JP7419260B2 - NanoLuc自殺基質としてのセレンテラジン化合物 - Google Patents
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Description
本願は、2018年5月1日に出願した米国特許仮出願第62/665,346号に基づく優先権の利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
(I)
またはその互変異性体もしくは塩であって、式中、
R1が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環または任意に置換されたシクロアルキルであり、R1が、-Q-L-Zである少なくとも1つの基で置換されており、
Qが、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Lが、-(CR1aR1b)m-、-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-(CR1xR1y)t2-Q1-、-(CR1xR1y)t2-A-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-Q1-、-(CR1xR1y)t3-A-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-(CR1xR1y)t2-または-(CR1xR1y)t3-A-(CR1xR1y)t4-であり、各Q1が独立して、結合手、-O-または-NRQ1-であり、各Aが独立して、結合手、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Zが、-COOR2、-SO2-OR3、-PO(OR4)(OR5)、ハロ、アジド、C2-C10アルキニル、ビオチン部分、-NR6R7、-NR8-CO-R9、-CO-R10または-NR11-CO-O-R12であり、
R2、R3、R4、R5、R8、R9、R10、R11及びR12が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターであり、
R6及びR7が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルもしくはエネルギーアクセプターであるか、またはR6及びR7が、それらと結合している窒素原子と一体となって、任意に置換された環を形成し、
R1a、R1b、RQ、RQ1、R1x及びR1yが各出現ごとに独立して、水素、C1-C4アルキルまたはC1-C4ハロアルキルであり、
qが、0、1または2であり、
mが各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12であり、
t1が各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、
t2が、0~5の整数であり、
t3が各出現ごとに、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、
t4が、0~5の整数であり、
その化合物が、4-[4-[[8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-7H-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル]メチル]フェノキシ]ブタン酸ではない化合物、またはその互変異性体もしくは塩を提供する。
(a)その試料と、本発明で開示される化合物を接触させること、及び
(b)その試料における発光を検出すること、
を含む方法を提供する。
(a)その試料と、式(I)の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させること、
(b)その試料にOplophorus由来のルシフェラーゼが存在しない場合に、その試料と、Oplophorus由来のルシフェラーゼを接触させること、及び
(c)その試料における発光を検出すること、
を含む方法を提供する。
(a)その試料と、式(I)の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることであって、その化合物が、少なくとも1つの蛍光色素を含む接触させること、
(b)その接触工程後に、その試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去すること、及び
(c)その洗浄工程後に、その試料における蛍光を検出すること、
を含む方法を提供する。
(a)その試料と、式(I)の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることであって、その化合物が、第1の官能基を含む接触させること、
(b)その試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去すること、
(c)その試料と、第2の官能基を含む蛍光色素を接触させることであって、その第2の官能基が、第1の官能基と反応するか、または第1の官能基に結合することができる接触させること、
(d)その試料を洗浄して、任意の未反応の蛍光色素を除去すること、及び
(e)その試料における蛍光を検出すること、
を含む方法を提供する。
(a)Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、式(I)の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることであって、その化合物が、第1の官能基を有する接触させること、
(b)その試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去すること、
(c)その試料と、1つ以上の溶解試薬を接触させること、
(d)その試料に、第1の官能基に結合するか、または第1の官能基と反応する第2の官能基を有する捕捉剤を加えて、そのOplophorus由来のルシフェラーゼを捕捉すること、
(e)その試料を洗浄して、捕捉されなかった、Oplophorus由来のルシフェラーゼを除去すること、及び
(f)工程(e)で捕捉された、Oplophorus由来のルシフェラーゼを単離すること、
を含む方法を提供する。
(a)Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む試料と、1つ以上の溶解試薬を接触させること、
(b)Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、式(I)の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることであって、その化合物が、第1の官能基を有する接触させること、
(c)その試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去すること、
(d)その試料に、第1の官能基に結合するか、または第1の官能基と反応する第2の官能基を有する捕捉剤を加えて、そのOplophorus由来のルシフェラーゼを捕捉すること、
(e)その試料を洗浄して、捕捉されなかった、Oplophorus由来のルシフェラーゼを除去すること、及び
(f)工程(e)で捕捉された、Oplophorus由来のルシフェラーゼを単離すること、
を含む方法を提供する。
(a)その試料と、基質セレンテラジン及び式(I)の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させること、ならびに
(b)その試料における発光を検出すること、
を含み、
その化合物により、そのOplophorus由来のルシフェラーゼによる発光が減少する方法を提供する。
(a)式(I)の化合物のような、本明細書に記載の化合物、及び
(b)Oplophorus由来のルシフェラーゼ、を含むキットを提供する。
別段の定義のない限り、本明細書で用いられているすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本書が優先されることになる。好ましい方法及び材料が下に記載されているが、本発明を実施または試験する際には、本明細書に記載の方法及び材料と類似または同等のものを使用することができる。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許及びその他の参照文献は、参照により、その全体が援用される。本明細書に開示されている材料、方法及び例は、例示的なものに過ぎず、限定するようには意図されていない。
という式のうちのいずれかを有してよい。
本発明で提供するのは、Oplophorus由来のルシフェラーゼ及び/またはOplophorus由来のルシフェラーゼの活性を標識/検出し得る化合物である。本発明で提供するのは、Oplophorus由来のルシフェラーゼ及び/またはOplophorus由来のルシフェラーゼの活性を阻害し得る化合物である。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼの阻害剤であり得る。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を不可逆的に阻害する自殺阻害剤であり得る。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を部分的に低減する部分的阻害剤であり得る。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼの基質であり得る。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼの基質であって、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのOplophorus由来のルシフェラーゼを阻害する基質であり得る。例えば、開示されている化合物は、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのOplophorus由来のルシフェラーゼに基質セレンテラジンを加えると生成される生物発光シグナルを阻害し得る。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼの自殺基質であって、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのOplophorus由来のルシフェラーゼを不可逆的に阻害する自殺基質であり得る。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼの基質であって、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのOplophorus由来のルシフェラーゼを部分的に阻害する基質であり得る。開示されている化合物は、そのOplophorus由来のルシフェラーゼと共有結合付加体を形成することによって、そのOplophorus由来のルシフェラーゼを阻害し得る。開示されている化合物は、NanoLuc、及び相補的な酵素系NanoBiTを阻害し得る。
(I)
またはその互変異性体もしくは塩が含まれ、式中、
R1は、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環または任意に置換されたシクロアルキルであり、R1は、-Q-L-Zである少なくとも1つの基で置換されており、
Qは、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Lは、-(CR1aR1b)m-、-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-(CR1xR1y)t2-Q1-、-(CR1xR1y)t2-A-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-Q1-、-(CR1xR1y)t3-A-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-(CR1xR1y)t2-または-(CR1xR1y)t3-A-(CR1xR1y)t4-であり、各Q1は独立して、結合手、-O-または-NRQ1-であり、各Aは独立して、結合手、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Zは、-COOR2、-SO2-OR3、-PO(OR4)(OR5)、ハロ、アジド、-NR6R7、-NR8-CO-R9、-CO-R10または-NR11-CO-O-R12であり、
R2、R3、R4、R5、R8、R9、R10、R11及びR12は各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターであり、
R6及びR7は各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルもしくはエネルギーアクセプターであるか、またはR6及びR7は、それらと結合している窒素原子と一体となって、任意に置換された環を形成し、
R1a、R1b、RQ、RQ1、R1x及びR1yは各出現ごとに独立して、水素、C1-C4アルキルまたはC1-C4ハロアルキルであり、
qは、0、1または2であり、
mは各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12であり、
t1は各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、
t2は、0~5の整数であり、
t3は各出現ごとに、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、
t4は、0~5の整数であり、
その化合物は、4-[4-[[8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-7H-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル]メチル]フェノキシ]ブタン酸ではない。
(I’)
またはその互変異性体もしくは塩であり、式中、
R1は、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環または任意に置換されたシクロアルキルであり、R1は、-Q-L-Zである少なくとも1つの基で置換されており、
Qは、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Lは、-(CR1aR1b)m-、-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-(CR1xR1y)t2-Q1-または-(CR1xR1y)t2-A-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-Q1-であり、各Q1は独立して、結合手、-O-または-NRQ1-であり、Aは、結合手、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Zは、-COOR2、-SO2-OR3、-PO(OR4)(OR5)、ハロ、アジド、-NR6R7または-NR8-CO-R9であり、
R2、R3、R4、R5、R8及びR9は各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターであり、
R6及びR7は各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルもしくはエネルギーアクセプターであるか、またはR6及びR7は、それらと結合している窒素原子と一体となって、任意に置換された環を形成し、
R1a、R1b、RQ、RQ1、R1x及びR1yは各出現ごとに独立して、水素、C1-C4アルキルまたはC1-C4ハロアルキルであり、
qは、0、1または2であり、
mは各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12であり、
t1は各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、
t2は、0~5の整数であり、
その化合物は、4-[4-[[8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-7H-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル]メチル]フェノキシ]ブタン酸ではない。
Qは、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Lは、-(CR1aR1b)m-、-(CR1xR1y)t3-A-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-(CR1xR1y)t2-または-(CR1xR1y)t3-A-(CR1xR1y)t4-であり、
各Aは独立して、-NRQ-CO-であり、
R1a、R1b、RQ、R1x及びR1yは各出現ごとに、水素であり、
mは、6、7または8であり、
t1は、6、7または8であり、
t2は、1、2または3であり、
t3は、6、7または8であり、
t4は、1、2または3であり、
Zは、-SO2-OR3、アジド、-NR6R7、-NR8-CO-R9、-CO-R10、または-NR11-CO-OR12であり、
R3、R6、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は独立して、水素、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリールまたは任意に置換された複素環である。
Qは、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Lは、-(CR1aR1b)m-であり、
Zは、-SO2-OR3、アジド、-NR6R7または-NR8-CO-R9であり、
R3、R6、R7及びR8は独立して、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリールまたは任意に置換された複素環であり、
R9は、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターである。
2-(4-((6-アミノヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン、
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキサン-1-スルホン酸、
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3-(5,5-ジフルオロ-7-(1H-ピロール-2-イル)-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド、
N,N’-(6-((6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイル)ビス(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)、
N-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
N-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
3-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)-N-(8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)プロパンアミド、
N-(2-(2-(3-((8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)アミノ)-3-オキソプロポキシ)エトキシ)エチル)-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
N-(2-(2-(3-((8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)アミノ)-3-オキソプロポキシ)エトキシ)エチル)-3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
6-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイルジアセテート、
2-(4-((6-アジドヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン、
5-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(2,7-ジフルオロ-3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)ベンゾエート、
5-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(3,11-ジヒドロキシジベンゾ[c,h]キサンテン-14-イウム-7-イル)ベンゾエート、
N1-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-N4-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)コハク酸アミド、
N1-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-N4-(ジベンジルシクロオクテニル)-コハク酸アミド及び
(E)-シクロオクト-4-エン-1-イル(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバメート
からなる群から選択されている。
式(I)の化合物は、発光を発生させるルシフェラーゼの基質であり得る。「発光」とは、適切な条件下、例えば、セレンテラジン類似体のような好適な基質の存在下におけるルシフェラーゼの光出力を指す。その光出力は、発光反応(基質セレンテラジンを加えると開始し得る)の開始時における瞬時またはほぼ瞬時の光出力測定値(「T=0」の発光または「閃光」と称する場合もある)として測定し得る。様々な実施形態における発光反応は、溶液中で行う。別の実施形態では、その発光反応は、固体支持体上で行う。その溶液は、例えば、細胞から得られた溶解液を原核生物または真核生物の発現系に含み得る。別の実施形態では、無細胞系で発現を行うか、またはルシフェラーゼタンパク質を細胞外の培地に分泌させ、後者の場合には、溶解液を作製する必要がなくなる。いくつかの実施形態では、その反応は、適切な材料、例えば、セレンテラジン類似体、緩衝剤などを、発光タンパク質の入った反応容器(例えば、96ウェルプレートのようなマルチウェルプレートのウェル)に注入することによって開始させる。さらに別の実施形態では、本発明の化合物(例えば、式(I)の化合物)を宿主に導入し、その宿主またはその一部(生物全体、またはその細胞、組織、外植片もしくは摘出物を挙げることができる)において、発光の測定を行う。特定の実施形態では、発光の測定は、細胞表面のような、宿主の表面で行う。さらに別の実施形態では、本発明の化合物(例えば、式(I)の化合物)を宿主に導入し、発光の測定を細胞外の空間で行う。例えば発光測定装置または光電子増倍管を用いて、光出力を測定できる読み取り装置に、反応容器を配置してよい。光出力または発光は、例えば、同じ反応容器で、数秒、数分、数時間などの期間にわたって経時的に測定してもよい。光出力または発光は、時間平均値、シグナル減衰半減期、ある期間にわたるシグナルの合計またはピーク出力として記録してもよい。発光は、相対発光値(RLU)で測定してもよい。
式(I)の化合物は、合成プロセスまたは代謝プロセスによって調製し得る。その化合物の代謝プロセスによる調製には、ヒトもしくは動物の体内(in vivo)で行うプロセス、またはin vitroで行うプロセスが含まれる。
スキーム1.パラ-ヒドロキシ6位フェニル基を有する化合物の合成
スキーム2.スルホネート含有化合物の合成
開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼの基質であり得る。開示されている化合物を用いて、Oplophorus由来のルシフェラーゼを標識/検出し得る。開示されている化合物を用いて、Oplophorus由来のルシフェラーゼを阻害し得る。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を阻害し得る。そのOplophorus由来のルシフェラーゼは、野生型Oplophorusルシフェラーゼ、または配列番号2のルシフェラーゼのような、Oplophorusルシフェラーゼのバリアントであってよい。Oplophorusルシフェラーゼバリアントは、米国特許第8,557,970号及び同第8,669,103号に記載されており、それらの各特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼの基質であり得る。本発明の開示されている化合物を用いて、Oplophorus由来のルシフェラーゼを標識/検出し得る。開示されている化合物を用いて、ルシフェラーゼ活性を阻害し得る。開示されている化合物は、基質であるセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体がルシフェラーゼに結合するのと競合するか、またはその結合を妨げることによって、ルシフェラーゼ活性を阻害し得る。基質セレンテラジンは、ルシフェラーゼ及びその他の生物発光タンパク質の作用を受けると発光する種類のレポーター分子である。基質セレンテラジンの例としては、WO2003/040100、米国特許出願公開第2008/0248511号及び米国特許出願公開第2012/0117667号に記載されているものに加えて、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体及び/または類似体(2-フラニルメチル-デオキシ-セレンテラジン(フリマジン)、セレンテラジン-n、セレンテラジン-f、セレンテラジン-h、セレンテラジン-hcp、セレンテラジン-cp、セレンテラジン-c、セレンテラジン-e、セレンテラジン-fcp、ビス-デオキシセレンテラジン(「セレンテラジン-hh」)、セレンテラジン-i、セレンテラジン-icp、セレンテラジン-v及び2-メチル-セレンテラジンなど)、プロセレンテラジン(すなわち、その化合物をルシフェラーゼの基質に変換する非発光酵素の基質ではない化合物)、キノンでマスクされたセレンテラジンなどが挙げられるが、これらに限らない。基質セレンテラジンのさらなる例は、例えば、米国特許出願公開第2012/0107849号、米国特許出願公開第2013/0130289号、米国特許出願第14/608,910号及び米国特許出願第14/609,372号に記載されており、これらの各特許は、参照により、本明細書に援用される。
本開示の化合物は、ルシフェラーゼ基質、例えばセレンテラジン類似体が用いられてきたいずれの方法でも使用し得る。例えば、本開示の化合物は、試料中の1つ以上の分子、例えば、酵素、酵素反応の補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性化剤もしくはOHラジカル、または1つ以上の状態、例えば酸化還元状態を検出するためにセレンテラジンの類似体を用いる生物発光方法で使用し得る。その試料としては、動物(例えば脊椎動物)、植物、真菌、生理液(例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物)、細胞、細胞溶解液、細胞上清または細胞の精製画分(例えば細胞内画分)を挙げてよい。このような分子の存在、量、スペクトル分布、発光キネティクスまたは比活性を検出または定量し得る。その分子は、多相溶液(例えば、乳濁液もしくは懸濁液)を含む溶液中、または固体支持体(例えば、粒子、毛細管もしくはアッセイ容器)上で検出または定量し得る。
いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、生細胞イメージング、細胞の取り込みまたは細胞の選別及び標識に用いるための薬物、ヌクレオチド、糖、タンパク質、ポリマー、固体表面、発色団、色素などのような様々な生体分子及び巨大分子に付加し得る。例えば、開示されている化合物を様々な官能基に付加して、NlucまたはNanoBiTを所望の官能基でポストラベリング可能にし得る。
いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質を捕捉または単離するのに使用し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、NanoLuc(登録商標)及びHaloTag(登録商標)ベースの技術を用いて、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、クリックケミストリーを用いて、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。例えば、開示されている化合物は、NanoLuc(登録商標)及びアジドまたはアルキンで修飾されたビーズまたは表面を用いて、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。別の実施形態では、開示されている化合物は、NanoLuc(登録商標)及びストレプトアビジンで修飾されたビーズまたは表面を用いて、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、NanoLuc(登録商標)及びシアノベンゾチアゾールで修飾されたビーズまたは表面を用いて、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質の単離に用いるための薬物、ヌクレオチド、糖、タンパク質、ポリマー及び固体表面のような様々な生体分子及び巨大分子に付加し得る。例えば、細胞に、Nluc-HT融合タンパク質のようなNluc融合タンパク質をトランスフェクションし、その細胞を、官能基に付加された本開示の化合物に暴露し得る。その官能基は、固体支持体に結合して、それによって、そのNluc融合タンパク質を単離可能にする分子であってよい。
開示されている化合物は、Oplophorusルシフェラーゼを阻害する方法で使用し得る。開示されている化合物は、その活性部位で共有結合を形成することによって、Oplophorusルシフェラーゼを阻害し得る。その方法は、本発明で開示される化合物と、Oplophorus由来のルシフェラーゼを発現するかまたは含む細胞を接触させることを含んでよく、その際、開示されている化合物は、そのOplophorus由来のルシフェラーゼと選択的に反応して、そのOplophorus由来のルシフェラーゼを不活化し得る。その方法は、試料と、基質セレンテラジン及び本発明で開示される化合物を接触させることを含んでよく、その際、本発明で開示される化合物により、そのOplophorus由来のルシフェラーゼによる発光が減少する。その方法は、試料と、本発明で開示される化合物を接触させる前に、試料と基質セレンテラジンを接触させることを含んでよい。その方法は、試料と基質セレンテラジンを接触させる前に、試料と、本発明で開示される化合物を接触させることを含んでよい。
特定の実施形態では、本発明で開示する方法は、試料(例えば細胞)と、細胞透過性基質のセレンテラジン、及び細胞不透過性となるように改変されている本明細書に記載の化合物の混合物とを接触させることを含む。このような実施形態では、開示されている化合物及び方法を用いて、ハイスループットスクリーニング作業のアッセイ形式の初期の輝度を確立した後に、細胞から排出され得るいずれのルシフェラーゼも選択的に阻害して、その細胞外で発生し得る発光を選択的に阻害し得る。このような方法は、細胞内で、より選択的なシグナルを提供し得る。
特定の実施形態では、本発明で開示する方法は、試料(例えば細胞)と、細胞透過性基質のセレンテラジン、及び細胞透過性である本明細書に記載の化合物の混合物とを接触させることを含む。このような実施形態では、開示されている化合物は、細胞に侵入し、その細胞内のOplophorusルシフェラーゼを選択的に阻害することができる。このような方法は、2つ以上のルシフェラーゼの使用を伴うマルチプレックスアッセイにおいて有益なことがあり、細胞内の別のルシフェラーゼによる発光を選択的に観測する目的で、Oplophorusルシフェラーゼによる発光を阻害可能にし得る。
開示されている化合物を使用して、他のルシフェラーゼ及びアッセイとの時間的マルチプレックス化に適用されているように、Oplophorusルシフェラーゼを阻害し得る。いくつかの実施形態では、Oplophorus由来のルシフェラーゼまたはそのバリアントを、異なる波長の光を発する別の酵素(例えばルシフェラーゼ)、例えば、緑色ホタルルシフェラーゼ、例えば、Photinus pyralis(例えば、Promega CorpのLuc2)または赤色コメツキムシルシフェラーゼ(Promega Corp.のChroma-Luc(商標)ルシフェラーゼ)とマルチプレックス化し得る。例えば、Oplophorusルシフェラーゼを機能的レポーターとして使用する場合、緑色ホタルルシフェラーゼまたは赤色Chroma-Luc(商標)ルシフェラーゼを使用して、遺伝子調節に対する非特異的な作用を制御したり、またはトランスフェクション効率を正規化したりできる。いくつかの実施形態では、Oplophorusルシフェラーゼから生成される発光(約460nm)及び赤色Chroma-Lucから生成される発光(約610nm)は、波長識別フィルターを備えた発光測定装置を用いて容易に分解でき、同じ試料からの両方のシグナルを測定可能となる。このような実施形態では、本明細書に記載の化合物を使用して、Oplophorusルシフェラーゼを選択的に阻害して、もう一方のルシフェラーゼからのシグナルを選択的に観測できるようにできる。
いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、Oplophorusルシフェラーゼを不可逆的に阻害する自殺阻害剤として使用し得る。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼの自殺基質であって、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのOplophorus由来のルシフェラーゼを不可逆的に阻害する自殺基質であり得る。開示されている化合物は、Oplophorus由来のルシフェラーゼと共有結合付加体を形成することによって、そのOplophorus由来のルシフェラーゼを阻害し得る。開示されている化合物は、NanoLuc、及び相補的な酵素系NanoBiTを阻害し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、リガンド-受容体結合アッセイに適用される自殺基質として使用し得る。
開示されている化合物は、生体成分を含む試料とともに使用し得る。その試料は、細胞を含んでよい。その試料は、成分の不均一混合物(インタクト細胞、細胞抽出物、細胞溶解液、細菌、ウイルス、細胞小器官、エクソソーム及びそれらの混合物を含む)、または単一成分もしくは均一な成分群(例えば、天然アミノ酸、合成アミノ酸、核酸重合体、糖鎖重合体もしくは脂質膜複合体)を含んでよい。開示されている化合物は概して、使用濃度範囲内では、生細胞及びその他の生体成分に対して無毒であり得る。
開示するのは、1つ以上の酵素(例えば、OplophorusルシフェラーゼまたはOplophorusバリアントルシフェラーゼ)の存在または活性を判断するためのキットである。そのキットは、OplophorusルシフェラーゼまたはOplophorusバリアントルシフェラーゼを阻害し得る本発明の化合物または組成物、基質であるセレンテラジンまたは基質であるセレンテラジン誘導体、OplophorusルシフェラーゼまたはOplophorusバリアントルシフェラーゼ、発光アッセイを実施するための説明、及び反応緩衝液(複数可)のうちの1つ以上を含んでよい。その反応緩衝液は、ルシフェラーゼ以外の酵素反応及び発光酵素反応のための個々の調合物に存在しても、一段階式のアッセイ用の単一の調合物に存在してもよい。そのキットは、ルシフェラーゼ以外の酵素(複数可)に対する他の阻害剤、活性化剤及び/または促進剤も含んでよい。そのキットは、そのアッセイのためのポジティブコントロール及び/またはネガティブコントロールも含んでよい。
下記の実施例では、「一般的手順」という場合には、発明を実施するための形態の節において、スキーム1~3に従って説明した手順を指す。
2-(4-((6-アミノヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(JRW-0855)
工程1.tert-ブチル(Z)-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-3-オキソイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2(3H)-イリデン)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)カルバメート(JRW-0852)
4-((6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)カルバモイル)-2-(3,6-ビス(ジメチルアミノ)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート(JRW-0857)
一般的手順Gに従って、2-(4-((6-アミノヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(60mg、0.11mmol)と、2-(3,6-ビス(ジメチルアミノ)キサンチリウム-9-イル)-4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート(29mg、0.055mmol)を反応させて、所望の生成物(9mg、8%)を赤色固体として得た。注:化合物は、溶液において不安定であった。ESI MS m/z 954 [M+H]+;HPLC 60.7 % (AUC), TR 6.58 分;UV (MeOH) λ 542nm, ε 73,359.
ナトリウム6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキサン-1-スルホネート(JRW-0892-2)
工程1.ナトリウム(Z)-6-(4-((8-ベンジル-6-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-3-オキソイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2(3H)-イリデン)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキサン-1-スルホネート(JRW-0890)
4-((6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)カルバモイル)-2-(3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)ベンゾエート(JRW-0893)
一般的手順Gに従って、2-(4-((6-アミノヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(53mg、0.10mmol)と、2-(3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)-4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート(55mg、0.12mmol)を反応させて[注:FAM-SEは、5-異性体と6-異性体の混合物であった]、所望の生成物(26mg、30%)をオレンジ色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.54 - 8.42 (m, 2H), 8.35 - 8.27 (m, 1H), 7.92 - 7.88 (m, 1H), 7.82 - 7.76 (m, 2H), 7.60 - 7.49 (m, 3H), 7.49 - 7.36 (m, 4H), 7.36 - 7.15 (m, 5H), 7.13 - 7.00 (m, 2H), 6.96 - 6.90 (m, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.26 (s, 2H), 4.11 - 3.96 (m, 2H), 3.42 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.89 - 1.61 (m, 4H), 1.61 - 1.41 (m, 4H);ESI MS m/z 899 [M+H]+;HPLC 73.4 % (AUC), TR 5.22 分;UV (MeOH) λ 444nm, ε 23,843.
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3-(5,5-ジフルオロ-7-(1H-ピロール-2-イル)-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド(JRW-0900)
一般的手順Gに従って、2-(4-((6-アミノヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(20mg、0.037mmol)と、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-(5,5-ジフルオロ-7-(1H-ピロール-2-イル)-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパノエート(15mg、0.037mmol)を反応させて、所望の生成物(10mg、32%)を黒色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.37 (s, 1H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.49 - 7.44 (m, 2H), 7.37 - 7.29 (m, 2H), 7.29 - 7.22 (m, 1H), 7.22 - 6.89 (m, 9H), 6.82 (s, 1H), 6.37 - 6.26 (m, 1H), 5.53 - 5.41 (m, 1H), 4.58 (s, 2H), 4.26 (s, 2H), 4.02 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.32 - 3.27 (m, 2H), 3.24 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.80 - 2.70 (m, 2H), 1.81 - 1.67 (m, 2H), 1.56 - 1.40 (m, 4H), 1.36 - 1.25 (m, 4H);ESI MS m/z 852 [M+H]+;HPLC 97.1 % (AUC), TR 5.74 分;UV (MeOH) λ 578nm, ε 72,280.
N,N’-(6-((6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイル)ビス(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)(JRW-0905)
一般的手順Gに従って、2-(4-((6-アミノヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(50mg、0.092mmol)と、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-オキソ-3’,6’-ビス(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキシレート(67mg、0.10mmol)を反応させて[注:R110-SEは、5-異性体と6-異性体の混合物であった]、所望の生成物(35mg、35%)をオレンジ色固体として得た。6-異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、5-異性体と6-異性体の混合物である。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.50 - 8.44 (m, 1H), 8.23 - 8.09 (m, 2H), 7.92 - 7.84 (m, 2H), 7.66 - 7.55 (m, 2H), 7.52 - 7.44 (m, 2H), 7.43 - 7.17 (m, 10H), 7.13 - 6.82 (m, 10H), 4.44 - 4.37 (m, 2H), 4.13-4.07 (m, 2H), 4.06 - 3.93 (m, 2H), 3.46 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.89 - 1.64 (m, 4H), 1.62 - 1.45 (m, 4H);ESI MS m/z 1089 [M+H]+;HPLC 61.4 % (AUC), TR 5.97 分;UV (MeOH) λ 434nm, ε 8,791.
2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(JRW-0904)
工程1.tert-ブチル(Z)-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-3-オキソイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2(3H)-イリデン)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバメート(JRW-0901)
4-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)ベンゾエート(JRW-0906)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(30mg、0.053mmol)と、2-(3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)-4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート(30mg、0.063mmol)を反応させて[注:FAM-SEは、5-異性体と6-異性体の混合物であった]、所望の生成物(25mg、52%)をオレンジ色固体として得た。6-異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、5-異性体と6-異性体の混合物である。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.84 (d, J = 1.7 Hz, 0.5H, 異性体A), 8.52 - 8.44 (m, 1.5H), 8.31 (ddd, J = 21.2, 8.1, 1.7 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 1.7 Hz, 0.5H, 異性体B), 7.82 - 7.76 (m, 2H), 7.64 - 7.49 (m, 3H), 7.48 - 7.37 (m, 4H), 7.37 - 7.17 (m, 5H), 7.14 - 6.99 (m, 3H), 6.98 - 6.89 (m, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.26 (s, 2H), 4.02 - 3.99 (m, 2H), 3.51 - 3.38 (m, 2H), 1.87 - 1.59 (m, 4H), 1.59 - 1.36 (m, 8H);ESI MS m/z 927 [M+H]+;HPLC 89.5 % (AUC), TR 5.57 分;UV (MeOH) λ 444nm, ε 24,071.
4-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(3,6-ビス(ジメチルアミノ)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート(JRW-0912)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(50mg、0.088mmol)と、2-(3,6-ビス(ジメチルアミノ)キサンチリウム-9-イル)-4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート(46mg、0.088mmol)を反応させて、所望の生成物(18mg、20%)を黒赤色固体として得た。注:化合物は、溶液において不安定であった。ESI MS m/z 981 [M+H]+;HPLC 64.8 % (AUC), TR 5.09 分;UV (MeOH) λ 552nm, ε 125,445.
3-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)-N-(8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)プロパンアミド(JRW-0925)
工程1.4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンズアルデヒド(JRW-0918)
4-((2-(2-(3-((8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)アミノ)-3-オキソプロポキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)-2-(3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)ベンゾエート(JRW-0926)
一般的手順Gに従って、-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)-N-(8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)プロパンアミド(50mg、0.069mmol)と、2-(3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)-4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート(32mg、0.069mmol)を反応させて[注:FAM-SEは、5-異性体と6-異性体の混合物であった]、所望の生成物(35mg、47%)を橙褐色固体として得た。6-異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、5-異性体と6-異性体の混合物である。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.85 (d, J = 1.7 Hz, 0.5H, 異性体A), 8.53 - 8.44 (m, 1.5H), 8.40 - 8.26 (m, 1H), 7.96 - 7.88 (m, 0.5H, 異性体B), 7.82 - 7.76 (m, 2H), 7.64 - 7.48 (m, 4H), 7.48 - 7.42 (m, 2H), 7.42 - 7.37 (m, 2H), 7.36 - 7.28 (m, 2H), 7.28 - 7.18 (m, 3H), 7.13 - 6.97 (m, 3H), 6.97 - 6.89 (m, 2H), 4.63 (s, 2H), 4.27 (s, 2H), 4.02 - 3.98 (m, 2H), 3.82 - 3.53 (m, 10H), 3.28 - 3.13 (m, 2H), 2.59 - 2.52 (m, 1H), 2.51 - 2.43 (m, 1H), 1.82 - 1.68 (m, 2H), 1.58 - 1.41 (m, 4H), 1.42 - 1.27 (m, 8H);ESI MS m/z 1086 [M+H]+;HPLC 74.9 % (AUC), TR 5.08 分;UV (MeOH) λ 444nm, ε 23,614.
4-((2-(2-(3-((8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)アミノ)-3-オキソプロポキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)-2-(3,6-ビス(ジメチルアミノ)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート(JRW-0927)
一般的手順Gに従って、-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)-N-(8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)プロパンアミド(50mg、0.068mmol)と、2-(3,6-ビス(ジメチルアミノ)キサンチリウム-9-イル)-4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート(36mg、0.068mmol)を反応させて、所望の生成物(18mg、23%)を黒赤色固体として得た。注:化合物は、溶液において不安定であった。ESI MS m/z 1140 [M+H]+;HPLC 37.6 % (AUC), TR 4.79 分;UV (MeOH) λ 552nm, ε 89,415.
6-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイルジアセテート(JRW-0972)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(50mg、0.068mmol)と、6-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイルジアセテート(58mg、0.10mmol)を反応させて[注:FAM-SEは、5-異性体と6-異性体の混合物であった]、所望の生成物(42mg、47%)をオレンジ色固体として得た。6-異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、5-異性体と6-異性体の混合物である。注:化合物は、溶液において不安定であった。ESI MS m/z 1011 [M+H]+;HPLC 45.7 % (AUC), TR 5.83 分;UV (MeOH) λ 444nm, ε 32,826.
2-(4-((6-アジドヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(JRW-0975)
工程1.4-((6-アジドヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンズアルデヒド(JRW-0891)
6-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイルジアセテート(JRW-0986)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(42mg、0.074mmol)と、4’,5’-ジクロロ-6-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)-2’,7’-ジメトキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイルジアセテート(55mg、0.081mmol)を反応させて[注:JOE-SEは、5-異性体と6-異性体の混合物であった]、所望の生成物(40mg、47%)を赤色固体として得た。6-異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、5-異性体と6-異性体の混合物である。注:化合物は、溶液において不安定であった。ESI MS m/z 1141 [M+H]+;HPLC 73.4 % (AUC), TR 6.45 分;UV (MeOH) λ 472nm, ε 4,433.
8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-2-((2-オキソ-2H-クロメン-6-イル)メチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(JRW-0995)
工程1.8-ベンジル-6-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-2-((2-オキソ-2H-クロメン-6-イル)メチレン)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(2H)-オン(JRW-0992)
N-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-11-オキソ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H,5H,11H-ピラノ[2,3-f]ピリド[3,2,1-ij]キノリン-10-カルボキサミド(JRW-1023)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(50mg、0.088mmol)と、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル11-オキソ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H,5H,11H-ピラノ[2,3-f]ピリド[3,2,1-ij]キノリン-10-カルボキシレート(67mg、0.17mmol)を反応させて、所望の生成物(24mg、33%)をオレンジ色固体として得た。ESI MS m/z 836 [M+H]+;HPLC 76.0 % (AUC), TR 6.43分.
N-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-7-ヒドロキシ-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボキサミド(JRW-1018)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(41mg、0.072mmol)と、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル7-ヒドロキシ-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボキシレート(43mg、0.14mmol)を反応させて、所望の生成物(36mg、67%)を褐色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.71 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.84 - 7.69 (m, 2H), 7.63 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.48 - 7.39 (m, 2H), 7.35 - 7.18 (m, 3H), 7.12 - 6.96 (m, 3H), 6.96 - 6.85 (m, 3H), 6.75 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.61 (s, 2H), 4.24 (s, 2H), 4.00 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.40 - 3.35 (m, 2H), 1.81 - 1.69 (m, 2H), 1.66 - 1.53 (m, 2H), 1.53 - 1.33 (m, 8H);ESI MS m/z 757 [M+H]+;HPLC 91.2 % (AUC), TR 5.69 分;UV (MeOH) λ 350nm, ε 23646.
2-(4-((8-アジドオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(JRW-1022)
工程1.4-((8-ブロモオクチル)オキシ)-3-フルオロベンズアルデヒド(JRW-1016)
5-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(2,7-ジフルオロ-3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)ベンゾエート(JRW-1058)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(15mg、0.026mmol)と、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル2’,7’-ジフルオロ-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキシレート(13mg、0.026mmol)を反応させて、所望の生成物(12mg、48%)を赤色固体として得た。ESI MS m/z 963 [M+H]+;HPLC 58.1 % (AUC), TR 5.50 分;UV (MeOH) λ 280nm, ε 21,600.
5-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(3,11-ジヒドロキシジベンゾ[c,h]キサンテン-14-イウム-7-イル)ベンゾエート(JRW-1059)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(25mg、0.044mmol)と、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3,11-ジヒドロキシ-3’-オキソ-3’H-スピロ[ジベンゾ[c,h]キサンテン-7,1’-イソベンゾフラン]-5’-カルボキシレート(25mg、0.044mmol)を反応させて、所望の生成物(13mg、28%)を褐色固体として得た。ESI MS m/z 1028 [M+H]+;HPLC 82.3 % (AUC), TR 5.71 分;UV (MeOH) λ 528nm, ε 11,800.
N1-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-N4-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)コハク酸アミド(JRW-1088)
発光特性
発光アッセイ手順:スクリーニングする各化合物をDMSO(5mM)に溶解してから、NANO-GLO(登録商標)Luciferase Assay Bufferにおいて100μMまでさらに希釈した。最初に、基質をNANO-GLO(登録商標)Luciferase Assay Buffer中に2倍段階希釈することによって、Km値を求めた。続いて、基質希釈液と、TBS+0.01%BSAにおいて4ng/mlまで希釈した当量のNanoLucを合わせた。基質の100uM希釈液とTBS+0.01%BSAを合わせることによって、自己発光を測定した。発光値及び自己発光値は、基質を加えてから3分後に、GloMax(登録商標)-Multi+という発光測定装置で測定した。TBS+0.01%BSAにおいて、当量の100uM基質と、4ng/mlのNanoLucを合わせることによって、シグナルの減衰を測定してから、GloMax(登録商標)-Multi+を用いて、試料を5分間隔で2時間、読み取った。100uMにおける発光値及び自己発光値が図1に示されている。Kmは、非線形のミカエルリス-メンテンの回帰を用いたGraphPad Prismを用いて算出した。GraphPad Prismの非線形減衰(プラトーを0に設定した)を用いて、シグナル半減期の値を算出した。光出力、シグナル半減期及びKmの値は、表1にまとめられている。値は、各カテゴリーにおいて、フリマジンを1とした場合の相対値として表されている(2ng/mlのNanoLucにおいて約2.0×107のRLU)。
表1
NT-未試験
NC-算出不能
NanoLuc(登録商標)ルシフェラーゼ(Nluc)の阻害
化合物は、NanoLucによるフリマジンの発光をブロックする能力についても試験した。典型的には、DMEM中のNanoLuc(0.4μg/mL)を、フリマジンまたは試験化合物(50μM)のいずれかとともにインキュベートしながら、RLUを発光測定装置GloMax(登録商標)で10~60分モニタリングした。設定時間の経過後、プレートをその装置から取り出し、試験化合物の入ったウェルに、ある用量のフリマジン(10μM)を加え、10~60分モニタリングした。
NanoBiT(商標)2分子ルシフェラーゼ系の阻害
化合物は、NanoBiT(商標)2分子ルシフェラーゼを阻害する能力についても試験した。HiBiT(配列番号3)及びLgBiT(配列番号4)(NanoBiT(商標)ルシフェラーゼの2つのサブユニット)をフリマジンまたはフリマジン-hとともに15分インキュベートした。インキュベーション期間後、10μMのフリマジンを加えた。図7に示されているように、フリマジン-hは、Nlucとインキュベーション後、初めに、フリマジンの発光シグナルに匹敵する発光シグナルを生成する。このシグナルは、フリマジンのポジティブコントロールウェルで観察されるシグナルの数分の1まで速やかに低下する。フリマジンのポジティブコントロールウェルにフリマジンを加えると、生物発光が増大する。対照的に、フリマジンをフリマジン-hのウェルに加えると、生物発光は増大しないことから、NanoBiT(商標)ルシフェラーゼが、フリマジン-hによって効果的に阻害されることが示されている。
蛍光イメージング
自殺基質がNanoLucを標識するのをさらに示すために、NanoLucを2つの蛍光性FAM-基質セレンテラジン、JRW-0906及びJRW-0926とともにインキュベートした。それらのNanoLuc自殺基質の効率は、HaloTagタンパク質(配列番号5)がグルタチオントランスフェラーゼ(GST)またはNanoLucのいずれかに融合されている融合タンパク質によって、クロロアルカン-FAMという基質と比較した。
3-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)-N-(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)プロパンアミド(JRW-1505)
DMF(5mL)中の2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エタン-1-アミン(60mg、0.27mmol)及び2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)プロパノエート(80mg、0.27mmol)の溶液に、トリメチルアミン(54mg、0.54mmol)を加えた。その反応物を室温で3時間撹拌した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、クロマトグラフにかけて、所望の生成物(38mg、34%)を無色油として得た。ESI MS m/z 409 [M+H]+.
(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)コハク酸アミド-DBCO(JRW-1550)
DMF(5mL)中の2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エタン-1-アミン(20mg、0.090mmol)及び2,5-ジオキソピロリジン-1-イル4-DBCO-アミノ-4-オキソブタノエート(36mg、0.090mmol)の溶液に、トリメチルアミン(18mg、0.18mmol)を加えた。その反応物を室温で4時間撹拌した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、クロマトグラフにかけて、所望の生成物(37mg、80%)を淡褐色油として得た。ESI MS m/z 512 [M+H]+.
N1-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-N4-DBCO-コハク酸アミド(JRW-1549)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(25mg、0.044mmol)と、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル4-DBCO-アミノ-4-オキソブタノエート(21mg、0.053mmol)を反応させて、所望の生成物(23mg、62%)をオレンジ色固体として得た。ESI MS m/z 857 [M+H]+.
(E)-シクロオクト-4-エン-1-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート(JRW-1567)
DCM(5mL)中の2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エタン-1-アミン(20mg、0.090mmol)及び(E)-シクロオクト-4-エン-1-イル(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カーボネート(24mg、0.090mmol)の溶液に、トリメチルアミン(18mg、0.18mmol)を加えた。その反応物を室温で3時間撹拌した。その反応物をDCMで希釈し、セライトを加えた。その混合物を濃縮し、クロマトグラフにかけて、所望の生成物(27mg、81%)を無色油として得た。ESI MS m/z 376 [M+H]+.
(E)-シクロオクト-4-エン-1-イル(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバメート(JRW-1566)
一般的手順Gに従って、2-(4-((8-アミノオクチル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(25mg、0.044mmol)と、(E)-シクロオクト-4-エン-1-イル(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カーボネート(14mg、0.053mmol)を反応させて、所望の生成物(13mg、40%)をオレンジ色固体として得た。ESI MS m/z 721 [M+H]+.
2-(6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-4-((3-(4-(6-メチル-1,2,4,5-テトラジン-3-イル)フェノキシ)プロピル)カルバモイル)安息香酸(JRW-1577)
DMF(5mL)中の3-(4-(6-メチル-1,2,4,5-テトラジン-3-イル)フェノキシ)プロパン-1-アミン塩酸塩(25mg、0.089mmol)及び4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)-2-(6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)安息香酸(31mg、0.066mmol)の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(34mg、0.27mmol)を加えた。その反応物を室温で2時間撹拌した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層をNH4Clの溶液で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、クロマトグラフにかけて、所望の生成物(16mg、30%)を赤色固体として得た。ESI MS m/z 604 [M+H]+.
アジド-DBCO対での直接標識及び2段階標識の蛍光イメージングによる比較
実施例26では、色素が付加された自殺基質が、NanoLucを標識することが蛍光イメージングによって示されている。この実施例では、アジドが付加された自殺基質が、2段階式の手順(その第2の工程は、DBCOが付加されたFAM色素との銅フリーのクリックケミストリーである)で、NanoLuc-HaloTagタンパク質を標識することが示されている。この実施例では、NanoLucをJRW-0926で直接標識する方法、NanoLucをJRW-0975及びDBCO-FAMで2段階標識する方法、NanoLucをJRW-1022及びDBCO-FAMで2段階標識する方法、HaloTagをFAM-HTリガンドで直接標識する方法、ならびにアジドが付加されたSEで2段階標識する方法という5つの方法を比較した。この実施例で使用した化合物の構造は、図10Aに示されている。
TCO-テトラジン対での直接標識及び2段階標識の蛍光イメージングによる比較
実施例33と同様に、NanoLuc-HaloTagタンパク質を化合物とともにインキュベートして、直接標識するか、FAMを用いる2段階プロセスによって標識するかした。この実施例で使用した追加の化合物の構造は、図12Aに示されている。化合物をNanoLuc-HaloTag融合タンパク質とともにインキュベートし、SDS/PAGEゲル上での蛍光イメージングによって解析した。
配列番号1-天然型の成熟Oplophorusルシフェラーゼのアミノ酸配列
FTLADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENGLKADIHVIIPYEGLSGFQMGLIEMIFKVVYPVDDHHFKIILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTLWNGNKIYDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCENILA
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA
VSGWRLFKKIS
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTIN
MAEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTSSYVWRNIIPHVAPTHRCIAPDLIGMGKSDKPDLGYFFDDHVRFMDAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGIAFMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTTDVGRKLIIDQNVFIEGTLPMGVVRPLTEVEMDHYREPFLNPVDREPLWRFPNELPIAGEPANIVALVEEYMDWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAKSLPNCKAVDIGPGLNLLQEDNPDLIGSEIARWLSTLEISG
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕下記の式(I)の化合物、
(I)
またはその互変異性体もしくは塩であって、式中、
R 1 が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環または任意に置換されたシクロアルキルであり、R 1 が、-Q-L-Zである少なくとも1つの基で置換されており、
Qが、-O-、-NR Q -、-NR Q -CO-、-CO-NR Q -、-O-CO-NR Q -または-NR Q -CO-O-であり、
Lが、-(CR 1a R 1b ) m -、-(CR 1x R 1y -CR 1x R 1y -O) t1 -(CR 1x R 1y ) t2 -Q 1 -、-(CR 1x R 1y ) t2 -A-(CR 1x R 1y -CR 1x R 1y -O) t1 -Q 1 -、-(CR 1x R 1y ) t3 -A-(CR 1x R 1y -CR 1x R 1y -O) t1 -(CR 1x R 1y ) t2 -または-(CR 1x R 1y ) t3 -A-(CR 1x R 1y ) t4 -であり、各Q 1 が独立して、結合手、-O-または-NR Q1 -であり、各Aが独立して、結合手、-O-、-NR Q -、-NR Q -CO-、-CO-NR Q -、-O-CO-NR Q -または-NR Q -CO-O-であり、
Zが、-COOR 2 、-SO 2 -OR 3 、-PO(OR 4 )(OR 5 )、ハロ、アジド、C 2 -C 10 アルキニル、ビオチン部分、-NR 6 R 7 、-NR 8 -CO-R 9 、-CO-R 10 または-NR 11 -CO-O-R 12 であり、
R 2 、R 3 、R 4 、R 5 、R 8 、R 9 、R 10 、R 11 及びR 12 が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC 1 -C 8 アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターであり、
R 6 及びR 7 が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC 1 -C 8 アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルもしくはエネルギーアクセプターであるか、またはR 6 及びR 7 が、それらと結合している窒素原子と一体となって、任意に置換された環を形成し、
R 1a 、R 1b 、R Q 、R Q1 、R 1x 及びR 1y が各出現ごとに独立して、水素、C 1 -C 4 アルキルまたはC 1 -C 4 ハロアルキルであり、
qが、0、1または2であり、
mが各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12であり、
t1が各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、
t2が、0~5の整数であり、
t3が各出現ごとに、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、
t4が、0~5の整数であり、
前記化合物が、4-[4-[[8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-7H-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル]メチル]フェノキシ]ブタン酸ではない前記化合物、またはその互変異性体もしくは塩。
〔2〕qが1である、前記〔1〕に記載の化合物。
〔3〕R 1 が、-Q-L-Zという1つの置換基で置換されたフェニルであり、任意に、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、-COOH、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリル、t-ブチルジメチルシリル、アルキルスルファニル、スルファニル及びアシルから独立して選択した1つまたは2つの置換基でさらに置換されており、
Qが、-O-、-NR Q -、-NR Q -CO-、-CO-NR Q -、-O-CO-NR Q -または-NR Q -CO-O-であり、
Lが、-(CR 1a R 1b ) m -であり、
Zが、-SO 2 -OR 3 、アジド、-NR 6 R 7 または-NR 8 -CO-R 9 であり、
R 3 、R 6 、R 7 及びR 8 が独立して、水素、任意に置換されたC 1 -C 8 アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリールまたは任意に置換された複素環であり、
R 9 が、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターである、前記〔1〕~〔2〕のいずれかに記載の化合物。
〔4〕R 1 が、-Q-L-Zという1つの置換基で置換されたフェニルであり、任意に、1つのハロゲンでさらに置換されている、前記〔3〕に記載の化合物。
〔5〕下記の式(Ia)の化合物であって、
(Ia)
式中、
R 1z がハロゲンである、前記〔1〕に記載の化合物。
〔6〕Qが、Oであり、
Lが、-(CR 1a R 1b ) m -であり、
R 1a 及びR 1b が、水素であり、
mが、5、6、7、8、9または10であり、
Zが、-NR 8 -CO-R 9 であり、
R 8 が、水素であり、
R 9 が、エネルギーアクセプターである、前記〔4〕~〔5〕のいずれかに記載の化合物。
〔7〕前記エネルギーアクセプターが、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ピレン、シアニン、スクアライン及びホウ素-ジピロメテンから選択した蛍光色素である、前記〔1〕~〔6〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔8〕前記-Q-L-Zという基が、
から選択した構造を有する、前記〔1〕~〔5〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔9〕2-(4-((6-アミノヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン、
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキサン-1-スルホン酸、
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3-(5,5-ジフルオロ-7-(1H-ピロール-2-イル)-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド、
N,N’-(6-((6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイル)ビス(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)、
N-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
N-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
3-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)-N-(8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)プロパンアミド、
N-(2-(2-(3-((8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)アミノ)-3-オキソプロポキシ)エトキシ)エチル)-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
N-(2-(2-(3-((8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)アミノ)-3-オキソプロポキシ)エトキシ)エチル)-3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
6-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイルジアセテート、
2-(4-((6-アジドヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン、
5-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(2,7-ジフルオロ-3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)ベンゾエート、
5-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(3,11-ジヒドロキシジベンゾ[c,h]キサンテン-14-イウム-7-イル)ベンゾエート、
N1-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-N4-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ 4 ,6λ 4 -ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)コハク酸アミド、
N 1 -(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-N 4 -(ジベンジルシクロオクテニル)-コハク酸アミド及び
(E)-シクロオクト-4-エン-1-イル(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバメート
からなる群から選択された、前記〔1〕に記載の化合物。
〔10〕試料中のOplophorus由来のルシフェラーゼの検出方法であって、前記試料と、前記〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程を含む前記方法。
〔11〕前記試料における発光を検出する工程をさらに含む、前記〔10〕に記載の方法。
〔12〕試料における発光の検出方法であって、
(a)前記試料と、前記〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、
(b)Oplophorus由来のルシフェラーゼが前記試料に存在しない場合には、前記試料と、Oplophorus由来のルシフェラーゼを接触させる工程、及び
(c)前記試料における発光を検出する工程、
を含む前記方法。
〔13〕試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの標識方法であって、前記試料と、前記〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程を含む前記方法。
〔14〕試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの標識方法であって、
(a)前記試料と、前記〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、少なくとも1つの蛍光色素を含む、
(b)前記接触工程後に、前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、及び
(c)前記洗浄工程後に、前記試料における蛍光を検出する工程、
を含む前記方法。
〔15〕試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの標識方法であって、
(a)前記試料と、前記〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、第1の官能基を含む、
(b)前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、
(c)前記試料と、第2の官能基を含む蛍光色素とを接触させる工程、ここで、前記第2の官能基が、前記第1の官能基と反応するか、または前記第1の官能基に結合することができる、
(d)前記試料を洗浄して、任意の未反応の蛍光色素を除去する工程、及び
(e)前記試料における蛍光を検出する工程、
を含む前記方法。
〔16〕前記第1の官能基が、アジドであり、前記第2の官能基が、アルキンである、前記〔15〕に記載の方法。
〔17〕前記第1の官能基が、アルキンであり、前記第2の官能基が、アジドである、前記〔15〕に記載の方法。
〔18〕前記第1の官能基が、ビオチン部分であり、前記第2の官能基が、ストレプトアビジンである、前記〔15〕に記載の方法。
〔19〕試料からのOplophorus由来のルシフェラーゼの単離方法であって、前記試料が、生細胞を含み、前記方法が、
(a)Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、前記〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、第1の官能基を有する、
(b)前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、
(c)前記試料と、1つ以上の溶解試薬を接触させる工程、
(d)前記第1の官能基に結合するか、または前記第1の官能基と反応する第2の官能基を有する捕捉剤を前記試料に加えて、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを捕捉する工程、
(e)前記試料を洗浄して、捕捉されなかったOplophorus由来のルシフェラーゼを除去する工程、及び
(f)工程(e)で捕捉された前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを単離する工程、
を含む前記方法。
〔20〕試料からのOplophorus由来のルシフェラーゼの単離方法であって、前記試料が、生細胞を含み、前記方法が、
(a)Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む試料と、1つ以上の溶解試薬を接触させる工程、
(b)Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、前記〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、第1の官能基を有する、
(c)前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、
(d)前記第1の官能基に結合するか、または前記第1の官能基と反応する第2の官能基を有する捕捉剤を前記試料に加えて、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを捕捉する工程、
(e)前記試料を洗浄して、捕捉されなかったOplophorus由来のルシフェラーゼを除去する工程、及び
(f)工程(e)で捕捉された前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを単離する工程、
を含む前記方法。
〔21〕前記Oplophorus由来のルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、前記〔10〕~〔20〕のいずれか1項に記載の方法。
〔22〕試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの阻害方法であって、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼと、前記〔1〕~〔9〕のいずれかに記載の化合物を接触させる工程を含む前記方法。
〔23〕前記Oplophorus由来のルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、前記〔22〕に記載の方法。
〔24〕前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを不可逆的に阻害する、前記〔22〕に記載の方法。
〔25〕前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを部分的に阻害する、前記〔22〕に記載の方法。
〔26〕試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
(a)前記試料と、基質セレンテラジン及び前記〔1〕~〔9〕のいずれかに記載の化合物を接触させる工程、ならびに
(b)前記試料における発光を検出する工程、
を含み、
前記〔1〕~〔9〕のいずれかに記載の化合物により、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼによる発光が減少する前記方法。
〔27〕前記試料と、前記〔1〕~〔10〕のいずれか1項に記載の化合物を接触させる前に、前記試料と、前記基質セレンテラジンを接触させる工程を含む、前記〔26〕に記載の方法。
〔28〕前記試料と、前記基質セレンテラジンを接触させる前に、前記試料と、前記〔1〕~〔10〕のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程を含む、前記〔26〕に記載の方法。
〔29〕試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
(a)前記試料と、前記〔1〕~〔9〕のいずれかに記載の化合物を接触させる工程、
(b)前記試料と、基質セレンテラジンを接触させる工程、及び
(c)前記試料における発光を検出する工程、
を含み、
前記〔1〕~〔9〕のいずれかに記載の化合物により、前記基質セレンテラジンを加えたときに、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼによる発光の増大が阻止される前記方法。
〔30〕前記試料が、細胞を含む、前記〔10〕~〔29〕のいずれか1項に記載の方法。
〔31〕前記細胞が、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む、前記〔30〕に記載の方法。
〔32〕
前記細胞が、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを発現する、前記〔31〕に記載の方法。
〔33〕前記基質セレンテラジンが、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジン類似体、プロセレンテラジン、またはキノンでマスクされたセレンテラジンである、前記〔26〕~〔29〕のいずれか1項に記載の方法。
〔34〕(a)前記〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の化合物、及び
(b)Oplophorus由来のルシフェラーゼ、
を含むキット。
〔35〕前記Oplophorus由来のルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、前記〔34〕に記載のキット。
〔36〕基質セレンテラジンをさらに含む、前記〔34〕に記載のキット。
〔37〕発光アッセイを実施するための説明をさらに含む、前記〔34〕~〔36〕のいずれか1項に記載のキット。
Claims (25)
- 下記の式(Ia)の化合物、
(Ia)
またはその互変異性体もしくは塩であって、式中、
R 1z がハロゲンであり、
Qが、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Lが、-(CR1aR1b)m-、-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-(CR1xR1y)t2-Q1-または-(CR1xR1y)t2-A-(CR1xR1y-CR1xR1y-O)t1-Q1-であり、各Q1が独立して、結合手、-O-または-NRQ1-であり、Aが、結合手、-O-、-NRQ-、-NRQ-CO-、-CO-NRQ-、-O-CO-NRQ-または-NRQ-CO-O-であり、
Zが、-COOR2、-SO2-OR3、-PO(OR4)(OR5)、ハロ、アジド、C2-C10アルキニル、ビオチン部分、-NR6R7 または-NR8-CO-R9 であり、
R2、R3、R4、R5、R8 及びR9 が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキル、フルオロフォア又は検出可能な発色団であり、
R6及びR7が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキル、フルオロフォア又は検出可能な発色団であるか、またはR6及びR7が、それらと結合している窒素原子と一体となって、任意に置換された環を形成し、
R1a、R1b、RQ、RQ1、R1x及びR1yが各出現ごとに独立して、水素、C1-C4アルキルまたはC1-C4ハロアルキルであり、
mが各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12であり、
t1が各出現ごとに独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、及び
t2が、0~5の整数であり、
前記化合物が、4-[4-[[8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-7H-イミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル]メチル]フェノキシ]ブタン酸ではない前記化合物、またはその互変異性体もしくは塩。 - Qが、Oであり、
Lが、-(CR1aR1b)m-であり、
R1a及びR1bが、水素であり、
mが、5、6、7、8、9または10であり、
Zが、-NR8-CO-R9であり、
R8が、水素であり、
R9が、フルオロフォア又は検出可能な発色団である、請求項1に記載の化合物。 - R9が、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ピレン、シアニン、スクアライン及びホウ素-ジピロメテンから選択したフルオロフォアである、請求項1又は2に記載の化合物。
- 2-(4-((6-アミノヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン、
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキサン-1-スルホン酸、
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
N-(6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)-3-(5,5-ジフルオロ-7-(1H-ピロール-2-イル)-5H-5λ 4 ,6λ 4 -ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド、
N,N’-(6-((6-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)ヘキシル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイル)ビス(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)、
N-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
N-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
3-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)-N-(8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)プロパンアミド、
N-(2-(2-(3-((8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)アミノ)-3-オキソプロポキシ)エトキシ)エチル)-3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
N-(2-(2-(3-((8-(4-((1-ベンジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)-6-オキソ-2,6-ジヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-7-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)アミノ)-3-オキソプロポキシ)エトキシ)エチル)-3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド、
6-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイルジアセテート、
2-(4-((6-アジドヘキシル)オキシ)-3-フルオロベンジル)-8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン、
5-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(2,7-ジフルオロ-3,6-ジヒドロキシキサンチリウム-9-イル)ベンゾエート、
5-((8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)カルバモイル)-2-(3,11-ジヒドロキシジベンゾ[c,h]キサンテン-14-イウム-7-イル)ベンゾエート、及び
N1-(8-(4-((8-ベンジル-6-(4-ヒドロキシフェニル)-3-オキソ-3,7-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-2-イル)メチル)-2-フルオロフェノキシ)オクチル)-N4-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)コハク酸アミド
からなる群から選択された、請求項1に記載の化合物。 - 試料中のOplophorus由来のルシフェラーゼの検出方法であって、前記試料と、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程を含む前記方法。
- 前記試料における発光を検出する工程をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 試料における発光の検出方法であって、
(a)前記試料と、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、
(b)Oplophorus由来のルシフェラーゼが前記試料に存在しない場合には、前記試料と、Oplophorus由来のルシフェラーゼを接触させる工程、及び
(c)前記試料における発光を検出する工程、
を含む前記方法。 - 試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの標識方法であって、前記試料と、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程を含む前記方法。
- 試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの標識方法であって、
(a)前記試料と、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、少なくとも1つの蛍光色素を含む、
(b)前記接触工程後に、前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、及び
(c)前記洗浄工程後に、前記試料における蛍光を検出する工程、
を含む前記方法。 - 試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの標識方法であって、
(a)前記試料と、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、第1の官能基を含む、
(b)前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、
(c)前記試料と、第2の官能基を含む蛍光色素とを接触させる工程、ここで、前記第2の官能基が、前記第1の官能基と反応するか、または前記第1の官能基に結合することができる、
(d)前記試料を洗浄して、任意の未反応の蛍光色素を除去する工程、及び
(e)前記試料における蛍光を検出する工程、
を含む前記方法。 - (i)前記第1の官能基が、アジドであり、前記第2の官能基が、アルキンである、
(ii)前記第1の官能基が、アルキンであり、前記第2の官能基が、アジドである、又は
(iii)前記第1の官能基が、ビオチン部分であり、前記第2の官能基が、ストレプトアビジンである、請求項11に記載の方法。 - 試料からのOplophorus由来のルシフェラーゼの単離方法であって、前記試料が、生細胞を含み、前記方法が、
(a)Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、第1の官能基を有する、
(b)前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、
(c)前記試料と、1つ以上の溶解試薬を接触させる工程、
(d)前記第1の官能基に結合するか、または前記第1の官能基と反応する第2の官能基を有する捕捉剤を前記試料に加えて、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを捕捉する工程、
(e)前記試料を洗浄して、捕捉されなかったOplophorus由来のルシフェラーゼを除去する工程、及び
(f)工程(e)で捕捉された前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを単離する工程、
を含む前記方法。 - 試料からのOplophorus由来のルシフェラーゼの単離方法であって、前記試料が、生細胞を含み、前記方法が、
(a)Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む試料と、1つ以上の溶解試薬を接触させる工程、
(b)Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、第1の官能基を有する、
(c)前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、
(d)前記第1の官能基に結合するか、または前記第1の官能基と反応する第2の官能基を有する捕捉剤を前記試料に加えて、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを捕捉する工程、
(e)前記試料を洗浄して、捕捉されなかったOplophorus由来のルシフェラーゼを除去する工程、及び
(f)工程(e)で捕捉された前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを単離する工程、
を含む前記方法。 - 試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの阻害方法であって、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼと、請求項1~5のいずれかに記載の化合物を接触させる工程を含む前記方法。
- 前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを不可逆的に阻害する又は部分的に阻害する、請求項15に記載の方法。
- 試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
(a)前記試料と、基質セレンテラジン及び請求項1~5のいずれかに記載の化合物を接触させる工程、ならびに
(b)前記試料における発光を検出する工程、
を含み、
請求項1~5のいずれかに記載の化合物により、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼによる発光が減少する前記方法。 - 前記試料と、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物を接触させる前に、前記試料と、前記基質セレンテラジンを接触させる工程を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記試料と、前記基質セレンテラジンを接触させる前に、前記試料と、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物を接触させる工程を含む、請求項18に記載の方法。
- 試料中の、Oplophorus由来のルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
(a)前記試料と、請求項1~5のいずれかに記載の化合物を接触させる工程、
(b)前記試料と、基質セレンテラジンを接触させる工程、及び
(c)前記試料における発光を検出する工程、
を含み、
請求項1~5のいずれかに記載の化合物により、前記基質セレンテラジンを加えたときに、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼによる発光の増大が阻止される前記方法。 - 前記試料が、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを含む細胞を含み、
任意に、前記細胞が、前記Oplophorus由来のルシフェラーゼを発現する、
請求項6~20のいずれか1項に記載の方法。 - 前記基質セレンテラジンが、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジン類似体、プロセレンテラジン、またはキノンでマスクされたセレンテラジンである、請求項17~20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Oplophorus由来のルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、請求項6~22のいずれか1項に記載の方法。
- (a)請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物、及び
(b)Oplophorus由来のルシフェラーゼ、
を含み、
任意に、基質セレンテラジン及び/又は発光アッセイを実施するための説明をさらに含む、キット。 - 前記Oplophorus由来のルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、請求項24に記載のキット。
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