KR20140003430A - 코엘렌테라진 유도체 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents

코엘렌테라진 유도체 및 이를 이용하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20140003430A
KR20140003430A KR1020137014031A KR20137014031A KR20140003430A KR 20140003430 A KR20140003430 A KR 20140003430A KR 1020137014031 A KR1020137014031 A KR 1020137014031A KR 20137014031 A KR20137014031 A KR 20137014031A KR 20140003430 A KR20140003430 A KR 20140003430A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
alkyl
substituted
heteroaryl
aryl
coelenterazine
Prior art date
Application number
KR1020137014031A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101968475B1 (ko
Inventor
디터 에이치. 클라우버트
폰초 마이젠하이머
제임스 언치
원후이 저우
Original Assignee
프로메가 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프로메가 코포레이션 filed Critical 프로메가 코포레이션
Publication of KR20140003430A publication Critical patent/KR20140003430A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101968475B1 publication Critical patent/KR101968475B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/02—Heterocyclic radicals containing only nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 비-발광성 효소를 위한 기질이며 발광성 효소를 위한 전구-기질인 코엘렌테라진 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 유도체를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

코엘렌테라진 유도체 및 이를 이용하는 방법{COELENTERAZINE DERIVATIVES AND METHODS OF USING SAME}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2010년 11월 2일에 출원된 미국 일련번호 제61/409,413호의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 효소의 존재 및 활성을 분석하기 위한 화합물 및 방법을 제공한다.
배경
효소의 존재 및 활성은 세포의 건강 또는 대사 상태를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 흔히 특정 효소의 출현 및 활성이 특정한 세포의 특징이기 때문에, 효소는 또한 특정 세포 유형에 대한 마커(marker)가 될 수 있다. 예를 들면, 특정 효소의 활성은 종종 박테리아, 식물 또는 동물 유래의 세포를 구별하기 위해 또는 그 효소가 유래된 조직의 출처를 구별하기 위해 사용될 수 있다.
글리코시드 가수분해 효소로도 알려진 글리코시다제(Glycosidase)는 글리코시드 결합을 가수분해하여 두 개의 더 작은 당을 생성하는 것을 촉매한다. 이들은 셀룰로스 및 헤미셀룰로스와 같은 생물질의 분해, 항-박테리아 방어 전략(예컨대, 리소자임)에서, 병원체발병 메커니즘(예컨대, 바이러스 뉴라미니다제)에서 및 일반 세포 기능(예컨대, N-결합형 당단백질 생합성에 관여하는트리밍(trimming) 만노시다제)에서를 비롯한 자연에서의 역할을 갖는 매우 흔한 효소이다. 박테리아 및 원핵생물에서, 글리코시다제는 영양분 섭취에 크게 관여하는 세포내 및 세포외 효소 둘다로서 발견된다. 박테리아에서 글리코시다제의 중요한 출현양상 중 하나는 효소 베타-갈락토시다제 (LacZ)이며, 이것은 E. coli에서 lac 오페론의 발현의 조절에 관여한다. 고등 생물에서, 글리코시다제는 이들이 N-결합형 당단백질의 가공에 관여하는 소포체 및 골지체(Golgi apparatus) 내에서 발견되며, 리소좀에서 탄수화물 구조물의 분해에 관여하는 효소로서 발견된다. 특정한 리소좀 글리코시다제의 결핍은 발달 장애 또는 사망을 야기하는 다양한 리소좀 축적 장애를 유발할 수 있다. 글리코시다제는 체내에서 글리코겐의 생합성 및 분해에 관여한다. 글리코실전달효소와 함께, 글리코시다제는 글리코시드 결합의 합성 및 분해를 위한 주요 촉매성 처리장치를 형성한다.
디아포라제(Diaphorase)는 디- 및 트리- 포스포피리딘 뉴클레오티드, 즉, NADH, NADPH의 환원된 형태로부터 다양한 화합물의 환원을 촉매하는 흔한 부류의 플라빈-결합 효소이며, 수소 수용체로서 기능한다. 세포성 에너지 대사는 일련의 효소적 및 화학적 반응을 통해 세포가 에너지를 저장하도록 허용하는 복잡한 과정이다. 세포성 에너지 대사의 한 가지 본질적 측면은 세포의 환원-산화 상태이다. 생존 세포의 대사 상태뿐만 아니라 효소 활성 및/또는 대사산물 수준의 분석은 보조-인자 NAD(P)/NAD(P)H를 나타내는 산화환원을 측정함으로써 결정될 수 있다.
요약
한 양상에서, 본 발명은 식 (I)의 화합물을 제공하며:
Figure pct00001
(I)
여기서 R2는 -(CH2)n-T 또는 C1 -5 알킬이고;
R2'는 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고;
R6은 -H, -OH, -NH2 -OC(O)R 또는 -OCH2OC(O)R으로 이루어진 군에서 선택되고;
R8은
Figure pct00002
,
Figure pct00003
, H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
L은 연결기이고;
n은 0 내지 3이고;
각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고;
T는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 시클로알킬이고;
V는 -S- 또는 -O-이고; 및
파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타낸다.
또다른 양상에서, 본 발명은 식 (II)의 화합물을 제공하며:
Figure pct00004
(II)
여기서 R2는 -(CH2)n-T 또는 C1 -5 알킬이고;
R6은 -H, -OH, -NH2, -OC(O)R 또는 -OCH2OC(O)R로 이루어진 군에서 선택되고;
R8은
Figure pct00005
,
Figure pct00006
, H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
R11은 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
L'은 직접적인 결합이거나 연결기이고;
n은 0 내지 3이고;
각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고;
T는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 시클로알킬이고;
V는 -S- 또는 -O-이고; 및
파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타낸다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 식 (III)의 화합물을 제공하고:
Figure pct00007
(III)
여기서 R6은 -H, -OH, -NH2 -OC(O)R 또는 -OCH2OC(O)R로 이루어진 군에서 선택되고;
R8은
Figure pct00008
,
Figure pct00009
, H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
R12는 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
L'은 직접적인 결합이거나 연결기이고;
V는 -S- 또는 -O-이고;
각각의 X는 독립적으로 -S-, -O- 또는 -NH-이고;
각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고; 및
파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타낸다.
또다른 양상에서, 본 발명은 식 (IV)의 화합물을 제공하고:
Figure pct00010
(IV)
여기서 R2는 -(CH2)n-T 또는 C1 -5 알킬이고;
R8은
Figure pct00011
,
Figure pct00012
, H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
R16은 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA 로 이루어진 군에서 선택되고.
여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
L'는 직접적인 결합이거나 연결기이고;
n은 0 내지 3이고;
T는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 시클로알킬이고;
V는 -S- 또는 -O-이고;
각각의 X는 독립적으로 -S-, -O- 또는 -NH-이고;
각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고; 및
파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타낸다.
본 발명은 또한 상기 화합물을 이용하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 z-DEVD-코엘렌테라진-h의 생물학적 시험의 결과를 나타낸다.
도 2는 오플로포러스(Oplophorus)-유래 루시페라제 및 z-DEVD-코엘렌테라진-h를 이용한 카스파제 3 분석의 결과를 나타낸다.
도 3은 적합한 연결기를 나타낸다.
도 4는 유도될 수 있는 코엘렌테라진을 나타낸다.
도 5는 글리코시다제 분석에서 유용한 전구-코엘렌테라진 당류의 예를 나타낸다.
도 6은 효소에 대한 다양한 펩티딜 기질을 나타낸다.
도 7은 프로테아제 분석에서 사용하기에 적합한 전구-코엘렌테라진을 나타낸다.
도 8은 화합물 40 및 50을 이용하여 측정된 발광도와 세포 수 사이의 직접적인 관계를 보여주는 세포 수와 발광도 사이의 선형 상관관계를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 전구-코엘렌테라진을 이용한 NADH의 검출을 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 다른 적합한 전구-코엘렌테라진 기질을 나타낸다.
상세한 설명
본 발명은 샘플 내 다양한 효소의 존재 및 활성을 분석하기 위한 화합물 및 방법을 제공한다.
달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 용어 "포함하는"은 본 명세서의 맥락에서 "포함하는"에 의해 도입된 목록의 구성원 이외에 추가적인 구성원이 임의로 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 그러나 본 발명의 특정한 구체예로서 용어 "포함하는"이 어떠한 추가적인 구성원도 존재하지 않을 가능성을 포괄하는 것, 즉 이 구체예의 목적을 위해 "포함하는"이 "~로 구성된"의 의미를 가지는 것으로서 이해되어야 하는 것이 고려된다.
본 명세서에서 사용된, 다음의 용어 및 표현들은 지정된 의미를 갖는다. 본 발명의 화합물이 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 함유하며 광학적으로 활성이거나 라세미 형태로 단리될 수 있는 점이 이해될 것이다. 광학적으로 활성인 형태를 어떻게 제조하는 지는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 가령 라세미 형태의 분해에 의한 것 또는 광학적으로 활성인 출발 물질로부터 합성에 의한 것이 있다. 모든 키랄, 부분입체이성질체, 라세미 형태 및 모든 기하학적 이성질체 형태의 구조가 본 발명에 포함된다.
라디칼, 치환기, 및 범위를 위해 하기에 나열되는 특정한 수치는 단지 예시를 위한 것이다. 이들은 라디칼 및 치환기에 대해 다른 정의된 수치 또는 정의된 수치 내의 다른 수치를 배제하지 않는다.
정의
용어 "알킬"은 탄화수소 화합물로부터 수소 원자를 제거하여 수득된 일가 부분(moiety)을 지칭한다. 알킬 기는 1-30개 탄소 원자, 또는 1-12개 탄소 원자, 또는 1-10개 탄소 원자 또는 1-6개 탄소 원자 또는 1-4개 탄소 원자를 함유할 수 있다. 알킬 기는 곧은-사슬이거나 분지될 수 있고 포화되거나, 부분적으로 불포화되거나, 또는 전부 불포화될 수 있다. 알킬 기는 임의로 예를 들면, 할로로 치환될 수 있다. 곧은-사슬 알킬 기의 예는 에틸, n-프로필, n-부틸, 및 n-프로필, n-헥실 및 n-헵틸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 곧은-사슬 불포화된 알킬 기의 예는 에테닐(비닐,-CH=CH2), 2-프로페닐(알릴, -CH-CH=CH2), 및 부테닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화된 알킬의 예는 에티닐 및 2-프로피닐(프로파르길)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 분지된 알킬 기의 예는 이소프로필, 이소-부틸, sec-부틸, t-부틸 및 이소-펜틸을 포함한다.
용어 "아미노산"은 천연 및 비천연 아미노산을 모두 지칭한다. 이는 또한 보호된 천연 및 비천연 아미노산을 포함한다.
용어 "아릴"은 방향족 고리로부터 수소 원자를 제거하여 수득된 일가 부분을 지칭한다. 아릴 기는 6-10개 탄소 원자(C6 -10 아릴)을 가질 수 있다. 예를 들면, 아릴 기는 페닐 또는 나프틸일 수 있다.
용어 "할로"는 Cl, F, Br 또는 I와 같은 할로겐을 지칭한다.
용어 "헤테로아릴"은 헤테로방향족 고리로부터 수소 원자를 제거하여 수득된 일가 부분을 지칭한다. 헤테로방향족 고리는 5-10개 고리 원자(C5 -10 헤테로아릴 ("C"의 사용은 그 원자가 C, N, O, 또는 S이든 상관없이 고리 원자의 총 수를 의미하는 것으로 이해된다).)를 가질 수 있다. 고리 원자는 탄소, 질소, 황 또는 산소일 수 있다. 하나 초과의 헤테로원자가 고리 내에 존재할 수 있다. 예를 들면, 헤테로아릴 기는 푸릴, 티에닐, 티아졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴 또는 테트라졸릴일 수 있다.
용어 "연결기"는 코엘렌테라진 중심에 기질 부분을 연결하는 2 내지 50개 원자의 사슬을 지칭한다. 연결기는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. 연결기는 또한 옥소 기, 아미노 기, 알킬 기, 할로겐 및 니트로 기로 치환될 수 있다. 연결기는 또한 아릴 기를 함유할 수 있다. 적합한 연결기는 도 3에 나타난 연결기, 가령 p-아미노벤질 연결기를 포함한다. 연결기는 적절하게는 "흔적없는" 또는 "자가-희생적(self-immolative)" 연결기이다. 용어 "흔적없는 연결기" 또는 "자가-희생적 연결기"는 연결기로부터 기질 부분의 절단이 코엘렌테라진 중심으로부터 연결기의 자발적인 절단을 야기하여 코엘렌테라진을 방출하는 연결기를 지칭한다. 예시적인 "자가-희생적 연결기"는 도 3에 나타난 연결기를 포함한다.
용어 "저급 시클로알킬"은 3 내지 6개 탄소 원자를 가지는 탄화수소 화합물로부터 수소 원자를 제거하여 수득된 일가 부분을 지칭한다. 포화된 저급 시클로알킬 기의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실과 같은 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 불포화된 저급 시클로알킬 기의 예는 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐 및 시클로헥세닐과 같은 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "발광성 효소"는 달리 명시되지 않는 한, 코엘렌테라진을 기질로서 사용하는 자연 발생적인, 재조합 또는 돌연변이 발광성 효소를 지칭한다. 자연 발생적인 경우의 발광성 효소는 당해 분야의 숙련가에 의해 유기체로부터 쉽게 수득할 수 있다. 발광성 효소가 자연발생적이거나 재조합 또는 돌연변이 발광성 효소인 것인 경우, 즉 자연 발생적인 발광성 효소의 루시페라제-코엘렌테라진 반응에서 활성을 보유하는 효소일 경우, 이는 발광성 효소를 암호화하는 핵산을 발현하도록 형질전환된 박테리아, 효모, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 등의 배양물로부터 쉽게 얻을 수 있다. 또한, 재조합 또는 돌연변이 발광성 효소는 루시페라제를 암호화하는 핵산을 사용하여 시험관 내(in vitro) 무-세포 시스템으로부터 유도될 수 있다. 적합한 발광성 효소는 생체발광성 십완목(decapod)으로부터, 가령 오플로포루스과(Oplophoroidea), 예컨대, 오플로포러스-유래 루시페라제, 수중 생물 가령 자포동물(예컨대, 레닐라(Renilla) 루시페라제), 십각목(Aristeidae), 대롱수염새우과(Solenoceridae), 루시페르과(Luciferidae), 젓새우과(Sergestidae), 돗대기새우과(Pasipheidae) 및 도화새우상과(Thalassocarididae) 십각목과로부터 유래된 루시페라제, 및 에쿼린(Aequorin)과 같은 발광단백질을 포함한다.
"발광성 반응 혼합물"은 발광성 효소가 빛 신호를 생성, 즉, 발광을 가능하게 할 물질을 함유한다. 혼합물은 또한 상기 효소를 함유할 수 있다. 발광성 신호를 생성하기 위해 필요한 물질, 및 필요한 물질의 특정한 농도 및/또는 양은 사용되는 발광성 효소뿐 아니라 수행되는 분석의 유형에 따라 달라질 것이다. 흔히 다음을 비롯한 다른 물질이 상기 용액에 부가될 것이다: 반응물을 적절한 pH로 유지하기 위한 완충제, 효소 활성을 유지하도록 보조하는 PRIONEX 또는 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)과 같은 첨가제, 환원제, 계면활성제, 등.
용어 "펩티드"는 적어도 두 개의 아미노산의 서열을 지칭한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 80개 이하의 아미노산, 또는 35개 이하의 아미노산, 또는 10개 이하의 아미노산을 함유할 수 있다.
용어 "당류"는 당 또는 다른 탄수화물, 특히 단순 당을 지칭한다. 이는 알파- 및 베타-아노머(anomer)를 둘다 포함한다. 당류는 C6-폴리히드록시 화합물, 전형적으로 C6-펜타히드록시, 및 흔히 시클릭 글리칼일 수 있다. 이는 공지의 단순 당 및 이들의 유도체, 뿐만 아니라 둘 이상의 단당류 잔기를 갖는 다당류를 포함한다. 당류는 히드록실 기 상에 보호 기를 포함할 수 있다. 당류의 히드록실 기는 하나 이상의 아세트아미도, 할로 또는 아미노 기로 대체될 수 있다. 부가적으로, 하나 이상의 탄소 원자는, 예를 들면 케토 또는 카르보닐 기로 산화될 수 있다. 적합한 당류는 갈락토스, 글루코스, 글루코론산 및 뉴로민산을 포함한다.
용어 "치환된"은 "치환된"을 사용한 표현에서 지시된 기 상의 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개; 일부 구체예에서 1, 2, 또는 3개; 및 다른 구체예에서 1 또는 2개)의 수소가 지시된 기(들)로부터의 선택으로, 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적합한 기로 대체됨을 가리키도록 의도되며, 단 지시된 원자의 일반적 원자가를 초과하지 않는 것, 그리고 이러한 치환이 안정한 화합물을 야기함을 전제로 한다. 적합한 치환기는 할로, 히드록실, 페닐, -NH2, -NHMe, -NMe2, -SH, -CH(OMe)2, -CF3, -OCH3, -SCH3, C1 -4 알킬, 피페라지닐, 및 아릴로 치환된 피페라지닐을 포함한다.
화합물
코엘렌테라진은 광범위한 생체발광성 단백질, 가령 해양 루시페라제에 의해 활성화되는 경우 발광하는 것으로 공지되어 있다. 해양 루시페라제의 예는 레닐라 루시페라제, 에쿼린, 고시아(Gaussia) 루시페라제, 오플로포러스 루시페라제, 및 갯반디(Cypridina) 루시페라제를 포함한다.
본 발명은 비-발광성 효소를 위한 기질 및 발광성 단백질을 위한 전구-기질 둘 다인 코엘렌테라진 유도체를 제공한다. 일단 관심의 비-발광성 효소에 의해 활성화되면, 상기 유도체는 발광성 단백질을 위한 기질이 되며, 따라서 당해 분야의 숙련가에게 공지된 수단에 의해 검출가능하다.
일부 구체예에서, 상기 유도체는 아래에 나타나는 식 I-IV의 화합물이며:
(1)
Figure pct00013
(I)
여기서 R2는 -(CH2)n-T 또는 C1 -5 알킬이고;
R2'는 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고;
R6은 -H, -OH, -NH2 -OC(O)R 또는 -OCH2OC(O)R로 이루어진 군에서 선택되고;
R8은
Figure pct00014
,
Figure pct00015
, H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
L은 연결기이고;
n은 0 내지 3이고;
각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고;
T는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 시클로알킬이고;
V는 -S- 또는 -O-이고; 및
파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타낸다;
(2)
Figure pct00016
(II)
여기서 R2는 -(CH2)n-T 또는 C1 -5 알킬이고;
R6은 -H, -OH, -NH2, -OC(O)R 또는 -OCH2OC(O)R로 이루어진 군에서 선택되고;
R8은
Figure pct00017
,
Figure pct00018
, H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
R11은 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
L'은 직접적인 결합이거나 연결기이고;
n은 0 내지 3이고;
각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고;
T는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 시클로알킬이고;
V는 -S- 또는 -O-이고; 및
파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타낸다;
(3)
Figure pct00019
(III)
여기서 R6은 -H, -OH, -NH2 -OC(O)R 또는 -OCH2OC(O)R로 이루어진 군에서 선택되고;
R8은
Figure pct00020
,
Figure pct00021
, H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
R12는 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
L'은 직접적인 결합이거나 연결기이고;
V는 -S- 또는 -O-이고;
각각의 X는 독립적으로-S-, -O- 또는 -NH-이고;
각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고; 및
파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타내거나; 또는
(4)
Figure pct00022
(IV)
여기서 R2는 -(CH2)n-T 또는 C1 -5 알킬이고;
R8은
Figure pct00023
,
Figure pct00024
, H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
R16은 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고.
여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
L'은 직접적인 결합이거나 연결기이고;
n은 0 내지 3이고;
T는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 시클로알킬이고;
V는 -S- 또는 -O-이고;
각각의 X는 독립적으로 -S-, -O- 또는 -NH-이고;
각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고; 및
파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타낸다.
일부 구체예에서, R2는
Figure pct00025
,
Figure pct00026
,
Figure pct00027
,
Figure pct00028
또는 C2 -5 알킬이고; 각각의 X는 독립적으로 -S-, -O- 또는 -NH-이고; Z는 -CH- 또는 -N-이고; Y는 -H 또는 -OH이고; W는 -NH2, 할로, -OH, -NHC(O)R, -CO2R이고; 및 R은 C1 -7 알킬이다.
일부 구체예에서, R2는
Figure pct00029
이고; 및 X는 O 또는 S이다. 다른 구체예에서, R2는 C2 -5 곧은-사슬 알킬이다. 특정 구체예에서, R8은
Figure pct00030
, 저급 시클로알킬 또는 H이고, 여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 C1 -2 알킬이다. 다른 구체예에서, R8은 벤질이다.
일부 구체예에서, V는 S이다.
적절하게는 본 발명의 화합물은 WO 2003/040100 및 미국 출원 일련 번호 제12/056,073호(문단 [0086])에 개시된 것들 외에도 자연-발생적("천연") 코엘렌테라진의 유도체뿐만 아니라 이들의 유사체, 가령 코엘렌테라진-n, 코엘렌테라진-f, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-hcp, 코엘렌테라진-cp, 코엘렌테라진-c, 코엘렌테라진-e, 코엘렌테라진-fcp, 비스-데옥시코엘렌테라진("코엘렌테라진-hh"), 코엘렌테라진-i, 코엘렌테라진-icp, 및 2-메틸 코엘렌테라진이며, 상기 개시는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다. 본 발명에 따라 유도될 수 있는 추가적인 적합한 코엘렌테라진은 도 4의 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 코엘렌테라진 유도체는 글리코시다제를 위한 기질이다. 적합한 유도체는 도 5에 나타난 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 코엘렌테라진 유도체는 프로테아제 가령 카스파제 2, 카스파제 3/7, 카스파제 6, 카스파제 8, 카스파제 9, 디펩티딜 펩티다제 4 (DPPIV), 칼페인, 키모트립신-유사 프로테아좀, 트립신-유사 프로테아좀, 카스파제-유사 프로테아좀, 그랜자임 B, 카텝신 B/L/K, 트롬빈, 트립신, 아미노펩티다제, 및 SARS 프로테아제를 위한 기질이다. 적합한 펩티드 및 아미노산, 및 이들을 기질로 하는 효소는 도 6에 나열된 것들을 포함한다. 부가적인 적합한 유도체는 도 7에 나열된 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 코엘렌테라진 유도체는 시토크롬 P450 효소를 위한 기질이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 코엘렌테라진 유도체는 디아포라제 효소를 위한 기질이다.
사용 방법
본 발명의 코엘렌테라진 유도체는 시토크롬 P450 효소, 프로테아제 또는 글리코시다제와 같은 비-발광성 효소의 존재 또는 활성을 검출하기 위한 분석 시약에서 사용될 수 있다. 발광성 효소 및 이들의 기질을 이용하는 분석은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 비-발광성 효소의 기질인 발광성 효소, 발광성 반응 혼합물 및 코엘렌테라진 유도체가 비-발광성 효소를 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 부가될 수 있다. 비-발광성 효소가 샘플에 존재하는 경우, 비-발광성 효소는 코엘렌테라진 유도체를 활성화시키고 이를 발광성 효소에 의해 인식되게 하여 발광성 신호를 생성할 것이다. 대안적으로, 비-발광성 효소는 광생성 코엘렌테라진 유도체를 비-발광성 형태로, 즉, 신호 분석의 없음으로 전환시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 분석은 코엘렌테라진의 화학발광을 이용할 수 있다. 예를 들면, 비-발광성 효소의 기질인 코엘렌테라진 유도체는 비-발광성 효소를 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 부가될 수 있다. 비-발광성 효소가 샘플 내에 존재하는 경우, 비-발광성 효소는 코엘렌테라진 유도체를 활성화시키고 이를 화학발광성이 되게 하여 널리-공지된 기술에 의해 검출가능하도록 할 것이다.
코엘렌테라진 유도체는 발광성 효소를 부가하기 전에 또는 동시에 샘플에 부가될 수 있다. 특정 구체예에서, 샘플은 세포일 수 있다. 세포는 진핵 세포, 예컨대, 효모, 조류, 식물, 곤충 또는, 인간, 유인원, 쥐, 개, 소, 말, 고양이, 양, 염소 또는 돼지 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유류 세포, 또는 원핵 세포, 또는 둘 이상의 상이한 유기체로부터의 세포, 또는 이들의 세포 용리액 또는 상청액일 수 있다. 세포는 재조합 기술을 통해 유전적으로 변형되었을 수 있다. 특정 양상에서, 세포는 동물, 예컨대, 형질전환 동물, 또는 생리적 액체, 예컨대, 혈액, 혈장, 뇨, 점액 분비물 등 내에 있을 수 있다.
샘플은 검출될 하나 초과의 비-발광성 효소를 함유할 수 있다. 이러한 경우에, 하나 초과의 발광성 효소가 사용될 수 있다. 게다가, 하나 초과의 기질이 사용될 수 있다. 복수의 기질 및/또는 발광성 효소가 복수의 비-발광성 효소 또는 다른 관심의 분자(들), 예컨대, 시험 화합물을 동시에, 예컨대, 다중다수의 반응에서 검출하기 위해 사용될 수 있다.
코엘렌테라진 유도체는 또한 세포를 분석하는 인시추(in situ) 방법에서 유용하다. 루시페라제를 이용하여 세포의 인시추 분석을 수행하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대, 미국 특허 제5,998,204호를 참조하라. 코엘렌테라진 유도체는 비-발광성 효소에 노출되기 전에는 발광성 효소의 기질이 아니다. 그렇지만, 비-발광성 효소에 노출되면, 유도체는 발광성 효소의 존재에서 빛-방출 반응으로 쉽게 검출될 수 있는 화합물로 전환된다. 따라서, 유도체는 비-발광성 효소가 세포 내에 위치하는 경우에 인시추 영상화로 측정될 수 있다. 이는 발광성 효소를 발현하는 세포를 코엘렌테라진 유도체와 접촉시킴으로써 진행될 수 있다.
대안적으로, 발광성 효소에 대한 유전자를 발현하는 형질전환 동물은 관심의 특정한 비-발광성 효소에 대한 기질인 코엘렌테라진 유도체를 투여받을 수 있다. 영상화 기술(예컨대, 생체내(in vivo) 광바이오(biophotonic) 영상화)가 이후 생존하는, 온전한 동물에서 발광성 효소 발현의 위치에서의 발광도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 발광성 효소를 발현하는 형질전환 동물은 적절한 관심의 비-발광성 효소가 발현되는 조직에서 발광성 효소를 위한 기질로 전환될 코엘렌테라진 유도체를 투여받을 수 있다. 발광성 효소가 또한 이러한 조직에서 발현되는 경우, 발광성 신호가 생성될 것이며 임의의 적합한 수단에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 시험 화합물, 예컨대, 약물은 동물-기반 분석에서 시험될 수 있다. 시험 화합물은 코엘렌테라진 유도체를 투여하기 전에 동물에 투여되어야 한다. 대안적으로, 형질전환 동물로부터의 조직이 조직 기반 분석에서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 비-형질전환 동물은 특정한 관심의 비-발광성 효소를 위한 기질인 코엘렌테라진 유도체를 투여받을 수 있다. 유도체는 적절한 비-발광성 효소가 발현되는 조직에서 발광성 효소를 위한 기질로 전환될 것이다. 생물학적 샘플, 예컨대, 혈액, 혈청, 담즙, 뇨, 배설물, 또는 조직이 동물로부터 수득되어 발광성 효소와 접촉될 수 있다. 생성된 신호는 임의의 적합한 수단에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 시험 화합물, 예컨대, 약물은 동물-기반 분석에서 시험될 수 있다. 시험 화합물은 코엘렌테라진 유도체를 투여하기 전에 동물에 투여되어야 한다.
일부 구체예에서, 시험 화합물 가령 후보 약물은 예컨대, (1) 비-루시페라제 효소의 기질로서, (2) 비-루시페라제 효소의 조절제, 예컨대, 저해제, 유도제 또는 활성화제로서, 또는 (3) 세포 조건(예컨대, 생존능력, 반응성 산소 종 증가, 또는 환원 전위 증가)의 조정제로서의 이들의 활성에 대해 선별되고 평가될 수 있다. 코엘렌테라진 유도체는 또한 비-루시페라제 효소의 기질과 저해제를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 선별은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기술된 생체광생성 분석 중 어느 하나에 있어서, 루시페라제의 비활성화를 저해 또는 방지, 또는 다른 경우 발광성 신호를 확장 또는 증진하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 시약이 반응 혼합물에 부가될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 하나 이상의 비-루시페라제 효소의 존재 또는 활성을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 코엘렌테라진 유도체(들), 비-루시페라제 효소(들), 코엘렌테라진-의존성 발광성 효소(들), 및 반응 완충제(들). 반응 완충제는 비-루시페라제 효소 반응 및 발광성 효소 반응을 위한 개별적인 제제 내 또는 단일 단계 분석을 위한 단일 제제 내에 존재할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 비-루시페라제 효소(들)을 위한 저해제, 활성화제 및/또는 증진제를 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 분석에 대한 양성 및/또는 음성 대조를 함유할 수 있다.
본 발명은 하기의 비-제한적 실시예에 의해 더욱 설명된다.
실시예
실시예 1: z- DEVD - 코엘렌테라진 -h (화합물 21)의 합성
Figure pct00031
tert -부틸 3-((((9H- 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)아미노)-4-((4-( 히드록시메틸 ) 페닐 )아미노)-4- 옥소부타노에이트 (13) : 플라스크에 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (6.7 g, 16.28 mmol) 및 100 ml의 건조 THF를 채웠다. 상기 용액에, 주변 온도에서, 무첨가 N-메틸모르폴린(1.9 mL, 17.28 mmol)을 부가하고, 용액을 -20℃까지 냉각하였다. 무첨가 이소부틸클로로포르메이트(2.2 mL, 16.96 mmol)를 시린지를 통해 부가하고 생성된 현탁액을 10분간 교반하였다. 아미노 알코올(2.0 g, 16.24 mmol)을 한 번에 부가하고, 반응 혼합물을 10분간 교반한 후 냉각조를 제거하고 주변 온도에서 2시간 동안 계속해서 교반하였다. 반응 혼합물을 300 mL의 에틸 아세테이트로 희석하고, 혼합물을 순서대로 2회의 50 mL 분량의 물, 50 mL의 0.5 M HCl 및 2회의 50 mL 분량의 염수 용액으로 세척하였다. 유기상을 건조하고(MgSO4) 진공하에 농축하였다. 잔사를 헵탄/에틸 아세테이트 구배를 이용하여 실리카 상에서 크로마토그래피 처리하였다. 이를 통해 5.2 g (10.7 mmol)의 생성물을 백색 고체로서 얻었다. 1H NMR (300 MHz, dmso) d 10.02 (s, 1H), 7.89 (d, J = 7.5, 2H), 7.81 - 7.67 (m, 3H), 7.55 (d, J = 8.4, 2H), 7.47 - 7.27 (m, 4H), 7.24 (d, J = 8.4, 2H), 5.09 (t, J = 5.7, 1H), 4.51 (m, 1H), 4.43 (d, J = 5.7, 2H), 4.37 - 4.16 (m, 3H), 2.76 - 2.51 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
tert -부틸 3-((((9H- 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)아미노)-4-((4-( 클로로메틸 ) 페닐 )아미노)-4- 옥소부타노에이트 (14) : 플라스크에 알코올 (13) (0.5 g, 0.97 mmol) 및 15 mL의 건조 벤젠을 채웠다. 상기 현탁액에, 주변 온도에서, 무첨가 트리에틸아민을 부가하고, 2분간 교반한 후에, 혼합물을 얼음/물 수조에서 10분간 냉각시켰다. 여기서, 무첨가 티오닐 클로라이드(78 μL, 1.07 mmol)를 부가하고, 2분 후에, 냉각 조를 제거하고 주변 온도에서 3시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고, 여과 케이크를 30 mL의 건조 벤젠으로 헹구었다. 여액을 진공 하에 농축하고, 잔사를 메틸렌 클로라이드를 이용하여 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이를 통해 457 mg(0.85 mmol)의 생성물을 끈적한 백색 고체로서 얻었다. 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 10.16 (s, 1H), 7.89 (d, J = 7.5, 2H), 7.79 (d, J = 8.1, 1H), 7.76 - 7.68 (m, 2H), 7.61 (d, J = 8.5, 2H), 7.44 - 7.27 (m, 6H), 4.72 (s, 2H), 4.58 - 4.44 (m, 1H), 4.33 - 4.18 (m, 3H), 2.63 (ddd, J = 6.0, 14.6, 21.8, 2H), 1.37 (s, 9H).
화합물 17 및 18 : 건조 플라스크에 아르곤 대기 하에 코엘렌테라진-h (7) (200 mg, .37 mmol) 및 15 mL의 무수, 산소가 제거된 DMF를 채웠다. 상기 용액에, 주변 온도에서, 칼륨 아이오다이드(31 mg, 0.19 mmol) 및 칼륨 카르보네이트(51 mg, 0.37 mmol)를 부가하고, 혼합물을 약 2분간 교반하였다. 여기에, 화합물 14를 부가하고, 혼합물을 18시간 동안 교반하였다. 생성물을 역상 및 정상 크로마토그래피 둘다에 의해 정제하였다.
화합물 19 및 20 : 주변 온도에서 3 mL의 디클로로메탄 내 화합물 17 또는 18(365 mg, 0.4 mmol)의 용액에, 7 mL의 디클로로메탄 내 피페리딘(2 mL)의 용액을 부가하였다. 반응 혼합물을 30분간 교반하고, 50 mL의 톨루엔으로 희석하고 진공하에서 농축하였다. 잔사를 아세토니트릴에 대한 0.1% TFA/물의 구배를 이용하여 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 위치이성질체의 혼합물(133 mg, 0.19 mmol)을 2 mL의 건조 DMF에 용해시키고, HOBt(30 mg, 0.22 mmol) 및 z-DEVD-CO2H(140 mg, 0.23 mmol)를 부가하였다. 상기 용액에, 주변 온도에서, EDC(42 mg, 0.22 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 미정제 반응 혼합물을 1 mL의 아세토니트릴로 희석하고 아세토니트릴에 대한 20 mM 암모늄 아세테이트의 구배를 이용하여 역상 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이를 통해 54 mg의 화합물 19 및 69 mg의 화합물 20을 얻었다.
화합물 21 : 화합물 19 및 20의 미정제 혼합물을 2 mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 상기 용액에 주변 온도에서, 4 mL 트리플루오로아세트산, 2 mL의 디클로로메탄, 0.4 mL의 트리이소프로필실란 및 0.4 mL의 티오아니솔로 이루어진 탈보호 칵테일을 부가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하고 30 mL의 디에틸 에테르로 희석하였다. 현탁액을 원심분리하고, 고체를 10 mL 분량의 디에틸 에테르로 두 차례 트리터레이션하였다(triturated). 잔사를 2 mL의 메탄올에 용해시키고 아세토니트릴에 대한 20 mM 암모늄 아세테이트의 구배를 이용하여 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이를 통해 9 mg의 화합물 21을 주황색 고체로서 얻었다.
실시예 2: z- DEVD - 코엘렌테라진 -h (화합물 21)의 생물학적 시험
화합물 21(50 μM)을 50 mM HEPES 완충제 pH 7.2, 2 mM DTT, 및 0.5% CHAPS 내에서 레닐라 루시페라제(6.5 μg/ml, 레닐라-GST 융합)과 조합하고 20분간 항온처리하여 레닐라 루시페라제를 위한 기질이 될 수 있는 임의의 유리 코엘렌테라진 유도체를 제거하였다. 정제된 카스파제-3 효소(50 U/ml) 또는 완충제 대조용액을 25μM Z-DEVD-코엘렌테라진 h 유도체 기질, 25U/ml 카스파제-3 및 3.25 ug/ml 루시페라제의 최종 농도에 대해 1:1 부피 비로 부가하였다. 110 분에 걸쳐 발광도를 측정하였다. 시간이 지나면서, 카스파제를 함유하지 않았던 대조 샘플에 비해 발광도에서 일백-배 증가가 나타났으며, 이는 코엘렌테라진의 효소적 방출을 나타내며 본 발명의 코엘렌테라진 화합물이 카스파제 효소를 검출하기 위해 사용될 수 있음을 증명한다(도 1).
실시예 3: z- DEVD - 코엘렌테라진 -h (화합물 21)의 대안적 합성
Figure pct00032
(R)- tert -부틸 3-아미노-4-(4-( 히드록시메틸 ) 페닐아미노 )-4- 옥소부타노에이트 (c) . 250 mL 둥근 바닥 플라스크에서, b (6 g, 0.011 mole)를 디메틸 포름아미드(60 mL)에 용해하였다. 피페리딘(10 mL)을 부가하였다. 4시간 후에, TLC가 반응 완료를 표시하였다. 용매를 증발시켰다. 잔사를 셀라이트(Celite)상에 로딩시키고(250 mL EtOAc 내 15 g) 실리카(80 g) 상에서 MeOH에 대한 DCM 상승(DCM 내 10%)으로 용리함으로써 정제하였다. 조합된 분획을 증발시켰다. 수율 (76%); Rf = 0.2 (50/50 헵탄/EtOAc), 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 7.56 (d, J = 8.3, 2H), 7.22 (d, J = 8.3, 2H), 5.06 (t, J = 5.4, 1H), 4.41 (d, J = 4.6, 2H), 3.61 (t, J = 6.5, 1H), 2.59 (dd, J = 5.8, 15.5, 1H), 2.41 (dd, J = 7.2, 15.6, 1H), 1.35 (s, 9H); m/z.
(5S,8S,11R,14R)- tert -부틸 5-(2- tert - 부톡시 -2-옥소에틸)-8-(3- tert - 부톡시 -3- 옥소프로필 )-14-(4-( 히드록시메틸 ) 페닐카르바모일 )-11-이소프로필-3,6,9,12- 테트라옥소 -1- 페닐 -2-옥사-4,7,10,13- 테트라아자헥사데칸 -16- 오에이트 (d) . 100 mL 둥근 바닥 플라스크에, Z-D(tBu)E(tBu)V-OH (3.96 g, 6.5 mmol), c (1.6 g, 5.4 mmol), HOBt (0.915 g, 5.9 mmol), 및 DMF (25 mL)를 부가하였다. 교반되는 용액에, EDAC (1.15 g, 5.9 mmol)를 부가하였다. 18시간 후에, 용매를 증발시키고, 잔사를 EtOAc (200 mL)에 재용해시켰다. 용액을 시트르산(30% - 50 mL), 바이카르보네이트포화(50 mL), 물 (2 x 50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하였다. 물질을 셀라이트(15 g)상에 흡착시키고 실리카 상에서 EtOAc에 대해 헵탄을 증가시켜서 정제하였다. 수율 (74%). 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 9.85 (s, 1H), 8.33 (d, J = 7.7, 1H), 7.95 (d, J = 8.1, 1H), 7.83 (d, J = 8.3, 1H), 7.59 (d, J = 8.3, 1H), 7.53 (d, J = 8.5, 2H), 7.43 - 7.26 (m, 5H), 7.21 (d, J = 8.6, 2H), 5.06 (t, J = 5.7, 1H(D2O 혼합시 사라짐)), 5.02 (d, J = 4.7, 2H), 4.70 (q, J = 7.7, 1H), 4.41 (d, J = 5.6, 2H(D2O 혼합시 s로 합쳐짐)), 4.38 - 4.25 (m, 2H), 4.17 - 4.09 (m, 1H), 2.79 - 2.63 (m, 1H), 2.62 - 2.35 (m, 4H), 2.26 - 2.11 (m, 2H), 2.00 - 1.79 (m, 2H), 1.73 (d, J = 6.0, 1H), 1.34 (dd, J = 4.7, 7.4, 31H), 0.81 (t, J = 6.3, 6H). MS: C45H65N5O13 에 대한 계산값 883.5; 측정값 883.7.
(5S,8S,11R,14R)- tert -부틸 5-(2- tert - 부톡시 -2-옥소에틸)-8-(3- tert - 부톡시 -3- 옥소프로필 )-14-(4-( 클로로메틸 ) 페닐카르바모일 )-11-이소프로필-3,6,9,12- 테트라옥소 -1- 페닐 -2-옥사-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-16- 오에이트 (e) . 100 mL RB 플라스크에, d (3.56 g, 4 mmol)와 벤젠(50 mL)을 부가하였다. 용액을 증발시키고 밤새 고진공하에서 저장하였다. 건조 벤젠(70 mL)을 상기 고체에 TEA (610 μL, 4.4 mmol)와 함께 부가하였다. 용액을 얼음조에서 차갑게 식히고, SOCl2 (320 μL, 4.4 mmol)를 천천히 부가하였다. 용액을 실온까지 가온되게 하였다. 4시간 후에, 추가적인 TEA (241 μL) 및 SOCl2 (100 μL)를 부가하였다. 추가적인 2시간 후에, 반응 혼합물을 셀라이트(10 g) 상에 흡착시키고 실리카 상에서 DCM 내 5% MeOH에 대해 DCM을 상승시켜 용리하였다. 수율 (33%). 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 10.00 (s, 1H), 8.35 (d, J = 7.8, 1H), 7.95 (d, J = 7.8, 1H), 7.84 (d, J = 8.3, 1H), 7.67 (d, J = 8.6, 3H), 7.41 - 7.22 (m, 7H), 5.11 - 4.91 (m, 2H), 4.77 - 4.59 (m, 3H), 4.43 - 4.21 (m, 2H), 4.19 - 4.04 (m, 1H), 3.30 (s, (물)), 2.79 - 2.32 (m, 4H+DMSO), 2.26 - 2.07 (m, 2H), 2.00 - 1.79 (m, 2H), 1.77 - 1.60 (m, 1H), 1.40 - 1.24 (m, 27H), 0.81 (t, J = 6.4, 6H).
(5S,8S,11R,14R)- tert -부틸 5-(2- tert - 부톡시 -2- 옥소에틸 )-8-(3- tert - 부톡시 -3- 옥소프로필 )-14-(4-((2,8- 디벤질 -6-(4- 히드록시페닐 ) 이미다조 [1,2-a]피라진-3- 일옥시 ) 메틸 ) 페닐카르바모일 )-11-이소프로필-3,6,9,12- 테트라옥소 -1- 페닐 -2-옥사-4,7,10,13- 테트라아자헥사데칸 -16- 오에이트 (20) . 코엘렌테라진-h (50 mg, 122 μmol) 및 K2CO3 (34 mg, 245 μmol)를 함유하는 아르곤 탈기된 바이알에, DMF (500 μL) 내 e (133 mg, 147 μmol)의 탈기된 용액을 부가하였다. 2시간 후에, 반응물을 RP-HPLC상에 직접 주입하고 아세토니트릴에 대한 0.1% TFA(수성)의 상승으로 용리하였다. 중심 피크를 단리하고 증발시켰다. 수율 (13%). UV: 피크 250, 300, 및 420 nm. 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 9.79 (s, 1H), 8.27 (d, J = 7.5, 1H), 7.92 (d, J = 8.0, 1H), 7.85 (d, J = 10.1, 1H), 7.58 (d, J = 8.3, 1H), 7.53 (d, J = 8.7, 2H), 7.45 - 7.14 (m, 15H), 7.09 - 6.80 (m, 6H), 6.72 (d, J = 8.8, 2H), 5.13 - 4.90 (m, 2H), 4.73 - 4.53 (m, 1H), 4.22 (dd, J = 5.0, 17.7, 3H), 4.16 - 4.01 (m, 3H(D2O 혼합 후 2H)), 3.25 - 3.01 (m, J = 10.0, 16.5, 4H), 2.76 - 2.53 (m, J = 15.6, 2H), 2.51 - 2.33 (m, 2H+DMSO), 2.24 - 2.04 (m, 2H), 1.99 - 1.77 (m, 2H), 1.76 - 1.61 (m, 1H), 1.40 - 1.07 (m, 27H), 0.89 - 0.62 (m, 6H). MS: C71H84N8O14에 대한 계산값 1272.6; 측정값 1272.8.
실시예 4. 30의 합성
Figure pct00033
20 ml의 메틸렌 디클로라이드 내 코엘렌테라진 아세틸 에스테르(0.50 g, 1.14 mmol), 퀴논 트리메틸록 C2-디아민 카르보닐 클로라이드(0.436 g, 1.14 mmol), DMAP(0.139 g, 1.14 mmol) 및 TEA(0.115 g, 1.14 mmol)의 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 화합물을 용리제로서 헵탄/에틸 아세테이트를 이용하는 실리카 크로마토그래피로 정제하여 20%의 수율을 얻었다(0.184 g). 1H NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 8.47 (s, 1H), 8.04 (d, 2H), 7.55 (d, 2H), 7.0-7.5 (m, 9H), 4.57 (s, 2H, CH2), 4.16 (s, 2H, CH2), 3.2-3.7 (m, 4H, NCH2), 2.7-3.2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 2.30 (s, 3H, CH3), 1.0-2.2 (m, 15 H, CH3). MS (m/e): 796.5 (M+).
실시예 5. 40의 합성
Figure pct00034
40을 30(실시예 4)을 제조하기 위한 것과 유사한 방법을 사용하여 제조하였다. 화합물을 용리제로서 헵탄/에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 크로마토그래피로 정제하여 60%의 수율을 얻었다(0.32 g). 1H NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 8.47 (s, 1H), 8.03 (m, 2H), 7.57 (d, 2H), 7.1-7.5 (m, 7H), 6.33 (s, 1H), 6.17 (s, 1H), 4.58 (s, 2H, CH2), 4.19 (s, 2H, CH2), 3.3-3.7 (m, 4H, NCH2), 2.7-3.2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 1.0-2.2 (m, 15 H, CH3). MS (m/e): 728.5 (M+). HPLC 순도: 262 nm에서 90%.
실시예 6. 50의 합성
Figure pct00035
50을 PBI 4442(실시예 20)를 제조하기 위한 것과 유사한 방법을 사용하여 제조하였다. 화합물을 용리제로서 헵탄/에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 크로마토그래피로 정제하여 17%의 수율을 얻었다(0.15 g). 1H NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 8.42 (s, 1H), 7.99 (m, 2H), 7.57 (d, 2H), 7.1-7.5 (m, 10H), 4.58 (s, 2H, CH2), 4.19 (s, 2H, CH2), 3.3-3.7 (m, 4H, NCH2), 2.7-3.2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 1.0-2.2 (m, 15 H, CH3). MS (m/e): 738.5 (M+). HPLC 순도: 262 nm에서 95%.
실시예 7. 퀴논 유도체를 이용하여 대사적으로 활성인 세포를 측정.
본 실시예는 대사적으로 활성인 세포의 양을 측정하기 위한 퀴닌-함유 코엘렌테라진 유도체의 용도를 보여준다. 생존가능한 세포는 대사적으로 활성인 상태를 유지하며 이 상태는 세포가 손상될 때 불가피하게 파괴된다. 생존하는 세포에 도입시, 퀴논 코엘렌테라진은 코엘렌테라진을-이용하는 루시페라제, 예컨대, 오플로포러스 또는 레닐라 루시페라제를 위한 기질인 코엘렌테라진 유도체로 환원된다. 퀴논 코엘렌테라진의 전환은 대사적으로 활성인 세포의 수에 비례하고, 따라서 루시페라제 반응에 의해 생성된 빛을 관찰함으로써 정량적으로 측정될 수 있다.
PBS 내에 저캇(Jurkat) 세포의 두-배 연속 희석을 제조하고, 96-웰 플레이트의 웰에 웰당 50μl을 옮겼다. 화합물 40 및 50을 PBS 내에 희석하여 각각 50μM 및 100μM 스톡을 제조하였다. 10μl의 제조된 화합물 스톡을 세포에 부가하고, 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에 배치하였다. 30분간 배양한 후에, 세포를 배양기로부터 꺼내어, 10분간 실온에서 냉각시키고, 50μl의 오플로포러스 루시페라제 검출 시약을 웰에 직접 부가하였다. 샘플을 혼합하고, 실온에서 20분간 배양하고, 발광도를 측정하였다. 도 8은 발광도와 세포 수간의 직접적인 관계를 보여주는 세포 수과 발광도 사이의 선형 상관관계를 나타낸다.
실시예 8: 오플로포러스 루시페라제 및 화합물 21을 이용하는 카스파제 3 분석
오플로포러스 루시페라제 (OgLuc) 변형체인, 9B8 opt를 DEVD 카스파제-3 절단 서열을 포함하는 전구-코엘렌테라진 기질을 사용하는 생체발광성 분석에서 사용하였다. 정제된 카스파제-3 효소를 변형체 9B8 opt를 발현하는 E. coli 용리액 샘플과 혼합하고, 이를 HALOLINKTM 수지(Promega Corp.)를 이용하여 제조자의 설명에 따라 정제하였고, 100 mM HEPES pH 7.5 내 23.5 μM z-DEVD-코엘렌테라진-h와 함께 또는 이것 없이, 100 mM MES pH 6.0, 1 mM CDTA, 150 mM KCl, 35 mM 티오우레아, 2 mM DTT, 0.25% TERGITOL® NP-9 (v/v), 0.025% MAZU®를 함유하는 완충제 내에 10-배로 희석하였다. 카스파제-3 효소를 용리액 샘플과 함께 3시간 동안 실온에서 항온처리하고, 발광도를 Turner MODULUSTM 광도계에서 다양한 시점에서 검출하였다. 박테리아 용리액만을 함유하는 샘플 및 카스파제-3만을 함유하는 샘플을 대조로서 사용하였다. 새 개의 중복물이 사용되었다. 도 2 및 표 1은 본 발명의 전구-코엘렌테라진 기질이 관심의 효소를 검출하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다.
표 1
Figure pct00036
또다른 오플로포러스 루시페라제 변형체인, L27V02 ("L27V")를 DEVD 카스파제-3 절단 서열을 포함하는 전구-코엘렌테라진 기질을 이용하는 생체발광성 분석에서 사용하였다. 100 mM MES pH 6 (50 μL) 내 정제된 카스파제-3 효소 (1 mg/mL)를 50 μL 분석 완충제 (100 mM MES pH 6, 35 mM 티오우레아, 0.5% TERGITOL® NP-9 (v/v), 1 mM CDTA, 2 mM DTT 및 150 mM KCl) 내 227 nM의 L27V02 변형체 및 47 μM PBI-3741 (z-DEVD-코엘렌테라진-h)과 혼합하였다. 반응물을 3시간 동안 실온에서 항온처리하고, 발광도를 앞서 기술한 바와 같이 검출하였다. L27V02 변형체를 이용한 분석을 이 분석의 반딧불 루시페라제 버전인, 카스파제 3/7 Glo(카스파제-Glo; Promega Corp.)와 비교하였다. 표 2는 본 발명의 화합물이 관심의 효소를 검출하기 위해 생체발광성 분석에서 사용될 수 있음을 보여준다.
표 2
Figure pct00037
예언적 실시예 9: O-(8-벤질-2-(푸란-2- 일메틸 )-6-페닐이미다조[ 1,2-a]피라진 -3(7H)-온-일) 갈락토시드 (25)의 합성
Figure pct00038
전형적인 베타 당 전구- 코엘렌테라진의 전형적인 합성 . (O-(8-벤질-2-(푸란-2-일메틸)-6-페닐이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온-일) 3,4,5,6-테트라아세트옥시-베타-갈락토시드)
100 mL 둥근 바닥 플라스크에, 적절한 아세토브로모-알파 당(예컨대, 아세토브로모 알파-D-갈락토스) (1.1EQ), 적절한 코엘렌테라진(예컨대, (8-벤질-2-(푸란-2-일메틸)-6-페닐이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온) (1.0 EQ, 100 mg), 및 실버트리플레이트(67mg, 1EQ)를 부가하고 아르곤으로 30분간 탈기시킨다. 2 mL 디클로로메탄 및 70μL의 테트라메틸우레아를 주입하고 실온에서 3시간 동안 교반한다. 4mL 아세토니트릴을 부가하고, 고체를 여과한다. 샘플을 분취용 250x41mm C18 RP-HPLC 컬럼 상에 상청액을 주입하여 정제하고 아세토니트릴 또는 다른 적절한 용매에 대한 물의 구배로 용리하여 적절한 분획을 수집한다. 상기 분획을 증발시켜 화합물을 수득할 수 있다.
상기 샘플에, 1mL 메탄올을 부가하고 얼음 조에서 0℃까지 냉각시킨다. 메탄올 또는 THF 내 칼륨 메톡사이드(5.2 EQ)의 용액을 이후 부가할 수 있다. 30분 후에, 정확하게 5.2 당량의 아세트산을 부가한다. 3mL 아세토니트릴을 이후 부가할 수 있고, 샘플을 여과할 수 있다. 샘플을 분취용 250x41mm C18 RP-HPLC 컬럼 상에 상청액을 주입하여 정제할 수 있고, 아세토니트릴 또는 다른 적절한 용매에 대한 물의 구배로 용리하여 적절한 분획을 수집할 수 있다. 상기 분획을 증발시켜 화합물(25)을 수득할 수 있다.
예언적 실시예 10: 다양한 P450 기질의 합성
Figure pct00039
DMF 내 코엘렌테라진 및 1.1 당량의 칼륨 카르보네이트의 혼합물에, 아르곤 대기 하에서, 일 당량의 메틸 아이오다이드를 실온에서 부가할 수 있다. 반응 진행을 박막 크로마토그래피에 의해 관찰할 수 있다. 반응의 완료시, 혼합물을 수 분간 얼음 조에서 냉각시킬 수 있고 반응물 부피와 동등한 부피의 물을 부가할 수 있다. 생성된 혼합물을 적합한 유기 용매(예컨대, 에틸 아세테이트)로 추출할 수 있고, 추출물을 농축하여 미정제 화합물 1을 얻을 수 있다. 상기 물질을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다.
Figure pct00040
DMF내 코엘렌테라진 및 1.1 당량의 칼륨 카르보네이트 및 칼륨 아이오다이드 둘 모두의 혼합물에 아르곤 대기 하에서, 일 당량의 p-메톡시벤질 브로마이드를 실온에서 부가할 수 있다. 반응 진행을 박막 크로마토그래피에 의해 관찰할 수 있고, 완료 시, 반응 혼합물을 수 분간 얼음 조에서 냉각시킨 후에 반응물 부피와 동등한 부피의 물을 부가할 수 있다. 생성된 혼합물을 적합한 유기 용매(예컨대, 에틸 아세테이트)로 추출할 수 있고, 추출물을 농축하여 미정제 화합물 2를 얻을 수 있다. 상기 물질을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다.
Figure pct00041
THF 내 3-벤질-5-페닐피라진-2-아민 (6) (1 당량), (E)-3-(4-((3,7-디메틸옥타-2,6-디엔-1-일)옥시)페닐)-2-옥소프로판산 (5) (1.5 당량) 및 캄포어 설폰산 (1.5 당량)의 혼합물을 분자체의 존재에서 출발 물질의 응축이 완료될 때까지 환류로 가열한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 그의 부피의 3배로 희석하고 물 및 염수 용액으로 세척한다. 황산 나트륨 상에서 건조한 후에, 용매를 진공 하에서 제거하고 화합물 7을 함유하는 잔사를 건조 DMF에 용해시킨다. 생성된 용액을 실온에서 아세트산 무수물 (1.5 당량) 및 피리딘 (1.5 당량)으로 처리한다. 반응의 진행을 TLC로 관찰할 수 있고, 완료되면, 반응 혼합물을 얼음 조에서 수 분간 냉각한 후에 반응물 부피와 동일한 부피의 물을 부가한다. 생성된 혼합물을 적합한 유기 용매(예컨대, 에틸 아세테이트)로 추출하고, 추출물을 농축하여 화합물 8을 제공한다. 물질을 메탄올에 용해하고, 대략 0 ℃까지 냉각한 후에, 생성물 형성이 완료될 때까지 수소화붕소 나트륨 (5-10 당량)으로 소량씩 처리한다. 계속 차갑게 두고, 반응 혼합물을 앞서 부가한 무수물의 몰과 동등한 양의 아세트산으로 처리할 수 있고, 반응 혼합물을 진공하에서 농축할 수 있다. 잔사를 물로 수 차례 트리터레이션하여 미정제 화합물 3을 얻을 수 있다. 이 물질을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다.
Figure pct00042
THF 내 3-벤질-5-(4-(3,3-디메톡시프로폭시)페닐)피라진-2-아민 (10) (1 당량), 2-옥소-3-페닐프로판산 (9) (1.5 당량) 및 캄포어 설폰산 (CSA) (1.5 당량)의 혼합물을 분자체의 존재에서 출발 물질의 응축이 완료될 때까지 환류로 가열한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 그의 부피의 3배로 희석하고 물 및 염수 용액으로 세척한다. 황산 나트륨 상에서 건조한 후에, 용매를 진공 하에서 제거하고 화합물 11을 함유하는 잔사를 건조 DMF에 용해시킨다. 생성된 용액을 실온에서 아세트산 무수물 (1.5 당량) 및 피리딘 (1.5 당량)으로 처리한다. 반응의 진행을 TLC로 관찰할 수 있고, 완료되면, 반응 혼합물을 얼음 조에서 수 분간 냉각한 후에 반응물 부피와 동일한 부피의 물을 부가한다. 생성된 혼합물을 적합한 유기 용매(예컨대, 에틸 아세테이트)로 추출하고, 추출물을 농축하여 화합물 12를 제공한다. 물질을 메탄올에 용해하고, 대략 0 ℃까지 냉각한 후에, 생성물 형성이 완료될 때까지 수소화붕소 나트륨 (5-10 당량)으로 소량씩 처리한다. 계속 차갑게 두고, 반응 혼합물을 앞서 부가한 무수물의 몰과 동등한 양의 아세트산으로 처리할 수 있고, 반응 혼합물을 진공하에서 농축할 수 있다. 잔사를 물로 수 차례 트리터레이션하여 미정제 화합물 4를 얻을 수 있다. 이 물질을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다.
실시예 11: NADH 의 측정
디아포라제를 검출하기 위한 본 발명의 전구-코엘렌테라진 기질을 샘플에 존재하는 NADH의 양을 측정하기 위해 사용하였다. NADH, 디아포라제, 전구-코엘렌테라진 기질, 및 에스테라제를 조합시킴으로써, 샘플에 존재하는 NADH를 검출하였다. 디아포라제에 의해 이용된 전구-코엘렌테라진 기질은 코엘렌테라진으로 전환되었다. 생성된 코엘렌테라진의 양을 오플로포러스 루시페라제 변형체로 검출하였고, 생성된 발광도는 샘플에 존재하는 NADH의 양에 비례한다.
분석을 위해, 10 μL NADH (60 μM에서 0 μM로 적정된 것), PBS 내 10 μL 12 U/mL 디아포라제 효소, PBS 내 10 μL 165 U 에스테라제 및 PBS 내 10 μL 60 μM PBI-4600를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 오플로포러스 루시페라제 변형체 (L27V)를 109 희석으로 함유하는 오플로포러스 루시페라제 검출 시약 (100mM MES pH 6, 1mM CDTA, 150mM KCl, 35mM 티오우레아, 1mM DTT, 0.5% 터지톨 및 0.05% 마주)를 부가하였다. 발광도를 5 분 및 1 시간에 측정하였다(도 9). 데이터는 본 발명의 화합물이 NADH를 이용하는 효소를 검출함으로써 샘플 내 NADH를 측정하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 참고로서 포함된다. 비록 전술된 명세서에서 본 발명은 그의 특정한 바람직한 구체예와 연관되어 기술되었고, 예시의 목적을 위해 많은 세부 내용들이 기술되었으나, 본 발명에 추가적인 구체예가 가능하며 본 명세서에 기술된 특정한 세부 내용은 본 발명의 기초적인 이론으로부터 벗어나지 않고 상당하게 변화될 수 있다는 점이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.

Claims (16)

  1. 식 (II)의 화합물:
    Figure pct00043
    (II)
    여기서 R2는 -(CH2)n-T 또는 C1 -5 알킬이고;
    R6은 -H, -OH, -NH2, -OC(O)R 또는 -OCH2OC(O)R로 이루어진 군에서 선택되고;
    R8은
    Figure pct00044
    ,
    Figure pct00045
    , H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
    R11은 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고;
    여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
    RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
    각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
    RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
    L'은 직접적인 결합이거나 연결기이고;
    n은 0 내지 3이고;
    각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고;
    T는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 시클로알킬이고;
    V는 -S- 또는 -O-이고; 및
    파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타냄.
  2. 식 (I)의 화합물:
    Figure pct00046
    (I)
    여기서 R2는 -(CH2)n-T 또는 C1 -5 알킬이고;
    R2'는 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고;
    R6은 -H, -OH, -NH2 -OC(O)R 또는 -OCH2OC(O)R로 이루어진 군에서 선택되고;
    R8은
    Figure pct00047
    ,
    Figure pct00048
    , H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
    여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
    RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
    각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
    RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
    L은 연결기이고;
    n은 0 내지 3이고;
    각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고;
    T는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 시클로알킬이고;
    V는 -S- 또는 -O-이고; 및
    파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타냄.
  3. 식 (III)의 화합물:
    Figure pct00049
    (III)
    여기서 R6은 -H, -OH , -NH2 -OC(O)R 또는 -OCH2OC(O)R로 이루어진 군에서 선택되고;
    R8은
    Figure pct00050
    ,
    Figure pct00051
    , H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
    R12는 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고;
    여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
    RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
    각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
    RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
    L'은 직접적인 결합이거나 연결기이고;
    V는 -S- 또는 -O-이고;
    각각의 X는 독립적으로-S-, -O- 또는 -NH-이고;
    각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고; 및
    파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타냄.
  4. 식 (IV)의 화합물:
    Figure pct00052
    (IV)
    여기서 R2는 -(CH2)n-T 또는 C1 -5 알킬이고;
    R8은
    Figure pct00053
    ,
    Figure pct00054
    , H 또는 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
    R16은 펩티드, 아미노산, 당류, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, 또는 -NHC(O)ORA로 이루어진 군에서 선택되고 .
    여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 둘다 C1 -2 알킬이고;
    RA는 C1 -4 알킬, 치환된 C1 -4 알킬, -CH2-RC 또는 -CH2-V-RC이고;
    각각의 RB는 독립적으로 -H 또는 -RA이고;
    RC는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고;
    L'은 직접적인 결합이거나 연결기이고;
    n은 0 내지 3이고;
    T는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 시클로알킬이고;
    V는 -S- 또는 -O-이고;
    각각의 X는 독립적으로 -S-, -O- 또는 -NH-이고;
    각각의 R은 독립적으로 C1 -7 알킬이고; 및
    파선 결합은 포화되거나 불포화될 수 있는 임의의 고리의 존재를 나타냄.
  5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2는
    Figure pct00055
    ,
    Figure pct00056
    ,
    Figure pct00057
    ,
    Figure pct00058
    또는 C2 -5 곧은-사슬 알킬이고;
    각각의 X는 독립적으로 -S-, -O- 또는 -NH-이고;
    Z는 -CH- 또는 -N-이고;
    Y는 -H 또는 -OH이고;
    W는 -NH2, 할로, -OH, -NHC(O)R, -CO2R이고; 및
    R은 C1 -7 알킬인 화합물.
  6. 제5항에 있어서,
    R2는
    Figure pct00059
    이고; 및
    X는 O 또는 S인 화합물.
  7. 제5항에 있어서, R2는 C2 -5 곧은-사슬 알킬인 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R8은
    Figure pct00060
    , 저급 시클로알킬 또는 H이고, 여기서 R3 및 R4는 둘다 H이거나 C1 -2 알킬인 화합물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R8은 벤질인 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, V는 S인 화합물.
  11. 하기 단계를 포함하는 효소의 존재 또는 양을 검출하는 방법:
    효소를 함유할 것으로 의심되는 샘플을 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    샘플의 발광도를 검출하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 발광도는 정량화되는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 샘플이 두 번째 효소를 함유할 것으로 의심되는 방법이되,
    샘플을 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 두 번째 화합물과 접촉시키는 단계, 여기서 상기 두 번째 화합물은 상기 두 번째 효소를 위한 기질을 함유함; 및
    샘플의 발광도를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 하기 단계를 포함하는 생체 내(in vivo)에서 효소의 존재를 검출하는 방법:
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 형질전환 동물에 투여하는 단계; 및
    발광도를 검출하는 단계.
  15. 하기 단계를 포함하는 효소의 존재를 검출하는 방법:
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 동물에 투여하는 단계;
    상기 동물로부터 샘플을 수득하는 단계; 및
    샘플의 발광도를 검출하는 단계.
  16. 하기로 이루어진 군에서 선택된 화합물:
    Figure pct00061

    Figure pct00062
KR1020137014031A 2010-11-02 2011-11-02 코엘렌테라진 유도체 및 이를 이용하는 방법 KR101968475B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40941310P 2010-11-02 2010-11-02
US61/409,413 2010-11-02
PCT/US2011/058924 WO2012061477A1 (en) 2010-11-02 2011-11-02 Coelenterazine derivatives and methods of using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140003430A true KR20140003430A (ko) 2014-01-09
KR101968475B1 KR101968475B1 (ko) 2019-04-15

Family

ID=44999921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137014031A KR101968475B1 (ko) 2010-11-02 2011-11-02 코엘렌테라진 유도체 및 이를 이용하는 방법

Country Status (15)

Country Link
US (1) US9487520B2 (ko)
EP (1) EP2635583B1 (ko)
JP (1) JP6040157B2 (ko)
KR (1) KR101968475B1 (ko)
CN (1) CN103180324A (ko)
AU (1) AU2011323455B2 (ko)
BR (1) BR112013010484B1 (ko)
CA (1) CA2815381C (ko)
DK (1) DK2635583T3 (ko)
ES (1) ES2543913T3 (ko)
IL (1) IL225869A (ko)
PL (1) PL2635583T3 (ko)
PT (1) PT2635583E (ko)
SG (1) SG189494A1 (ko)
WO (1) WO2012061477A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200029247A (ko) * 2018-09-10 2020-03-18 (주)신우에이엔티 웨이퍼 세정용 나노 버블 분사 구조

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2817102C (en) * 2010-11-02 2020-07-28 Promega Corporation Oplophorus-derived luciferases, novel coelenterazine substrates, and methods of use
PL2635583T3 (pl) 2010-11-02 2015-11-30 Promega Corp Pochodne koelenterazyny i metody ich wykorzystania
WO2013033515A1 (en) * 2011-09-02 2013-03-07 Promega Corporation Compounds and methods for assaying redox state of metabolically active cells and methods for measuring nad(p)/nad(p)h
WO2014052653A1 (en) * 2012-09-26 2014-04-03 Promega Corporation Real-time monitoring
CN108283644B (zh) 2013-03-15 2022-03-18 G1治疗公司 在化学疗法期间对正常细胞的瞬时保护
JP6435315B2 (ja) 2013-03-15 2018-12-05 ジー１、セラピューティクス、インコーポレイテッドＧ１ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 高活性抗新生物薬及び抗増殖剤
JP6270127B2 (ja) * 2014-01-17 2018-01-31 国立研究開発法人物質・材料研究機構 ニコチンアデニンジヌクレオチド誘導体を検出する方法
US9790537B2 (en) 2014-01-29 2017-10-17 Promega Corporation Quinone-masked probes as labeling reagents for cell uptake measurements
JP6588917B2 (ja) * 2014-01-29 2019-10-09 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 生細胞への適用のためのプロ基質
JP6862368B2 (ja) 2015-06-25 2021-04-21 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ チエノピロール化合物、及びそのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの阻害剤としての使用
EP4086261A1 (en) 2016-02-15 2022-11-09 Promega Corporation Process for the preparation of coelenterazine analogues
EP3490991B1 (en) 2016-07-28 2021-01-06 Promega Corporation Coelenterazine analogues
JP6978492B2 (ja) * 2016-09-09 2021-12-08 プロメガ コーポレイションPromega Corporation 二重保護されたプロセレンテラジン基質
EP4144738A1 (en) 2016-11-01 2023-03-08 Promega Corporation Coelenterazine analogues tethered to energy acceptors
DK3548492T3 (en) 2016-12-01 2023-08-07 Promega Corp Cell impermeable coelenterazine analogues
US10815247B2 (en) 2016-12-28 2020-10-27 Promega Corporation Functionalized NANOLUC inhibitors
EP3395803A1 (en) * 2017-04-28 2018-10-31 Institut Pasteur Imidazopyrazine derivatives, process for preparation thereof, and their uses as luciferins
JP7419260B2 (ja) 2018-05-01 2024-01-22 プロメガ コーポレイション ＮａｎｏＬｕｃ自殺基質としてのセレンテラジン化合物
EP3802514B1 (en) 2018-06-01 2022-08-03 Promega Corporation Inhibitors of oplophorus luciferase-derived bioluminescent complexes
SG11202103289SA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Promega Corp Compositions and methods for stabilizing coelenterazine and analogs and derivatives thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0859686A (ja) * 1994-08-23 1996-03-05 Nippon Oil & Fats Co Ltd ウミホタルルシフェリン誘導体および糖加水分解酵素の定量方法
JPH08294397A (ja) * 1995-04-27 1996-11-12 Nippon Oil & Fats Co Ltd 免疫学的活性物質の測定方法

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0134108B1 (en) 1983-08-17 1989-04-05 AlliedSignal Inc. Gas generator and method of generating gas
JP3012274B2 (ja) * 1989-03-22 2000-02-21 日本臓器製薬株式会社 新規ルシフェリン誘導体
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5368484A (en) 1992-05-22 1994-11-29 Atari Games Corp. Vehicle simulator with realistic operating feedback
US6387675B1 (en) 1994-01-03 2002-05-14 Promega Corporation Mutant luciferases
ATE391769T1 (de) 1994-01-03 2008-04-15 Promega Corp Mutierte luziferasen
GB9501170D0 (en) 1994-03-23 1995-03-08 Secr Defence Luciferases
GB9417593D0 (en) 1994-09-01 1994-10-19 Secr Defence Luciferase labelling method
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
AU707243B2 (en) 1995-01-20 1999-07-08 Promega Corporation Mutant luciferases
US6522361B2 (en) 1996-03-08 2003-02-18 Sony Corporation Electronic apparatus having the function of displaying the battery residual quantity and method for displaying the battery residual quantity
JP4026876B2 (ja) * 1996-09-05 2007-12-26 日本食品化工株式会社 発光性シクロデキストリン誘導体及びその製造方法
US5998204A (en) 1997-03-14 1999-12-07 The Regents Of The University Of California Fluorescent protein sensors for detection of analytes
GB9707486D0 (en) 1997-04-11 1997-05-28 Secr Defence Enzyme assays
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
EP2860252A1 (en) 1997-09-19 2015-04-15 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
GB9823468D0 (en) 1998-10-28 1998-12-23 Secr Defence Novel enzyme
JP3694181B2 (ja) 1999-01-05 2005-09-14 キッコーマン株式会社 変異型ルシフェラーゼ、変異型ルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ルシフェラーゼの製造法
ATE374820T1 (de) 1999-10-26 2007-10-15 Secr Defence Mutantenluciferase
GB9925161D0 (en) 1999-10-26 1999-12-22 Secr Defence Novel enzyme
US20010046687A1 (en) 2000-03-31 2001-11-29 Dicesare Joseph L. Method for the enhancement of luminescence intensity from a reaction between adenosine triphosphate (ATP) and a luciferase/luciferin reactant system
EP1156103B1 (en) 2000-04-26 2010-08-11 Chisso Corporation Oplophorus luciferase
JP4613441B2 (ja) 2000-04-26 2011-01-19 チッソ株式会社 新規ルシフェラーゼおよび発光蛋白質
US7118878B1 (en) 2000-06-09 2006-10-10 Promega Corporation Method for increasing luminescence assay sensitivity
US7879540B1 (en) 2000-08-24 2011-02-01 Promega Corporation Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation
AU2002223536A1 (en) 2000-09-13 2002-03-26 Merck Patent G.M.B.H Method for the detection and measurement of biomass
US7268229B2 (en) 2001-11-02 2007-09-11 Promega Corporation Compounds to co-localize luminophores with luminescent proteins
EP1472238B1 (en) * 2002-02-01 2012-07-04 Promega Corporation Bioluminescent protease assay
ATE513838T1 (de) 2002-09-20 2011-07-15 Promega Corp Auf lumineszenz basierende verfahren und sonden zur messung der cytochrom-p450-aktivität
ES2237643T3 (es) * 2002-10-21 2005-08-01 Axxam S.R.L. Fotoproteina con bioluminiscencia mejorada.
JP4485470B2 (ja) 2002-12-23 2010-06-23 プロメガ コーポレイション ルシフェラーゼ酵素活性を保護するための方法及びキット
DE10303265A1 (de) 2003-01-28 2004-07-29 Roche Diagnostics Gmbh Fluorimetrische Bestimmung von Analyten durch ein intramolekulares Quencher-Fluorophor-Konjugat
US7429472B2 (en) 2003-01-31 2008-09-30 Promega Corporation Method of immobilizing a protein or molecule via a mutant dehalogenase that is bound to an immobilized dehalogenase substrate and linked directly or indirectly to the protein or molecule
EP1594962B1 (en) 2003-01-31 2014-08-27 Promega Corporation Covalent tethering of functional groups to proteins
EP1592805A1 (en) 2003-02-12 2005-11-09 Promega Corporation Methods and kits for dual enzymatic assays whereby light is quenched from luminescent reactions
US20040178545A1 (en) 2003-03-14 2004-09-16 Cates Larry E. System for optically analyzing a molten metal bath
EP2308978B8 (en) 2003-10-10 2015-04-08 Promega Corporation Luciferase biosensor
ATE443070T1 (de) 2004-01-08 2009-10-15 Univ Zuerich Metallkomplexe mit vitamin b12 als ligand
US7553632B2 (en) 2004-01-22 2009-06-30 Promega Corporation Luminogenic and nonluminogenic multiplex assay
US7416854B2 (en) 2004-01-22 2008-08-26 Promega Corporation Luminogenic and nonluminogenic multiplex assay
US20070087400A1 (en) 2004-07-30 2007-04-19 Aldis Darzins Covalent tethering of functional groups to proteins and substrates therefor
US7425436B2 (en) 2004-07-30 2008-09-16 Promega Corporation Covalent tethering of functional groups to proteins and substrates therefor
EP3179252B1 (en) 2004-07-30 2018-11-14 Promega Corporation Covalent tethering of functional groups to proteins and substrates therefor
US7728118B2 (en) 2004-09-17 2010-06-01 Promega Corporation Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation
JP4453528B2 (ja) * 2004-10-26 2010-04-21 東京化成工業株式会社 新規化学発光試薬
EP1700865A1 (en) 2005-03-11 2006-09-13 AXXAM S.r.l. Photoproteins with enhanced bioluminescence and their use as intracellular calcium indicators
JP4639904B2 (ja) 2005-03-30 2011-02-23 チッソ株式会社 蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強方法
JP3844082B2 (ja) 2005-04-08 2006-11-08 キッコーマン株式会社 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法
EP1935986B1 (en) 2005-05-31 2014-04-16 Promega Corporation Luminogenic and fluorogenic compounds and methods to detect molecules or conditions
EP2272972A1 (en) 2005-05-31 2011-01-12 Promega Corporation Luminogenic and fluorogenic compounds and methods to detect molecules or conditions
CA2616930A1 (en) 2005-08-17 2007-02-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods and compositions for determining a level of biologically active serum paraoxonase
JP4999341B2 (ja) 2005-09-06 2012-08-15 株式会社バイオエネックス 変異型ホタルルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法
CA2648263A1 (en) 2006-04-03 2007-10-25 Promega Corporation Permuted and nonpermuted luciferase biosensors
EP2087132B1 (en) 2006-10-24 2017-01-25 Gene Stream Pty Ltd. Luciferase signal enhancng compositions
EP2087107A2 (en) 2006-10-30 2009-08-12 Promega Corporation Mutant hydrolase proteins with enhanced kinetics and functional expression
WO2008086035A2 (en) 2007-01-10 2008-07-17 Promega Corporation Split mutant hydrolase fusion reporter and uses thereof
US20080248511A1 (en) 2007-03-26 2008-10-09 Promega Corporation Methods to quench light from optical reactions
JP2011502509A (ja) 2007-11-05 2011-01-27 プロメガ コーポレイション ハイブリッド融合レポーター及びその使用
US9045730B2 (en) 2008-05-19 2015-06-02 Promega Corporation Luciferase biosensors for cAMP
CN102159948B (zh) 2008-07-22 2014-06-25 普罗美加公司 基于adp检测的发光磷酸转移酶或atp水解酶测定
TWI354101B (en) 2008-08-19 2011-12-11 Univ Nat Taipei Technology Fluorimetric indicator for biosensing and manufact
WO2010119721A1 (ja) 2009-04-17 2010-10-21 独立行政法人産業技術総合研究所 超高輝度で安定な人工生物発光酵素
AU2010242771B2 (en) 2009-05-01 2015-01-22 Promega Corporation Synthetic Oplophorus luciferases with enhanced light output
WO2011038219A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Promega Corporation Proteases having improved stability, solubility and activity
WO2011143339A1 (en) 2010-05-11 2011-11-17 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics
US9816127B2 (en) 2010-09-01 2017-11-14 Promega Corporation Oxidized glutathione assay
US9284188B2 (en) 2010-09-03 2016-03-15 The Regents Of The University Of California Cytosolic delivery of materials with endosome-disrupting colloids
CA2817102C (en) 2010-11-02 2020-07-28 Promega Corporation Oplophorus-derived luciferases, novel coelenterazine substrates, and methods of use
PL2635583T3 (pl) 2010-11-02 2015-11-30 Promega Corp Pochodne koelenterazyny i metody ich wykorzystania
WO2013033515A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Promega Corporation Compounds and methods for assaying redox state of metabolically active cells and methods for measuring nad(p)/nad(p)h

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0859686A (ja) * 1994-08-23 1996-03-05 Nippon Oil & Fats Co Ltd ウミホタルルシフェリン誘導体および糖加水分解酵素の定量方法
JPH08294397A (ja) * 1995-04-27 1996-11-12 Nippon Oil & Fats Co Ltd 免疫学的活性物質の測定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Analytical Sciences, Vol.10, pp. 1013-1015 (1995.) *
Chemistry Letters, Vol. 16, pp. 417-418 (1987.)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200029247A (ko) * 2018-09-10 2020-03-18 (주)신우에이엔티 웨이퍼 세정용 나노 버블 분사 구조

Also Published As

Publication number Publication date
SG189494A1 (en) 2013-05-31
CA2815381A1 (en) 2012-05-10
BR112013010484B1 (pt) 2019-09-03
BR112013010484A2 (pt) 2016-07-05
EP2635583B1 (en) 2015-06-03
DK2635583T3 (en) 2015-08-03
CN103180324A (zh) 2013-06-26
IL225869A (en) 2017-09-28
PL2635583T3 (pl) 2015-11-30
AU2011323455B2 (en) 2017-07-27
CA2815381C (en) 2019-03-19
US9487520B2 (en) 2016-11-08
JP2013544242A (ja) 2013-12-12
AU2011323455A1 (en) 2013-05-30
US20120107849A1 (en) 2012-05-03
IL225869A0 (en) 2013-07-31
PT2635583E (pt) 2015-09-11
WO2012061477A1 (en) 2012-05-10
ES2543913T3 (es) 2015-08-25
EP2635583A1 (en) 2013-09-11
KR101968475B1 (ko) 2019-04-15
JP6040157B2 (ja) 2016-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101968475B1 (ko) 코엘렌테라진 유도체 및 이를 이용하는 방법
US9951372B2 (en) Compounds and methods for assaying redox state of metabolically active cells and methods for measuring NAD(P)/NAD(P)H
JP4958388B2 (ja) 発光性化合物に関する組成物、方法並びにキット
US8288559B2 (en) Luminogenic compounds and methods to detect cytochrome P450 3A enzymes
JP2017522296A (ja) 活性化可能な水溶性の分子プローブ、その合成のための中間体、および関連する検出方法
US20170002396A1 (en) Red-shifted luciferins and methods of using same
US20240059697A1 (en) Coelenterazine analogues
Jiang et al. New bioluminescent coelenterazine derivatives with various C-6 substitutions
JP2021523111A (ja) ＮａｎｏＬｕｃ自殺基質としてのセレンテラジン化合物
FR2994180A1 (fr) Substrat de glycosidase fluorogene et procede de detection associe
WO2014057139A2 (en) Precursor molecule for the synthesis of d-luciferin
US20240150363A1 (en) Coelenterazine analogues
US10995110B2 (en) Trehalose analogues

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant