵素活性既知のα−Ｌ−フコシダーゼ［シグマ
社製α−Ｌ−フコシダーゼ（１．１５ｕ／０．５ｍ
ｌ）］を精製水を用いて、２８．７５，５７．５，１１
５，２３０，５７５ｕ／ｍｌの活性になるように希釈し
て標品α−Ｌ−フコシダーゼ液とした。なお、α−Ｌ−
フコシダーゼの活性は、１分間に１．０μｍｏｌのｐ−
ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドをｐＨ５．５、２５
℃でｐ−ニトロフェノールとＬ−フコースへ加水分解す
る酵素量を１ｕと定義した。

【００２３】（３）検量線の作成 各種活性の標品α−Ｌ−フコシダーゼ液０．１ｍｌにあ
らかじめ３７℃で５分間加温した基質液３．０ｍｌを加
えてかきまぜ、３７℃で２分間加温したのち、４分間の
４０５ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した。各標品
α−Ｌ−フコシダーゼ液の活性と、吸光度の変化量の関
係により検量線を作成した。その結果、検量線の式は、 Ｕ＝１．０９×（ΔＡ）×１０³−１．４ （Ｕ：試料液中の酵素活性ｕ／ｌ、ΔＡ：吸光度変化
量） となった。そのグラフを図１に示す。

【００２４】（４）試料液の調製 α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試料が液体の場合はそ
のまま試料液とする。固体の場合は通常、試料５０ｍｇ
を正確に秤量し、精製水を加えて全量を５．０ｍｌとし
て試料液とした。必要に応じて、不溶物をろ過などの操
作で除去してから用いた。

【００２５】（５）試料液中のα−Ｌ−フコシダーゼ活
性の測定 試料液０．１ｍｌにあらかじめ３７℃で５分間加温した
基質液３．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加
温したのち、４分間の４０５ｎｍにおける吸光度の変化
量を測定した。この測定値と（３）で作成した検量線か
ら算出して、試料液中のα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測
定を行うことができる。なお、試料液の酵素活性の値が
検量線の測定範囲（０〜５７５ｕ／ｌ）を越えた場合
は、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．５）を用いて相当
する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行う。

【００２６】実施例３ α−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定用試薬 （１）試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することによ
り、試薬を調製した。 成 分 濃 度 ２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド ３．０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．５） ０．２Ｍ

【００２７】（２）測定法 測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とする。固体
の場合は試料５０ｍｇを正確に秤量し、精製水を加えて
全量を５．０ｍｌとし、これを試料液とした。試料液
０．１ｍｌにあらかじめ３７℃で５分間加温した試薬
３．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温した
のち、４分間の４０５ｎｍにおける吸光度の変化量を測
定した。この吸光度変化量とあらかじめ作成した検量線
から算出して、試料液中のα−Ｌ−フコシダーゼ活性の
測定を行うことができる。なお、試料液の酵素活性の値
が検量線の測定範囲（０〜５７５ｕ／ｌ）を越えた場合
は、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．５）を用いて相当
する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行う。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例２におけるα−Ｌ−フコシダーゼ活性
の測定に用いる検量線を示すグラフ。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中のＲはハロゲン原子又はニトロ基である）で表わ
   されるα−Ｌ−フコース誘導体。
2. 【請求項２】 一般式 【化２】 （式中のＡｃはアセチル基である）で表わされるテトラ
   −Ｏ−アセチル−Ｌ−フコースと、一般式 【化３】 （式中のＲはハロゲン原子又はニトロ基である）で表わ
   される４−ニトロフェノール誘導体を縮合させたのち、
   脱アセチル化することを特徴とする請求項１記載のα−
   Ｌ−フコース誘導体の製造方法。
3. 【請求項３】 請求項１記載のα−Ｌ−フコース誘導体
   を有効成分とするα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試
   薬。
4. 【請求項４】 α−Ｌ−フコシダーゼ含有試料に、請求
   項１記載のα−Ｌ−フコース誘導体を添加して酵素反応
   を行わせ、遊離する４−ニトロフェノール誘導体を定量
   することを特徴とするα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定
   方法。