JPH0859686A - ウミホタルルシフェリン誘導体および糖加水分解酵素の定量方法 - Google Patents
ウミホタルルシフェリン誘導体および糖加水分解酵素の定量方法Info
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- JPH0859686A JPH0859686A JP19877094A JP19877094A JPH0859686A JP H0859686 A JPH0859686 A JP H0859686A JP 19877094 A JP19877094 A JP 19877094A JP 19877094 A JP19877094 A JP 19877094A JP H0859686 A JPH0859686 A JP H0859686A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 α−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の糖加水分解酵
素の基質として利用して発光させることができ、糖加水
分解酵素の定量に利用することができる新規かつ有用な
ウミホタルルシフェリン誘導体を得る。 【構成】 下記一般式（１）で表わされるウミホタルル
シフェリン誘導体。 【化１】 （Ｒ1およびＲ2は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、
炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のア
リールアルキル基。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基ま
たはアルコキシ基。ｎは０〜５の整数。）
素の基質として利用して発光させることができ、糖加水
分解酵素の定量に利用することができる新規かつ有用な
ウミホタルルシフェリン誘導体を得る。 【構成】 下記一般式（１）で表わされるウミホタルル
シフェリン誘導体。 【化１】 （Ｒ1およびＲ2は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、
炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のア
リールアルキル基。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基ま
たはアルコキシ基。ｎは０〜５の整数。）
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規かつ有用なウミホ
タルルシフェリン誘導体、その中間体、これらの製造方
法、およびウミホタルルシフェリン誘導体を発光基質と
して用いた糖加水分解酵素の定量方法に関する。
タルルシフェリン誘導体、その中間体、これらの製造方
法、およびウミホタルルシフェリン誘導体を発光基質と
して用いた糖加水分解酵素の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗原抗体反応に基づくイムノアッセイの
分野において、ラジオイムノアッセイに代わる分析手段
として化学発光酵素イムノアッセイが注目されている。
化学発光酵素イムノアッセイは、酵素が化学結合してい
る抗体または抗原を用いて、基質となる化学発光物質を
定量することによって、その抗体または抗原の量を測定
する方法である。
分野において、ラジオイムノアッセイに代わる分析手段
として化学発光酵素イムノアッセイが注目されている。
化学発光酵素イムノアッセイは、酵素が化学結合してい
る抗体または抗原を用いて、基質となる化学発光物質を
定量することによって、その抗体または抗原の量を測定
する方法である。
【０００３】化学発光酵素イムノアッセイに用いられ、
酵素反応により発光する基質（発光基質）としては、ル
ミノール誘導体、シュウ酸エステル、アダマンチルジオ
キセタン誘導体などが知られている。これらの中でアダ
マンチルジオキセタン誘導体はβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの基質として利用され、発光量を測定することにより
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を定量することができる
（特開平２−１８０８９３号）。しかしながら、アダマ
ンチルジオキセタン誘導体は分子内に過酸化物構造を有
しているので、光および熱による分解や、金属との反応
によるレドックス分解を引き起こし易く、このため定量
分析の誤差を招きやすいという問題点がある。
酵素反応により発光する基質（発光基質）としては、ル
ミノール誘導体、シュウ酸エステル、アダマンチルジオ
キセタン誘導体などが知られている。これらの中でアダ
マンチルジオキセタン誘導体はβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの基質として利用され、発光量を測定することにより
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を定量することができる
（特開平２−１８０８９３号）。しかしながら、アダマ
ンチルジオキセタン誘導体は分子内に過酸化物構造を有
しているので、光および熱による分解や、金属との反応
によるレドックス分解を引き起こし易く、このため定量
分析の誤差を招きやすいという問題点がある。
【０００４】ところで、これまでに知られているウミホ
タルルシフェリン誘導体は、一重項酸素、スパーオキシ
ドアニオン、ヒドロキシルラジカル等の活性酸素と選択
的に反応して発光することから、これら活性酸素の微量
定量に有効であることが知られている。しかしながらβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの糖加水分解酵素の基質と
して用いても発光しない。また本発明のウミホタルルシ
フェリン誘導体と類似した構造を有するセレンテラジン
グルクロニドが知られている（Chem. Latt. 417-8(198
7)）が、この化合物はグルクロニダーゼという特殊な酵
素でのみ発光するため、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど
の糖加水分解酵素の定量に利用することはできない。こ
のため発光を利用して、糖加水分解酵素を高精度で定量
することができる発光基質の開発が強く望まれている。
タルルシフェリン誘導体は、一重項酸素、スパーオキシ
ドアニオン、ヒドロキシルラジカル等の活性酸素と選択
的に反応して発光することから、これら活性酸素の微量
定量に有効であることが知られている。しかしながらβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの糖加水分解酵素の基質と
して用いても発光しない。また本発明のウミホタルルシ
フェリン誘導体と類似した構造を有するセレンテラジン
グルクロニドが知られている（Chem. Latt. 417-8(198
7)）が、この化合物はグルクロニダーゼという特殊な酵
素でのみ発光するため、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど
の糖加水分解酵素の定量に利用することはできない。こ
のため発光を利用して、糖加水分解酵素を高精度で定量
することができる発光基質の開発が強く望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、糖加
水分解酵素に対する基質として利用して発光させること
ができ、糖加水分解酵素の定量に利用することができる
新規かつ有用なウミホタルルシフェリン誘導体、および
その中間体を提供することである。本発明の他の目的
は、上記ウミホタルルシフェリン誘導体を簡単に効率よ
く製造することができるウミホタルルシフェリン誘導体
の製造方法、および中間体の製造方法を提案することで
ある。本発明の別の目的は、上記ウミホタルルシフェリ
ン誘導体を利用して、高い精度で酵素量を定量すること
ができる糖加水分解酵素の定量方法を提案することであ
る。
水分解酵素に対する基質として利用して発光させること
ができ、糖加水分解酵素の定量に利用することができる
新規かつ有用なウミホタルルシフェリン誘導体、および
その中間体を提供することである。本発明の他の目的
は、上記ウミホタルルシフェリン誘導体を簡単に効率よ
く製造することができるウミホタルルシフェリン誘導体
の製造方法、および中間体の製造方法を提案することで
ある。本発明の別の目的は、上記ウミホタルルシフェリ
ン誘導体を利用して、高い精度で酵素量を定量すること
ができる糖加水分解酵素の定量方法を提案することであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は次のウミホタル
ルシフェリン誘導体、その中間体、これらの製造方法、
およびウミホタルルシフェリン誘導体を発光基質として
用いた糖加水分解酵素の定量方法である。 （１）下記一般式（１）で表わされるウミホタルルシフ
ェリン誘導体。
ルシフェリン誘導体、その中間体、これらの製造方法、
およびウミホタルルシフェリン誘導体を発光基質として
用いた糖加水分解酵素の定量方法である。 （１）下記一般式（１）で表わされるウミホタルルシフ
ェリン誘導体。
【化１１】 （式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。） （２）下記一般式（２）で表わされるウミホタルルシフ
ェリン中間体。
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。） （２）下記一般式（２）で表わされるウミホタルルシフ
ェリン中間体。
【化１２】 （式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。Ｒ4は炭素数１〜７のアシル基
を示す。） （３）一般式（３）
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。Ｒ4は炭素数１〜７のアシル基
を示す。） （３）一般式（３）
【化１３】 （式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。）で表わされるイミダゾピラジ
ン誘導体と、一般式（４）
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。）で表わされるイミダゾピラジ
ン誘導体と、一般式（４）
【化１４】 （式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ4は炭素数１〜７のアシ
ル基を示す。）で表わされる糖誘導体とを、トルフルオ
ロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存
在下に反応させて、前記一般式（２）で表わされるウミ
ホタルルシフェリン中間体を製造した後、アルカリ存在
下に加溶媒分解することを特徴とする前記一般式（１）
で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体の製造方
法。 （４）前記一般式（３）で表わされるイミダゾピラジン
誘導体と、前記一般式（４）で表わされる糖誘導体と
を、トリフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナ
トリウム塩の存在下に反応させることを特徴とする前記
一般式（２）で表わされるウミホタルルシフェリン中間
体の製造方法。 （５）糖加水分解酵素によりウミホタルルシフェリン誘
導体が分解されることによって発光する発光量を測定す
ることにより糖加水分解酵素の酵素量を定量する方法で
あって、ウミホタルルシフェリン誘導体として前記一般
式（１）で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体を
使用することを特徴とする糖加水分解酵素の定量方法。
ル基を示す。）で表わされる糖誘導体とを、トルフルオ
ロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存
在下に反応させて、前記一般式（２）で表わされるウミ
ホタルルシフェリン中間体を製造した後、アルカリ存在
下に加溶媒分解することを特徴とする前記一般式（１）
で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体の製造方
法。 （４）前記一般式（３）で表わされるイミダゾピラジン
誘導体と、前記一般式（４）で表わされる糖誘導体と
を、トリフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナ
トリウム塩の存在下に反応させることを特徴とする前記
一般式（２）で表わされるウミホタルルシフェリン中間
体の製造方法。 （５）糖加水分解酵素によりウミホタルルシフェリン誘
導体が分解されることによって発光する発光量を測定す
ることにより糖加水分解酵素の酵素量を定量する方法で
あって、ウミホタルルシフェリン誘導体として前記一般
式（１）で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体を
使用することを特徴とする糖加水分解酵素の定量方法。
【０００７】一般式（１）において、Ｒ1またはＲ2で示
される基の具体的なものとしては、例えばメチル基、エ
チル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル
基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシ
ル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、
トリデシル基、ヘキサデシル基、イコシル基等の直鎖状
または分岐鎖状の炭素数１〜２０のアルキル基；フェニ
ル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、
ナフタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基等の炭素数
６〜２０のアリール基；ベンジル基、フェネチル基、ジ
フェニルメチル基、トリチル基、トリル基、キシリル
基、クメニル基、メシチル基等の炭素数７〜１９のアリ
ールアルキル基があげられる。Ｒ1とＲ2とは同一でも異
なっていてもよい。
される基の具体的なものとしては、例えばメチル基、エ
チル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル
基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシ
ル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、
トリデシル基、ヘキサデシル基、イコシル基等の直鎖状
または分岐鎖状の炭素数１〜２０のアルキル基；フェニ
ル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、
ナフタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基等の炭素数
６〜２０のアリール基；ベンジル基、フェネチル基、ジ
フェニルメチル基、トリチル基、トリル基、キシリル
基、クメニル基、メシチル基等の炭素数７〜１９のアリ
ールアルキル基があげられる。Ｒ1とＲ2とは同一でも異
なっていてもよい。
【０００８】一般式（１）で表わされる本発明のウミホ
タルルシフェリン誘導体を後述の糖加水分解酵素の発光
基質として利用する場合は、Ｒ1またはＲ2は水素原子、
メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル
基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、フェ
ニル基、ナフチル基、ベンジル基またはフェネチル基で
あるのが好ましい。
タルルシフェリン誘導体を後述の糖加水分解酵素の発光
基質として利用する場合は、Ｒ1またはＲ2は水素原子、
メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル
基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、フェ
ニル基、ナフチル基、ベンジル基またはフェネチル基で
あるのが好ましい。
【０００９】一般式（１）においてＲ3で示される基の
具体的なものとしては、例えばメチル基、エチル基、ｎ
−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブ
チル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基等の直鎖状または分
岐鎖状の炭素炭１〜５のアルキル基；メトキシ基、エト
キシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブ
トキシ基、イソブトキシ基、ｔ−ブトキシ基等の炭素数
１〜５のアルコキシ基があげられる。これらの基がベン
ゼン環に結合する位置はどこの位置でもよく、またその
数（ｎの数）は０〜５である。
具体的なものとしては、例えばメチル基、エチル基、ｎ
−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブ
チル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基等の直鎖状または分
岐鎖状の炭素炭１〜５のアルキル基；メトキシ基、エト
キシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブ
トキシ基、イソブトキシ基、ｔ−ブトキシ基等の炭素数
１〜５のアルコキシ基があげられる。これらの基がベン
ゼン環に結合する位置はどこの位置でもよく、またその
数（ｎの数）は０〜５である。
【００１０】一般式（１）で表わされる本発明のウミホ
タルルシフェリン誘導体を後述の糖加水分解酵素の発光
基質として利用する場合は、Ｒ3はメチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、
イソブチル基、ｔ−ブチル基、メトキシ基、エトキシ
基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキ
シ基、イソブトキシ基またはｔ−ブトキシ基であって、
ベンゼン環の４位に１個、２および４位に２個、または
２、４および６位に３個結合しているのが好ましい。
タルルシフェリン誘導体を後述の糖加水分解酵素の発光
基質として利用する場合は、Ｒ3はメチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、
イソブチル基、ｔ−ブチル基、メトキシ基、エトキシ
基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキ
シ基、イソブトキシ基またはｔ−ブトキシ基であって、
ベンゼン環の４位に１個、２および４位に２個、または
２、４および６位に３個結合しているのが好ましい。
【００１１】一般式（２）におけるＲ4のアシル基とし
ては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソ
ブチリル基、バレリル基、ベンゾイル基などの炭素数１
〜７のアシル基があげられる。一般式（２）におけるＲ
1、Ｒ2、Ｒ3およびｎは前記と同じものを示す。
ては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソ
ブチリル基、バレリル基、ベンゾイル基などの炭素数１
〜７のアシル基があげられる。一般式（２）におけるＲ
1、Ｒ2、Ｒ3およびｎは前記と同じものを示す。
【００１２】一般式（１）で表わされる本発明のウミホ
タルルシフェリン誘導体は、一般式（３）で表わされる
イミダゾピラジン誘導体と、一般式（４）で表わされる
糖誘導体とを、トリフルオロメタンスルホン酸銀および
リン酸二ナトリウム塩の存在下に反応させて一般式
（２）で表わされるウミホタルルシフェリン中間体（以
下、単に中間体という場合がある）を製造した後、この
中間体をアルカリ存在下に加溶媒分解することにより製
造できる。
タルルシフェリン誘導体は、一般式（３）で表わされる
イミダゾピラジン誘導体と、一般式（４）で表わされる
糖誘導体とを、トリフルオロメタンスルホン酸銀および
リン酸二ナトリウム塩の存在下に反応させて一般式
（２）で表わされるウミホタルルシフェリン中間体（以
下、単に中間体という場合がある）を製造した後、この
中間体をアルカリ存在下に加溶媒分解することにより製
造できる。
【００１３】一般式（３）におけるＲ1、Ｒ2、Ｒ3およ
びｎは前記と同じものを示す。一般式（４）におけるＸ
で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原
子、臭素原子、ヨウ素原子等があげられる。Ｒ4は前記
と同じものを示すが、アセチル基またはベンゾイル基が
好ましい。一般式（４）で表わされる糖誘導体の糖骨格
としては、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラ
クトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノースおよびβ−
Ｄ−グルコピラノースがあげられる。
びｎは前記と同じものを示す。一般式（４）におけるＸ
で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原
子、臭素原子、ヨウ素原子等があげられる。Ｒ4は前記
と同じものを示すが、アセチル基またはベンゾイル基が
好ましい。一般式（４）で表わされる糖誘導体の糖骨格
としては、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラ
クトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノースおよびβ−
Ｄ−グルコピラノースがあげられる。
【００１４】一般式（３）のイミダゾピラジン誘導体と
一般式（４）の糖誘導体との仕込み割合は、イミダゾピ
ラジン誘導体：糖誘導体のモル比で１：０．１〜１：１
００、好ましくは１：１〜１：１０とするのが望まし
い。このモル比が０．１未満の場合には生成する中間体
の収率が低下する傾向にあり、一方１００を超えると反
応終了後に未反応の糖誘導体が残存し、目的とする生成
物の単離が困難となるので好ましくない。
一般式（４）の糖誘導体との仕込み割合は、イミダゾピ
ラジン誘導体：糖誘導体のモル比で１：０．１〜１：１
００、好ましくは１：１〜１：１０とするのが望まし
い。このモル比が０．１未満の場合には生成する中間体
の収率が低下する傾向にあり、一方１００を超えると反
応終了後に未反応の糖誘導体が残存し、目的とする生成
物の単離が困難となるので好ましくない。
【００１５】トリフルオロメタンスルホン酸銀の使用量
は、糖誘導体：トリフルオロメタンスルホン酸銀の仕込
みモル比で１：０．１〜１：１００、好ましくは１：１
〜１：２０とするのが望ましい。またリン酸二ナトリウ
ム塩の使用量は、イミダゾピラジン誘導体：リン酸二ナ
トリウム塩の仕込みモル比で１：０．１〜１：１００、
好ましくは１：１〜１：５０とするのが望ましい。な
お、トリフルオロメタンスルホン酸銀は触媒として、ま
たリン酸二ナトリウム塩はイミダゾピラジン誘導体の活
性を上げるために用いられる。
は、糖誘導体：トリフルオロメタンスルホン酸銀の仕込
みモル比で１：０．１〜１：１００、好ましくは１：１
〜１：２０とするのが望ましい。またリン酸二ナトリウ
ム塩の使用量は、イミダゾピラジン誘導体：リン酸二ナ
トリウム塩の仕込みモル比で１：０．１〜１：１００、
好ましくは１：１〜１：５０とするのが望ましい。な
お、トリフルオロメタンスルホン酸銀は触媒として、ま
たリン酸二ナトリウム塩はイミダゾピラジン誘導体の活
性を上げるために用いられる。
【００１６】反応溶媒としては、反応条件下で不活性で
あり、かつ生成した中間体からの分離が容易なものであ
るならばどのような溶媒でも使用できる。このような溶
媒としては、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、テ
トラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシドあるいはこれらの混合溶媒な
どが適当である。使用する溶媒の量は特に限定されない
が、出発物質の総重量あたり１〜１０００倍量であるこ
とが好ましい。また反応をさらに円滑に進めるために、
脱水溶媒を用いることが好ましい。さらに反応系から水
分を除去するために、反応条件下で不活性な吸湿剤、例
えばモレキュラーシーブなどを反応系内に存在させるこ
とが好ましい。吸湿剤の仕込み量としては、出発物質の
総重量あたり１〜１０００倍量とするのが好ましい。
あり、かつ生成した中間体からの分離が容易なものであ
るならばどのような溶媒でも使用できる。このような溶
媒としては、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、テ
トラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシドあるいはこれらの混合溶媒な
どが適当である。使用する溶媒の量は特に限定されない
が、出発物質の総重量あたり１〜１０００倍量であるこ
とが好ましい。また反応をさらに円滑に進めるために、
脱水溶媒を用いることが好ましい。さらに反応系から水
分を除去するために、反応条件下で不活性な吸湿剤、例
えばモレキュラーシーブなどを反応系内に存在させるこ
とが好ましい。吸湿剤の仕込み量としては、出発物質の
総重量あたり１〜１０００倍量とするのが好ましい。
【００１７】反応温度は、通常−２０〜＋１５０℃、好
ましくは−１０〜＋１００℃とするのが望ましい。反応
は減圧または加圧下に行うこともできるが、常圧で行う
のが好ましい。反応時間は、通常３０分間〜２０時間の
範囲で行うことができるが、実用的には１〜１０時間に
なるように条件を設定するのが望ましい。また反応は不
活性ガス雰囲気下に行うのが好ましい。
ましくは−１０〜＋１００℃とするのが望ましい。反応
は減圧または加圧下に行うこともできるが、常圧で行う
のが好ましい。反応時間は、通常３０分間〜２０時間の
範囲で行うことができるが、実用的には１〜１０時間に
なるように条件を設定するのが望ましい。また反応は不
活性ガス雰囲気下に行うのが好ましい。
【００１８】このようにして反応を行うことにより、一
般式（２）で表わされる中間体が得られる。この中間体
から最終目的物である一般式（１）のウミホタルルシフ
ェリン誘導体を得るには、反応液からクロマトグラフィ
ーなどの方法により中間体を単離した後、得られた中間
体をアルカリ存在下に加溶媒分解して脱保護基化するこ
とにより得ることができる。溶媒としては、水；メタノ
ール、エタノール等の低級アルコール；これらの混合液
などが使用できる。
般式（２）で表わされる中間体が得られる。この中間体
から最終目的物である一般式（１）のウミホタルルシフ
ェリン誘導体を得るには、反応液からクロマトグラフィ
ーなどの方法により中間体を単離した後、得られた中間
体をアルカリ存在下に加溶媒分解して脱保護基化するこ
とにより得ることができる。溶媒としては、水；メタノ
ール、エタノール等の低級アルコール；これらの混合液
などが使用できる。
【００１９】アルカリとしてはアンモニア、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、トリエチルアミン、グアニジン、１，８−ジアザビ
シクロ［５．４．０］ウンデセンなどが使用できる。ア
ルカリの使用量は、反応液中の濃度が０．００１〜５
Ｎ、好ましくは０．０１〜１Ｎとなる量で使用するのが
望ましい。加溶媒分解は−５０〜＋１００℃、好ましく
は０〜＋８０℃で、０．１〜２４時間、好ましくは０．
１〜１０時間行うのが望ましい。
ム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、トリエチルアミン、グアニジン、１，８−ジアザビ
シクロ［５．４．０］ウンデセンなどが使用できる。ア
ルカリの使用量は、反応液中の濃度が０．００１〜５
Ｎ、好ましくは０．０１〜１Ｎとなる量で使用するのが
望ましい。加溶媒分解は−５０〜＋１００℃、好ましく
は０〜＋８０℃で、０．１〜２４時間、好ましくは０．
１〜１０時間行うのが望ましい。
【００２０】反応終了後は、クロマトグラフィー、再結
晶等の通常の手段により精製することができる。このよ
うにして得られた一般式（１）で表わされるウミホタル
ルシフェリン誘導体は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼまた
はβ−Ｄ−グルコシダーゼの糖加水分解酵素の基質とし
て使用して発光させることができ、これらの糖加水分解
酵素の定量試薬として利用することができる。糖加水分
解酵素としては、抗体または抗原に化学的に結合してい
る酵素を用いることもでき、この場合は化学発光酵素イ
ムノアッセイ用の定量試薬として利用できる。
晶等の通常の手段により精製することができる。このよ
うにして得られた一般式（１）で表わされるウミホタル
ルシフェリン誘導体は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼまた
はβ−Ｄ−グルコシダーゼの糖加水分解酵素の基質とし
て使用して発光させることができ、これらの糖加水分解
酵素の定量試薬として利用することができる。糖加水分
解酵素としては、抗体または抗原に化学的に結合してい
る酵素を用いることもでき、この場合は化学発光酵素イ
ムノアッセイ用の定量試薬として利用できる。
【００２１】糖加水分解酵素の定量は、反応媒体中で一
般式（１）のウミホタルルシフェリン誘導体と糖加水分
解酵素とを接触させ、このとき発光する発光量を測定
し、予め作成した検量線を基に定量することができる。
ウミホタルルシフェリン誘導体の使用量は、測定試料中
に存在する糖加水分解酵素１モルに対して、通常１〜１
０18モル、好ましくは１０3〜１０15モルとするのが望
ましい。
般式（１）のウミホタルルシフェリン誘導体と糖加水分
解酵素とを接触させ、このとき発光する発光量を測定
し、予め作成した検量線を基に定量することができる。
ウミホタルルシフェリン誘導体の使用量は、測定試料中
に存在する糖加水分解酵素１モルに対して、通常１〜１
０18モル、好ましくは１０3〜１０15モルとするのが望
ましい。
【００２２】反応媒体としては、通常ｐＨ４〜１０、好
ましくは定量する糖加水分解酵素の活性が高く維持され
るｐＨ値を有する水溶液または緩衝液などが使用でき
る。このような水溶液または緩衝液としては、例えば酢
酸、炭酸、リン酸、ホウ酸水溶液；酢酸ナトリウム緩衝
液、トリスアミノヒドロキシメタン緩衝液、コハク酸緩
衝液、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパンカルボン
酸緩衝液、モノフタル酸カリウム緩衝液、２−（Ｎ−モ
ルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、リン酸ナトリウム
緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩
衝液、イミダゾール緩衝液等をあげることができ、使用
に際しては単独もしくは混合物として用いることができ
る。
ましくは定量する糖加水分解酵素の活性が高く維持され
るｐＨ値を有する水溶液または緩衝液などが使用でき
る。このような水溶液または緩衝液としては、例えば酢
酸、炭酸、リン酸、ホウ酸水溶液；酢酸ナトリウム緩衝
液、トリスアミノヒドロキシメタン緩衝液、コハク酸緩
衝液、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパンカルボン
酸緩衝液、モノフタル酸カリウム緩衝液、２−（Ｎ−モ
ルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、リン酸ナトリウム
緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩
衝液、イミダゾール緩衝液等をあげることができ、使用
に際しては単独もしくは混合物として用いることができ
る。
【００２３】反応を行う際の温度は、通常０〜７０℃、
好ましくは１５〜６０℃の範囲であることが望ましい。
この温度範囲以外では、酵素の活性が低下するので好ま
しくない。このようにして反応させることによって、糖
加水分解酵素の作用によりウミホタルルシフェリンが分
解されて発光する。発光量は市販の光電子増倍管を備え
た化学発光測定器などを用いることにより容易に行うこ
とができる。
好ましくは１５〜６０℃の範囲であることが望ましい。
この温度範囲以外では、酵素の活性が低下するので好ま
しくない。このようにして反応させることによって、糖
加水分解酵素の作用によりウミホタルルシフェリンが分
解されて発光する。発光量は市販の光電子増倍管を備え
た化学発光測定器などを用いることにより容易に行うこ
とができる。
【００２４】このような本発明の糖加水分解酵素の定量
方法は、基質として化学的に安定な前記ウミホタルルシ
フェリン誘導体を使用しているので、分析誤差を生じる
ことなく、高い精度で酵素量を定量することができる。
方法は、基質として化学的に安定な前記ウミホタルルシ
フェリン誘導体を使用しているので、分析誤差を生じる
ことなく、高い精度で酵素量を定量することができる。
【００２５】
【発明の効果】本発明のウミホタルルシフェリン誘導体
は新規であり、糖加水分解酵素の発光基質として有用で
ある。本発明のウミホタルルシフェリン中間体は新規で
あり、上記のウミホタルルシフェリン誘導体の中間体と
して有用である。本発明のウミホタルルシフェリン誘導
体の製造方法は、一般式（３）で表わされるイミダゾピ
ラジン誘導体および一般式（４）で表わされる糖誘導体
を出発物質として用い、これらをトリフルオロメタンス
ルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存在下に反応
させた後、得られた中間体を加溶媒分解するようにした
ので、上記ウミホタルルシフェリン誘導体を簡単に効率
よく製造することができる。また本発明のウミホタルル
シフェリン誘導体の中間体の製造方法も、一般式（３）
で表わされるイミダゾピラジン誘導体および一般式
（４）で表わされる糖誘導体を出発物質として用い、こ
れらをトリフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二
ナトリウム塩の存在下に反応させるようにしたので、上
記ウミホタルルシフェリン誘導体の中間体を簡単に効率
よく製造することができる。本発明の糖加水分解酵素の
定量方法は、基質として上記ウミホタルルシフェリン誘
導体を使用しているので、高い精度で定量することがで
きる。
は新規であり、糖加水分解酵素の発光基質として有用で
ある。本発明のウミホタルルシフェリン中間体は新規で
あり、上記のウミホタルルシフェリン誘導体の中間体と
して有用である。本発明のウミホタルルシフェリン誘導
体の製造方法は、一般式（３）で表わされるイミダゾピ
ラジン誘導体および一般式（４）で表わされる糖誘導体
を出発物質として用い、これらをトリフルオロメタンス
ルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存在下に反応
させた後、得られた中間体を加溶媒分解するようにした
ので、上記ウミホタルルシフェリン誘導体を簡単に効率
よく製造することができる。また本発明のウミホタルル
シフェリン誘導体の中間体の製造方法も、一般式（３）
で表わされるイミダゾピラジン誘導体および一般式
（４）で表わされる糖誘導体を出発物質として用い、こ
れらをトリフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二
ナトリウム塩の存在下に反応させるようにしたので、上
記ウミホタルルシフェリン誘導体の中間体を簡単に効率
よく製造することができる。本発明の糖加水分解酵素の
定量方法は、基質として上記ウミホタルルシフェリン誘
導体を使用しているので、高い精度で定量することがで
きる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１−１ ６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルイミダゾ
［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（一般式（３）のＲ
1はメチル基、Ｒ2は水素原子、Ｒ3はメトキシ基、ｎは
１）０．１ｇ（０．３５ｍｍｏｌ）とリン酸二ナトリウ
ム１．１ｇ（７．７５ｍｍｏｌ）との混合物中に、アセ
トニトリル５ｍｌおよびベンゼン９ｍｌを加えた後、モ
レキュラーシーブ４Ａを２．６ｇ加え、室温で１時間攪
拌した。続いて２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル
−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド（一般式（４）
のＸは臭素原子、Ｒ4はアセチル基）０．１８ｇ（０．
４５ｍｍｏｌ）およびトリフルオロメタンスルホン酸銀
０．３７ｇ（１．４３ｍｍｏｌ）を加えて、窒素雰囲気
下に室温で２時間攪拌し、６−（４−メトキシフェニ
ル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３
−オンと２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−ガラクトピラノシルブロミドとを反応させた。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１−１ ６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルイミダゾ
［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（一般式（３）のＲ
1はメチル基、Ｒ2は水素原子、Ｒ3はメトキシ基、ｎは
１）０．１ｇ（０．３５ｍｍｏｌ）とリン酸二ナトリウ
ム１．１ｇ（７．７５ｍｍｏｌ）との混合物中に、アセ
トニトリル５ｍｌおよびベンゼン９ｍｌを加えた後、モ
レキュラーシーブ４Ａを２．６ｇ加え、室温で１時間攪
拌した。続いて２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル
−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド（一般式（４）
のＸは臭素原子、Ｒ4はアセチル基）０．１８ｇ（０．
４５ｍｍｏｌ）およびトリフルオロメタンスルホン酸銀
０．３７ｇ（１．４３ｍｍｏｌ）を加えて、窒素雰囲気
下に室温で２時間攪拌し、６−（４−メトキシフェニ
ル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３
−オンと２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−ガラクトピラノシルブロミドとを反応させた。
【００２７】反応終了後、セライトを敷いたガラスフィ
ルターにより反応溶液を濾過した後、残渣をアセトニト
リルおよびベンゼンで洗浄した。濾液および洗液の混合
液から溶媒を留去し、次に塩化メチレン１５ｍｌおよび
飽和炭酸水素ナトリウム−食塩水１０ｍｌを加えて攪拌
した後、不溶物をガラスフィルターにより取り除いた。
次に塩化メチレン層を分取した後、硫酸ナトリウムによ
り乾燥した。溶媒を留去後、得られた油状物をシリカゲ
ルカラム（３０％アセトン−ベンゼン）および中圧カラ
ムクロマトグラフィーにより精製すると、中間体である
６−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−（テ
トラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキ
シ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン（一般式（２）の
Ｒ1はメチル基、Ｒ2は水素原子、Ｒ3はメトキシ基、ｎ
は１、Ｒ4はアセチル基）が収量０．０８ｇ（０．１４
ｍｍｏｌ）、収率３９％で得られた。
ルターにより反応溶液を濾過した後、残渣をアセトニト
リルおよびベンゼンで洗浄した。濾液および洗液の混合
液から溶媒を留去し、次に塩化メチレン１５ｍｌおよび
飽和炭酸水素ナトリウム−食塩水１０ｍｌを加えて攪拌
した後、不溶物をガラスフィルターにより取り除いた。
次に塩化メチレン層を分取した後、硫酸ナトリウムによ
り乾燥した。溶媒を留去後、得られた油状物をシリカゲ
ルカラム（３０％アセトン−ベンゼン）および中圧カラ
ムクロマトグラフィーにより精製すると、中間体である
６−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−（テ
トラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキ
シ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン（一般式（２）の
Ｒ1はメチル基、Ｒ2は水素原子、Ｒ3はメトキシ基、ｎ
は１、Ｒ4はアセチル基）が収量０．０８ｇ（０．１４
ｍｍｏｌ）、収率３９％で得られた。
【００２８】スペクトルデータは次の通りである。 ＭＳ（ＦＡＢ：ｍ／Ｚ）：５８６（Ｍ＋Ｈ）+，２５６ Ｅｘａｃｔ ＭＳ：５８６．１９９５ Ｃ28Ｈ32Ｏ11Ｎ3の計算値：５８６．２０３７ ＩＲ（ＫＢｒ：ｃｍ-1）：3450, 2970, 2940, 1745, 16
05, 1560,1495, 1370, 1245, 1225, 1060, 10351 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ：δ(ｐｐｍ)）：1.73
(3H, s, CH3CO), 2.05(3H, s, CH3CO),2.21(3H, s, CH3
CO), 2.27(3H, s, CH3CO),2.47(3H, s, CH3), 3.88(3H,
s, CH3O),3.93(1H, dd, J=6.4, 5.9Hz),4.11(1H, dd,
J=11.4, 6.9Hz),4.18(1H, dd, J=11.4, 5.9Hz),4.89(1
H, d, J=7.9Hz),5.10(1H, dd, J=10.4, 3.5Hz),5.45(1
H, d, J=2.5Hz),5.62(1H, dd, J=10.6, 8.2Hz),7.02(2
H, A2'X2', J=8.9Hz),7.86(2H, A2'X2', J=8.9Hz),8.34
(1H, d, J=1.5Hz), 8.94(1H, d, J=1.5Hz)
05, 1560,1495, 1370, 1245, 1225, 1060, 10351 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ：δ(ｐｐｍ)）：1.73
(3H, s, CH3CO), 2.05(3H, s, CH3CO),2.21(3H, s, CH3
CO), 2.27(3H, s, CH3CO),2.47(3H, s, CH3), 3.88(3H,
s, CH3O),3.93(1H, dd, J=6.4, 5.9Hz),4.11(1H, dd,
J=11.4, 6.9Hz),4.18(1H, dd, J=11.4, 5.9Hz),4.89(1
H, d, J=7.9Hz),5.10(1H, dd, J=10.4, 3.5Hz),5.45(1
H, d, J=2.5Hz),5.62(1H, dd, J=10.6, 8.2Hz),7.02(2
H, A2'X2', J=8.9Hz),7.86(2H, A2'X2', J=8.9Hz),8.34
(1H, d, J=1.5Hz), 8.94(1H, d, J=1.5Hz)
【００２９】実施例１−２ 実施例１−１で得られた中間体０．０５ｇ（０．０９ｍ
ｍｏｌ）にメタノール３．５ｍｌおよび濃アンモニア水
１．８ｍｌを加えた後、４０℃で６時間３０分攪拌して
加溶媒分解した。白色沈澱を濾取し、メタノールから再
結晶を行うと目的の３−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル
オキシ）−６−（４−メトキシフェニル）−２−メチル
イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン（一般式（１）のＲ1
はメチル基、Ｒ2は水素原子、Ｒ3はメトキシ基、ｎは
１）が収量０．０３ｇ（０．０７ｍｍｏｌ）、収率７８
％で得られた。
ｍｏｌ）にメタノール３．５ｍｌおよび濃アンモニア水
１．８ｍｌを加えた後、４０℃で６時間３０分攪拌して
加溶媒分解した。白色沈澱を濾取し、メタノールから再
結晶を行うと目的の３−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル
オキシ）−６−（４−メトキシフェニル）−２−メチル
イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン（一般式（１）のＲ1
はメチル基、Ｒ2は水素原子、Ｒ3はメトキシ基、ｎは
１）が収量０．０３ｇ（０．０７ｍｍｏｌ）、収率７８
％で得られた。
【００３０】スペクトルデータは次の通りである。 ＭＳ（ＦＡＢ：ｍ／Ｚ）：４１８（Ｍ＋Ｈ）+ Ｅｘａｃｔ ＭＳ：４１８．１５５５ Ｃ20Ｈ24Ｏ7Ｎ3の計算値：４１８．１６１４ ＩＲ（ＫＢｒ：ｃｍ-1）：3450, 2930, 2880, 1605, 15
65, 1490,1405, 1240, 1090, 1080, 1010 ＩＲ（ＫＢｒ：ｃｍ-1）：3450, 2975, 2950, 1745, 16
05, 1555,1495, 1365, 1225, 1075, 10351 Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6／ＴＭＳ：δ（ｐｐ
ｍ））：2.41(3H, s, CH3), 3.3〜3.73(3H, m),3.82(3
H, s, CH3O), 4.59〜4.68(2H, m),4.97(1H, d, J=5.4H
z),5.78(1H, d, J=5.4Hz),7.06(2H, A2'X2', J=8.9Hz),
7.95(2H, A2'X2', J=8.9Hz),8.77(1H, d, J=1.5Hz), 8.
94(1H, d, J=1.5Hz)
65, 1490,1405, 1240, 1090, 1080, 1010 ＩＲ（ＫＢｒ：ｃｍ-1）：3450, 2975, 2950, 1745, 16
05, 1555,1495, 1365, 1225, 1075, 10351 Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6／ＴＭＳ：δ（ｐｐ
ｍ））：2.41(3H, s, CH3), 3.3〜3.73(3H, m),3.82(3
H, s, CH3O), 4.59〜4.68(2H, m),4.97(1H, d, J=5.4H
z),5.78(1H, d, J=5.4Hz),7.06(2H, A2'X2', J=8.9Hz),
7.95(2H, A2'X2', J=8.9Hz),8.77(1H, d, J=1.5Hz), 8.
94(1H, d, J=1.5Hz)
【００３１】実施例１−３ 実施例１−１で用いた糖誘導体の代わりに２，３，４，
６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル
ブロミド０．１７ｇ（０．４１ｍｍｏｌ）を用いた以外
は、実施例１−１と同様に反応を行うと、β体のみが収
量０．０３ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、収率１６％で得ら
れた。
６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル
ブロミド０．１７ｇ（０．４１ｍｍｏｌ）を用いた以外
は、実施例１−１と同様に反応を行うと、β体のみが収
量０．０３ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、収率１６％で得ら
れた。
【００３２】スペクトルデータは次の通りである。 ＭＳ（ＦＡＢ：ｍ／Ｚ）：５８６（Ｍ＋Ｈ）+，２５６ Ｅｘａｃｔ ＭＳ：５８６．２０２３ Ｃ28Ｈ32Ｏ11Ｎ3の計算値：５８６．２０３７ ＩＲ（ＫＢｒ：ｃｍ-1）：3450, 2975, 2950, 1745, 16
05, 1555,1495, 1365, 1225, 1075, 10351 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ：δ(ｐｐｍ)）：1.82
(3H, s, CH3CO), 2.04(3H, s, CH3CO),2.06(3H, s, CH3
CO), 2.18(3H, s, CH3CO),2.46(3H, s, CH3),3.70(1H,
ddd, J=9.6, 2.5, 2.0Hz),3.87(3H, s, CH3O),4.06(1H,
dd, J=12.4, 2.0Hz),4.24(1H, dd, J=12.6, 5.7Hz),4.
94(1H, d, J=7.9Hz),5.19(1H, t, J=9.7Hz),5.29(1H,
t, J=9.4Hz),5.42(1H, t, J=8.7, 7.9Hz),6.99(2H, A2'
X2', J=8.9Hz),7.86(2H, A2'X2', J=8.9Hz),8.33(1H,
d, J=1.5Hz),8.94(1H, broad s)
05, 1555,1495, 1365, 1225, 1075, 10351 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ：δ(ｐｐｍ)）：1.82
(3H, s, CH3CO), 2.04(3H, s, CH3CO),2.06(3H, s, CH3
CO), 2.18(3H, s, CH3CO),2.46(3H, s, CH3),3.70(1H,
ddd, J=9.6, 2.5, 2.0Hz),3.87(3H, s, CH3O),4.06(1H,
dd, J=12.4, 2.0Hz),4.24(1H, dd, J=12.6, 5.7Hz),4.
94(1H, d, J=7.9Hz),5.19(1H, t, J=9.7Hz),5.29(1H,
t, J=9.4Hz),5.42(1H, t, J=8.7, 7.9Hz),6.99(2H, A2'
X2', J=8.9Hz),7.86(2H, A2'X2', J=8.9Hz),8.33(1H,
d, J=1.5Hz),8.94(1H, broad s)
【００３３】実施例２−１ １ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）６５０μｌに、１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈されたβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ水溶液２５μｌおよび実施例１
−２で得られた１００μＭ ３−（β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシルオキシ）−６−（４−メトキシフェニル）−２
−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジンのジメチルス
ルホキシド溶液７５μｌを加え、４０℃で２０分間イン
キュベートした。反応溶液から５００μｌをサンプリン
グし、化学発光測定器（東北電子産業社製，ＣＬＤ−１
００、商品名）により発光強度を１０秒間測定した。そ
の結果を表１に示す。
（ｐＨ８．０）６５０μｌに、１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈されたβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ水溶液２５μｌおよび実施例１
−２で得られた１００μＭ ３−（β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシルオキシ）−６−（４−メトキシフェニル）−２
−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジンのジメチルス
ルホキシド溶液７５μｌを加え、４０℃で２０分間イン
キュベートした。反応溶液から５００μｌをサンプリン
グし、化学発光測定器（東北電子産業社製，ＣＬＤ−１
００、商品名）により発光強度を１０秒間測定した。そ
の結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】表１の結果から、酵素の量に応じた発光量
が観察されたことがわかる。そして、ｌｏｇ（酵素量，
ｍｏｌ／ｔｅｓｔ）とｌｏｇ（発光量，ｃｏｕｎｔｓ／
１０ｓ）との関係式は次式（５）
が観察されたことがわかる。そして、ｌｏｇ（酵素量，
ｍｏｌ／ｔｅｓｔ）とｌｏｇ（発光量，ｃｏｕｎｔｓ／
１０ｓ）との関係式は次式（５）
【数１】 log（発光量，counts/10s) ＝1.08 × log（酵素量，mol/test） ＋ 19.27 …（５） 相関係数ｒ＝0.992 で表わされるので、発光量によりβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼを定量することができることがわかる。従って、実
施例のウミホタルルシフェリン誘導体はβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼの化学発光基質として有用である。
ーゼを定量することができることがわかる。従って、実
施例のウミホタルルシフェリン誘導体はβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼの化学発光基質として有用である。
Claims (5)
- 【請求項１】 下記一般式（１）で表わされるウミホタ
ルルシフェリン誘導体。 【化１】 （式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。） - 【請求項２】 下記一般式（２）で表わされるウミホタ
ルルシフェリン中間体。 【化２】 （式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。Ｒ4は炭素数１〜７のアシル基
を示す。） - 【請求項３】 一般式（３） 【化３】 （式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。）で表わされるイミダゾピラジ
ン誘導体と、一般式（４） 【化４】 （式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ4は炭素数１〜７のアシ
ル基を示す。）で表わされる糖誘導体とを、トルフルオ
ロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存
在下に反応させて、一般式（２） 【化５】 （式中、Ｒ1〜Ｒ4およびｎは上記と同じものを示す。）
で表わされるウミホタルルシフェリン中間体を製造した
後、アルカリ存在下に加溶媒分解することを特徴とする
一般式（１） 【化６】 （式中、Ｒ1〜Ｒ3およびｎは上記と同じものを示す。）
で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体の製造方
法。 - 【請求項４】 一般式（３） 【化７】 （式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。）で表わされるイミダゾピラジ
ン誘導体と、一般式（４） 【化８】 （式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ4は炭素数１〜７のアシ
ル基を示す。）で表わされる糖誘導体とを、トルフルオ
ロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存
在下に反応させることを特徴とする一般式（２） 【化９】 （式中、Ｒ1〜Ｒ4およびｎは上記と同じものを示す。）
で表わされるウミホタルルシフェリン中間体の製造方
法。 - 【請求項５】 糖加水分解酵素によりウミホタルルシフ
ェリン誘導体が分解されることによって発光する発光量
を測定することにより糖加水分解酵素の酵素量を定量す
る方法であって、ウミホタルルシフェリン誘導体として
下記一般式（１）で表わされるウミホタルルシフェリン
誘導体を使用することを特徴とする糖加水分解酵素の定
量方法。 【化１０】 （式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素
数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基
または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ
3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎ
は０〜５の整数を示す。）
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