JP4342608B2 - 突然変異体ルシフェラーゼ - Google Patents
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Description
ホタルルシフェラーゼは、ATP、Mg2+及び分子酸素の存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、その結果として発光を生じさせる。この反応は、約0.88の量子収率を有し(DeLuca及びMcElroy(1978)とSeliger及びMcElroy(1960)を参照されたい)、この発光特性は、ATPレベルを測定する発光測定検定において使用されている。
ルシフェラーゼはホタルの体から直接得ることも、この酵素をコードする組換えDNA構築物を含む微生物からの発現によって得ることも可能である。この酵素を得ることが可能な、又は、この酵素をコードするDNAを得ることが可能な重要な種は、日本のGENJI及びHEIKEホタルであるLuciola cruciataとLuciola lateralis、東ヨーロッパのホタルであるLuciola mingrelica、北アメリカのホタル(Photinus pyralis)とツチボタル、及び、ヨーロッパのツチボタルであるLampyris noctilucaである。
野生型及び組換え型のルシフェラーゼの熱安定性は、約30℃を越える温度、特に35℃を越える温度に露出される時に極めて迅速にその活性を失うような熱安定性であり、このために、高い外界温度で使用する場合にはこの酵素の欠損が生じる。日本ホタルのルシフェラーゼをその217位で突然変異させてイソロイシン残基によってトレオニン残基を置き換えることによって、この酵素を熱安定化することが可能であり(Kajiyama及びNakano(1993)Biochemistry 32,p.13795−13799)、そのpH安定性と比活性も増大される。
同時係属中の特許出願GB 9405750.2は、特に、50℃以上の温度において比較的熱安定であるルシフェラーゼを提供するために、使用可能なPhotinus pyralisの熱安定性を217位における改変によって増大させることが可能なアミノ酸置換を開示している。
本発明は、ルシフェラーゼ酵素を、比較的低いレベルにおけるアデノシン三リン酸の検出に基づく検定で使用するのに適したものにする、ルシフェラーゼ酵素の特性の強化に係わる。この強化は、Photinus pyralisルシフェラーゼのミカエリス−メンテン定数(Km)が、野生型配列を有する対応するルシフェラーゼに比較して低減するように、この酵素のアミノ酸配列内の270位に相当する位置においてアミノ酸を改変することによって実現される。これは、Luciola mingrelica、Luciola cruciata及びLuciola lateralisにおけるアミノ酸272に相当する。これは、Lampris Noctilucaにおけるアミノ酸270にも相当する。
本発明は、更に、野生型ルシフェラーゼの発光波長とは異なった波長の発光を伴うD−ルシフェリンの酸化を生じさせる能力を特徴とするルシフェラーゼを提供し、従って、放出光の波長が存在する特定の標識材料に特徴的である結合測定法において、特異的標識としてこのルシフェラーゼを使用することを可能にし、又は、このルシフェラーゼをコードするDNAを、遺伝子操作細胞もしくはこうした細胞から誘導された細胞のリポーターDNAとして使用することを可能にする。
従って、本発明の第1の側面では、Photinus pyralisルシフェラーゼの残基270、並びに、Luciola mingrelica、Luciola cruciata及びLuciola lateralisルシフェラーゼの残基272に相当するアミノ酸残基がグルタメート以外のアミノ酸であることを特徴とする、ルシフェラーゼ活性を有し且つPhotinus pyralis、Luciola mingrelica、Luciola cruciata、又は、Luciola lateralisのアミノ酸配列に対して60%を越えるアミノ酸配列相同性を有するタンパク質が提供される。このタンパク質が保存アミノ酸配列F(1)XE(2)FLを有することを特徴とすることが好ましく、前式中で(1)がD又はEであり、(2)がT又はLであり、Xがグルタメート以外のアミノ酸であり、F、E、L、D、Tの各々が、単一文字アミノ酸コードによって与えられるような対応するアミノ酸に関連する。
現時点までに確定している好ましいアミノ酸Xは、リシン、その類似体、又は、その修飾物である。他の好ましいアミノ酸は、アルギニン、グルタミン、及び、アラニンを含む。
本発明の更に好ましい実施様態では、本発明のタンパク質が、更に、疎水性アミノ酸、好ましくはイソロイシン、ロイシン、バリン、又は、これらの類似体に改変された、Luciolaホタルルシフェラーゼのアミノ酸217又はPhotinus pyralisルシフェラーゼのアミノ酸215に相当する位置のアミノ酸を有し、及び/又は、グルタミン酸以外のアミノ酸、特に、リシン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、又は、これらの類似体もしくは修飾物に改変された、Luciola ホタルルシフェラーゼのアミノ酸356又はPhotinus pyralisルシフェラーゼのアミノ酸354に相当する位置のアミノ酸を有する。
本発明の第2の側面では、本発明のタンパク質をコードするDNAが提供され、第3の側面では、本発明のタンパク質を発現させることが可能であるような形でluc遺伝子(ルシフェラーゼをコードする遺伝子)を含むベクター(特に、プラスミド)が提供される。こうした形は、微生物宿主細胞の中に取り込まれる時にそのタンパク質が(場合によっては、適切な誘導物質の添加によって)必要に応じて容易に発現させられることが可能であるように本発明のタンパク質の発現を制御することが可能なDNAを上記ベクターが含むような形である。
Photinus pyralis、Luciola mingrelica、Luciola cruciata及びLuciola lateralisに関するluc遺伝子が公知であり、標準的な分子生物学的方法で単離可能である。これは、更に、Lampyris noctilucaに関しても同様である。Photinus pyralisのluc遺伝子は、PromegaからプラスミドpGEM−lucとして市販入手可能である。従って、本発明のDNAの生産のための開始材料を得るための慣用方法と起源は、(i)自然発生ホタルゲノムDNAの使用、及び、例えばPCRを使用することによるこのDNAからのluc遺伝子の増幅、(ii)pGEMプラスミド、並びに、(iii)Kajiyama及びNakanoのpGLf37プラスミドである。ルシフェラーゼ活性、即ち、発光を伴ってルシフェリンを酸化する活性を有するタンパク質をコードする更に別の遺伝子も、DNAを得るための、及び、最終的には遺伝子発現によって本発明のタンパク質を得るための開始材料の適切な起源であろう。
本発明のDNAを生産するための野生型又は他のluc遺伝子DNAの操作に使用するのに適したベクターは、天然グルタメートを別のアミノ酸に改変する際に本発明のDNAがその中に含まれることが可能なあらゆるベクターである。例えばヒドロキシルアミンのような物質を使用して化学的に誘導する突然変異誘発の場合には、こうしたベクターはあまり重要ではなく、突然変異誘発処理の前と後に遺伝子の容易な操作を可能にする数多くの適切なベクターを、当業者は見い出すだろう。そのluc遺伝子をグルタメートにおいて特異的に突然変異させることが好ましい場合も考えられ、従って、この場合には、部位特異的な突然変異誘発操作が必要とされるだろう。こうした操作をベクター内において極めて容易に行うことが可能であり、こうした操作は当業者にとって公知だろう。
野生型及び公知タイプのluc遺伝子と本発明のluc遺伝子とを発現させるための適切なベクターは、pKK223−3、pDR540(Boehringer Mannheimから入手可能)、及び、pT7−7を含む。pKK223−3とpDR540は、イソプロピル−チオガラクトシド(IPTG)の存在によって発現が誘導されることを可能にする、ラクトースリプレッサーの制御下にあるtacプロモーターを有する。pT7−7は、T7−RNAポリメラーゼプロモーターによる制御を可能にし、従って、T7−RNAポリメラーゼを含むE.coli細胞内での非常に高レベルの遺伝子発現のための基礎を与える。こうしたベクターの中で、luc遺伝子を挿入する場合に最も高レベルの発現を示すことが確認されているベクターは、pT7−7ベクターである。
pKK223−3及びpDR540の中に挿入されたluc遺伝子からのルシフェラーゼの発現が、野生型N末端配列ルシフェラーゼの発現を生じさせると同時に、pT7−7の中に挿入されたluc遺伝子からの発現が、別のN末端アミノ酸A−R−I−Qを有する融合タンパク質の合成をもたらす。luc遺伝子を含む個々のベクター(構築物pPW204、pPW116、及び、pPW304と呼ぶ)内のluc遺伝子のリボソーム結合部位と出発コドンを、実施例の表1に示す。後述するpW601aは、ユニークXho I部位pPW116を除去することによって得られる。
本発明の第3の側面は、本発明のタンパク質を発現させることが可能な細胞、この細胞を用いるこうしたタンパク質を生産するための方法及び本発明のタンパク質を含むテストキット及び試薬を提供する。当業者には公知であるように、そのルシフェラーゼが本発明のタンパク質であることを特徴とするルシフェリン/ルシフェラーゼ試薬を使用してATPを測定する検定方法も提供される。本発明のルシフェラーゼ調製物は、対応する野生型及び組換えルシフェラーゼに比較してKmが低く、更に、好ましい二重改変及び三重改変ルシフェラーゼ(即ち、215、270もしくは354位において改変されたPhotinus、217、272もしくは356位において改変されたLuciola、又は、215、270もしくは354位で改変されたL.noctiluca)は、30℃から70℃までにおいて、特に37℃から60℃までにおいて、とりわけ40℃から50℃までにおいて、比較的高い熱安定性特性を有する。従って、本発明は、本発明人等による他の同時期の研究と以前の研究との熱安定性強化策が使用されることを妨げないものとして、確立されている。
その細胞のDNA中のDNA配列、又は、細胞中に含まれるプラスミドのようなベクター中のDNA配列を使用して異種タンパク質を発現させることが可能な細胞を、本発明のタンパク質を発現させるために使用することが可能である。こうした細胞の中で典型的な細胞は、Saccharomyces cerevisiae細胞のような酵母細胞と、Escherichia coli細胞のような細菌細胞であると考えられるが、当業者は、タンパク質発現の目的に適した他の数多くの宿主生物を見い出すことだろう。
本発明のタンパク質を、自然ルシフェラーゼ及び公知の組換えルシフェラーゼに類似した構造のタンパク質として発現させることが可能であり、又は、他のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、もしくは、他の化学種(例えば、上記のA−R−I−O配列)を有するこうしたタンパク質の融合体又は複合体として発現させることが可能である。
宿主の中には特定のコドン優先性を有するものがあり、例えば、細菌が酵母とは異なったコドンを使用する場合があり、従って、こうした宿主におけるより有利な発現を生じさせる所与のアミノ酸に関与する縮重コドンを与えるために、その宿主に取り込まれたDNAを有利に改変することが可能であることが当業者に理解されるだろう。当然のことながら、こうした縮重コドンは本発明のDNAの範囲内に含まれる。
E.coli BL21(DE3)は、適した宿主の1つであり、誘導性lacUV5プロモーターの制御下でその染色体の中に安定的に統合されたT7 RNAポリメラーゼを有し、従って、pT7−7誘導構築物に対して適合性がある。
E.coli B菌株は、BL21と同様に、lonプロテアーゼとompT外膜プロテアーゼとに欠けている。こうした欠乏は、E.coli中における外来タンパク質の発現と蓄積の安定化を促進することが可能である。上記の3つの発現構築物の各々を含むE.coli BL21(DE3)の粗抽出物の検定は、最高レベルのルシフェラーゼ発現が、構築物pPW304を含む細胞から得られることを示した(表2を参照されたい)。下記の実施例で使用するE.coli JM109細胞のような他の適切な細胞系統を、当業者は容易に見い出すだろう。
以下では、下記の非限定的な実施例、図面、表及び配列表を参照しながら、本発明のタンパク質、DNA、ベクター及び細胞を単なる例示の形で説明する。本発明のタンパク質、DNA、ベクター及び細胞を考慮することによって、当業者は、これらのいずれかを組み込んだ更に別のタンパク質、タンパク質複合体、DNA、ベクター及び細胞、並びに、検定及びテストキットを容易に見い出すだろう。
図面
図1は、下記実施例で説明する通りのluc遺伝子の挿入によってpKK223−3から誘導されるプラスミドpPW204の制限地図を示す。
図2は、下記実施例で説明する通りのluc遺伝子の挿入によってpDR540から誘導されるプラスミドpPW116の制限地図を示す。
図3は、下記実施例で説明する通りのluc遺伝子の挿入によってpT7−7から誘導されるプラスミドpPW304の制限地図を示す。
図4は、pDR540と、Xho部位が除去されたpGEM−lucからのBamH1/Sst1フラグメントとから誘導された、プラスミドpPW601aの制限地図を示す。
図5は、下記実施例で説明する通りに所与の温度に16分間インキュベートした、組換え野生型Photinusルシフェラーゼ(Sigma)、本発明のKm改変ルシフェラーゼ、同時係属中のGB 9405750.2に開示されている熱安定性354リシン突然変異体、及び、本発明のKm/354リシン二重突然変異体の熱不活性化のグラフを示す。
図6は、Tabor後のpT7−7の制限地図を示す。
配列表
本明細書の末尾に示した配列表は、次のようなDNA配列とアミノ酸配列を示す。
配列番号:1は、811から813までのPhotinus pyralis野生型コドンが突然変異している本発明のルシフェラーゼをコードするDNAのDNA配列を示す。リシンに関しては811の塩基だけがAに突然変異している。この配列は、1063から1065までの、熱安定性をもたらすための位置も示す。
配列番号:2は、Photinus pyralis野生型アミノ酸270グルタメートがグルタメート以外の残基Xaaに改変されている、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号:3は、270位においてグルタメートの代わりにリシンを与えるための、pPW601aのSDM突然変異に使用するオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号:4は、Photinus pyralis野生型アミノ酸270グルタメートがリシンに改変され且つアミノ酸354がリシンに改変されている、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号:5は、354位においてグルタメートの代わりにリシンを与えるためのpPW601aのSDM突然変異に使用するオリゴヌクレオチドの配列を示す。
実施例
実施例1: 本発明のDNAを含むプラスミドの生産
プラスミドpKK223−3とプラスミドpDR540をBoehringer Mannheimから入手した。pDR540は、Pharmacia Biotech,St Albans,UKからも入手可能である。ファージミドpBluescript II SK(+)をStratagene,La Jolla,USAから入手した。E.coli菌株BL21(DE)を、pT7−7誘導プラスミドからのルシフェラーゼの発現のために使用し、E.coli菌株JM109(4)をクローニング実験の全てにおいてpDR540誘導プラスミドからのルシフェラーゼの発現のために使用した。
プラスミドpT7−7(Molecular Biology,Vol II,Section 16.2.1のCurrent protocolsを参照されたい)を、Stan Tabor,Dept of Biol Chem,Harvard Medical School,Boston,Mass 02115から入手し、このプラスミドは(図6に示すように)、T7 RNAポリメラーゼプロモーターφ10と、pT7−5のPvuII部位とClaI部位との間に挿入されたT7遺伝子10タンパク質(T7 bp22857からbp22972まで)のための翻訳開始部位とを含む。(5′末端の充填後の)融合タンパク質の作成のためのユニーク制限部位は、Frame 0:EcoR1、Frame 1:NdcI,SmaI、CalI、Frame 2:BamHI,SalI,HindIIIである。その当初のポリリンカーのSacI部位を欠失によって除去し、追加のXbaI部位を出発コドンの上流に与える。
図面の説明に述べているように、各々に、標準的な制限エンドヌクレアーゼとライゲーション法とを使用してPromega pGEM−lucから誘導したluc遺伝子を挿入することによって、pPW204をpKK223−3から誘導し、pPW116をpDR540から誘導し、pPW304をpT7−7から誘導し、一方、pDR540と、このプラスミドのポリリンカー内のユニークXho I部位を除去することによって誘導されるようなpPW601aとの中に、pGEM−lucから誘導したluc遺伝子と、BamH1/Sst1フラグメントとをクローニングすることによって、pPW601を生産した。pPW601aは、ルシフェラーゼアミノ酸354改変のためのSDM手順を単純化する、Ava Iに関するユニーク認識部位を含む。
pPW304の生産のために、pT7−7をEcoRIで消化し、末端をクレノウフラグメントを使用して充填し、その産物をSalIで消化し、そのDNAをゲル精製する。pGEM−lucをBam HIで消化し、生産されたオーバーハングをMBNで消化し、その産物をSalIで消化し、生産された1Kbフラグメントを精製し、ライゲーションして精製pT7−7 DNAを得る。
BMH 71−18 mut S細胞へのプラスミドの形質転換を、Bio−Rad Gene Pulser version 2−89を使用して行った。pPW601クローンの生産のために、収集した細胞と、突然変異プラスミドと親プラスミドを含む精製混合プラスミドプールとを与え、E.coli JM109細胞内への形質転換の前にAva Iによる二次制限消化を行った。これらの細胞を選択培地(LB寒天+50μg/mLアンピシリン)上で平板培養し、クローンを、そのプラスミドDNAを精製して所期の改変に関して分析することによってスクリーニングした。プラスミドDNAを、アルカリ溶解を使用して精製した(Birnboim & Doly(1979)Nucleic Acids Research 7,p1513)。
E.coli BL21(DE3)において発現させた場合に、構築物pPW204、pPW116、及び、pPW304の各々から得られるルシフェラーゼの相対的発現レベルは、0.1:0.5:1.0である。細胞を37℃のLB中で0.3のOD 600に増殖させ、その後で、IPTGで誘導し、増殖を4時間続けさせた後で粗抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
初期定常期に収集した後で、50mM KCl、0.5mM ジチオトレイトール及び1mM EDTAを含む50mMトリス塩酸(pH 8.0)(緩衝液A)中に再懸濁させたE.coli JM109細胞上で、ルシフェラーゼの部分精製を行った。MSE soniprep(増幅14μ)内での破壊によって細胞を破壊し、そのライゼートを30000xgで1時間遠心した。その後で、硫酸アンモニウムを使用して粗抽出物の上清液を分画し、35%飽和から55%飽和の間で沈殿した画分がルシフェラーゼ活性を含み、この画分を緩衝液A中に溶解し、0.4mM DTTを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)(緩衝液B)500mLに対して一晩透析した。
沈殿させ透析したその酵素をMono Q(HR10/10)陰イオン交換カラムにかけ、緩衝液B中の0−200mM NaCl直線勾配(流量4mL/分、画分2mL)で酵素を溶離させることによって、ルシフェラーゼの完全精製を行った。ルシフェラーゼ活性を含むピーク画分を50%グリセロール(v/v)にし、−20℃で保存した。
ホタルルシフェラーゼ(結晶性懸濁液から調製、Cat No.L9009)、コエンザイムA、及び、ATPを、Sigma Chemical Co.から入手した。甲虫ルシフェリンカリウム塩をPromega Corporation,Madison,Wisconsin,USAから入手した。細胞抽出物をPromega technical bulletin No.101に記載の通りに調製した。E.coli培養のアリコートを、細胞培養溶解試薬(25mMトリス−リン酸塩、pH7.8、2mM DTT、2mM EDTA、10%グリセロール、1% Triton X−100、2.5mg/mL BSA、1.25mg/mLリゾチーム)中で室温で10分間溶解し、2分間16000gで遠心し、その後で、検定で使用するまで氷上に保存した。
コロニーをナイロンフィルター(Hybond N、Amersham)に移し、そのフィルターを室温の100mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH5.0中の0.5mM ルシフェリンで浸漬し(Wood及びDeLuca,(1987)Anal Biochem 161,p501−507)、コロニーが放出するバイオルミネセンスの測定によって細胞系のルシフェラーゼ活性を検定した。検定緩衝液(1mM MgSO4、0.1mM EDTA、33.3mM DTT、0.27mM コエンザイムA、0.47mM D−ルシフェリン、0.53mM ATP、及び、試料1μLから5μLを含む20mM トリシン(pH7.8))100μLを使用して、21℃でインビトロでルシフェラーゼ検定を行った。検定用反応混液の最終pHは7.8であり、光測定をBioOrbit 1250 luminometerを使用して、又は、labsystems luminoskan RS plate luminometerを使用してマイクロタイタープレート内で行った。
Bradford(1976)Anal.Biochem.72,p248−254の方法によって、BSAを標準として使用してタンパク質を決定した。DNAの非特異的化学突然変異を生じさせるために、Kironde他(1989)Biochem.J.259,p421−426の方法によって、0.1mMリン酸ナトリウム(pH6.0)中の0.8Mヒドロキシルアミン、1mM EDTAを使用して、65℃で2時間、luc遺伝子を含むプラスミドを処理した。
最初に、pW304内でのluc遺伝子のヒドロキシルアミン誘導突然変異誘発を生じさせ、270位におけるアミノ酸グルタメートのリシンへの改変を生じさせる配列番号:1の811におけるDNA配列の単一塩基改変を有するプラスミド304 G1を得ることによって、Km突然変異体を産生した。1.1kb DNAフラグメント(BstE II/Stu I)をpPW304からクローニングし、pP601a内の対応するフラグメントを置き換えてpPW601G1を形成するために使用し、こうして、pPW304によってコードされる、4つの別のアミノ酸(M−A−R−I−QからのMは含まれない)を含まないルシフェラーゼをコードするluc遺伝子を得た。
この突然変異誘発プラスミドをG60 DNAグレードNickカラム(Pharmacia)上で脱塩した後に、E.coli BL21(DE3)の中に形質転換した。これから発現させたルシフェラーゼは、当初の突然変異体の低Km表現型と同じ低Km表現型を示した。
[α−32P]dATPと8M尿素(6%wt/vol)ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動を使用するSanger他(1977)Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)74,5463−5467のジデオキシ鎖成長終結法によって、二本鎖DNAの配列決定を行った。更に、自動配列決定を、DNA model 373A自動シークエンサー(Applied Biosystems)を使用して行った。
ATPに関するこのルシフェラーゼのKm値を定量するための検定を、cpmを測定するためにルミノメーターを使用し、検定緩衝液(1.0mM MgSO4、0.1mM EDTA、33mMジチオトレイトール、270μMコエンザイムA、470μM D−ルシフェリン、及び、6.25μMから400μMまでのATPを含む20mM トリシン pH7.8)100μLを用いて21℃で行った。
601a組換え野生型に関するKm値を66.1μM(標準誤差4.1)と測定し、601aK(熱安定性突然変異体354リシン)に関しては61.3(標準誤差4.7)と測定し、601aG1(270リシンKm改変)に関しては28.7(標準誤差0.9)と測定し、このことは、270改変が、その酵素が最適化されるATP濃度を半分以上にすることを示している。
ルシフェラーゼの熱安定性に対する270改変の影響はネガティブであり、37℃において、野生型ではt1/2活性に達するのに7分を要するのとは対照的に、僅か2分後にt1/2活性に達するが、30℃では、270の比活性は野生型より高い。
実施例2: 「二重突然変異体」270K:354K Photinus pyralisルシフェラーゼの調製
270改変ルシフェラーゼの熱安定性の低下を補うために、部位特異的突然変異誘発を使用して、実施例1で説明した270リシンルシフェラーゼをコードするDNAとプラスミドとの中に354におけるリシン改変を組み込むことによって、二重改変ルシフェラーゼを調製した。これは、pPW601aG1をpPW601aに変換し更にG1Kに変換するために特別に設計されたオリゴヌクレオチドを使用する突然変異を含んでいた。
SDMによって354リシン改変を生じさせるために使用したオリゴヌクレオチドは、下線付きのTがミスマッチであるCATCCCCCTTGGGTGTAATCAG(配列番号:5)であった。
pPW601aE270Kのグルタメート354を所期のアミノ酸に変換するために(及び、pPW601aからの270突然変異体の直接合成が必要である場合に)必要とされる部位特異的突然変異誘発を、必要に応じて設計したオリゴヌクレオチドを使用して、次のプロトコルによって行う。
部位特異的突然変異誘発プロトコル
選択されたプラスミドを、選択と、所期の改変のための突然変異原性オリゴヌクレオチドとによって、変性させ、アニーリングする。突然変異体DNA鎖を合成してライゲーションし、一次制限全体を制限エンドヌクレアーゼで消化する。配列決定とSDMのためのオリゴヌクレオチドプライマーを、Applied Biosystems model 380A DNAシンセサイザーを使用して合成した。DNAオリゴヌクレオチドプライマーを、luc遺伝子内のユニークAva I部位、又は、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子のユニークScaI部位を破壊するように設計した。これらの部位の存在を、突然変異誘発を受けなかったプラスミドを選択するために使用した。詳細なプロトコルは、Clontech Laboratories Inc(US)catalog No.K1600−1によって販売されるTransformerRTM Site−Directed Mutagenesis Kit(Version 2.0)に記載されている通りだった。
pDR540から誘導したpPW601とクローニングしたluc遺伝子との制限地図を図4に示す。挿入された野生型Photinus luc遺伝子を、改変されたアミノ酸配列のタンパク質を発現する、配列番号:1で示される配列に配列番号:2でXaaとして示されている270位においてリシンに変換するように、部位特異的突然変異誘発を上記の通りに且つClontechの指示に従って行った。
Kmの測定を実施例1で説明した通りに行い、一方、熱不活性化の研究を溶解緩衝液(25mMトリス−リン酸、pH 7.8、2mM DTT、2mM EDTA、10%グリセロール、及び、1% Triton X−100)中で37℃で粗抽出物を使用して行い、様々な時点で、酵素のアリコートを取り出し、上記の通りに検定した(530μM ATPを使用)。残留活性を時間経過に応じてプロットした。
この例の二重改変である601G1Kに関するKm値が、25.2μM(標準誤差1.5)であることを見い出し、この値も、対応する354リシン突然変異体と野生型ルシフェラーゼのKm値の1/2よりも小さかった。
連続加熱時にルシフェラーゼの活性がその初期値の50%に減少するのに要する時間であるt1/2値が、次の値であることが判明した。
60la (組換え野生型) 7.0分後にt1/2に達した。
60laGl(270Km改変) 1.75分後にt1/2に達した。
60laK (354熱安定性改変)35分よりも長い時間が経過した後にt1/2に達した。
60laGlK (270+354改変) 10.5分後にt1/2に達した。
上記データは、Km値と共に次のリスト(他のデータに加えて)に含まれる。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人:SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE
(ii)発明の名称:ルシフェラーゼ
(iii)配列数:5
(iv)通信住所:
(A)受信人:THE SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE
(B)通り:WHITEHALL
(C)市:LONDON
(D)州:LONDON
(E)国:英国(GB)
(F)ZIP:SW1A 2HB
(v)コンピュータ読み取り可能形式:
(A)メディアタイプ:フロッピーディスク
(B)コンピュータ:IBM PC互換
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:PatentIn Release #1.0,Version #1.30
(vi)現在出願データ:
(A)出願番号:WO
(B)出願日:
(C)分類:
(2)配列番号:1に関する情報:
(i)配列の特質:
(A)配列の長さ:1722
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:cDNA to mRNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチセンス:No
(vi)起源:
(A)生物:Photinus pyralis
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:4..1653
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:misc_difference
(B)存在位置:replace(811..813,″″)
(xi)配列:配列番号:1
(2)配列番号:2に関する情報:
(i)配列の特質:
(A)配列の長さ:550
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(iii)ハイポセティカル配列:No
(vi)起源:
(A)生物:Photinus pyralis
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:Modified−site
(B)存在位置:270
(xi)配列:配列番号:2
(2)配列番号:3に関する情報:
(i)配列の特質:
(A)配列の長さ:30
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル配列:No
(vi)起源:
(A)生物:Photinus pyralis
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:misc_difference
(B)存在位置:replace(10,″″)
(xi)配列:配列番号:3
(2)配列番号:4に関する情報:
(i)配列の特質:
(A)配列の長さ:550
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(iii)ハイポセティカル配列:No
(vi)起源:
(A)生物:Photinus pyralis
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:Modified−site
(B)存在位置:354
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:Modified−site
(B)存在位置:270
(xi)配列:配列番号:4
(2)配列番号:5に関する情報:
(i)配列の特質:
(A)配列の長さ:22
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:cDNA to mRNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(vi)起源:
(A)生物:Photinus pyralis
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:misc_difference
(B)存在位置:replace(10,″″)
(xi)配列:配列番号:5
Claims (22)
- ルシフェラーゼ活性を有し、かつ配列番号2で表されるアミノ酸配列の残基270のXaaがグルタメートであるPhotinus pyralisの野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列からなるPhotinus pyralisの変異ルシフェラーゼタンパク質であって、該変異タンパク質は配列番号2で表されるアミノ酸配列の残基270がグルタメート以外のアミノ酸であって、ATPに対するミカエリス−メンテン定数(Km)が対応する野生型の配列を有するタンパク質に比べて減少していることを特徴とするPhotinus pyralisの変異ルシフェラーゼタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号2で表されるアミノ酸配列の残基270に相当するアミノ酸残基がXであるように、アミノ酸配列:F(1)XE(2)FLを有することを特徴とし、配列中の(1)がD又はEであり、(2)がT又はLであり、且つ、Xがグルタメート以外のアミノ酸残基である、アミノ酸配列からなるタンパク質。
- 前記アミノ酸残基Xがリシンであることを特徴とする請求項2に記載のタンパク質。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列の残基215に相当するアミノ酸残基が疎水性アミノ酸である請求項1から3のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 請求項4に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号2で表されるアミノ酸配列の残基215に相当するアミノ酸残基が、イソロイシン、ロイシン、又はバリンである、アミノ酸配列からなるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号2で表されるアミノ酸配列の残基354に相当するアミノ酸残基が、グルタメート以外のアミノ酸である、アミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列の残基354に相当するアミノ酸残基が、リシン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、又はヒスチジンである請求項6に記載のタンパク質。
- アミノ酸配列TPXGDDKPGAを有するタンパク質であって、Xはグルタメート以外のアミノ酸であって、Xは、配列番号2で表されるアミノ酸配列の残基354に相当する請求項6または7に記載のタンパク質。
- アミノ酸残基Xがリシンである請求項8に記載のタンパク質。
- 配列中のXaaがリシンである、配列番号2で記述されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするDNA。
- 配列番号1で記述されるヌクレオチド配列を含む請求項11に記載のDNAであって、配列中の811から813までの3つの塩基Nがグルタメート以外のアミノ酸をコードするコドンを形成するDNA。
- 前記コドンがリシンをコードする請求項12に記載のDNA。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするluc遺伝子を含むベクター。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列の270位のグルタメートをコードするコドンを別のアミノ酸に改変するための部位特異的突然変異誘発によって、野生型又は組換えluc遺伝子を含むベクターを処理することによって得られる請求項14に記載のベクター。
- 前記別のアミノ酸がリシンである請求項15に記載のベクター。
- 発光試薬中に含まれる請求項1から10のいずれか一項に記載のタンパク質を含むことを特徴とするATP測定による検定を行うためのテストキット。
- ルシフェラーゼが請求項1から10のいずれか一項に記載のタンパク質であることを特徴とする、ATP量に関係した量の光を発生させるためにルシフェリンとルシフェラーゼを使用してATPを測定する検定方法。
- 前記検定を30℃から70℃までの温度で行う請求項18に記載の検定方法。
- 前記検定を37℃から60℃までの温度で行う請求項18に記載の検定方法。
- 前記検定を40℃から50℃までの温度で行う請求項18に記載の検定方法。
- 配列番号2で記述されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列中のXaaがアルギニン、グルタミン及びアラニンから選択されるタンパク質。
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