JP6588917B2 - 生細胞への適用のためのプロ基質 - Google Patents
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Description
の化合物またはその塩であり、
式中、
RAは細胞非透過性部分であり;
RBは−OC(O)NRARBのカルボニル基と反応するように構成される官能基を含む部分であり(たとえば、官能基は、−OC(O)NRARBのカルボニル基への求核付加を触媒してもよく、及び/または官能基は、−OC(O)NRARBのカルボニル基との求核付加反応を受けてもよい);
RCは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または1以上の好適な置換基によって置換され;
RDは水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり;
REは水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ(アルキル)アミノ、−OC(O)アルキル、または−OCH2OC(O)アルキルであり;
式中、破線の結合は一緒に式(I)の化合物における任意の6員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である。
RAは、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルから成る群から選択され、その際、前記アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され;
RBは、アミノアルキルまたはチオアルキルであり、その際、前記アルキルは非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され、且つアミノアルキルの前記アミノは非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され、またはアミノアルキルの窒素原子が複素環基の一部を形成し、前記複素環基は非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され;
RCは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され;
RDは、水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり;
REは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ(アルキル)アミノ、−OC(O)アルキル、または−OCH2OC(O)アルキルであり;
式中、破線の結合は一緒に式(I)の化合物における任意の6員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である。
RAは、アルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アジドアルキル、シアノアルキル、マレイミドアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルケニル、アルキニル、−(CR1R2)m−N(R3)C(O)R4、−(CR5R6)m−SO3R7、−(CR5R6)m−OPO2R7、−(CR5R6)m−SO2N(R8)(R9)、−(CR10R11)m−CO2R12、−(CR13R14)m−CON(R15)(R16)、−(CR17R18)m−ON(R19)(R20)、−(CR21R22)m−ヘテロシクリル−(CR23R24)n−R25、−(CR26R27)m−ヘテロアリール−(CR28R29)n−R30、−(CR31R32)m−アリール−(CR33R34)n−R35、及び−(CR36R37)m−シクロアルキル−(CR38R39)n−R40から成る群から選択され;
R1、R2、R3、R5、R6、R8、R10、R11、R13、R14、R15、R17、R18、R19、R21、R22、R23、R24、R26、R27、R28、R29、R31、R32、R33、R34、R36、R37、R38、及びR39はそれぞれ独立して水素及びアルキルから成る群から選択され;
R4、R7、R9、R12、R16、R20、R25、R30、R35、及びR40は独立して水素、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルコキシルアルキル、アルキルカルボニルオキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、ヒドロキシ−(モノまたはポリアルコキシ)アルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルコキシアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキルアルキル、
及び
から成る群から選択され、
その際、R4、R7、R9、R12、R16、R20、R25、R30、R35及びR40の前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから独立して選択される1、2、3、4、または5の置換基で置換され;
R41、R42、及びR44は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、イミダゾリルアルキル、グアニジノールアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキサミドアルキル、チオアルキル、セラニルアルキル、ピロリジニル、メチルチオアルキル、フェニルアルキル、4−ヒドロキシフェニルアルキル、及びインドリルアルキルから成る群から選択され;
R43及びR45はそれぞれ独立して水素、−C(O)アルキル及び
から成る群から選択され;
m、及びnはそれぞれ独立して1、2、3、4、5、または6であり;
x、及びyはそれぞれ独立して1〜20から選択される整数であり;
RBは、−(CR46R47)t−NR48R49または−(CR53R54)Z−SR55であり;
R46及びR47は各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から選択され;
R48及びR49はそれぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、−(CR50R51)z−OC(O)R52、−(CR53R54)Z−SR55、−(CR56R57)z−S(O)R58、−(CR59R60)Z−S(O)2R61、−(CR62R63)Z−N(R64)(R65)、−(CR66R67)z−N(R68)C(O)R69、−(CR70R71)z−N(R72)S(O)2R73、−(CR74R75)z−N(R76)C(O)N(R77)(R78)、−(CR79R80)z−N(R81)S(O)2N(R82)(R83)、−(CR84R85)z−C(O)R86、−(CR87R88)z−C(O)O(R89)、−(CR90R91)z−C(O)N(R92)(R93)、及び−C(R94)=N−OR95から選択され;
またはR48及びR49はそれらが連結される窒素原子と一緒にヘテロシクリルを形成し、その際、前記ヘテロシクリルは非置換であり、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、−NO2、−CN、ハロゲン、オキソ、−OR96、−OC(O)R97、−SR98、−S(O)R99、−S(O)2R100、−S(O)2N(R101)(R102)、−N(R103)(R104)、−N(R105)C(O)R106、−N(R107)S(O)2R108、−N(R109)C(O)N(R110)(R112)、−N(R113)S(O)2N(R114)(R115)、−C(O)R116、−C(O)O(R117)、−C(O)N(R118)(R119)、ハロアルキル、−(CR120R121)Z−CN、−(CR122R123)z−OR124、−(CR125R126)z−OC(O)R127、−(CR128R129)Z−SR130、−(CR131R132)z−S(O)R133、−(CR134R135)z−S(O)2R136、−(CR137R138)Z−N(R139)(R140)、−(CR141R142)Z−N(R143)C(O)R144、−(CR145R146)z−N(R147)S(O)2R148、−(CR149R150)z−N(R151)C(O)N(R152)(R153)、−(CR154R155)z−N(R156)S(O)2N(R157)(R158)、−(CR159R160)z−C(O)R161、−(CR162R163)z−C(O)O(R164)及び−(CR165R166)z−C(O)N(R167)(R168)から成る群から独立して選択される1、2、3、4、5または6の置換基によって置換され;
R52、R55、R64、R65、R68、R72、R69、R76、R77、R81、R82、R86、R89、R92、R93、R96、R97、R98、R101、R102、R103、R104、R105、R106、R107、R109、R110、R112、R113、R114、R115、R116、R117、R118、R119、R124、R127、R130、R139、R140、R143、R144、R147、R151、R152、R153、R156、R157、R158、R161、R164、R167、及びR168は各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ハロアルコキシアルキル、及びハロアルキルから成る群から選択され;
R58、R61、R73、R99、R100、R108、R133、R136、及びR148は各存在ごとにそれぞれ独立してアルキル及びハロアルキルから選択され;
R50、R51、R53、R54、R56、R57、R59、R60、R62、R63、R66、R67、R70、R71、R74、R75、R79、R80、R84、R85、R87、R88、R90、R91、R120、R121、R122、R123、R125、R126、R128、R129、R131、R132、R134、R135、R137、R138、R141、R142、R145、R146、R149、R150、R154、R155、R159、R160、R162、R163、R165、及びR166は各存在ごとにそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、及びハロアルキルから選択され;
R94及びR95は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素及びアルキルから選択され;
tは1、2、3、4、5、6、7、または8であり;
zは、各存在ごとにそれぞれ独立して1、2、3、または4であり;
RCは−(CH2)0-3−TまたはC1-5アルキルであり;その際、Tはアリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキルアミノアルキル)、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から独立して選択される1、2、または3の置換基によって置換され;
RDは、水素、低級シクロアルキル、ベンジル、及びC1−C4−アルキルから成る群から選択され;且つ
REは、−H、−OH、−NH2、−OC(O)−C1−C7−アルキルまたは−OCH2OC(O)−C1−C7−アルキルから成る群から選択され;
その際、式(I)の破線の結合は任意の環の存在を示し、それは飽和されてもよいし、または不飽和であってもよい。
及び
から成る群から選択される。
及び
から成る群から選択される。
またはその塩を有し、
式中、RA、RB、RC、RD及びREは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、R200はそれぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される1、2または3の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり;
RA及びRBは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、
sは1または2であり、
R201は、それぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される1、2または3の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり;
RAは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、式中、qは1または2であり;sは1または2であり;R4は上記で定義されたとおりである。
及び
またはその塩から成る群から選択される。
の少なくとも1つの化合物の混合物を含む組成物であり、式中、RC、RD及びREは上記で定義されたとおりである。
またはそれらの組み合わせから成る群から選択される。
(式中、R’は各存在ごとに独立してハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から選択され;y’は0、1、2、3、または4であり;RA、RB、RC、RD及びREは上記で定義されたとおりである);
(b)試料にて発光を検出することとを含み、その際、式(I)の化合物、式(a)の化合物、式(b)の化合物、式(c)の化合物、式(d)の化合物、またはそれらの組み合わせは、非発光酵素との反応を介して1以上の細胞透過性基質に変換される。非発光酵素は、ホスファターゼ、プロテアーゼ、エステラーゼまたはスルファターゼであってもよい。
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が規制するであろう。本明細書で記載されるものに類似するまたは同等の方法及び材料を本発明の実践及び試験で使用することができるけれども、好まれる方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される出版物、特許出願、特許及び他の参考文献はすべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。本明細書で開示される材料、方法及び実施例は説明に役立つのみであって、限定を意図されるものではない。
本発明の化合物には細胞非透過性のプロ基質が含まれる。生細胞における酵素の存在/非存在及び/または活性を検出する方法にてプロ基質を使用することができる。細胞非透過性のプロ基質は細胞透過性基質の持続遊離を提供する。分子内反応及び/または分子間反応によって細胞非透過性のプロ基質が細胞透過性基質に変換されてもよい。細胞非透過性のプロ基質は緩衝溶液中にあってもよい。細胞非透過性のプロ基質は、プロ基質の細胞非透過性部分を切断する(たとえば、求核付加反応を介して及び/または、たとえば、加水分解反応のような求核付加反応の触媒を介して)ように構成された官能基(たとえば、塩基性官能基)を含んでもよい。官能基は、同一分子内での分子内反応を介して、及び/または異なるプロ基質分子に作用する分子間反応を介して細胞非透過性部分を切断してもよい。細胞に侵入する際、細胞透過性基質はルシフェラーゼのような酵素に作用されてもよい。開示されるプロ基質はその結果、酵素を検出する方法にて有用であり得るってもよい。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式(I):
またはその塩を有し、
式中、
RAは細胞非透過性部分であり;
RBは−OC(O)NRARBのカルボニル基と反応するように構成される官能基を含む部分であり(たとえば、官能基は、−OC(O)NRARBのカルボニル基への求核付加を触媒してもよく、及び/または官能基は、−OC(O)NRARBのカルボニル基との求核付加反応を受けてもよい);
RCは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または1以上の好適な置換基によって置換され;
RDは水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり;
REは水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ(アルキル)アミノ、−OC(O)アルキル、または−OCH2OC(O)アルキルであり;
式中、破線の結合は一緒に式Iの化合物における任意の6員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である。
またはその塩を有し、
式中、
RAは、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルから成る群から選択され、その際、前記アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され;
RBは、アミノアルキルまたはチオアルキルであり、その際、前記アルキルは非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され、且つアミノアルキルの前記アミノは非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され、またはアミノアルキルの窒素原子が複素環基の一部を形成し、前記複素環基は非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され;
RCは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され;
RDは、水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり;
REは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ(アルキル)アミノ、−OC(O)アルキル、または−OCH2OC(O)アルキルであり;
式中、破線の結合は一緒に式Iの化合物における任意の6員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である。
またはその塩を有し、
式中、
RAは、アルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アジドアルキル、シアノアルキル、マレイミドアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルケニル、アルキニル、−(CR1R2)m−N(R3)C(O)R4、−(CR5R6)m−SO3R7、−(CR5R6)m−OPO2R7、−(CR5R6)m−SO2N(R8)(R9)、−(CR10R11)m−CO2R12、−(CR13R14)m−CON(R15)(R16)、−(CR17R18)m−ON(R19)(R20)、−(CR21R22)m−ヘテロシクリル−(CR23R24)n−R25、−(CR26R27)m−ヘテロアリール−(CR28R29)n−R30、−(CR31R32)m−アリール−(CR33R34)n−R35、及び−(CR36R37)m−シクロアルキル−(CR38R39)n−R40から成る群から選択され;
R1、R2、R3、R5、R6、R8、R10、R11、R13、R14、R15、R17、R18、R19、R21、R22、R23、R24、R26、R27、R28、R29、R31、R32、R33、R34、R36、R37、R38、及びR39はそれぞれ独立して水素及びアルキルから成る群から選択され;
R4、R7、R9、R12、R16、R20、R25、R30、R35、及びR40は独立して水素、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルコキシルアルキル、アルキルカルボニルオキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、ヒドロキシ−(モノまたはポリアルコキシ)アルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルコキシアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキルアルキル、
及び
から成る群から選択され、
その際、R4、R7、R9、R12、R16、R20、R25、R30、R35及びR40の前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから独立して選択される1、2、3、4、または5の置換基で置換され;
R41、R42、及びR44は、存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、イミダゾリルアルキル、グアニジノールアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキサミドアルキル、チオアルキル、セラニルアルキル、ピロリジニル、メチルチオアルキル、フェニルアルキル、4−ヒドロキシフェニルアルキル、及びインドリルアルキルから成る群から選択され;
R43及びR45はそれぞれ独立して水素、−C(O)アルキル及び
から成る群から選択され;
m、及びnはそれぞれ独立して1、2、3、4、5、または6であり;
x、及びyはそれぞれ独立して1〜20から選択される整数であり;
RBは、−(CR46R47)t−NR48R49または−(CR53R54)Z−SR55であり;
R46及びR47は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から選択され;
R48及びR49は、それぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、−(CR50R51)z−OC(O)R52、−(CR53R54)Z−SR55、−(CR56R57)z−S(O)R58、−(CR59R60)Z−S(O)2R61、−(CR62R63)Z−N(R64)(R65)、−(CR66R67)z−N(R68)C(O)R69、−(CR70R71)z−N(R72)S(O)2R73、−(CR74R75)z−N(R76)C(O)N(R77)(R78)、−(CR79R80)z−N(R81)S(O)2N(R82)(R83)、−(CR84R85)z−C(O)R86、−(CR87R88)z−C(O)O(R89)、−(CR90R91)z−C(O)N(R92)(R93)、及び−C(R94)=N−OR95から選択され;
またはR48及びR49は、それらが連結される窒素原子と一緒にヘテロシクリルを形成し、その際、前記ヘテロシクリルは非置換であり、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、−NO2、−CN、ハロゲン、オキソ、−OR96、−OC(O)R97、−SR98、−S(O)R99、−S(O)2R100、−S(O)2N(R101)(R102)、−N(R103)(R104)、−N(R105)C(O)R106、−N(R107)S(O)2R108、−N(R109)C(O)N(R110)(R112)、−N(R113)S(O)2N(R114)(R115)、−C(O)R116、−C(O)O(R117)、−C(O)N(R118)(R119)、ハロアルキル、−(CR120R121)Z−CN、−(CR122R123)z−OR124、−(CR125R126)z−OC(0)R127、−(CR128R129)Z−SR130、−(CR131R132)z−S(O)R133、−(CR134R135)z−S(O)2R136、−(CR137R138)Z−N(R139)(R140)、−(CR141R142)Z−N(R143)C(O)R144、−(CR145R146)z−N(R147)S(O)2R148、−(CR149R150)z−N(R151)C(O)N(R152)(R153)、−(CR154R155)z−N(R156)S(O)2N(R157)(R158)、−(CR159R160)z−C(O)R161、−(CR162R163)z−C(O)O(R164)及び−(CR165R166)z−C(O)N(R167)(R168)から成る群から独立して選択される1、2、3、4、5または6の置換基によって置換され;
R52、R55、R64、R65、R68、R72、R69、R76、R77、R81、R82、R86、R89、R92、R93、R96、R97、R98、R101、R102、R103、R104、R105、R106、R107、R109、R110、R112、R113、R114、R115、R116、R117、R118、R119、R124、R127、R130、R139、R140、R143、R144、R147、R151、R152、R153、R156、R157、R158、R161、R164、R167、及びR168は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ハロアルコキシアルキル、及びハロアルキルから成る群から選択され;
R58、R61、R73、R99、R100、R108、R133、R136、及びR148は、存在ごとにそれぞれ独立してアルキル及びハロアルキルから選択され;
R50、R51、R53、R56、R57、R59、R60、R62、R63、R66、R67、R70、R71、R74、R75、R79、R80、R84、R85、R87、R88、R90、R91、R120、R121、R122、R123、R125、R126、R128、R129、R131、R132、R134、R135、R137、R138、R141、R142、R145、R146、R149、R150、R154、R155、R159、R160、R162、R163、R165、及びR166は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、及びハロアルキルから選択され;
R94及びR95は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素及びアルキルから選択され;
tは1、2、3、4、5、6、7、または8であり;
zは、各存在ごとに独立して1、2、3、または4であり;
RCは−(CH2)o-3−TまたはC1-5アルキルであり;その際、Tはアリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルであり、前記アリール、ヘテロアリール、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキルアミノアルキル)、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から独立して選択される1、2、または3の置換基によって置換され;
RDは、水素、低級シクロアルキル、ベンジル、及びC1−C4−アルキルから成る群から選択され;及び
REは、−H、−OH、−NH2、−OC(O)−C1−C7−アルキルまたは−OCH2OC(O)−C1−C7−アルキルから成る群から選択され;
その際、式(I)の破線の結合は任意の環の存在を示し、それは飽和されてもよいし、または不飽和であってもよい。
または
であるように塩の形態である。
または
であり、R4は上記で定義されたとおりである。
または
であり、mは2、3または4であり、その際、x、y、R41、R42、R43、R44、及びR45は上記で定義されたとおりである。特定の実施形態では、R41、R42及びR44は−CH2CO2Hからそれぞれ選択される。特定の実施形態では、R43及びR45はアセチル(−C(O)CH3)から選択される。特定の実施形態では、xは1または2である。特定の実施形態では、yは3である。
であり、mは2または3である。
及び
から選択される。
、
及び
から選択される。
及び
から成る群から選択される。
及び
から成る群から選択される。
及び
から成る群から選択される。
またはその塩を有し、
式中、RA、RB、Rc、RD、及びREは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、RA、RB、Rc、及びREは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、RA、RB、及びRCは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、R200はそれぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される1、2または3の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり;及び、RA及びRBは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、RA及びRBは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、XはO、SまたはNHであり、RA及びRBは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
RA及びRBは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、sは1または2であり;且つ、RA、RC、RD及びREは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、sは1または2であり;且つ、RA、RC、RD及びREは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、sは1または2であり;R201は、それぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される1、2または3の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり;且つ、RAは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、sは1または2であり;及びRAは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、sは1または2であり;XはO、SまたはNHであり;及びRAは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、sは1または2であり;及びRAは上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、qは1または2であり;sは1または2であり;R202は、それぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される1、2または3の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり;且つ、R4は上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、qは1または2であり;sは1または2であり;及びR4は上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、qは1または2であり;sは1または2であり;XはO、SまたはNHであり;及びR4は上記で定義されたとおりである。
またはその塩を有し、
式中、qは1または2であり;sは1または2であり;及びR4は上記で定義されたとおりである。
5295:2,8−ジベンジル−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(3−(N,3−ジメチル−3−(2,4,5−トリメチル1−3,6−ジオキソシクロヘキサ−1,4−ジエン−1−イル)ブタンアミド)プロピル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5296:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(3−(N,3−ジメチル−3−(2,4,5−トリメチル−3,6−ジオキソシクロヘキサ−l,4−ジエン−l−イル)ブタンアミド)プロピル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5393:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[1,2−a]ピラジン−3−イルメチル(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5394:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イルメチル(4−モルフォリノブチル)カルバメート;
5396:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イルメチル(2−モルフォリノエチル)カルバメート;
5442:3−((((2,8−ジベンジル−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)(3−モルフォリノプロピル)アミノ)プロパン−1−スルホネート;
5455:15−アセトアミド−4−(((8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)−9,12−ビス(カルボキシメチル)−7−メチル−1−モルフォリノ−8,11,14−トリオキソ−4,7,10,13−テトラアザヘプタデカン−17−酸;
5456:21−アセトアミド−4−(((8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)−15,18−ビス(カルボキシメチル)−7−メチル−1−モルフォリノ−8,14,17,20−テトラオキソ−9−オキサ−4,7,13,16,19−ペンタアザトリコサン−23−酸;
5457:2−(2−((2−((((8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)(3−モルフォリノプロピル)アミノ)エチル)(メチル)アミノ)−2−オキソエトキシ)酢酸;
5488:16−アセトアミド−4−(((8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)−10,13−ビス(カルボキシメチル)−8−メチル−l−モルフォリノ−9,12,15−トリオキソ−4,8,11,14−テトラアザオクタデカン−18−酸;
5489:19−アセトアミド−4−(((8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)−10,13,16−トリス(カルボキシメチル)−8−メチル−1−モルフォリノ−9,12,15,18−テトラオキソ−4,8,1l,14,17−ペンタアザヘニコサン−21−酸;
5370:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−(N,3−ジメチル−3−(2,4,5−トリメチル−3,6−ジオキソシクロヘキサ−l,4−ジエン−l−イル)ブタンアミド)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5545:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−((tert−ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(3−(ジメチルアミノ)プロピル)カルバメート;
5393:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[1,2−a]ピラジン−3−イルメチル(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5394:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イルメチル(4−モルフォリノブチル)カルバメート;
5396:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イルメチル(2−モルフォリノエチル)カルバメート
5422:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(3−(4−ベンゾイルピペラジン−1−イル)プロピル)(メチル)カルバメート;
5416:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−((tert−ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5417:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−(N−メチルベンズアミド)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5418:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−(N−メチルアセトアミド)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5452:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−(N−メチル−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5453:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−(N−メチルイソブチルアミド)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5450:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5451:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−(4−メトキシ−N−メチルベンズアミド)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5454:8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル(2−(4−フルオロ−N−メチルベンズアミド)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート;
5512:3−((((8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)(3−モルフォリノプロピル)アミノ)プロパン−l−スルホネート;
5547:tert−ブチルN−(((8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)−N−(3−モルフォリノプロピル)グリシネート;
5546:2,2’−((3−((((2,8−ジベンジル−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)プロピル)アザネジイル)二酢酸;
5486:2−(2−((3−((((8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)(3−モルフォリノプロピル)アミノ)プロピル)(メチル)アミノ)−2−オキソエトキシ)酢酸;
及び
5487:3−アセトアミド−4−((l−((3−((((8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3−イル)オキシ)カルボニル)(3−モルフォリノプロピル)アミノ)プロピル)(メチル)アミノ)−3−カルボキシ−l−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−4−オキソブタン酸;またはその塩から成る群から選択される。
及び
は式(I)の化合物として除外される。
分子内反応によって細胞非透過性のプロ基質を細胞透過性基質に変換してもよい。細胞非透過性の基質はアミン塩基(または求核試薬)と、任意で1以上の荷電した官能基を含有してもよい。細胞非透過性のプロ基質は、プロ基質の細胞非透過性部分を切断する(たとえば、加水分解反応のような求核付加反応の触媒を介して)ように構成された官能基を含んでもよい。「自己ベースの加水分解」と呼ばれる同一分子内での分子内反応を介して官能基は細胞非透過性部分を切断してもよい。細胞非透過性部分の切断は細胞透過性基質を遊離する。
式(I)の化合物を含むが、これらに限定されない本明細書で開示される細胞非透過性のプロ基質は細胞を含有する試料の細胞外培地にて細胞透過性基質に変換されてもよい。細胞非透過性の部分を切断して細胞透過性基質を遊離する非発光酵素(たとえば、ホスフェート、プロテアーゼ、エステラーゼ、またはスルファターゼ)に細胞非透過性のプロ基質を接触させることによって細胞非透過性のプロ基質を細胞透過性基質に変換してもよい。たとえば、細胞非透過性のプロ基質を試料に接触させる前にまたは後でプロ基質を非発光酵素に接触させることによって細胞非透過性のプロ基質を細胞透過性基質に変換してもよい。非発光酵素との反応を介して細胞透過性基質に変換されてもよい細胞非透過性のプロ基質には、式(I)の化合物、式(a)の化合物、式(b)の化合物、式(c)の化合物、及び式(d)の化合物:
及び
が挙げられるが、これらに限定されず、
式中、R’は、各存在ごとに水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から独立して選択され;y’は0、1、2、3、または4であり;且つ、RA、RB、RC、RD、及びREは上記で定義されたとおりである。
開示されている化合物をアッセイにて用いて酵素の存在または活性を検出してもよい。本発明の化合物は、ルシフェラーゼの基質、たとえば、セレンテラジンが使用されているどんな方法で使用されてもよい。たとえば、試料、たとえば、酵素、酵素反応のための補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性剤、またはOHラジカル、または1以上の条件、たとえば、レドックス条件にて1以上の分子を検出するのにセレンテラジンを採用する生物発光法にてそれらを使用してもよい。開示されている化合物は加水分解されて、発光酵素、たとえば、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼのための基質である細胞透過性基質を提供してもよい。特定の実施形態では、工程(a)はさらに、式(I)の化合物と反応するように構成された求核性化合物に試料を接触させて細胞透過性基質を提供することを含む。細胞透過性基質は上記で定義されたような式(II)の化合物であってもよい。
特定の実施形態では、方法には発光酵素を発現している細胞に本明細書で開示されている化合物を接触させることが含まれてもよい。開示されている化合物は細胞内ルシフェラーゼのために基質、すなわち、細胞透過性基質を提供してもよい。好適な発光酵素には、セレンテラジン(またはその誘導体または類似体)を基質として利用するルシフェラーゼ(セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ)、たとえば、生物発光性甲殻類、たとえば、Oplophoroideaに由来するルシフェラーゼ、たとえば、Oplophorus由来のルシフェラーゼ、海洋生物、たとえば、刺胞動物(たとえば、Renillaルシフェラーゼ)、Aristeidae、Solenoceridae、Luciferidae、Sergestidae、Pasipheidae及びThalassocarididae甲殻類ファミリーに由来するルシフェラーゼ、カイアシ類のルシフェラーゼ、たとえば、Gaussiaルシフェラーゼ、たとえば、Gaussia princepsルシフェラーゼ、Metridiaルシフェラーゼ、たとえば、Metridia longa及びMetridia paciflcaのルシフェラーゼs、Vargulaルシフェラーゼ、たとえば、Vargula hilgendorfliルシフェラーゼ、Pleuromamma xiphiasルシフェラーゼ、及びそれらの変異体、組換え体及び突然変異体が挙げられる。化合物は、たとえば、エクオリン、オベリン、イフォチナ(iPhotina)のような発光タンパク質及びそれらの変異体、組換え体及び突然変異体と共に使用されてもよい。一部の実施形態では、ルシフェラーゼはOplophorusルシフェラーゼまたはOplophorusルシフェラーゼの変異体、たとえば、NANOLUC(登録商標)であってもよい。Oplophorusルシフェラーゼは、双方ともその全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第8,557,970号及び米国特許出願公開第20120117667号にて記載されている。
開示されている化合物は遺伝子転写レポーター系と共に使用されてもよい。特定の実施形態では、提供されるのは、試料におけるプロモータの活性を測定する方法であって、その際、該プロモータは発光酵素をコードする遺伝子に操作可能に連結される。該方法には、(a)開示されている化合物に試料を接触させることと、(b)試料の発光を測定することによってプロモータの活性を決定することとを含み、その際、試料はプロモータを含む。プロモータは翻訳融合または転写融合を介して遺伝子に操作可能に連結されてもよい。対象の生物経路は、たとえば、発光酵素をコードする遺伝子に操作可能に連結されるプロモータを含む細胞を経路の誘導剤で処理することによって調べられてもよい。次いでこのプロモータ活性を測定し、モニターしてプロモータの活性と当該経路の間の相関を検討すると共に、遺伝子発現に関連する動態測定(たとえば、誘導性、抑制及び活性化)を得てもよい。
開示されている化合物は、リガンド/タンパク質及び/またはタンパク質/タンパク質の相互作用を検出するどんな方法で使用されてもよい。開示されている化合物から生成される細胞透過性基質は発光酵素によって使用され得る。種々の実施形態では、発光酵素を用いてエネルギーをエネルギーアクセプターに移動させてもよい。そのような方法の1つが生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)である。BRETに関して、生物発光ドナーからの蛍光アクセプターへのエネルギー移動は発光のスペクトル分布にてシフトを生じる。このエネルギー移動は、タンパク質/タンパク質またはリガンド/タンパク質の試験管内または生体内での相互作用のリアルタイムのモニタリングを可能にする。一部の実施形態では、BRET法は、リガンド/タンパク質及び/またはタンパク質/タンパク質の相互作用のためのNANOLUC(登録商標)が介在する生物発光共鳴エネルギー移動(NANOBRET(登録商標))アッセイであってもよい。NANOBRETは、2つの異なる方法:(1)HALOTAG(登録商標)とNANOLUC(登録商標)の技法、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を用いてタンパク質/タンパク質及び/またはリガンド/タンパク質の相互作用を検出することが、増加したシグナルと低下したスペクトルの重複によって達成されてもよいこと;及び(2)対象のタンパク質に融合されたNANOLUCと、蛍光トレーサを用いて生細胞にてリガンド/受容体の相互作用を検出することを含む。
一部の実施形態では、開示されている化合物を循環置換型(circularly premuted)(CP)または直鎖開裂型(straight split)(SS)の発光酵素融合タンパク質と共に用いてタンパク質の近接を測定してもよい。発光酵素はプロテアーゼ基質のアミノ酸配列(たとえば、TEV)の挿入を介して置換され、または開裂されて低い生物発光を生成する。不活性の発光酵素を(たとえば、遺伝子融合を介して)モニタータンパク質に繋げる。相互作用する可能性のあるタンパク質が(たとえば、遺伝子融合を介して)プロテアーゼ(たとえば、TEV)に繋がれる。2つのモニタータンパク質が相互作用する、または十分に近接する(たとえば、構成的な相互作用、薬剤刺激または経路の応答を介して)と、発光酵素が切断されて高い生物発光活性を生成する。その例が細胞または生化学アッセイにおいてタンパク質近接の測定に適用されてもよい。
一部の実施形態では、開示されている化合物は、たとえば、タンパク質相補アッセイ(PCA)または酵素断片化アッセイのようなリガンド/タンパク質及びタンパク質/タンパク質の相互作用または近接性を検出する他の方法で使用されてもよい。タンパク質相補アッセイ(PCA)は2つの生体分子、たとえば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。PCAは、互いに最接近させると機能的に活性のあるタンパク質に再構成する同じタンパク質、たとえば、酵素の2つの断片を利用する。一部の実施形態では、NANOBIT(登録商標)技術(Promega Corporation)を用いて酵素の成分またはサブユニットの結合相互作用を介した発光酵素の再構成による分子の近接を検出してもよい。NANOBITは、Oplophorusルシフェラーゼ変異体、NANOLUCルシフェラーゼに由来する非発光性ペプチド(NLPep)及び非発光性ポリペプチド(NLPoly)を利用する。NLPep及びNLPolyは対象タンパク質に融合される。対象タンパク質が相互作用するのであれば、NLPep及びNLPolyが相互作用して完全長のOplophorusルシフェラーゼ酵素を再構成する。
一部の実施形態では、開示されている化合物は、各結合相手、たとえば、FRB及びFKBPに融合される完全長の循環置換型発光酵素と共に使用され、タンパク質相補型アッセイで使用されてもよい。本明細書で開示されている方法と従来のタンパク質相補性アッセイとの間での重大な差異は、相補性はなかったが、むしろ、2つの完全長の酵素、たとえば、循環置換型発光酵素の二量体化があったということである。
特定の実施形態では、本明細書で開示されている方法には、細胞非透過性のプロ基質とそれに対応する細胞透過性基質との混合物に試料(たとえば、細胞)を接触させることが含まれる(たとえば、図15を参照)。特定の実施形態では、本明細書で開示されている方法には、適当なpHの緩衝液条件にてまたは適当な求核試薬溶液にて開示されている細胞透過性化合物を事前にインキュベートしてある程度細胞透過性基質を遊離し、次いで上記の事前にインキュベートした溶液に試料(たとえば、細胞)を接触させることが含まれる。特定の実施形態では、本明細書で開示されている方法には、細胞非透過性基質と細胞透過性基質のカルバメート官能基に反応するように構成された求核性化合物とに試料を接触させて細胞透過性基質(たとえば、セレンテラジン)を遊離することが含まれる。一部の実施形態では、開示されている化合物と方法を用いて高処理能力スクリーニング操作アッセイ方式の初期輝度を増大させてもよい。そのような方法は試料へのセレンテラジンの持続的な遊離による試料継続時間での高い輝度を提供する。
生物成分を含有する試料と共に開示されている化合物を使用してもよい。試料は細胞を含んでもよい。試料は、成分(無傷細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、細菌、ウイルス、細胞小器官、及びそれらの混合物を含む)の異種混合物、または単一成分、または成分(たとえば、天然のまたは合成のアミノ酸、核酸または糖質ポリマー、または脂質膜複合体)の同種群を含んでもよい。化合物は一般に、使用の濃度の範囲内で生細胞及び他の生物成分に対して非毒性である。
開示されるのは、1以上の酵素(たとえば、ルシフェラーゼ)の存在または活性を測定するためのキットである。キットは、以下:本発明の化合物または組成物、セレンテラジン依存性の発光酵素及び反応緩衝液の1以上を含んでもよい。反応緩衝液は、非ルシフェラーゼ酵素反応及び発光酵素反応のために個々の製剤で存在してもよく、または単一工程アッセイのために単一製剤で存在してもよい。キットはまた、非ルシフェラーゼ酵素のための阻害剤、活性化剤及び/または増強剤を含有してもよい。キットはまたアッセイのための陽性対照及び/または陰性対照を含有してもよい。
3−[(N−メチル−N−Boc]プロパナールの合成
Des−Martin試薬(16.02g,37.78ミリモル)を0℃にて3−(N−メチル−N−Boc)プロパノール(6.5g,34.35ミリモル)の塩化メチレン溶液120mlに加え、得られた混合物を室温で4時間撹拌した。飽和チオ硫酸ナトリウム溶液で反応混合物の反応を止め、生成物を塩化メチレンで抽出した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液、ブライン溶液及び水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。減圧下で溶媒を蒸発させ、溶離液としてヘプタンと酢酸エチルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製して74.64%の収率で4.8gの所望の生成物を得た。1H NMR(300MHz,CD2C12)δppm:9.80(s,1H,HC=O),3.50(t,2H,CH2),2.83(s,3H,CH3),2.62(t,2H,CH2);MS−ESI(m/e):188.2[M+H].
モルフォリンプロピルアミン(0.231g,1.60ミリモル)のメタノール溶液20mlに、3−[(N−メチル)Boc]プロパナール(0.3g,1.60ミリモル)を加えた。混合物を室温で3時間撹拌した。NaBH4(0.18g,4.81ミリモル)を0℃にて混合物に加え、得られた混合物を0℃で1時間及び室温で1時間撹拌した。5mlの水を加えることによって反応を止めた。溶媒を除いた後、5mlの水を加え、塩化メチレンで混合物を3回抽出した。合わせた有機層をNa2SO4上で乾燥させ、溶媒を蒸発させた後、所望の生成物を得、さらに精製することなく生成物をそのまま次の工程で使用した。
セレンテラジン HH(0.1g,0.256ミリモル)とビス(ペンタフルオロフェニル)ジカルボネート(0.112g,0.256ミリモル)の無水THF10mlにおける混合物にTEA(52mg,0.512ミリモル)をアルゴンのもとで室温にて加えた。固形物が消失するまで混合物2〜3分撹拌し、tert−ブチルメチル(3−((3−モルフォリノプロピル)アミノ)プロピル)カルバメート(0.161g,0.512ミリモル)を加えた。得られた混合物を室温で30分間撹拌した。溶離液としてヘプタン/酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、69.3%の収率で生成物を得た(0.13g、0.177ミリモル)。MS−ESI(m/e):719.5[M+H]+.
セレンテラジンHH−[N’−メチル−N’−Boc−N−(3−モルフォリノプロピル)プロパン−1,3−ジアミン]カルバメート(0.1g,0.136ミリモル)とトリイソプロピルシラン(50ul)を10mlの塩化メチレンとTFA(容積で1:1)に溶解し、混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、高真空下で一晩、残留物を乾燥させ、生成物をそのまま次の工程で使用した。
3−メチル−3−(2,4,5−トリメチル−3,6−ジオキソシクロヘキサ−l,4−ジエン−l−イル)ブタン酸(102.5mg,0.409ミリモル)とクロロギ酸イソブチル(55.9mg,0.409ミリモル)の無水THF溶液10mlに0℃で、N−メチルモルフォリン(82.8mg)を加えた。得られた混合物を0℃で30分間撹拌し、5mlのCH2Cl2中のセレンテラジンHH−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)プロパン−l,3−ジアミン]カルバメートを加え、得られた混合物を1時間撹拌した。溶離液としてヘプタン及び酢酸エチルを使用したフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を直接精製し、74%の収率(0.087g)で生成物を得た。MS−ESI(m/e):865.5[M+H]+.
フリマジン−[N’−メチル−N’−Boc−N−(3−モルフォリノプロピル)プロパン−l,3−ジアミン]カルバメートの合成
無水THF20mlにおけるフリマジン(300mg,0.788ミリモル)とビス(ペンタフルオロフェニル)ジカルボネート(380mg,0.867ミリモル)の混合物にアルゴンのもとで室温にてTEA(160mg,1.58ミリモル)を加えた。混合物を2〜3分撹拌し、tert−ブチルメチル(3−((3−モルフォリノプロピル)アミノ)プロピル)カルバメート(0.497g,0.512ミリモル)を加えた。得られた混合物を室温で30分間撹拌した。溶離液としてヘプタン/酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、72.3%の収率で生成物を得た。1H NMR(300MHz,CD2C12)δppm:7.9−8.0(m,3H),7.53(d,2H),7.2−7.5(m,7H),6.34(m,1H,フラン),6.13(d,1H,フラン),4.59(s,2H,CH2Ph),4.18(s,2H,CH2Ph),3.66(m,4H,CH2O),3.20−3.56(m,6H),2.84(d,3H,NCH3),2.3−2.5(m,6H),1.79−2.0(m,4H,CH2),1.41(s,9H,CH3);MS−ESI(m/e):723.59[M+H]+.
#5295の合成に使用した上記の方法を用いて#5296を調製した。MS−ESI(m/e):855.38[M+H]+.
5393の合成。
氷水槽にて窒素のもとでビス(ペンタフルオロフェニル)カルボネート(77mg,0.20ミリモル)とトリエチルアミン(40mg,0.39ミリモル)を8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニル−l,7−ジヒドロイミダゾ[l,2−a]ピラジン−3(2H)−オン(50mg,0.13ミリモル)のTHF溶液に連続して加えた。混合物を5分間撹拌し、N−メチル−3−モルフォリン−4−イルプロパン−l−アミン(HC1塩,38mg,0.20ミリモル)を加え、混合物をさらに10分間撹拌した。TLCが出発物質の消失を示した後、溶媒を取り除き、残留物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して黄色っぽい固形物として生成物(42mg、57%)を得た。1HNMR(300MHz,CD2C12,δ):7.86(m,3H),7.17(m,8H),6.87(s,1H),6.23(s,1H),6.02(s,1H),4.48(s,2H),4.08(s,3H),3.60(m,6H),3.35(m,2H),2.41(m,6H),1.74(m,2H).MS(ESI)m/z:566.5.
5396の合成。
5393に使用したものと同じ手順に従った。1HNMR(300MHz,CD2C12,δ):7.96(m,3H),7.32(m,8H),6.97(s,IH),6.32(s,IH),6.12(s,IH),5.02(s,2H),4.58(s,3H),3.69(m,6H),3.35(m,2H),2.55(m,6H),1.83(m,2H),1.28(m,2H).MS(ESI)m/z:580.5.
5394の合成。
5393に使用したものと同じ手順に従った。1HNMR(300MHz,CD2C12,δ):7.39(m,11H),6.97(s,IH),6.28(s,IH),6.13(s,IH),5.02(s,2H),4.58(s,3H),3.69(m,6H),3.46(m,2H),2.59(m,2H).MS(ESI)m/z:551.5.
N’−メチル−N’−Boc−N−(3−モルフォリノプロピル)エチレンジアミンの合成
モルフォリンプロピルアミン(0.50g,3.46ミリモル)の無水メタノール溶液40mlに、3−(N−メチル−N−Boc)アセトアルデヒド(0.6g,3.46ミリモル)を加えた。混合物を室温で3時間撹拌した。0℃で混合物にNaBH4(0.393g,10.39ミリモル)を加え、得られた混合物を0℃で1時間及び室温で1時間撹拌した。5mlの水を加えることによって反応を止めた。溶媒を取り除いた後、10mlの水を残留物に加えた。塩化メチレンで混合物を3回抽出し、合わせた有機層をNa2SO4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、所望の生成物を得たが、さらに精製することなく、生成物をそのまま次の工程で使用した。
アルゴンのもとで室温にて無水THF20mlにおけるフリマジン(250mg,0.657ミリモル)とビス(ペンタフルオロフェニル)ジカルボネート(0.317mg,0.722ミリモル)の混合物にTEA(73mg,0.512ミリモル)を加えた。混合物を2〜3分間撹拌し、tert−ブチルメチル(3−((3−モルフォリノプロピル)アミノエチル))カルバメート(0.396g,1.31ミリモル)を加えた。得られた混合物を室温で30分間撹拌した。溶離液としてヘプタン/酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、76.4%の収率(0.356g)で生成物を得た。1H NMR(300MHz,CD2C12)δppm:7.9−8.0(m,3H),7.58(d,2H),7.2−7.5(m,7H),6.36(m,1H,フラン),6.15(dd,1H,フラン),4.59(s,2H,CH2Ph),4.20(d,2H,CH2Ph),3.67(m,4H,CH2O),3.30−3.60(m,6H),2.87(s,3H,NCH3),2.3−2.5(m,6H),1.6−2.0(m,2H,CH2),1.44(s,9H,CH3);MS−ESI(m/e):709.62[M+H]+.
フリマジン−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)エチレンジアミン]カルバメートの合成
フリマジン−[N’−メチル−N’−Boc−N−(3−モルフォリノプロピル)エチレンジアミン]カルバメート#5416(0.350g,0.494ミリモル)とトリイソプロピルシラン(100ul)を20mlの塩化メチレンとTFA(容積で1:1)に溶解し、混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、高真空下で一晩、残留物を乾燥させ、生成物をそのまま次の工程で使用した。
室温で無水THF10mlにおけるフリマジン−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)エチレンジアミン]カルバメート(0.0563ミリモル)と無水安息香酸(63mg,0.282ミリモル)の混合物にTEAを加えた。得られた混合物を室温で1時間撹拌した。溶離液としてヘプタン/酢酸エチルを用いたフラッシュシリカカラムによって化合物を75%の収率(30mg)で直接精製した。MS−ESI (m/e):713.5[M+H]+.
#5418の合成。
室温で無水THF10mlにおけるフリマジン−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)エチレンジアミン]カルバメート(0.0563ミリモル)と塩化アセチル(44mg,0.282ミリモル)の混合物にTEAを加えた。得られた混合物を室温で1時間撹拌した。溶離液としてヘプタン及び酢酸エチルを用いたフラッシュシリカカラムによって化合物を直接精製し、68%の収率(25mg)を得た。MS−ESI(m/e):651.5[M+H]+.
tert−ブチルメチル(3−オキソプロピル)カルバメートの合成
N−メチル−N−boc−アミノプロパン−3−ol(5.55g,29.3ミリモル)のジクロロメタン(100ml)溶液にDess−Martinペリオジナン(14.93g,35.2ミリモル)を加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌した。次いで得られた混合物を飽和チオ硫酸ナトリウム溶液、飽和炭酸ナトリウム溶液及びブラインで洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を取り除き、残留物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して透明な油(3.5g、64%)として生成物を得た。1HNMR(300MHz,CD2C12,δ):9.78(s,1H),3.52(t,J=9.0Hz,2H),2.84(s,3H),2.65(m,2H),1.44(s,9H).
tert−ブチルメチル(3−オキソプロピル)カルバメート(0.57g,3.29ミリモル)のメタノール(20ml)溶液に1−ベンゾイルピペラジン(0.63g,3.29ミリモル)を加えた。反応混合物を1時間撹拌し、水素化ホウ素ナトリウム(0.25g,6.58ミリモル)を加えた。次いで混合物をさらに4時間撹拌し、酢酸エチル/水で抽出した。有機層を回収し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残留物をフラッシュクロマトグラフィによって精製し、白色固形物(0.84g、70%)として生成物を得た。1HNMR(300MHz,CD2C12,δ):7.41(m,5H),3.50(m,4H),3.24(t,J=6.0Hz,2H),2.83(s,3H),2.36(m,6H),1.69(m,2H),1.43(s,9H).
Tert−ブチル(3−(4−ベンゾイルピペラジン−1−イル)プロピル)(メチル)カルバメート(0.8g,2.2ミリモル)をジクロロメタン(15ml)に溶解した。トリフルオロ酢酸(5ml)と2〜3滴のトリイソプロピルシランを連続して加えた。次いで得られた混合物を1時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、さらに精製することなく、残留物を次の工程で使用した。
5393に使用したものと同じ手順に従った。1HNMR(300MHz,CD2C12,δ):7.95(m,2H),7.42(m,12H),6.97(s,5H),5.02(s,3H),4.58(s,2H),3.71(m,6H),3.05(m,2H),1.82(m,4H).MS(ESI)m/z:669.5
3−モルフォリノプロパナールの合成
3−[(N−メチル−N−Boc]プロパナール(「1307−84」)の合成に使用したものと同じ手順に従った。粗精製物をそのまま次の工程で使用した。
1307−84に使用したものと同じ手順に従った。粗精製物をそのまま次の工程で使用した。
5393に使用したものと同じ手順に従った。1HNMR(300MHz,CD2C12,δ):8.03(m,2H),7.34(m,12H),4.58(s,2H),4.18(s,2H),3.66(m,6H),3.46(m,2H),3.06(m,6H),2.43(m,6H),1.91(m,2H),1.42(s,9H).MS(ESI)m/z:695.5.
tert−ブチルメチル(2−((3−モルフォリノプロピル)アミノ)エチル)カルバメートの合成
1307−84に使用したものと同じ手順に従った。粗精製物をそのまま次の工程で使用した。粗精製物をそのまま次の工程で使用した。
5393に使用したものと同じ手順に従った。1HNMR(300MHz,CD2Cl2,δ):7.95(m,2H),7.28(m,12H),4.48(s,2H),3.62(m,6H),3.36(m,7H),2.79(m,2H),2.47(m,6H),1.91(m,2H),1.42(s,9H).MS(ESI)m/z:709.5
8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[1,2−a]ピラジン−3−イル(2−((tert−ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(3−モルフォリノプロピル)カルバメート(1328−19)(90mg,0.13ミリモル)のジクロロメタン(5ml)溶液に、トリフルオロ酢酸(1ml)と2〜3滴のトリイソプロピルシランを加えた。反応混合物を1時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥させた。ジクロロメタン(5ml)を残留物に加え、その後、塩化4−メトキシベンゾイル(43.3mg,0.25ミリモル)を加えた。次いでトリエチルアミン(0.18ml,1.27ミリモル)をゆっくり加え、得られた混合物をさらに1時間撹拌した。溶媒を取り除き、フラッシュクロマトグラフィによって残留物を精製し、黄色っぽい固形物(40mg、43%)として生成物を得た。MS(ESI)m/z:743.5
5393に使用したものと同じ手順に従った。1HNMR(300MHz,CD2Cl2,δ):7.53(m,18H),5.02(s,2H),4.55(m,2H),3.68(m,8H),2.91(m,5H),2.49(m,8H),1.43(m,2H);FNMR(300MHz,CD2Cl2,δ):−61.17(s);MS(ESI)m/z:781.4
5393に使用したものと同じ手順に従った。1HNMR(300MHz,CD2Cl2,δ):8.18(m,2H),7.40(m,12H),5.02 6.97(m,2H),4.58(s,2H),4.16(m,2H),3.67(m,6H),3.09(m,5H),2.41(m,7H),1.28(m,2H),1.15(m,6H);MS(ESI)m/z:679.5
5393に使用したものと同じ手順に従った。1HNMR(300MHz,CD2C12,δ):7.68(m,2H),7.31(m,14H),6.87(m,2H),4.92(s,2H),4.46(m,2H),3.61(m,6H),2.94(m,5H),2.41(m,8H),1.33(m,2H);MS(ESI)m/z:731.4
3−((3−モルフォリノプロピル)アミノ)プロパン−1−スルホネートの合成
50mlのイソプロパノールにおける3−モルフォリノプロパン−1−アミン(1.0g,6.93ミリモル)と1,3−プロパンスルトン(0.846g,6.93ミリモル)とTEA(0.701g,6.93ミリモル)の混合物を2日間還流した。溶媒を取り除き、残留物をエーテルで粉砕し、次いで遠心分離の後、エーテルを静かに捨て、エーテルによる粉砕、遠心分離及び溶媒を静かに捨てることを3回繰り返した。淡白色の固形物を回収し、真空下で一晩乾燥させ、そのまま次の工程で使用した。1H NMR(300MHz,CD2C12)δppm:8.52(s,1H),8.17(t,2H),7.1−7.6(m,13H),4.44(s,2H,CH2Ph),4.08(s,2H,CH2Ph),3.3−3.8(m,10H),2.91(s,3H,NCH3),2.1−2.5(m,6H),1.6−2.0(m,4H,CH2);MS−ESI(m/e):684.39[M+H]+;HPLC純度:254nmにて99.3%
アルゴンのもとで室温にて10mlの無水THFにおけるセレンテラジンHH(300mg,0.768ミリモル)とビス(ペンタフルオロフェニル)ジカルボネート(0.437mg,0.998ミリモル)の混合物にTEA(202mg,2ミリモル)を加え、混合物を2〜3分撹拌し、次いで15mlのDMF中の3−((3−モルフォリノプロピル)アミノ)プロパン−1−スルホネート(0.611mg,2.30ミリモル)を加えた。得られた混合物を室温で1時間撹拌した。真空下で溶媒を取り除いた後、溶離液としてヘプタン/酢酸エチル及び塩化メチレン/MeOHを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、12.4%(65mg)の収率を得た。
#5512の合成。
アルゴンのもとで室温にてセレンテラジンHH(200mg,0.525ミリモル)とビス(ペンタフルオロフェニル)ジカルボネート(0.276mg,0.631ミリモル)の10mlの無水THFにおける混合物にTEA(0.64mg,0.63ミリモル)を加え、混合物を2〜3分撹拌し、次いで10mlのDMF中の3−((3−モルフォリノプロピル)アミノ)プロパン−l−スルホネート(0.418g,1.58ミリモル)を加えた。得られた混合物を室温で1時間撹拌した。真空下で溶媒を取り除いた後、溶離液としてヘプタン/酢酸エチル及び塩化メチレン/MeOHを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、8.5%(30mg)の収率を得た。674.36[M+H]+;HPLC純度:254nmにて98.2%
AcD(tBu)D(tBu)D(tBu)−C2−MOP−フリマジンカルバメートの合成
アルゴンのもとで0℃にてAcD(tBu)D(tBu)D(tBu)−COOH(666.7mg,1.16ミリモル)とイソクロロホルメート(0.158g,1.16ミリモル)の無水THF40ml溶液にN−メチルモルフォリン(0.235g,2.32ミリモル)を加えた。混合物を0℃〜室温で1時間撹拌し、5mlの塩化メチレン中のフリマジン−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)エチレンジアミン]カルバメートTFA塩(0.2lmg,0.29ミリモル)を加え、その後、さらなるN−メチルモルフォリン(0.235g,2.32)を添加し(pHをチェックすること、塩基性である必要あり)、次いで得られた混合物を室温で30分間撹拌した。ヘプタン/酢酸エチル及び酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製した。次いで精製した化合物を100mlの塩化メチレンに溶解し、水で溶液を3回洗浄して、THF溶媒によってカラムから洗い流された可能性があるN−メチルモルフォリンHCl塩を取り除いた。有機層をNa2SO4上で乾燥させた。溶媒を取り除いた後、溶離液としてヘプタン/酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、66.4%(0.21g)の収率を得た。MS−ESI(m/e):[M+H]+l164.67;HPLC純度:254nmにて95.6%
AcD(tBu)D(tBu)D(tBu)−C2−MOP−フリマジンカルバメート(0.21g)とトリイソプロピルシラン(0.1ml)を15mlの塩化メチレンとTFA(容積で1:1)に溶解し、混合物を室温で4時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、トルエン(20ml)を加え、残留TFAを同時蒸発させた。残留固形物をエーテルで3回粉砕した。エーテルを静かに捨てた後、固形物を真空下で乾燥させた。[M+H]+996.50;HPLC純度:254nmにて95.6%
#5457(COOH−MOP−C2−FRZ)の合成
室温にて20mlの無水THFにおける1,4−ジオキサン−2,6−ジオン(0.25g,0.435ミリモル)とフリマジン−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)エチレンジアミン]カルバメートTFA塩(0.104g,0.144モル)の混合物にTEA(88mg,0.871ミリモル)を加えた。出発物質アミンが完全に消費されるまで(pHをチェックのこと、塩基性条件が求められ、必要に応じてさらなるTEAが添加されるべきである)、混合物を室温で1時間撹拌した。溶離液としてヘプタン/酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって生成物を精製した。MS−ESI(m/e):[M+H]+725.44;HPLC純度:254nmにて97.8%.
#5486(COOH−MOP−C3−FRZ)の合成
室温にて20mlの無水THFにおけるl,4−ジオキサン−2,6−ジオン(88mg,0.760ミリモル)とフリマジン−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)エチレンジアミン]カルバメートTFA塩(80mg,0.109ミリモル)の混合物にTEA(77mg,0.76ミリモル)を加えた。出発物質アミンが完全に消費されるまで(pHをチェックのこと、塩基性条件が求められ、必要に応じてさらなるTEAが添加されるべきである)、混合物を室温で1時間撹拌した。溶離液としてヘプタン/酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって生成物を精製した。MS−ESI(m/e):[M+H]+739.47;HPLC純度:254nmにて85.1%.
AcD(tBu)D(tBu)−MOP−C3−FRZの合成
AcD(tBu)D(tBu)−COOH(239mg,0.593ミリモル)とクロロギ酸イソブチル(81mg,0.593ミリモル)の40ml無水THF溶液にN−メチルモルフォリン(85.8mg,0.848ミリモル)を0℃で加えた。混合物を0℃〜室温で1時間撹拌し、5mlの塩化メチレン中のフリマジン−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)−l,3−プロパン−ジアミン]カルバメートTFA塩(125mg,0.169ミリモル)を加え、その後さらなるN−メチルモルフォリン(86mg,0.848ミリモル)を加え(pHをチェックのこと、塩基性である必要あり)、次いで、得られた混合物を室温で30分間撹拌した。ヘプタン/酢酸エチル及び酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製した。次いで精製した化合物を100mlの塩化メチレンに溶解し、水で溶液を3回洗浄して、THF溶媒によってカラムから洗い流された可能性があるN−メチルモルフォリンHCl塩を取り除いた。有機層をNa2SO4上で乾燥させた。溶媒を取り除いた後、溶離液として酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を再精製し、58.2%(0.10g)の収率を得た。MS−ESI(m/e):[M+H]+1007.8;HPLC純度:254nmにて96.9%
AcD(tBu)D(tBu)−C3−MOP−フリマジンカルバメート(100mg)とトリイソプロピルシラン(50ul)を15mlの塩化メチレンとTFA(容積で1:1)に溶解し、混合物を室温で4時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、トルエン(20ml)を加え、残留TFAを同時蒸発させた。残留固形物をエーテルで3回粉砕した。エーテルを静かに捨てた後、固形物を真空下で乾燥させた。MS−ESI(m/e):[M+H]+895.62;HPLC純度:254nmにて98.6%
AcD(tBu)D(tBu)D(tBu)−MOP−C3−FRZの合成
AcD(tBu)D(tBu)D(tBu)−COOH(373mg,0.651ミリモル)とクロロギ酸イソブチル(89mg,0.651ミリモル)の40ml無水THF溶液に0℃にてN−メチルモルフォリン(131mg,1.30ミリモル)を加えた。混合物を0℃〜室温で1時間撹拌し、5mlの塩化メチレン中のフリマジン−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)−l,3−プロパン−ジアミン]カルバメートTFA塩(120mg,0.162ミリモル)を加え、その後さらなるN−メチルモルフォリン(86mg,0.848ミリモル)を加え(pHをチェックすること、塩基性である必要あり)、次いで得られた混合物を室温で30分間撹拌した。ヘプタン/酢酸エチル及び酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製した。次いで精製した化合物を100mlの塩化メチレンに溶解し、水で溶液を3回洗浄して、THF溶媒によってカラムから洗い流された可能性があるN−メチルモルフォリンHCl塩を取り除いた。有機層をNa2SO4上で乾燥させた。溶媒を取り除いた後、溶離液として酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を再精製して52.1%(0.10g)の収率を得た。MS−ESI(m/e):[M+H]+1178.89;HPLC純度:254nmにて96.6%
AcD(tBu)D(tBu)D(tBu)−C3−MOP−フリマジンカルバメート(100mg)とトリイソプロピルシラン(50ul)を15mlの塩化メチレンとTFA(容積で1:1)に溶解し、混合物を室温で4時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、トルエン(20ml)を加え、残留TFAを同時蒸発させた。残留固形物をエーテルで3回粉砕した。エーテルを静かに捨てた後、固形物を真空下で乾燥させた。MS−ESI(m/e):[M+H]+1010.54;HPLC純度:254nmにて97.8%
AcD(tBu)D(tBu)D(tBu)D(tBu)−MOP−C3−FRZの合成
0℃にてAcD(tBu)D(tBu)D(tBu)D(tBu)−COOH(300mg,0.403ミリモル)とクロロギ酸イソブチル(55mg,0.403ミリモル)の30ml無水THF溶液にN−メチルモルフォリン(81.5mg,0.805ミリモル)を加えた。混合物を0℃〜室温で1時間撹拌し、5mlの塩化メチレン中のフリマジン−[N’−メチル−N−(3−モルフォリノプロピル)−l,3−プロパン−ジアミン]カルバメートTFA塩(74.2mg,0.1ミリモル)を加え、その後、さらなるN−メチルモルフォリン(86mg,0.848ミリモル)を加え(pHをチェックすること、塩基性である必要あり)、次いで得られた混合物を室温で30分間撹拌した。ヘプタン/酢酸エチル及び酢酸エチル/THFを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、58.8%(80mg)の収率を得た。
AcD(tBu)D(tBu)D(tBu)D(tBu)−C3−MOP−フリマジンカルバメート(80mg)とトリイソプロピルシラン(50ul)を15mlの塩化メチレンとTFA(容積で1:1)に溶解し、混合物を室温で4時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、トルエン(20ml)を加え、残留TFAを同時蒸発させた。残留固形物をエーテルで3回粉砕した。エーテルを静かに捨てた後、固形物を真空下で乾燥させた。MS−ESI(m/e):[M+H]/2 563.45;HPLC純度:254nmにて84.9%
HeLa細胞におけるPBI−5512、PBI−5455、PBI−5487、PBI−5488
開示されている化合物のプロ基質として作用する能力を実証するために、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、NANOLUC(登録商標)を発現している細胞に化合物PBI−5512、PBI−5455、PBI−5487、及びPBI−5488(図2)を加え、発光を検出した。
HeLa細胞におけるPBI−5457、PBI−5486、PBI−5487、PBI−5488及び5489
開示されている化合物のプロ基質として作用する能力を実証するために、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、NANOLUC(登録商標)を発現している細胞に化合物PBI−5457、PBI−5486、PBI−5487、及びPBI−5488(図6)を加え、発光を検出した。
HeLa細胞におけるPBI−5296、PBI−5370、PBI−5393、PBI−5416、PBI−5417及びPBI−5418
開示されている化合物のプロ基質として作用する能力を実証するために、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、NANOLUC(登録商標)を発現している細胞に化合物PBI−5296、PBI−5370、PBI−5393、PBI−5416、PBI−5417及びPBI−5418(図10)を加え、発光を検出した。
開示されている化合物の加水分解に対するpHの効果は高処理能力スクリーニング(HTS)にとって有用であってもよい。262nmでのHPLCを用いて、5.9〜7.6に及ぶ様々なpH値を持つ1mMのPBI−5455溶液にて遊離されたフリマジンの比率が経時的に検出された。図14はPBI−5455の加水分解によるフリマジンの遊離がpH依存性であることを示している。これらの化合物を用いてHTS操作法を支援し、pHを調整するまたは適当な求核試薬を加えることによって初期輝度を高めることができる。
実施例23で示したように、PBI−5455はやや酸性の緩衝液で10時間安定である。pHが高ければ高いほど、遊離は速い。タンパク質/タンパク質及び/またはリガンド/タンパク質の相互作用を検出するためのBRETでの適用については、それが一時点の読み取りであるならば、培地における濃度は100〜200μMより高くてもよい。緩衝液ストックにおけるpHを利用して初期輝度を調整し、それをフリマジンに匹敵させ、フリマジンの動態を維持することができる。図15はフリマジンを用いることに比べたPBI−5455を用いたHTS操作を示す模式図である。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕式(I)
の化合物またはその塩であって、
式中、
R A は細胞非透過性部分であり;
R B は−OC(O)NR A R B のカルボニル基と反応するように構成される官能基を含む部分であり;
R C は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または1以上の好適な置換基によって置換され;
R D は水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり;
R E は水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ(アルキル)アミノ、−OC(O)アルキル、または−OCH 2 OC(O)アルキルであり;
式中、破線の結合は一緒に式(I)の化合物における任意の6員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である、前記式(I)の化合物またはその塩。
〔2〕R A が、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルから成る群から選択され、その際、前記アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され;
R B が、アミノアルキルまたはチオアルキルであり、その際、前記アルキルは非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され、及びアミノアルキルの前記アミノは非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され、またはアミノアルキルの窒素原子が複素環基の一部を形成し、前記複素環基は非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され;
R C が、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルは、それぞれ独立して非置換であり、または1以上の好適な置換基で置換され;
R D が、水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり;
R E が、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ(アルキル)アミノ、−OC(O)アルキル、または−OCH 2 OC(O)アルキルであり;
式中、破線の結合は一緒に式(I)の化合物における任意の6員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である前記〔1〕に記載の化合物。
〔3〕R A が、アルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アジドアルキル、シアノアルキル、マレイミドアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルケニル、アルキニル、−(CR 1 R 2 ) m −N(R 3 )C(O)R 4 、−(CR 5 R 6 ) m −SO 3 R 7 、−(CR 5 R 6 ) m −OPO 2 R 7 、−(CR 5 R 6 ) m −SO 2 N(R 8 )(R 9 )、−(CR 10 R 11 ) m −CO 2 R 12 、−(CR 13 R 14 ) m −CON(R 15 )(R 16 )、−(CR 17 R 18 ) m −ON(R 19 )(R 20 )、−(CR 21 R 22 ) m −ヘテロシクリル−(CR 23 R 24 ) n −R 25 、−(CR 26 R 27 ) m −ヘテロアリール−(CR 28 R 29 ) n −R 30 、−(CR 31 R 32 ) m −アリール−(CR 33 R 34 ) n −R 35 、及び−(CR 36 R 37 ) m −シクロアルキル−(CR 38 R 39 ) n −R 40 から成る群から選択され;
R 1 、R 2 、R 3 、R 5 、R 6 、R 8 、R 10 、R 11 、R 13 、R 14 、R 15 、R 17 、R 18 、R 19 、R 21 、R 22 、R 23 、R 24 、R 26 、R 27 、R 28 、R 29 、R 31 、R 32 、R 33 、R 34 、R 36 、R 37 、R 38 、及びR 39 は、それぞれ独立して水素及びアルキルから成る群から選択され;
R 4 、R 7 、R 9 、R 12 、R 16 、R 20 、R 25 、R 30 、R 35 、及びR 40 は、それぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルコキシルアルキル、アルキルカルボニルオキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、ヒドロキシ−(モノまたはポリアルコキシ)アルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルコキシアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキルアルキル、
及び
から成る群から選択され、
その際、R 4 、R 7 、R 9 、R 12 、R 16 、R 20 、R 25 、R 30 、R 35 及びR 40 の前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから独立して選択される1、2、3、4、または5の置換基で置換され;
R 41 、R 42 、及びR 44 は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素、アルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、イミダゾリルアルキル、グアニジノールアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキサミドアルキル、チオアルキル、セラニルアルキル、ピロリジニル、メチルチオアルキル、フェニルアルキル、4−ヒドロキシフェニルアルキル、及びインドリルアルキルから成る群から選択され;
R 43 及びR 45 は、それぞれ独立して水素、−C(O)アルキル及び
から成る群から選択され;
m、及びnはそれぞれ独立して1、2、3、4、5、または6であり;
x、及びyはそれぞれ独立して1〜20から選択される整数であり;
R B が、−(CR 46 R 47 ) t −NR 48 R 49 または−(CR 53 R 54 ) Z −SR 55 であり;
R 46 及びR 47 は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から選択され;
R 48 及びR 49 は、それぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、−(CR 50 R 51 ) z −OC(O)R 52 、−(CR 53 R 54 ) Z −SR 55 、−(CR 56 R 57 ) z −S(O)R 58 、−(CR 59 R 60 ) Z −S(O) 2 R 61 、−(CR 62 R 63 ) Z −N(R 64 )(R 65 )、−(CR 66 R 67 ) z −N(R 68 )C(O)R 69 、−(CR 70 R 71 ) z −N(R 72 )S(O) 2 R 73 、−(CR 74 R 75 ) z −N(R 76 )C(O)N(R 77 )(R 78 )、−(CR 79 R 80 ) z −N(R 81 )S(O) 2 N(R 82 )(R 83 )、−(CR 84 R 85 ) z −C(O)R 86 、−(CR 87 R 88 ) z −C(O)O(R 89 )、−(CR 90 R 91 ) z −C(O)N(R 92 )(R 93 )、及び−C(R 94 )=N−OR 95 から選択され;
またはR 48 及びR 49 はそれらが連結される窒素原子と一緒にヘテロシクリルを形成し、その際、前記ヘテロシクリルは非置換であり、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、−NO 2 、−CN、ハロゲン、オキソ、−OR 96 、−OC(O)R 97 、−SR 98 、−S(O)R 99 、−S(O) 2 R 100 、−S(O) 2 N(R 101 )(R 102 )、−N(R 103 )(R 104 )、−N(R 105 )C(O)R 106 、−N(R 107 )S(O) 2 R 108 、−N(R 109 )C(O)N(R 110 )(R 112 )、−N(R 113 )S(O) 2 N(R 114 )(R 115 )、−C(O)R 116 、−C(O)O(R 117 )、−C(O)N(R 118 )(R 119 )、ハロアルキル、−(CR 120 R 121 ) Z −CN、−(CR 122 R 123 ) z −OR 124 、−(CR 125 R 126 ) z −OC(O)R 127 、−(CR 128 R 129 ) Z −SR 130 、−(CR 131 R 132 ) z −S(O)R 133 、−(CR 134 R 135 ) z −S(O) 2 R 136 、−(CR 137 R 138 ) Z −N(R 139 )(R 140 )、−(CR 141 R 142 ) Z −N(R 143 )C(O)R 144 、−(CR 145 R 146 ) z −N(R 147 )S(O) 2 R 148 、−(CR 149 R 150 ) z −N(R 151 )C(O)N(R 152 )(R 153 )、−(CR 154 R 155 ) z −N(R 156 )S(O) 2 N(R 157 )(R 158 )、−(CR 159 R 160 ) z −C(O)R 161 、−(CR 162 R 163 ) z −C(O)O(R 164 )及び−(CR 165 R 166 ) z −C(O)N(R 167 )(R 168 )から成る群から独立して選択される1、2、3、4、5または6の置換基によって置換され;
R 52 、R 55 、R 64 、R 65 、R 68 、R 72 、R 69 、R 76 、R 77 、R 81 、R 82 、R 86 、R 89 、R 92 、R 93 、R 96 、R 97 、R 98 、R 101 、R 102 、R 103 、R 104 、R 105 、R 106 、R 107 、R 109 、R 110 、R 112 、R 113 、R 114 、R 115 、R 116 、R 117 、R 118 、R 119 、R 124 、R 127 、R 130 、R 139 、R 140 、R 143 、R 144 、R 147 、R 151 、R 152 、R 153 、R 156 、R 157 、R 158 、R 161 、R 164 、R 167 、及びR 168 は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ハロアルコキシアルキル、及びハロアルキルから成る群から選択され;
R 58 、R 61 、R 73 、R 99 、R 100 、R 108 、R 133 、R 136 、及びR 148 は、各存在ごとに、それぞれ独立してアルキル及びハロアルキルから選択され;
R 50 、R 51 、R 53 、R 54 、R 56 、R 57 、R 59 、R 60 、R 62 、R 63 、R 66 、R 67 、R 70 、R 71 、R 74 、R 75 、R 79 、R 80 、R 84 、R 85 、R 87 、R 88 、R 90 、R 91 、R 120 、R 121 、R 122 、R 123 、R 125 、R 126 、R 128 、R 129 、R 131 、R 132 、R 134 、R 135 、R 137 、R 138 、R 141 、R 142 、R 145 、R 146 、R 149 、R 150 、R 154 、R 155 、R 159 、R 160 、R 162 、R 163 、R 165 、及びR 166 は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、及びハロアルキルから選択され;
R 94 及びR 95 は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素及びアルキルから選択され;
tは、1、2、3、4、5、6、7、または8であり;
zは、各存在ごとに、それぞれ独立して1、2、3、または4であり;
R C は、−(CH 2 ) 0-3 −TまたはC 1-5 アルキルであり;その際、Tはアリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、及びシクロアルキルは、それぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキルアミノアルキル)、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から独立して選択される1、2、または3の置換基によって置換され;
R D が、水素、低級シクロアルキル、ベンジル、及びC 1 −C 4 −アルキルから成る群から選択され;および
R E が、−H、−OH、−NH 2 、−OC(O)−C 1 −C 7 −アルキルまたは−OCH 2 OC(O)−C 1 −C 7 −アルキルから成る群から選択され;
その際、式(I)の破線の結合は任意の環の存在を示し、それは飽和されてもよいし、または不飽和であってもよい前記〔1〕に記載の化合物。
〔4〕R A が、−(CR 1 R 2 ) m −N(R 3 )C(O)R 4 であり、式中、mは2、3または4であり;R 1 及びR 2 は、各存在ごとに、水素であり;R 3 は水素またはメチルであり;ならびにR 4 は上記で定義されたとおりである前記〔3〕に記載の化合物。
〔5〕R 4 がtert−ブトキシ、フェニル、メチル、4−トリフルオロメチルフェニル、イソプロピル、4−メトキシフェニルまたは4−フルオロフェニルである前記〔4〕に記載の化合物。
〔6〕R A が
及び
から成る群から選択される前記〔1〕に記載の化合物。
〔7〕R B がモルフォリニルアルキルである前記〔1〕に記載の化合物。
〔8〕R B が
及び
から成る群から選択される前記〔1〕に記載の化合物。
〔9〕R C がフリルメチルである前記〔1〕に記載の化合物。
〔10〕R C がベンジルである前記〔1〕に記載の化合物。
〔11〕R D がベンジルである前記〔1〕に記載の化合物。
〔12〕R E が水素である前記〔1〕に記載の化合物。
〔13〕式(I−i):
またはその塩を有し、
式中、R A 、R B 、R C 、R D 、及びR E が上記で定義されたとおりである前記〔1〕に記載の化合物。
〔14〕式(I−iv):
またはその塩を有し、
式中、R 200 がそれぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される1、2または3の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり;
R A 及びR B が上記で定義されたとおりである前記〔1〕に記載の化合物。
〔15〕式(I−x)
またはその塩を有し、
式中、
sが1または2であり、
R 201 が、それぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される1、2または3の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり;
R A が上記で定義されたとおりである前記〔1〕に記載の化合物。
〔16〕式(I−xvii):
またはその塩を有し、式中、qが1または2であり;sが1または2であり;R 4 が上記で定義されたとおりである前記〔3〕に記載の化合物。
〔17〕
及び
またはその塩から成る群から選択される前記〔1〕に記載の化合物。
〔18〕前記〔1〕に記載の式(I)の化合物と式(II)
の少なくとも1つの化合物との混合物を含む組成物であって、式(II)におけるR C 、R D 及びR E が上記で定義されたとおりである、前記組成物。
〔19〕式(II)の化合物が、(II−i)、(II−ii)、(II−iii)、(II−iv)、及び(II−v):
またはそれらの組み合わせから成る群から選択される前記〔18〕に記載の組成物。
〔20〕試料における発光酵素の検出方法であって、
(a)前記試料を前記〔1〕に記載の化合物に接触させることと、
(b)前記試料にて発光を検出することとを含み、
発光の検出が発光酵素の存在を示す、前記検出方法。
〔21〕試料におけるプロモータの活性の測定方法であって、前記プロモータが発光酵素をコードする遺伝子に操作可能に連結され、
(a)試料を前記〔1〕に記載の化合物に接触させて反応混合物を作製することと、
(b)前記反応混合物の発光を測定することによってプロモータの活性を決定することとを含み、前記試料が前記プロモータを含む、前記測定方法。
〔22〕前記試料が細胞を含む前記〔20〕または〔21〕に記載の方法。
〔23〕前記細胞が前記発光酵素を含む前記〔23〕に記載の方法。
〔24〕前記細胞が前記発光酵素を発現する前記〔23〕に記載の方法。
〔25〕前記〔1〕に記載の前記化合物が緩衝溶液中にある前記〔20〕または〔21〕に記載の方法。
〔26〕前記〔1〕に記載の前記化合物が少なくとも部分的に加水分解されて前記試料との接触に先立って細胞透過性基質を遊離する前記〔25〕に記載の方法。
〔27〕前記緩衝溶液が前記〔1〕に記載の前記化合物の自己ベースの触媒を調節するまたは促進するpHを有して前記細胞透過性基質を遊離する前記〔26〕に記載の方法。
〔28〕前記緩衝溶液が求核試薬溶液を含み、前記求核試薬溶液が式(I)の化合物と反応して前記細胞透過性基質を遊離するように構成された求核試薬を含む前記〔26〕に記載の方法。
〔29〕前記緩衝溶液が式(I)の前記化合物の細胞非透過性部分を切断して細胞透過性基質を遊離する非発光酵素を含む前記〔26〕に記載の方法。
〔30〕工程(a)がさらに、式(I)の化合物と反応して細胞透過性基質を提供するように構成された求核試薬または非発光酵素に前記試料を接触させることを含む前記〔20〕または〔21〕に記載の方法。
〔31〕前記細胞透過性基質が式(II)
の化合物であって、式(II)におけるR C 、R D 及びR E が上記で定義されたとおりである前記〔26〕〜〔30〕のいずれか一項に記載の方法。
〔32〕式(II)の化合物が、(II−i)、(II−ii)、(II−iii)、(II−iv)、及び(II−v):
またはそれらの組み合わせから成る群から選択される前記〔31〕に記載の方法。
〔33〕試料における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間の相互作用の検出方法であって、
(a)試料と前記〔1〕の前記化合物と接触させ、前記試料は、
(i)第1の融合タンパク質は発光酵素の第1の断片と第1のタンパク質とを含み、前記第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドと
(ii)第2の融合タンパク質は発光酵素の第2の断片と第2のタンパク質とを含み、前記第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドとを含み、
(b)前記試料における発光を検出することとを含み、
前記発光の検出が前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質との間の相互作用を示す、前記検出方法。
〔34〕前記〔1〕に記載の前記化合物が少なくとも部分的に加水分解されて細胞透過性基質を遊離する前記〔33〕に記載の方法。
〔35〕前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質が相互作用すると、前記発光酵素の前記第1の断片と前記発光酵素の前記第2の断片が前記細胞透過性基質を安定して結合することが可能である完全長の酵素を再構成する前記〔34〕に記載の方法。
〔36〕試料における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間の相互作用の検出方法であって、
(a)試料と前記〔1〕の前記化合物と接触させ、前記試料は、
(i)第1の融合タンパク質が発光酵素と第1のタンパク質とを含み、前記第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドと
(ii)第2の融合タンパク質が蛍光アクセプター分子と第2のタンパク質とを含み、前記第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドとを含み、
(b)前記試料にて、生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または最近接を示す生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)検出することとを含む、前記検出方法。
〔37〕前記試料が細胞を含む前記〔33〕〜〔36〕のいずれか一項に記載の方法。
〔38〕前記細胞が発光酵素を含む前記〔37〕に記載の方法。
〔39〕前記発光酵素がセレンテラジンを利用するルシフェラーゼ酵素である前記〔38〕に記載の方法。
〔40〕セレンテラジンを利用する酵素がOplophorusルシフェラーゼ酵素またはその変異体または突然変異体である前記〔39〕に記載の方法。
〔41〕生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システムであって、生物発光ドナー分子が発光酵素である、前記生物発光ドナー分子と第1の標的タンパク質とを含む第1の融合タンパク質と、第2の標的タンパク質と蛍光アクセプター分子とを含む第2の融合タンパク質と、前記〔1〕に記載の前記化合物とを含む前記生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システム。
〔42〕前記〔1〕に記載の化合物を含むキット。
〔43〕試料における酵素の検出方法であって、
(a)式(I)の化合物、式(a)の化合物、式(b)の化合物、式(c)の化合物、式(d)の化合物、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物に前記試料を接触させることと、
及び
(式中、R’は、各存在ごとに、独立してハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキル)アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から選択され;y’は0、1、2、3、または4であり;R A 、R B 、R C 、R D 及びR E は前記〔1〕で定義されたとおりである);
(b)前記試料にて発光を検出することとを含み、その際、式(I)の前記化合物、式(a)の前記化合物、式(b)の前記化合物、式(c)の前記化合物、式(d)の前記化合物、またはそれらの前記組み合わせは、非発光酵素との反応を介して1以上の細胞透過性基質に変換される、前記検出方法。
〔44〕前記非発光酵素が、ホスファターゼ、プロテアーゼ、エステラーゼまたはスルファターゼである前記〔43〕に記載の方法。
Claims (17)
- 式(I−x)
式中、
RAは、−(CR1R2)m−N(R3)C(O)R4、−(CR5R6)m−SO3R7及び−(CR10R11)m−CO2R12から成る群から選択され;
mは、各存在において、独立して2、3または4であり;
R1、R2、R3、R5、R6、R7、R10、R11及びR12は、各存在において、独立して水素又はC1−C4アルキルであり;
R4は、C1−C4アルキル;C1−C4アルコキシ;カルボキシ−C1−C4アルコキシ−C1−C4アルキル;ハロゲン、C1−C4アルコキシ及びC1−C4ハロアルキルから成る群から独立して選択される1、2、3、4、または5の置換基で任意に置換されているフェニル、
R41、R42及びR44は、各存在において、それぞれ独立して、カルボキシ−C1−C4アルキルであり;
R43及びR45はそれぞれ独立して、水素、−C(O)アルキル及び
x及びyは、それぞれ独立して1〜20から選択される整数であり;
sが1または2であり;
R 201 が、それぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される1、2または3の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールである、
前記式(I−x)の化合物またはその塩。 - RAが、−(CR1R2)m−N(R3)C(O)R4であり、式中、m、R1、R2、R3及びR4は請求項1で定義されたとおりである、請求項1に記載の化合物。
- RAが
- 式(I−xvii):
- RAが
式中、R41、R42、R43、R44、R45、x及びyは請求項1で定義されたとおりであり、
RBが
-
- 請求項1に記載の式(I−x)の化合物と式(II)
R C は−(CH 2 ) 0-3 −TまたはC 1-5 アルキルであり;その際、Tはアリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ(アルキルアミノアルキル)、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ(アルキル)アミノから成る群から独立して選択される1、2、または3の置換基によって置換され;
R D は水素、C 1 −C 4 アルキル、ベンジル、又はC 3 −C 6 シクロアルキルであり;
R E は水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ(アルキル)アミノ、−OC(O)アルキル、または−OCH 2 OC(O)アルキルであり;
式中、破線の結合は一緒に式(II)の化合物における任意の6員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である)の少なくとも1つの化合物との混合物を含む組成物。 - 式(II)の化合物が、(II−i)、(II−ii)、(II−iii)、(II−iv)、及び(II−v):
- 試料における発光酵素の検出方法であって、
(a)前記試料を請求項1に記載の化合物に接触させることと、
(b)前記試料にて発光を検出することとを含み、
発光の検出が発光酵素の存在を示す、前記検出方法。 - 前記試料が細胞を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞が、前記発光酵素を含む、又は、前記発光酵素を発現する、請求項10に記載の方法。
- 前記化合物が緩衝溶液中にある、請求項9に記載の方法。
- 前記化合物が少なくとも部分的に加水分解されて前記試料との接触に先立って細胞透過性基質を遊離し、
前記細胞透過性基質が式(II)
R C は−(CH 2 )−R 201 であり、R 201 は請求項1で定義されたとおりであり、
R D はベンジルであり、
R E は水素であり、
破線の結合は存在しない)の化合物である、請求項12に記載の方法。 - 前記緩衝溶液が、前記化合物の自己ベースの触媒を調節するまたは促進して前記細胞透過性基質を遊離させるpHを有する、
前記緩衝溶液が求核試薬溶液を含み、前記求核試薬溶液が式(I−x)の化合物と反応して前記細胞透過性基質を遊離するように構成された求核試薬を含む、又は
前記緩衝溶液が式(I−x)の前記化合物の細胞非透過性部分を切断して細胞透過性基質を遊離する非発光酵素を含む、
請求項13に記載の方法。 - 工程(a)がさらに、式(I−x)の化合物と反応して細胞透過性基質を提供するように構成された求核試薬または非発光酵素に前記試料を接触させることを含み、
前記細胞透過性基質が式(II)
R C は−(CH 2 )−R 201 であり、R 201 は請求項1で定義されたとおりであり、
R D はベンジルであり、
R E は水素であり、
破線の結合は存在しない)の化合物である、請求項9に記載の方法。 - 試料における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間の相互作用の検出方法であって、
(a)試料と請求項1の前記化合物と接触させること、ここで前記試料は、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド、ここで前記第1の融合タンパク質は発光酵素の第1の断片と第1のタンパク質とを含む、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド、ここで前記第2の融合タンパク質は、
a.発光酵素の第2の断片と第2のタンパク質、又は
b.蛍光アクセプター分子と第2のタンパク質を含む、
を含む、並びに
(b)前記第2の融合タンパク質が発光酵素の第2の断片と第2のタンパク質とを含む場合、前記試料における発光を検出することを含み、前記発光の検出が前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質との間の相互作用を示す、又は
前記第2の融合タンパク質が蛍光アクセプター分子と第2のタンパク質とを含む場合、前記試料における生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)検出することを含み、前記BRETの検出が、生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または最近接を示す、前記検出方法。 - 生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システムであって、
第1の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む第1の融合タンパク質、ここで前記生物発光ドナー分子が発光酵素である、
第2の標的タンパク質と蛍光アクセプター分子とを含む第2の融合タンパク質、及び
請求項1に記載の前記化合物
を含む、前記生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システム。
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