NO322134B1 - Protein med luciferaseaktivitet, DNA, vektor, celle, testkit samt analysemetode. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører nye proteiner med luciferaseaktivitet og DNA og vektorer som koder for deres ekspresjon. Oppfinnelsen vedrører særlig luciferaser med lavere 1^ for substrat ATP enn eksisterende native og rekombinante luciferaser av villtype og endret villtype.

Den foreliggende•oppfinnelse vedrører også en celle som kan uttrykke proteinet.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et testkit for å utføre en analyse gjennom måling av ATP..

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en analysemetode hvori ATP måles ved anvendelse av lueiferin og luciferase for å danne lys hvis kvantitet relaterer til mengden ATP.

Ildflue luciferase katalyserer oksydasjonen av luciferin i nærvær av ATP, Mg<2+> og molekylært oksygen med det resultat at lys dannes. Denne reaksjon har et kvantumutbytte på omtrent 0,88 (se DeLuca & McElroy (1978) og Seliger & McElroy (1960)) og denne, lysemitterende egenskap har ført til anvendelsen derav i luminometri analyser hvor ATP-nivåer måles.

Luciferase oppnås direkte fra ildfluelegemer eller ved ekspresjon fra mikroorganismer som omfatter rekombinant DNA konstrukter som koder for enzymet. Signifikante arter hvorfra enzymet kan oppnås, eller hvorfra DNA som koder for det er avledet, er de japanske GENJI og HEIKE ildfluer Luciola cruciata og Luciola lateralis. den øst-europeiske ildfluen Luciola minarelica. den nord-amerikanske ildfluen (Photinus pyralis) og sankthansormen og den europeiske sankt hansormen Lampyris noctiluca.

Varmestabiliteten til villtype luciferaser og luciferaser av rekombinant type er slik at de taper aktivitet ganske hurtig når de utsettes for temperaturer over omtrent 30°C, særlig over 35°C, og dette gjør enzymet utilstrekkelig når det anvendes ved høye omgivelsestemperaturer. Det er kjent at japansk ildflue luciferase kan varmestabiliseres ved å mutere det i posisjon 217 for å erstatte en treoninrest med en iso-leucinrest (Kajiyama og Nakano (1993) Biochemistry 22.

s.. 13795 til 13799 og EP 524448), idet pH stabilitet og spesifikk aktivitet også økes.

Samtidig patentsøknad GB 9405750.2 omhandler en aminosyre-substitusjon som er istand til å øke térmostabiliteten til bl.a. Photinus pyralis som kan anvendes med endringen i 217 til å gi luciferase som er relativt varmestabil ved 50°C eller høyere.

EP 449621 omhandler modifikasjon av luciferase, f.eks. fra Luciola cruciata. Luciola lateralis og Photinus pyralis. i posisjoner 23 3 (Val-Ile), 239 (Val-Ile), 286 (Ser-Asp), 326 (Gly-Ser), 433 (His-Tyr) og/eller 452 (Pro-Ser). De mutante luciferasene er angitt til å katalysere luciferin for å pro-dusere rødt, oransje eller grønt lys.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en ytterligere forbedring av egenskapene til luciferase-enzymer, noe som gjør dem egnet for anvendelse i analyser som er basert på deteksjon av adenosintrifosfat ved relativt små mengder. Denne forbedring er tilveiebragt ved å forandre aminosyren i posisjonen som svarer til posisjon 2 70 i Photinus pyralis luciferase aminosyresekvensen hvorved Michaelis-Menten konstanten (1^) til enzymet nedsettes sammenlignet med en tilsvarende luciferase med villtype sekvens. Denne svarer til aminosyre 272 i Luciola mingrelica, Luciola cruciata og Luciola lateralis. Denne svarer også til aminosyre 270 i Lampris Noctiluca.

Den foreliggende forbedring tilveiebringer videre luciferaser som er kjennetegnet ved evnen til å oksydere D-lueiferin med lysemisjon av en annen bølgelengde enn den for villtype luciferase, hoe som tillater at de kan anvendes som spesifikke markører i bindingsanalyser hvori bølgelengden til emittert lys er karakteristisk for et spesielt merket materiale som er tilstede, eller tillater at DNA som koder for luciferaser kan anvendes som et rapporterings-DNA for genmanipulerte celler og celler avledet derfra.

I et første aspekt av den foreliggende oppfinnelse er der således tilveiebragt et protein med luciferaseaktivitet og med over 60% homologi i aminosyresekvens med luciferase fra Photinus pyralis. Luciola mingrelica. Luciola cruciata eller Luciola lateralis. og som ér kjennetegnet ved at aminosyreresten som svarer til rest 270 i Photinus pyralis luciferase eller rest 272 i Luciola mingrelica. Luciola cruciata og Luciola lateralis luciferase er en aminosyre annet enn glutamat, slik at Michaelis-Menten konstanten (1^) for proteinet er nedsatt sammenlignet med den tilsvarende villtype-sekvensen.

Proteinet omfatter foretrukket en konservert aminosyresekvens F(1)XE(2)FL hvori (1) er D eller E, (2) er T eller L og X er aminosyren annet enn glutamat, hvori X svarer til rest 270 i Photinus pyralis luciferase eller rest 272 i Luciola mingrelica, Luciola cruciata eller Luciola lateralis luciferase.

F, E, L, D og T relaterer hver til den tilsvarende aminosyren som tilveiebragt ved enbokstav-aminosyrekoden.

Den foretrukne aminosyre X så langt bestemt er lysin, eller en analog eller modifikasjon derav. Andre foretrukne aminosyrer inkluderer arginin, glutamin og alanin.

I ytterligere foretrukne former av oppfinnelsen har proteinet i henhold til oppfinnelsen også aminosyren i posisjonen svarende til aminosyre 217 i Luciola ildflue luciferase eller 215 i Photinus pyralis forandret til en hydrofob aminosyre, foretrukket til isoleucin, leucin eller valin eller en analog av disse og/eller har aminosyren i posisjonen svarende til aminosyre 356 i Luciola ildflue luciferase eller.354 i Photinus pyralis forandret til en aminosyre annet enn glutamat, særlig til lysin, arginin, leucin, isoleucin eller histidin eller analoger eller modifikasjoner av disse.

I et annet aspekt av oppfinnelsen er der tilveiebragt DNA som koder for proteinet i henhold til oppfinnelsen og i et tredje aspekt er der tilveiebragt en vektor, særlig et plasmid, som omfatter et lue gen (genet som koder for luciferase) i en slik form at det er istand til å uttrykke proteinet i henhold til oppfinnelsen. Slike former er dem hvor vektoren inkluderer DNA sekvenser istand til å styre ekspresjonen av proteinet i henhold til oppfinnelsen slik at ved innlemmelse i en mikroorganisme-vertcelle kan proteinet enkelt uttrykkes som ønsket, om nødvendig ved tilsetning av passende indusere.

Lue genene for Photinus pyralis, Luciola mingrelica. Luciola cruciata og Luciola lateralis er alle vel kjente og kan isoleres ved hjelp av standardteknikker innen molekylær biologi. Dette er også tilfellet for Lampris noctiluca. Photinus pyralis lue gen er kommersiélt tilgjengelig fra Promega som plasmidet pGEM-lue. Således er passende metoder og-kilder for å utlede utgangsmaterial for fremstilling av DNA i henhold til oppfinnelsen (i), anvendelse av naturlig forekommende ildflue genom DNA og amplifikasjon av lue genet derfra ved anvendelse av f.eks. PCR, (ii) pGEM og (iii) pGLf3 7 plasmid fra Kajiyama og Nakano. Ytterligere gener som koder for proteiner med luciferaseaktivitet, dvs. aktiviteten med oksydasjon av luciferin med emisjon av lys, vil også være passende kilder for utgangsmateriale for oppnåelse av et DNA, og til sist gjennom genekspresjon, et protein i henhold til

oppfinnelsen.

Passende vektorer for anvendelse for manipulering av villtype eller annet lue gen DNA for å danne DNA i henhold til oppfinnelsen kan være en hvilken som helst vektor hvori DNA kan være inneholdt deri mens endring av det naturlig forekommende glutamat til en alternativ aminosyre gjennomføres. For kjemisk indusert mutagenese, f.eks. ved anvendelse av midler som hydroksylamin, er dette ikke spesielt kritisk og mange passende vektorer vil fremgå for fagkyndige på området og som vil tillate enkel manipulasjon av genet før og etter den mutagene prosess. Det kan være foretrukket å spesifikt mutere lue genet i glutamatet og således vil en seterettet mutagenese-operasjon kreves. Slike operasjoner kan enkelt gjennomføres i vektorer og disse vil også være kjent for fagkyndige på området.

For ekspresjon av lue gener av villtype og. av kjent type, og dem i henhold til oppfinnelsen, omfatter passende vektorer pKK223-3, pDR540 (tilgjengelig fra Boehringer Mannheim) og pT7-7, idet de første to har tac promoteren under kontroll av laktoserepressoren som tillater at ekspresjon induseres ved tilstedeværelsen av isopropyl-tiogalaktosid (IPTG). pT7-7 tillater kontroll ved T7-RNA polymerase promoteren og tilveiebringer således basisen for et svært høyt nivå av genekspresjon i E. coli celler inneholdende T7 RNA polymerase. Av disse vektorer er ekspresjon funnet til å være høyest når lue genene innføres i pT7-7 vektoren.

Ekspresjon av luciferase fra et lue gen innført i pKK233-3 og pDR540 resulterer i ekspresjonen av villtype N-terminal-sekvens luciferase mens ekspresjon fra et lue gen innført i pT7-7 resulterer i syntese av et fusjonsprotein med ekstra N-terminale aminosyrer A-R-I-Q. Ribosom-bindingssetet og startkodonet for lue genet i hver av de respektive vektorer med lue genet tilstede (betegnet strukturer pPW2 04, pPW116 og pPW3 04) er vist i tabell 1 i eksemplene. pPW601a omtalt i det etterfølgende er avledet ved å fjerne det unike Xho I setet pPW116.

Et tredje aspekt av den foreliggende oppfinnelse -tilveiebringer celler som er istand til å uttrykke proteinene i henhold til oppfinnelsen, som omfatter DNA eller en vektor ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen vedrører også et testkit for å utføre en analyse gjennom måling av ATP hvori kitet omfatter et protein ifølge oppfinnelsen inneholdt i et lumine-scerende reagens. Oppfinnelsen vedrører også en analysemetode hvor- ATP måles ved anvendelse av luciferin/luciferase for å danne lys hvis kvantitet relaterer til mengden ATP, og

som er kjennetegnet ved at luciferase er et protein i henhold til oppfinnelsen. Luciferasepreparater i henhold til oppfinnelsen har relativt lav med hensyn til de tilsvarende villtype og rekombinante'luciferaser, og foretrukne lucife-

raser med doble og triple forandringer (dvs. 215, 270, 354 forandret Photinus eller 217, 272, 356 forandret Luciola eller 215, 270, 354 forandret L. noctiluca) har også egen-skapen med relativ termostabilitet ved 30-70°C, særlig 37-60°C og spesielt 40-50°C. Den foreliggende oppfinnelse ér således tilveiebragt til ikke å hindre at térmostabilitets-forhøy-elsene i andre samtidige og tidligere arbeider av de foreliggende oppfinnere og andre, anvendes.'

En hvilken som helst celle istand til å uttrykke heterologt protein ved anvendelse av DNA sekvenser i sitt DNA, eller i vektorer som plasmider inneholdt i cellen, kan anvendes til å uttrykke proteinene i henhold til oppfinnelsen. Typiske eksempler på slike celler vil være gjær og bakterieceller som Saccharomyces cerevisiae og Escherichia coli celler, men en rekke andre vertsorganismer som er egnet for proteinekspre-sjon vil være kjent for fagkyndige på området.

Proteinet kan uttrykkes som et protein med lignende struktur som native og kjente rekombinante luciferaser, eller det kan uttrykkes som en fusjon eller konjugat av slike proteiner med andre aminosyrer, peptider, proteiner eller andre kjemiske entiteter, f.eks. den ovennevnte A-R-I-Q sekvensen.

Det vil vites av fagkyndige på området at bestemte verter kan ha spesielle kodon preferanser, f.eks. anvender bakterier i noen tilfeller andre kodoner enn gjær, og således kan DNA innlemmet i en slik vert fordelaktig være endret til å tilveiebringe et degenerert kodon for en gitt aminosyre som vil gi en mere fordelaktig ekspresjon i denne vert. Slike dege-nererte DNA'er er selvfølgelig inkludert i rammen for DNA i henhold til oppfinnelsen.

E. coli BL21 (DE3) er en passende vert og har T7 RNA polyme-rasen stabilt integrert i sitt kromosom under kontroll, av den induserbare lacUVS promotoren og er således kompatibel med pT7-7 avledede konstrukter.

E. coli B stammer som BL21 mangler lon proteasen og ompT ytre-membran proteasen. Disse mangler kan hjelpe til å stabilisere ekspresjonen og akkumuleringen av fremmede proteiner i E. coli. Analyser av råekstrakter av E. coli BL21 (DE3) inneholdende hver av de tre ekspresjonsstrukturer som beskrevet over indikerte at de høyeste ekspresjonshivåer av luciferase ble oppnådd fra celler som inneholdt strukturen pPW3 04 (se tabell 2). Andre passende cellelinjer, som den av E. coli JM109 cellene anvendt i eksemplene i det etterfølg-ende, vil klart fremgå for fagkyndige på området.

Proteinene, DNA, vektorene og cellene i henhold til oppfinnelsen skal nå beskrives i illustrerende hensikt under hen-visning til de etterfølgende eksempler, figurer, tabeller og sekvensliste. Ytterligere proteiner, konjugater av proteiner, DNA, vektorer og celler og analyser og testkit som innlemmer hvilkén som helst av de ovennevnte vil klart fremgå for fagkyndige på bakgrunn av dette.

Figurer

Fig. l: viser et restriksjonskart av plasmid pPW2 04 avledet fra pKK223-3 ved innskudd av et lue gen som beskrevet i de etterfølgende eksempler. Fig. 2: viser et restriksjonskart av plasmid pPWH6 avledet fra pDR540 ved innskudd av et lue gen som beskrevet i de etterfølgende eksempler. Fig. 3: viser et restriksjonskart av plasmid pPW3 04 avledet fra pT7-7 ved innskudd av et lue gen som beskrevet i de etterfølgende eksempler. Fig. 4: viser et restriksjonskart av plasmid pPW601a avledet fra pDR540 og BamHl/Sstl fragment fra pGEM-luc med Xho setet fjernet. Fig. 5: viser en kurve for varmeinaktivering av rekombinante villtype Photinus luciferaser (Sigma), ^ forandret

luciferase i henhold til oppfinnelsen, den termosta-bile 354 lysinmutanten tilveiebragt ved den samti-. dige GB 9405750.2 og 1^/354 lysin dobbeltmutant en i henhold til oppfinnelsen inkubert ved en gitt tempe-

råtur i 16 min. som beskrevet i de etterfølgende eksempler.

Fig. 6: viser et restriksjonskart for pT7-7 ifølge Tabor.

SEKVENSLISTE

Sekvenslisten tilveiebragt på slutten av denne foreliggende beskrivelse beskriver DNA og aminosyresekvenser som følger: SEQ ID NO:l: viser DNA sekvensen for et DNA som koder for luciferase i henhold til oppfinnelsen hvori Photinus pyralis villtype kodonet i 811 til 813 er mutert, og for lysin er kun basen i 811 mutert til en A. Det er også vist stillingen for innføring av termostabilitet i 1063-65.

SEQ ID NO:2: viser aminosyresekvensen for et protein i henhold til oppfinnelsen hvori Photinus pyralis villtype aminosyre 270 glutamatet er blitt forandret til en rest Xaa annet enn glutamat.

SEQ ID NO:3: viser sekvensen for oligonukleotidet anvendt for SDM mutasjonen av pPW601a til å gi et lysin i stedet for glutamat i stilling 270.

SEQ ID N0:4: viser aminosyresekvensen for et protein i henhold til oppfinnelsen hvori Photinus pyralis villtype aminosyre 270 glutamat er blitt forandret til lysin og 354 aminosyren er blitt forandret til lysin.

SEQ ID NO:5: viser sekvensen for oligonukleotidet anvendt for SDM mutasjonen av pPW60la til å gi et lysin i stedet for glutamat i stilling 354..

EKSEMPLER

Eksempel 1

Fremstilling av plasmider som inneholder DNA i henhold til o<pp>finnelsen

Plasmider pKK223-3 og pDR540 ble oppnådd fra Boehringer Mannheim, pDR54 0 er også tilgjengelig fra Pharmacia Biotech, St Albans, UK. Phagemid pBluescript II SK(+) ble oppnådd fra Stratagene, La Jolla, USA. E. Coli stamme BL21 (DE3) ble anvendt for ekspresjonen av luciferase fra pT7-7 avledede plasmider og E. coli stamme JM109 (4) ble anvendt i alle klo-ningsforsøk og for ekspresjonen av luciferase fra pDR540 avledede plasmider.

Plasmid pT7-7 (se gjeldende protokoller i Molecular Biology Vol II del 16.2.1) ble oppnådd fra Stan Tabor, Dept. of Biol Chem, Harvard Medical School, Boston, Mass. 02115 og (som vist i fig. 6) inneholder T7 RNA polymerase promoter 4>10 og translasjons-startsetet for T7 gen 10 proteinet (T7 bp 22857 til 22972) innskutt mellom PvuII og Clal setene til pT7-5. Unike restriksjonsseter for dannelse av fusjonsproteiner

(etter fylling av 5' ender) er Frame 0:EcoRl, Frame l:NdcI, Smal, Clal, Frame 2:BamHI, Sali, Hindlll. SacI setet av de originale polylinkere er fjernet ved delesjon og et ytterligere Xbal sete er tilveiebragt oppstrøms av startkodonet.

Som angitt i omtalen av figurene, var pPW204 avledet fra pKK223-3, pPW116 var avledet fra pDR540, pPW304 var avledet fra pT7-7, hver ved innskudd av et lue gen avledet fra Promega pGEM- lue ved anvendelse av standard restriksjonsendonuklease og ligeringsteknikker, mens pPW601 var dannet ved kloning av lue genet og BamHl/Sstl fragmentet fra pGEM-Juc inn i pDR540 og pPW601a som avledet ved å fjerne det unike Xho I setet i polylinkeren til plasmidet. pPW601a inneholder et unikt gjenkjennelsessete for Ava I som for-■ enkler SDM prosedyren for luciferase aminosyre 354 forandringer.

For fremstilling av pPW3 04, blir pT7-7 kuttet med EcoRI, endene blir fylt ved anvendelse av Klenow fragment, produktet blir kuttet med Sali og DNA gelen renset, pGEM-Iuc blir kuttet med Barn HI, de utstående ender som dannes blir kuttet med MBN, produktet blir kuttet med Sali og 1 Kb fragmentet som dannes blir renset og ligert til det rensede pT7-7 DNA. Transformasjon av plasmider inn i BMH 71-18 mut S celler ble gjennomført ved anvendelse av en Bio-Rad Gene Pulser versjon 2-89. For fremstilling av pPW601.kloner ble høstede celler og renset, blandet plasmid-pool inneholdende muterte plasmider og foreldreplasmider ble tilveiebragt og sekundær restriksjonskutting med Aval ble gjennomført før transformasjon inn i E. coli JM 109 celler. Disse celler ble utplatet på selektive medier (LB agar + 50 jtg/ml- ampicillin) og kloner ble screenet ved å rense deres plasmid DNA og analysere for ønsket forandring. Plasmid DNA ble renset ved anvendelse av alkalisk lysis (Birnboim & Doly (1979) Nucleic Acids Research 7, s. 1513).

Relative ekspresjonsnivåer for luciferase fra hver av struk-turene pPW2 04, pPW116 og pPW3 04 er 0,1:0,5:1,0 fra E. coli BL21 (DE3). Celler ble dyrket i LB ved 37°C til en OD 600 på 0,3, og deretter indusert med IPTG og dyrkingen fikk fort-sette i 4 timer hvoretter råekstrakten ble fremstilt og luciferaseaktivitet ble målt.

Delvis rensing av luciferaser ble gjennomført på E. coli JM109 celler høstet i den tidlige stasjonære fase og de ble deretter resuspendert i 50 mM Tris HC1 pH 8,0 inneholdende 5 0 mM KC1, 0,5 mM ditiotreitol og 1 mM EDTA (buffer A).

Celler ble nedbrutt ved at de ble revet opp i en MSE soniprep (amplityde 14 fi) og lysatet ble sentrifugert ved 30000 x g i 1 time. Supernatanten av råekstrakten ble deretter under-kastet fraksjonering med ammoniumsulfat og fraksjonen som presipiterte mellom 35% og 55% metning inneholdt luciferaseaktivitet og ble oppløst i buffer A og dialysert over natten

f

mot 500 ml 50 mM Tris-HCl buffer pH 8,0 inneholdende 0,4 mM DTT (buffer B)..

Fullstendig rensing av luciferaser ble gjennomført ved å på-føre det presipiterte og dialyse rte enzym på en Mono Q (HR 10/10) anionbytterkolonne og eluere denne med en lineær gra-dient på 0-200 mM NaCl' i buffer B (strømningstakt 4 ml/min., 2 ml fraksjoner). Toppfraksjoner som inneholdt luciferaseaktivitet ble tilsatt 50% glyserol (volum/volum) og lagret ved.-2 0°C.

Ildflue luciferase (fremstilt fra en krystallinsk suspensjon, Cat No L9009) og koenzym A og ATP ble oppnådd fra Sigma Che-mical Co. Bille-luciferin-kaliumsalt ble oppnådd fra Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA. Celleekstrakter ble fremstilt som beskrevet i Promega technical bulletin No 101. Prøver av E. coli kulturer ble lysert i cellekultur-lysisrea-gens (2 5 mM Tris-fosfat, pH 7,8, 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 10% glyserol, 1% Triton X-100, 2,5 mg/ml BSA, 1,25 mg/ml lysozym)

i 10 min. ved romtemperatur, sentrifugert ved 16000 g i 2

min. og deretter lagret på is før analyse.

Luciferaseaktivitet av cellelinjer ble bestemt ved å måle bioluminescens emittert ved kolonier ved å overføre disse til nylonfiltre (Hybond N, Amersham) og deretter gjennombløte filterne med 0,5 mM luciferin i 100 mM natriumcitratbuffer pH 5,0 (Wood & DeLuca,- (1987) Anal Biochem 161 s. 501-507)

ved romtemperatur. Luciferaseanalyser in vitro ble utført ved 2i°C ved anvendelse av 100 /il analysebuffer (20 mM Tricine pH 7,8 inneholdende 1 mM MgS04, 0,1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 0,27 mM koenzym A, 0,47 mM D-luciferin, 0,53 mM ATP og 1 til 5 ( il prøve) . Den endelige pH til analyseblandingen var 7,-8 og lysmålinger ble gjennomført med et BioOrbit 1250 luminometer eller i mikrotiterplater ved anvendelse av et "labsystems luminoskan RS" plate luminometer.

Protein ble bestemt ved metoden etter Bradford (1976) Anal. Biochem. 72 s. 248-254 ved anvendelse av BSA som standard.

For fremstilling av ikke-spesifikke kjemiske mutasjoner av

DNA, ble plasmider inneholdende lue gener behandlet i henhold til metoden etter Kironde et al (1989) Biochem. J. 259, s. 421-426 ved anvendelse av 0,8 M hydroksylamin, 1 mM EDTA i 0,1 mM natriumfosfat pH 6,0 i 2 timer ved 65°C.

K,,, mutanten ble initialt dannet ved hydroksylamin-indusert mutagenese av lue genet i pPW3 04 for å gi plasmid 304 61 som bærer en enkelt base-forandring i DNA sekvensen ved 811 av SEQ ID NO:l, resulterende i en aminosyre-glutamatforandring til lysin i posisjon 270. Et 1,1 kb DNA fragment (BstE 11/Stu I) ble klonet fra pPW304 og anvendt til å erstatte det tilsvarende fragment i pP601a til å danne pPW60lGl, og således tilveiebringe et lue gen som.koder for luciferase uten de fire ekstra aminosyrer kodet for av pPW304 (M ikke inkludert fra M-A-R-I-Q).

Dette mutageniserte plasmid ble avsaltet på en G60 DNA "grade" Nick kolonne (Pharmacia) etterfulgt av transformasjon inn i E. coli BL21 (DE3). Luciferase uttrykt derfra viste en identisk lav fenotype med den av den opprinnelige mutant.

Dobbeltrådet DNA sékvensering ble utført ved hjelp av dide-oksy-kjedetermineringsmetoden ifølge Sanger et al (1977)

Proe. Nat. Acad. Sei. (USA) 74, 5463-5467 ved anvendelse av [alfa-32P] dATP og elektroforese i 8 M urea (6% vekt/volum) polyakrylamidgeler. Automatisk sekvensering ble også gjen-nomført ved anvendelse av en DNA modell 3 73A automatisert sekvensator (Applied Biosystems).

Analyse for å bestemme K,,, verdien til denne luciferase med hensyn til ATP ble gjennomført ved 21°C med 100 fil analysebuffer (20 mM tricin pH 7,8, inneholdende 1,0 mM MgS04,

0,1 mM EDTA, 33 mM ditiotreitol, 270 /iM koenzym A, 470 pM D-luciferin og 6,25 til 400 [ M ATP) ved anvendelse av et luminometer for.å måle cpm.

K,,, verdien for 601a-rekombinant vi 11 typen ble bestemt til å være 66,1 /iM (s.e. 4,1), for 601aK (termostabil mutant 354 lysin) var den 61,3 (s.e. 4,7) og for 601aGl (270 lysin 3^ forandring) var den 28,7 (s.e. 0,9) noe som viser at 2 70 forandringen mere enn halverer den ATP konsentrasjonen som enzymet er optimalisert for.

Effekten av 270 forandringen på termostabiliteten til luciferase er negativ, idet t1^ 2 aktivitet oppnås etter kun 2 min. sammenlignet med villtype på 7 min., begge ved 37°C, men ved 30°C er imidlertid den spesifikke aktivitet av 270 større enn villtype.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av " dobbel mutant" 270K:354K Photinus pyralis luciferase

For å kompensere den reduserte termostabiliteten til 270 forandrings-luciferasen, ble en luciferase med dobbelforand-ring tilveiebragt ved anvendelse av seterettet mutagenese for å gjennomføre lysinforandringen i 354 til 270-lysin luciferasene som koder for DNA og plasmid beskrevet i eksempel 1.

Dette involverte mutasjon ved anvendelse av spesifikt utfor-mede oligonukleotider for å omdanne pPW601aGl til pPW601a til GlK.

Oligonukleotidet anvendt til å danne 3 54 lysinforandringen ved SDM var CATCCCCCTTGGGTGTAATCAG (SEQ ID NO:5) hvor den understrekede T var mismatchen.

Den seterettede mutagenese som krevdes for å omdanne glutamatet 354 i pPW601aE270K, og hvor påkrevd for direkte syntese av 270 mutant fra pPW601a, til ønskede aminosyrer gjennom-føres ved anvendelse av følgende protokoll med oligonukleotider utformet som påkrevd.

Protokoll for seterettet mutagenese: Valgt plasmid denature-res og anneales med seleksjons- og mutagene oligonukleotider for den ønskede forandring. Den mutante DNA tråd syntetise-res og ligeres og hele den primære restriksjon kuttes med en restriksjonsendonuklease. Oligonukleotidprimere for sekvensering og SDM ble syntetisert ved anvendelse av en Applied Biosystems modell 38OA DNA syntetisator. DNA oligonukleotidprimere ble utformet til å ødelegge enten et unikt Ava I sete innen lue genet eller det unike Seal setet innen genet for p-laktamase, idet tilstedeværelsen av disse seter anvendes til

- å selektere overfor plasmider som ikke hadde gjennomgått

mutagenese. Nøyaktige prosedyrer var som beskrevet i the Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Version 2,0) som selges av Clontech Laboratories Inc (US) katalog nr. K1600-1.

Restriksjonskartet for pPW601 avledet fra pDR540 og det klonede lue gen er vist som fig. 4. Seterettet mutagenese ble gjennomført som beskrevet over og i Clontech instruk-sjonene for å omdanne villtype Photinus lue genet innskutt deri til en sekvens som vist i SEQ ID NO:l med uttrykt protein av aminosyresekvens modifisert i stilling 270 som vist som Xaa i SEQ ID NO:2 til lysin.

Km studier ble gjennomført som beskrevet i eksempel 1 mens varmeinaktiveringsstudier ble gjennomført ved anvendelse av råekstrakter ved 37°C i lysisbuffer (25 mM Tris-fosfat pH 7,8, 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 10% glyserol og 1% Triton X-100) og ved forskjellige tidspunkter ble enzymprøver fjernet og analysert som beskrevet over (med 53 0 [ M ATP). Den gjen-værende aktivitet ble plottet mot tid.

K,,, verdien for 601aGlK, dobbel f orandringen i dette eksempel, ble funnet til å være 25,2 iM (s.e. 1,5) og var igjen mindre enn halvparten av den for den tilsvarende 354 lysinmutant og villtype luciferasen.

fci/2 verdien, tiden hvoretter aktiviteten til luciferasen er

redusert ved kontinuerlig oppvarming til 50% av den initiale

...verdi., hie funnet til å være som følger:

De ovennevnte data er inkludert i det etterfølgende (pluss andre data) sammen med K^, verdier.

Claims (15)

1. Protein med luciferaseaktivitet og med over 60% homologi- i aminosyresekvens med luciferase fra Photinus pyralisrLuciola min<g>relica, Luciola cruciata eller Luciola lateralis. karakterisert ved at aminosyreresten svarende til rest 270 i Photinus pyralis luciferase eller rest 272 i Luciola mingrelica. Luciola cruciata og Luciola lateralis luciferase er en aminosyre annet enn glutamat, slik at Michael is-Menten konstanten (K,,,) for proteinet er nedsatt sammenlignet med den tilsvarende villtype-sekvensen.

2. Protein som angitt i krav 1, som omfatter en aminosyresekvens P{1)XE{2)FL hvori (1) er D eller E, (2) er T eller L og X er aminosyreresten annet enn glutamat, hvori X svarer til rest 270 i Photinus pyralis luciferase eller rest 272 i Luciola mingrelica. Luciola cruciata eller Luciola lateralis luciferase.

3. Protein som angitt i krav 2, hvori aminosyreresten X er lysin.

4. Protein som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 3, hvori aminosyreresten svarende til rest 215 i Photinus pyralis luciferase eller rest 217 i Luciola mingrelica. Luciola cruciata eller Luciola lateralis luciferase er en hydrofob aminosyre.

5. Protein som angitt i krav 4, hvori aminosyreresten svarende til rest 215 i Photinus pyralis luciferase eller rest 217 i mcjpla tnjngreljca,, Luciola cruciata eller Luciola lateralis luciferase er en av isoleucin, leucin eller valin eller en analog av hvilken som helst av-disse.

6. Protein som angitt i ett eller flere av kravene l til 5, hvori aminosyreresten svarende til rest 354 i Photinus pyralis luciferase eller rest 356 i Luciola mingrelica. Luciola cruciata eller Luciola lateralis luciferase er en aminosyre annet enn glutamat.

7. Protein som angitt i krav 6, hvori aminosyreresten svarende til rest 354 i Photinus pyralis luciferase eller rest 356 i Luciola mingrelica. Luciola cruciata eller Luciola lateralis luciferase er en av lysin, arginin, leucin, isoleucin eller histidin eller en analog av hvilken som helst av disse.

8. Protein som angitt i krav 6 eller 7, som omfatter en aminosyresekvens TPXGDDKPGA hvor X er aminosyreresten annet enn glutamat son svarer til rest 354 i Photinus pyralis luciferase eller rest 3 56 i Luciola mingrelica. Luciola cruciata eller Luciola lateralis luciferase.

9. Protein, karakterisert ved at det omfatter en aminosyre sekvens som beskrevet i SEQ ID NO 2 hvor Xaa er valgt fra lysin, arginin, glutamin og alanin.

10. DNA, karakterisert ved at det koder for et protein som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 9.

11. DNA som angitt i krav 10, som omfatter en nukleotid-sekvens som beskrevet i SEQ ID NO:i hvor de tre baser N i 811 til 813 danner et kodon som koder for en aminosyre annet enn glutamat.

12. Vektor, karakterisert ved at den omfatter et lue gen som koder for et protein som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 9.

13. Celle i stand til å uttrykke et protein som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 9, karakterisert ved at den omfatter DNA eller en vektor som angitt i ett eller flere av kravene 10 til 12.

14. Testkit for å utføre en analyse gjennom måling av ATP, karakterisert ved at kitet- omfatter et protein som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 9 inneholdt i et lumineseerende reagens.

15. Analysemetode hvori ATP måles ved anvendelse av luciferin og luciferase for å danne lys hvis kvantitet relaterer til mengden ATP, karakterisert ved at luciferasen er et protein som angitt i ett eller flere av kravene l til 9.