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Luciferasa mutante.
ES2292479T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
David James Squirrell Melenie Jane Murphy Rachel Louise Price Peter John White Tara Louise Willey - Current Assignee
- SECR DEFENCE
- UK Secretary of State for Defence
Worldwide applications
Application ES00971589T events
1999-10-26
2008-03-16
Application granted
2008-03-16
2020-10-26
Anticipated expiration
Status
Expired - Lifetime
Description
translated from
Luciferasa mutante.
La presente invención se refiere a una proteína
nueva, en particular a enzimas luciferasas mutantes que muestran
propiedades características en comparación con la enzima de tipo
natural correspondiente, al ADN que codifica estas proteínas, al
uso de estas enzimas en ensayos y a los equipos de análisis que las
contienen.
La luciferasa de luciérnaga cataliza la
oxidación de luciferina en presencia de ATP, Mg^{2+} y oxígeno
molecular con la producción resultante de luz. Esta reacción tiene
un rendimiento cuántico de alrededor de 0,88. La propiedad de
emisión de luz ha llevado a su uso en una amplia diversidad de
ensayos luminométricos en los que se miden las concentraciones de
ATP. Los ejemplos de tales ensayos incluyen aquellos que se basan en
lo descrito en los documentos
EP-B-680515 y WO 96/02665, pero se
usan muchos otros de forma rutinaria en los laboratorios.
La luciferasa es obtenible directamente de los
cuerpos de los insectos, en particular escarabajos tales como
luciérnagas o gusanos de luz. Las especies particulares a partir de
las cuales se han obtenido luciferasas incluyen las luciérnagas
japonesas GENJI o KEIKE, Luciola cruciata y Luciola
lateralis, la luciérnaga del este de Europa Luciola
mingrelica, la luciérnaga norteamericana Photinus pyralis
y el gusano de luz Lampyris noctiluca.
Sin embargo, ya que se han clonado y secuenciado
muchos de los genes que codifican estas enzimas, también se pueden
producir mediante el uso de la tecnología del ADN recombinante. Las
secuencias de ADN recombinantes que codifican las enzimas se usan
para transformar microorganismos tales como E. coli, que
expresan después el producto enzimático deseado.
El color de la luz emitida por estas enzimas
cuando se usan en ensayos de laboratorio es claramente similar.
Sería útil si se pudiera alterar la longitud de onda para que se
realizase la lectura más fácilmente mediante un detector
específico, o para el uso en sistemas en los que se necesitan
múltiples indicadores, por ejemplo para monitorizar distintos
sucesos en la misma muestra. Una manera de distinguir las moléculas
indicadoras es utilizar moléculas de luciferasa que emitan luz a
longitudes de onda distintas. Esto se puede conseguir mediante el
uso de moléculas indicadoras que comprenden luciferasas derivadas de
diferentes especies de escarabajos o gusanos de luz. Una estrategia
alternativa, sin embargo, es producir luciferasas mutantes mediante
el uso de la tecnología del ADN recombinante, de forma que se
produce una variación en la longitud de onda de la señal. Los
ejemplos de tales mutantes se proporcionan en el documento WO
95/18853.
Además, la termoestabilidad de las luciferasas
de tipo natural y recombinantes hace que pierdan actividad bastante
rápidamente cuando se exponen a temperaturas superiores a 30ºC,
especialmente por encima de 35ºC. Esta inestabilidad provoca
problemas cuando la enzima se usa o se almacena a una temperatura
ambiente elevada, o si el ensayo se efectúa en condiciones de
reacción a temperatura elevada, por ejemplo para incrementar la
velocidad de la reacción.
Se conocen luciferasas mutantes que tienen una
termoestabilidad incrementada a partir de los documentos
EP-A-524448 y WO/95/25798. El
primero de éstos describe una luciferasa mutante que tiene una
mutación en la posición 217 de la luciferasa de luciérnaga
japonesa, en particular mediante la sustitución de un residuo de
treonina con un residuo de isoleucina. El segundo describe
luciferasas mutantes que tienen más de un 60% de similitud respecto
de la luciferasa de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis, pero en las que el residuo
de aminoácido que corresponde al residuo 354 de Photinus
pyralis o 356 de la especie Luciola está mutado de forma
que es distinto de glutamato, y en particular es distinto de
glutamato, aspartato, prolina o glicocola.
La patente británica pendiente junto con la
presente GB 2345913 y la solicitud de patente internacional derivada
de ella, WO0024878, describen adicionalmente tales mutantes. En
este caso, se describen proteínas que tienen actividad luciferasa y
al menos un 60% de similitud respecto de la luciferasa de tipo
natural, tal como la de la enzima de Photinus pyralis, Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis, pero
que incluyen mutaciones en diversas posiciones de la proteína, que
incluyen, entre otras,
(a) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 214 en la luciferasa de Photinus pyralis y al residuo
216 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata
o Luciola lateralis; o
(b) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 232 de laluciferasa de Photinus pyralis y al residuo
234 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata
o Luciola lateralis; o
(c) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 295 en la luciferasa de Photinus pyralis y al residuo
297 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata
o Luciola lateralis.
El documento WO 01/20002 describe el uso de la
evolución dirigida para descubrir luciferasas mutantes que tienen
múltiples mutaciones, que tienen propiedades mejoradas.
Los solicitantes han descubierto que mediante la
mutación (o mediante la introducción) de un aminoácido en una
posición diferente dentro de la proteína luciferasa se pueden
conseguir grandes desplazamientos de la longitud de onda de la luz
emitida, y/o que la enzima tenga una termoestabilidad mejorada.
Además, el flujo de fotones de la luz emitida se puede mejorar, por
lo que se hace que la enzima sea más adecuada para los ensayos
in vivo en los que la cinética luminiscente está impedida, o
para los ensayos in vitro en los que no hay presentes CoA u
otros compuestos "inductores de la cinética luminiscente".
La presente invención proporciona una proteína
recombinante que tiene actividad luciferasa y al menos un 90% de
similitud respecto de una luciferasa de tipo natural de Photinus
pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata o Luciola
lateralis, Hotaria parvula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris
noctiluca, Pyrocoelia miyako, o Phrixothrix
(gusanos de luz, véase Biochem. 38 (1999)
8271-8279), en la que en la secuencia de la enzima
el residuo de aminoácido que corresponde al residuo 357 de la
luciferasa de Photinus pyralis está mutado en comparación
con la luciferasa de tipo natural correspondiente, de forma que la
enzima luciferasa es capaz de emitir luz a una longitud de onda
diferente en comparación con la luciferasa de tipo natural
correspondiente y/o tiene una termoestabilidad incrementada en
comparación con la luciferasa de tipo natural correspondiente, y en
la que la similitud se determina mediante el uso de un algoritmo de
alineación como definieron Lipman y Pearson (1985, Science 227:
1435-1441) con los parámetros ktup = 1, penalización
por hueco = 4 y penalización por longitud de hueco = 12.
Las enzimas bioluminiscentes de especies que
pueden usar el sustrato D-luciferina (ácido
4,5-dihidro-2-[6-hidroxi-2-benzotiazolil]-4-tiazol-carboxílico)
para producir la emisión de luz pueden formar la base de las
enzimas mutantes de la invención.
En particular, las luciferasas son enzimas
obtenibles de la enzima de Photinus pyralis, Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis.
En las enzimas de Luciola mingrelica, Luciola cruciata o
Luciola lateralis, el residuo de aminoácido apropiado está en
la posición 359 de la secuencia.
Las secuencias de las diversas luciferasas
muestran que están sumamente conservadas y que tienen un grado
significativo de similitud entre ellas. Esto significa que las
regiones correspondientes entre las secuencias de las enzimas son
fácilmente determinables mediante el examen de las secuencias para
detectar las regiones más similares. Los aminoácidos
correspondientes se pueden determinar mediante referencia a L. Ye
et al., Biochim. Biophys Acta 1339 (1997)
39-52, que muestra las secuencias de las enzimas
junto con la numeración, cuyo sistema de numeración se usa en la
presente solicitud.
Por lo que se refiere al posible cambio del
residuo de aminoácido correspondiente al residuo 357 en la
luciferasa de Photinus pyralis, la mayoría de las secuencias
de tipo natural tienen un residuo ácido (ácido aspártico o ácido
glutámico) en esta posición. La excepción son algunas formas de la
luciferasa de Photuris pennsylvanica en las que el residuo
correspondiente (356) es un residuo apolar, valina, o algunas formas
de la luciferasa de Phrixothrix en las que la posición
correspondiente es V354 en Pv_{GR} o en Ph_{RE}, en la que es
leucina L355. Así, en general, el aminoácido usado como aminoácido
sustituto en esta posición es distinto de ácido aspártico, ácido
glutámico, valina o leucina.
En la mayoría de los casos, por lo tanto, se
sustituye un residuo de aminoácido ácido con un residuo que no es
ácido, que incluye aminoácidos básicos tales como lisina o arginina,
aminoácidos apolares tales como leucina, valina o isoleucina,
aminoácidos polares sin carga tales como tirosina, asparagina,
glutamina, fenilalanina, serina, triptófano o treonina. En
particular, se puede sustituir con un aminoácido polar sin carga tal
como tirosina, asparagina, serina o treonina. Los residuos de
aminoácidos particularmente preferidos para la sustitución en esta
posición son tirosina, fenilalanina o triptófano, y lo más
preferiblemente tirosina. En general, los residuos aromáticos en
esta posición dan lugar a los mayores desplazamientos y pueden
ayudar también en cuanto a la termoestabilidad.
Cuando las secuencias de tipo natural incluyen
residuos de aminoácidos que no son ácidos en esta posición, éstos se
mutan de forma adecuada por residuos diferentes que no son
ácidos.
Se ha descubierto que mediante la mutación de la
enzima de esta manera se desplaza la longitud de onda de la luz
emitida por la luciferasa, en algunos casos hasta 50 nm hacia el
extremo rojo del espectro. Así, la luciferasa de Photinus
pyralis mutante D357Y emite luz a una longitud de onda de unos
612 nm en comparación con la enzima de tipo natural, que emite luz a
una longitud de onda de 562 nm.
Un desplazamiento de la longitud de onda de 50
nm tiene una capacidad de uso considerable en aplicaciones de
análisis, ya que un desplazamiento de esta magnitud se puede definir
fácilmente en el espectro. Las luciferasas con diferentes colores
se podrían emplear como moléculas indicadoras en estudios de
expresión génica, lo que permitiría la monitorización simultánea de
más de un gen, por ejemplo como se describe en el documento WO
95/18853. También se podrían realizar análisis de analitos múltiples
con luciferasas como marcadores.
El hecho de que la luz en este caso sea de un
color rojo intenso es particularmente útil en la metodología de
ensayo. Un mutante rojo podría ser útil cuando se analiza el ATP en
una disolución que contuviera pigmentos u otros compuestos que
podrían absorber luz de longitudes de onda más cortas. Por ejemplo,
una disolución de color rojo no absorbería la luz roja. Los
ejemplos de disoluciones de color rojo que son objeto frecuentemente
de tales análisis incluyen las muestras de sangre, o una disolución
de medio de cultivo de células eucarióticas que puede contener un
indicador de pH de color rojo.
Cuando se usa una mezcla de agentes
colorimétricos tales como luciferasas, la capacidad de generar una
señal roja intensa puede ser útil, en particular cuando otro agente
de la muestra genera una señal verde. Se puede ajustar un tubo
fotomultiplicador usado en el análisis espectral con fotocátodo para
detectar uno o ambos máximos generados en una única muestra. En
otras palabras, es posible distinguir entre el flujo de fotones de
un emisor rojo y uno verde en la misma muestra.
Además, se ha descubierto que el desplazamiento
de la longitud de onda se puede ver afectado por la presencia del
cofactor coenzima A (CoA). Esta característica da lugar a la
posibilidad de que esta enzima se pueda usar en un ensayo para
determinar el cofactor.
Como se describe más adelante, se investigó el
efecto del cofactor coenzima A sobre el espectro in vitro de
la luz emitida. A medida que se incrementa la concentración de
coenzima A se altera la distribución espectral, y a las
concentraciones más elevadas de CoA el espectro está dominado por
longitudes de onda en la región de 590-630 nm, con
un máximo pronunciado a 610 nm.
Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la
invención, se proporciona un ensayo para determinar la presencia de
CoA en una muestra, cuyo ensayo comprende añadir luciferasa a una
muestra que se sospecha que contiene CoA como se describió
anteriormente junto con otros reactivos que son necesarios para
provocar una reacción luciferasa/luciferina, medir la longitud de
onda de la luz emitida por la muestra y relacionar esto con la
presencia o ausencia de CoA.
Tal ensayo puede ser útil en la detección del
estado de crecimiento o actividad de las células, por ejemplo
microorganismos o células eucarióticas.
Por ejemplo, la concentración de CoA en E.
coli es relativamente elevada, y varía considerablemente con el
estado metabólico. Las enzimas mutantes de la invención se pueden
usar para monitorizar el estado metabólico de un organismo, en
particular la concentración in vivo de CoA, ya que la
longitud de onda de la emisión varía dependiendo de la
concentración de CoA. Tales ensayos pueden ser particularmente
útiles en situaciones en las que CoA es un metabolito primario
importante en la producción de antibióticos (p. ej. en
estreptomicetos). Las concentraciones celulares de CoA son también
un indicador importante de la biosíntesis de ácidos grasos, y
varían con el estado de privación de nutrientes de la célula. Varios
trastornos metabólicos, tales como carcinogénesis y diabetes,
muestran anormalidades en los metabolitos de los ácidos grasos, y
por lo tanto concentraciones anormales de CoA. Los ensayos de la
invención se pueden usar en el diagnóstico de tales enfermedades.
Por ejemplo, las concentraciones de CoA de una muestra celular, tal
como una muestra de sangre de un paciente, se pueden determinar
midiendo la longitud de onda de la luz emitida por una luciferasa de
la invención usada en el ensayo. Este resultado se puede comparar
con el obtenido de una muestra de células sanas para determinar si
la longitud de onda ha cambiado, y así hay presente una
concentración modificada de CoA. Esto puede ser indicativo de un
estado de enfermedad en el paciente. Las células se lisan de forma
adecuada antes del ensayo mediante el uso de un agente lítico
conocido.
Se cree que el residuo de aminoácido de la
posición 357 está asociado de forma crucial con el sitio de unión
de la coenzima A. Cuando se determinó la superficie de la enzima
luciferasa (mediante el uso del soporte informático de modelado de
proteínas SYBL, Tripos Ltd.) a una resolución de 1 Angstrom
(\ring{A}), se observó un bolsillo polar pequeño. Este bolsillo
parece estar recubierto por los residuos H310, E354 y D357, y mide
8-10 \ring{A}. Cuando se observa desde lo alto de
la molécula, este bolsillo parece ser parte de un bolsillo mayor,
recubierto por los residuos H310, E354, D357 e I232. Los residuos
H310 y E354 parecen formar un puente a través de la hendidura, lo
que da una apariencia de dos bolsillos más pequeños (véase la Figura
8).
Sin limitarse por la teoría, parece posible que
los residuos del puente sean lo suficientemente flexibles para
separarse cuando la enzima está en disolución para proporcionar un
bolsillo mayor (\sim12 \ring{A} de profundidad y \sim8
\ring{A} de ancho), lo que permite la unión de CoA. Esto concuerda
con los cálculos de energía.
Cuando las células de E. coli que
expresan los mutantes de luciferasa de luciérnaga de la invención se
cultivaron con fuentes de carbono diferentes, se observaron cambios
en el espectro in vivo de la luz emitida. El cambio de un
medio rico (LB) a un medio mínimo definido con acetato o glucosa
como la única fuente de carbono dio como resultado desplazamientos
hacia longitudes de onda más largas de la luz emitida y una
reducción de la contribución de las longitudes de onda más cortas.
Esto puede proporcionar un medio adicional para controlar la
longitud de onda de la luz emitida para los ensayos.
Se ha descubierto que la mutación de la posición
357 de la proteína da como resultado una termoestabilidad
incrementada.
Las proteínas pueden contener mutaciones
adicionales en la secuencia, con tal de que la actividad luciferasa
de la proteína no se vea comprometida excesivamente. Las mutaciones
incrementan de forma adecuada las propiedades de la enzima, o la
hacen más adecuada de alguna manera para el fin deseado. Esto puede
significar que den como resultado unas propiedades incrementadas de
termoestabilidad y/o de desplazamiento del color, y/o de la K_{m}
de las enzimas por el ATP. Los ejemplos de mutaciones que dan lugar
a desplazamientos del color se describen en el documento
WO95/18853. Las mutaciones que afectan a los valores de K_{m} se
describen, por ejemplo, en el documento WO 96/22376 y en la
solicitud de patente internacional nº WO9846729.
En general, se ha descubierto que los efectos de
las mutaciones son aditivos en cuanto a las alteraciones de las
propiedades.
Las luciferasas mutantes de la invención pueden
incluir otras mutaciones específicas que incrementan la
termoestabilidad en comparación con la luciferasa de tipo natural.
En particular, al menos uno de
(a) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 354 de la luciferasa de Photinus pyralis (356 en
luciferasa de Luciola) está mutado;
(b) el residuo de aminoácido que corresponde a
la posición 215 en la luciferasa de Photinus pyralis (217 en
la luciferasa de Luciola) es un aminoácido hidrofóbico
diferente; o
(c) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 214 en la luciferasa de Photinus pyralis o al residuo
216 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata
o Luciola lateralis;
(d) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 232 en la luciferasa de Photinus pyralis o al residuo
234 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata
o Luciola lateralis;
(e) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 295 en la luciferasa de Photinus pyralis o al residuo
297 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata
o Luciola lateralis;
(f) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 14 de la luciferasa de Photinus pyralis o al
residuo 16 de la luciferasa de Luciola mingrelica, o 17 en
Luciola cruciata o Luciola lateralis;
(g) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 35 de la luciferasa de Photinus pyralis o al
residuo 37 de Luciola mingrelica, o al residuo 38 de
Luciola cruciata o Luciola lateralis;
(h) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 105 de la luciferasa de Photinus
pyralis o al residuo 106 de Luciola mingrelica, 107 de
Luciola cruciata o Luciola lateralis;
(i) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 234 de la luciferasa de Photinus
pyralis o al residuo 236 de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis;
(j) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 420 de la luciferasa de Photinus
pyralis o al residuo 422 de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis;
(k) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 310 de la luciferasa de Photinus
pyralis o al residuo 312 de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis;
es diferente del aminoácido que
aparece en la secuencia de tipo natural correspondiente, y en el que
la enzima luciferasa tiene una termoestabilidad incrementada en
comparación con una enzima que tiene el aminoácido de la luciferasa
de tipo natural correspondiente en esta
posición.
\vskip1.000000\baselineskip
Así, los ejemplos preferidos de las proteínas de
la invención son luciferasas de tipo natural mutadas en las que más
de un aminoácido, por ejemplo hasta 100 residuos de aminoácidos,
preferiblemente no más de 40 aminoácidos, y más preferiblemente
hasta 30 aminoácidos, son diferentes del aminoácido de la posición
correspondiente en la enzima de tipo natural apropiada.
Así, en una realización preferida, la proteína
de la invención comprende luciferasa de Photinus pyralis, en
la que, además de la mutación en la posición 357 como se describió
anteriormente, al menos uno de
(a) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 354 de la luciferasa de Photinus pyralis es
distinto de glutamato;
(b) el residuo de aminoácido que corresponde a
la posición 215 en la luciferasa de Photinus pyralis es un
aminoácido hidrofóbico distinto de alanina;
(c) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 214 en la luciferasa de Photinus pyralis es distinto
de treonina;
(d) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 232 en la luciferasa de Photinus pyralis es distinto
de isoleucina;
(e) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 295 en la luciferasa de Photinus pyralis es distinto
de fenilalanina;
\newpage
(f) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 14 de la luciferasa de Photinus pyralis es
distinto de fenilalanina;
(g) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 35 de la luciferasa de Photinus pyralis es
distinto de leucina;
(h) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 105 de la luciferasa de Photinus
pyralis es distinto de alanina;
(i) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 234 de la luciferasa de Photinus
pyralis es distinto de ácido aspártico;
(j) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 420 de la luciferasa de Photinus
pyralis es distinto de serina;
(k) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 310 de la luciferasa de Photinus
pyralis es distinto de histidina.
\vskip1.000000\baselineskip
De forma alternativa, la proteína de la
invención comprende una proteína con la secuencia de luciferasa de
la enzima de Luciola mingrelica, Luciola cruciata o
Luciola lateralis, y en la que, además de la mutación en la
posición 359 descrita anteriormente, al menos uno de
(a) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 356 de la luciferasa de Photinus pyralis es
distinto de glutamato;
(b) el residuo de aminoácido que corresponde a
la posición 215 en la luciferasa de Photinus pyralis es un
aminoácido hidrofóbico distinto de alanina o treonina;
(c) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 216 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis es distinto de glicocola
(para las secuencias basadas en Luciola mingrelica) o
asparagina (para las secuencias basadas en Luciola cruciata o
Luciola lateralis);
(d) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 234 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis es distinto de serina;
(e) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 297 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis es distinto de leucina;
(f) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 16 de Luciola mingrelica, o al aminoácido 17 de
Luciola cruciata o Luciola lateralis es distinto de
fenilalanina;
(g) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 37 de Luciola mingrelica, o 38 en Luciola
cruciata o Luciola lateralis es distinto de lisina;
(h) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 106 de Luciola mingrelica, o al residuo
de aminoácido 107 de Luciola cruciata o Luciola
lateralis es distinto de glicocola;
(i) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 236 de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis es distinto de
glicocola;
(j) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 422 de Luciola mingrelica, Luciola cruciata o
Luciola lateralis es distinto de treonina;
(k) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 312 de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis es distinto de treonina
(para las secuencias basadas en Luciola mingrelica) o valina
(para las secuencias basadas en Luciola cruciata o Luciola
lateralis).
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En cualquier caso, los aminoácidos sustituidos
particulares que dan lugar a una termoestabilidad incrementada se
pueden determinar mediante métodos rutinarios como se ilustra más
adelante. En cada caso, las diferentes sustituciones pueden dar
como resultado una termoestabilidad incrementada. La sustitución se
puede llevar a cabo mediante mutagénesis dirigida del ADN que
codifica las proteínas nativas o mutantes adecuadas, como
entendería el experto. La invención, en este caso, está asociada con
la identificación de las posiciones que están asociadas con la
termoestabilidad.
En general, sin embargo, puede ser deseable
considerar la sustitución con un aminoácido de propiedades
diferentes por el aminoácido de tipo natural. Así, se pueden
sustituir preferiblemente en algunos casos los residuos de
aminoácidos hidrofílicos con residuos de aminoácidos hidrofóbicos y
viceversa. De forma similar, los residuos de aminoácidos ácidos se
pueden sustituir con residuos básicos.
Por ejemplo, la proteína puede comprender una
proteína que tiene actividad luciferasa y al menos un 60% de
similitud con la enzima luciferasa de Photinus pyralis, Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis, en la
que la secuencia de la enzima, en al menos uno de
(a) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 214 en la luciferasa de Photinus pyralis y al
residuo 216 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis está mutado y es distinto de
treonina en el caso de la luciferasa de Photinus pyralis;
o
(b) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 232 en la luciferasa de Photinus pyralis y al
residuo 234 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis está mutado y es distinto de
isoleucina en el caso de la luciferasa de Photinus pyralis;
o
(c) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 295 en la luciferasa de Photinus pyralis y al
residuo 297 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis está mutado y es, por
ejemplo, distinto de fenilalanina en el caso de la luciferasa de
Photinus pyralis;
y la enzima luciferasa tiene una
termoestabilidad incrementada en comparación con la luciferasa de
tipo
natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Con respecto al posible cambio del residuo de
aminoácido que corresponde al residuo 214 en la luciferasa de
Photinus pyralis, el aminoácido polar treonina se sustituye
de forma adecuada con un aminoácido apolar tal como alanina,
glicocola, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,
metionina, triptófano o cisteína. Una sustitución particularmente
preferida para el residuo de treonina que corresponde al residuo 214
en Photinus pyralis es alanina. Una sustitución más
preferida es cisteína. Sin embargo, los residuos polares diferentes
en esta posición, tales como asparagina, pueden incrementar también
la termoestabilidad de la enzima correspondiente que tiene treonina
en esta posición. Otros aminoácidos que aparecen en esta posición en
las enzimas luciferasas de tipo natural incluyen glicocola
(Luciola mingrelica, Hotaria parvula), asparagina
(Pyrophorus plagiophthalamus, GR, YG, YE y OR, Luciola
cruciata, Luciola lateralis, Lampyris noctiluca, Pyrocelia miyako,
Photuris pennsylvanica LY, KW, J19) y serina
(Phrixothix). Estos se pueden sustituir de forma ventajosa
con cadenas laterales apolares o cadenas laterales apolares
diferentes, tales como alanina y cisteína.
Por lo que respecta al posible cambio del
residuo de aminoácido que corresponde al residuo 232 en la
luciferasa de Photinus pyralis, el aminoácido apolar
isoleucina se sustituye de forma adecuada con un aminoácido apolar
diferente tal como alanina, glicocola, valina, leucina, prolina,
fenilalanina, metionina, triptófano o cisteína. Otros aminoácidos
que aparecen en esta posición en las secuencias de tipo natural
incluyen serina y asparagina. De forma adecuada, estos residuos
polares se sustituyen por residuos apolares tales como los
resumidos anteriormente. Una sustitución particularmente preferida
para el residuo que corresponde al residuo 232 en la luciferasa de
Photinus pyralis y al residuo 234 de la luciferasa de
Luciola mingrelica, Luciola cruciata o Luciola
lateralis es alanina.
Los cambios en el residuo de aminoácido que
corresponde al residuo 295 en la luciferasa de Photinus
pyralis y al residuo 297 de la luciferasa de Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis pueden
afectar también a la termoestabilidad de la proteína (esto
corresponde a la posición 292 en la luciferasa de Phrixothix). En
general, el aminoácido en esta posición es un aminoácido apolar de
fenilalanina o leucina. Estos se cambian de forma adecuada por
aminoácidos apolares diferentes. Por ejemplo, en Photinus
pyralis, el aminoácido apolar fenilalanina se sustituye de
forma adecuada con un aminoácido apolar diferente, tal como
alanina, leucina, glicocola, valina, isoleucina, prolina, metionina,
triptófano o cisteína. Una sustitución particularmente preferida
para el residuo de fenilalanina que corresponde al residuo 214 en la
luciferasa de Photinus pyralis es leucina.
También es posible la mutación en el residuo de
aminoácido que corresponde al aminoácido 14 de la luciferasa de
Photinus pyralis o al aminoácido 16 ó 17 en la luciferasa de
Luciola (13 en la luciferasa de Phrixothrix). Este
residuo de aminoácido (que normalmente es fenilalanina, pero puede
ser también leucina, serina, arginina o en algunos casos tirosina)
se cambia de forma adecuada por un aminoácido diferente, en
particular por un aminoácido apolar diferente tal como alanina,
valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina o triptófano,
preferiblemente alanina.
También puede ser eficaz la mutación en el
residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 35 de la
luciferasa de Photinus pyralis o al residuo de aminoácido 37
en la luciferasa de Luciola mingrelica (38 en otras especies
de Luciola). Este aminoácido varía entre las enzimas de tipo
natural, que pueden incluir leucina (Photinus pyralis) pero
también lisina, histidina, glicocola, alanina, glutamina y ácido
aspártico en esta posición. De forma adecuada, el residuo de
aminoácido en esta posición se sustituye con un residuo de
aminoácido apolar o un aminoácido apolar diferente tal como alanina,
valina, fenilalanina, isoleucina, prolina, metionina o triptófano.
Un aminoácido preferido en esta posición es alanina, cuando es
diferente del de la enzima de tipo natural.
Las mutaciones en el aminoácido que corresponde
a la posición 14 de la secuencia de Photinus pyralis y/o la
mutación en el residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido
35 de la luciferasa de Photinus pyralis preferiblemente no
son las únicas mutaciones de la enzima. Van acompañadas de forma
adecuada por otras de las mutaciones definidas anteriormente, en
particular aquellas en las posiciones que corresponden a las
posiciones 214, 395 ó 232 de la luciferasa de Photinus
pyralis.
Los cambios del residuo de aminoácido que
corresponde al residuo 105 en la luciferasa de Photinus
pyralis y al residuo 106 de Luciola mingrelica, o al
residuo 107 de la luciferasa de Luciola cruciata o
Luciola lateralis (102 en Phrixothrix), pueden afectar
también a la termoestabilidad de la proteína. En general, el
aminoácido en esta posición es un aminoácido apolar de alanina o
glicocola, o serina en Phrixothrix. Estos se cambian de
forma adecuada por aminoácidos apolares diferentes. Por ejemplo, en
Photinus pyralis, el aminoácido apolar alanina se sustituye
de forma adecuada con un aminoácido apolar diferente, tal como
fenilalanina, leucina, glicocola, valina, isoleucina, prolina,
metionina o triptófano. Una sustitución particularmente preferida
para el residuo de alanina que corresponde al residuo 105 en la
luciferasa de Photinus pyralis es valina.
Los cambios del residuo de aminoácido que
corresponde al residuo 234 en la luciferasa de Photinus
pyralis y al residuo 236 de la luciferasa de Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis (231 en
Phrixothrix), pueden afectar también a la termoestabilidad de
la proteína. En general, el aminoácido en esta posición es ácido
aspártico o glicocola y, en algunos casos, glutamina o treonina.
Estos se cambian de forma adecuada por aminoácidos apolares o
aminoácidos apolares diferentes, según sea apropiado. Por ejemplo,
en Photinus pyralis, el residuo de aminoácido ácido aspártico
se sustituye de forma adecuada con un aminoácido apolar, tal como
alanina, leucina, glicocola, valina, isoleucina, prolina, metionina
o triptófano. Una sustitución particularmente preferida para el
residuo de fenilalanina que corresponde al residuo 234 en la
luciferasa de Photinus pyralis es glicocola. Cuando hay
presente un residuo de aminoácido apolar tal como glicocola en esta
posición (por ejemplo en la luciferasa de Luciola), éste se
puede sustituir con un aminoácido apolar diferente.
Los cambios del residuo de aminoácido que
corresponde al residuo 420 en la luciferasa de Photinus
pyralis y al residuo 422 de la luciferasa de Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis (417 en
verde de Phrixothrix y 418 en rojo de Phrixothrix),
pueden afectar también a la termoestabilidad de la proteína. En
general, el aminoácido en esta posición es un aminoácido polar sin
carga de serina o treonina, o glicocola. Estos se cambian de forma
adecuada por aminoácidos polares sin carga diferentes. Por ejemplo,
en Photinus pyralis, la serina se puede sustituir con
asparagina, glutamina, treonina o tirosina, y en particular
treonina.
Los cambios del residuo de aminoácido que
corresponde al residuo 310 en la luciferasa de Photinus
pyralis y al residuo 312 de la luciferasa de Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis pueden
afectar también a la termoestabilidad de la proteína. El residuo de
aminoácido en esta posición varía entre las proteínas luciferasas
conocidas, y es histidina en la luciferasa de Photinus pyralis,
Pyrocelia miyako, Lampyris noctiluca y en algunas formas de
luciferasa de Photuris pennsylvanica, treonina en la
luciferasa de Luciola mingrelica, Hotaria parvula y
Phrixothix (en las que es el aminoácido 307), valina en
Luciola cruciata y Luciola lateralis, y asparagina en
alguna luciferasa de Pyrophorus plagiophthalamus. Así, en
general, el aminoácido en esta posición es un aminoácido hidrofílico
que se puede cambiar por un residuo de aminoácido diferente que
incrementa la termoestabilidad de la enzima. Una sustitución
particularmente preferida para el residuo de histidina que
corresponde al residuo 310 en la luciferasa de Photinus
pyralis es arginina.
Puede haber presentes otras mutaciones en la
enzima. Por ejemplo, en una realización preferida, la proteína
tiene también el aminoácido de la posición que corresponde al
aminoácido 354 de la luciferasa de Photinus pyralis (356 en
la luciferasa de Luciola) cambiado de glutamato, en
particular por un aminoácido distinto de glicocola, prolina o ácido
aspártico. De forma adecuada, el aminoácido en esta posición es
triptófano, valina, leucina, isoleucina y asparagina, pero lo más
preferiblemente es lisina o arginina. Esta mutación se describe en
el documento WO 95/25798. Se ha descubierto que los residuos
hidrofóbicos en esta posición incrementan el desplazamiento de la
longitud de onda de la enzima. Además, la presencia de un aminoácido
grande hidrofóbico (V o I), polar (N) o cargado positivamente (K o
R) en la posición 354 incrementa la termoestabilidad.
En una realización preferida alternativa, la
proteína tiene también el aminoácido de la posición que corresponde
al aminoácido 217 en la luciferasa de Luciola (215 en
Photinus pyralis) cambiado por un aminoácido hidrofóbico, en
particular por isoleucina, leucina o valina, como se describe en el
documento EP-A-052448.
Las proteínas de la invención son enzimas
luciferasas recombinantes. Pueden tener al menos un 90% de similitud
respecto de las secuencias naturales, tales como las de la enzima
de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata o
Luciola lateralis en el sentido de que al menos un 90% de los
aminoácidos presentes en las enzimas de tipo natural están
presentes en las proteínas de la invención. Las proteínas similares
que son de este tipo incluyen las variantes alélicas, las proteínas
de otras especies de insectos, así como las enzimas producidas de
forma recombinante. Se pueden identificar fácilmente ya que están
codificadas por ácidos nucleicos que hibridan con las secuencias
que codifican las enzimas de tipo natural en condiciones de
hibridación rigurosas. Una persona experta en la técnica entendería
bien tales condiciones, y se ejemplifican, por ejemplo, en Sambrook
et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press. En términos generales, las condiciones de
rigurosidad baja se pueden definir como 3 x SCC a alrededor de la
temperatura ambiente hasta alrededor de 65ºC, y las condiciones de
rigurosidad elevada como 0,1 x SSC a alrededor de 65ºC. SSC es el
nombre de un tampón de NaCl 0,15 M, citrato trisódico 0,015 M. 3 x
SSC está tres veces más concentrado que SSC, y así
sucesivamente.
\newpage
En concreto, la similitud de una secuencia
particular respecto de las secuencias de la invención se puede
determinar mediante el uso del método de alineación múltiple
descrito por Lipman y Pearson, (Lipman, D.J. y Pearson, W.R. (1985)
Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, vol. 227,
págs 1435-1441). La puntuación en porcentaje
"optimizada" se debería calcular con los siguientes parámetros
para el algoritmo de Lipman-Pearson: ktup =1,
penalización por hueco =4 y penalización por longitud de hueco =12.
Las secuencias para las que se va a determinar la similitud se
deberían usar como la "secuencia de análisis", lo que significa
que la secuencia base para la comparación, tal como la secuencia de
Photinus pyralis o cualquiera de las otras secuencias
informadas en Ye et al., anteriormente mencionado, se
deberían introducir primero en el algoritmo.
Los ejemplos particulares de las proteínas de la
invención son la secuencia de luciferasa de tipo natural con una o
más de las mutaciones resumidas anteriormente.
La invención proporciona además ácidos nucleicos
que codifican las luciferasas descritas anteriormente. De forma
adecuada, los ácidos nucleicos se basan en las secuencias de tipo
natural que se conocen bien en la técnica. La mutación adecuada
para llevar a cabo la mutación deseada en la secuencia de
aminoácidos sería claramente evidente, basándose en el conocimiento
del código genético.
En una realización preferida de la invención, el
ácido nucleico es un gen sintético. De forma adecuada, el gen
sintético se modifica para eliminar los codones que se hallan
raramente en los genes sumamente expresados de los hospedadores de
expresión habituales tales como E. coli y, al mismo tiempo,
se evita la introducción de codones hallados raramente en los genes
que codifican las luciferasas de escarabajos. Esta aproximación
asegura que el nuevo gen tenga una utilización de los codones que es
óptima para los sistemas de expresión tanto de E. coli como
de
insectos.
insectos.
Por ejemplo, cuando fue posible, los codones de
los aminoácidos arg, leu, ile, gly y pro se cambiaron a CGT o CGC
(arg), CTG, CTT o CTC (leu), ATC o ATT (ile), GGT o GGC (gly), y
CCG, CCA o CCT (pro), por lo que se eliminan así los codones poco
frecuentes. En el caso del gen sintético ilustrado más adelante (ID
SEC Nº 1) y en la Figura 14, esto dio como resultado un total de
139 mutaciones sinónimas que crearon 62 codones frecuentes nuevos
(11% del total). Los primeros 8 nucleótidos mostrados en la Figura
14 forman parte del sitio de unión al ribosoma, y así no son
codificantes. La secuencia codificante comienza con el residuo de
metionina indicado mediante una flecha hacia arriba. Esta secuencia
codificante y las secuencias muy similares, por ejemplo las
secuencias que tienen al menos un 90% de similitud o preferiblemente
al menos un 95% de similitud, forman un aspecto preferido de
la
invención.
invención.
Otra característica útil que se puede emplear
cuando se produce una construcción sintética es la incorporación de
sitios de restricción nuevos únicos. Estos sitios hacen la
mutagénesis del gen, en particular la mutagénesis mediante casete
combinatorio, más simple y más eficaz. En particular, puede ser
deseable crear sitios de restricción únicos en el cADN que codifica
el subdominio B de la enzima. Además, puede ser ventajosa la
creación de un sitio de restricción único en el extremo 3' del gen
para permitir fusiones simples y/o para la eliminación de la
secuencia de reconocimiento del peroxisoma.
En el ejemplo ilustrado más adelante, se
construyeron nueve sitios de restricción nuevos únicos, en su
mayoría en el tercio central del gen, y se generó un único sitio
Hind III en el extremo 3' del gen para permitir fusiones
C-terminales simples (Figura 12).
Finalmente, el uso de un gen sintético permite
la introducción de mutaciones para incrementar la termoestabilidad
del producto del gen, o para modificar de otra forma las propiedades
del producto como se desee. En el ejemplo ilustrado más adelante,
por ejemplo, se realizaron tres mutaciones que no eran sinónimas
para introducir los cambios de aminoácidos termoestabilizantes
T214C, E354K y D357F en el polipéptido.
Los ácidos nucleicos de la invención se
incorporan de forma adecuada en un vector de expresión, tal como un
plásmido, bajo el control de elementos de control tales como
promotores, potenciadores, terminadores, etc. Estos vectores se
pueden usar después para transformar una célula hospedadora, por
ejemplo una célula procariótica o eucariótica tal como una célula
vegetal o animal, pero en particular una célula procariótica tal
como E. coli, de forma que la célula expresa la enzima
luciferasa deseada. El cultivo de las células así transformadas
mediante el uso de condiciones que se conocen bien en la técnica
dará como resultado la producción de la enzima luciferasa, que se
puede separar después del medio de cultivo. Cuando las células son
células vegetales o animales, se pueden propagar los vegetales o
los animales a partir de dichas células. La proteína se puede
extraer después de los vegetales, o en el caso de animales
transgénicos, las proteínas se pueden recuperar de la leche. Los
vectores, las células transformadas, las plantas y los animales
transgénicos y los métodos para producir la enzima cultivando estas
células forman aspectos adicionales de la invención.
Se creó la luciferasa mutante D357Y de
Photinus pyralis mediante mutagénesis aleatoria como se
describe más adelante. Se descubrió que la mutación puntual única
D357Y produce un gran desplazamiento del color en la longitud de
onda de la luz emitida, y también tiene una termoestabilidad mayor
que la luciferasa de tipo natural. Las investigaciones adicionales
han revelado que una variedad de sustituciones en esta posición dan
lugar a una buena termoestabilidad y/o a grandes desplazamientos de
color.
\newpage
Los ejemplos particulares de enzimas mutantes de
Photinus pyralis que están dentro del alcance de la invención
incluyen los siguientes:
D357Y
D357F
D357W
D357K
D357N
D357I
E354I/D357Y
E354V/D357Y
E354C/D357Y
E354R/D357Y
E354S/D357Y
E354N/D357Y
E354K/D357M
E354R/D357L
E354W/D357W
E354H/D357W
E354R/D357F
E354K/D357F
E354S/D357F
E354M/D357F
E354A/D357R
E354A/D357F
E354T/D357Y
E354A/D357N
I351M/E354R/D357V
E354S/D357V
E354R/D357W
E354R/D357M
E354R/D357S
E354N/D357S
o los equivalentes de cualquiera de
éstos cuando derivan de las luciferasas de otras
especies.
Las mutaciones para la creación de los mutantes
anteriores se introdujeron en el gen de luciferasa en el plásmido
pET23 mediante mutagénesis dirigida, (PCR) o mutagénesis mediante
casete combinatorio. Los oligonucleótidos añadidos a la reacción de
PCR para efectuar las mutaciones relevantes se proporcionan más
adelante.
Se ha informado previamente que el efecto de las
mutaciones puntuales en las posiciones 354 y 215 es aditivo. Esta
invención proporciona la posibilidad de combinar tres o más de tales
mutaciones para proporcionar una termoestabilidad elevada en una
enzima mutante que tiene un gran desplazamiento de color.
Las proteínas de luciferasa de la invención se
emplearán de forma ventajosa en cualquier ensayo bioluminiscente
que utilice la reacción luciferasa/luciferina como medio de
señalización. Existen muchos ensayos de este tipo conocidos en la
bibliografía. Las proteínas se pueden incluir, por lo tanto, en
equipos preparados con objeto de realizar tales ensayos,
opcionalmente con luciferina y cualquier otro reactivo necesario
para realizar el ensayo particular.
La invención se describirá a continuación en
particular por medio de ejemplos con referencia a los dibujos
esquemáticos adjuntos, en los que:
La Figura 1 es un gráfico logarítmico que
muestra el % de actividad restante frente al tiempo en la incubación
a 45ºC de varias enzimas mutantes de acuerdo con la invención;
La Figura 2 muestra los máximos espectrales
obtenidos incubando células de E. coli que expresan enzimas
luciferasas en un tampón citrato con D-luciferina,
en la que la enzima usada es (a) luciferasa de Photinus
pyralis de tipo natural recombinante, (b) un mutante D357K, un
mutante D357N, (d) un mutante D357W, (e) un mutante D357I, (f) un
mutante D357F, (g) un mutante D357Y y (h) un doble mutante E354I +
D357Y;
La Figura 3 es un gráfico que muestra el % de
actividad restante frente al tiempo de tres enzimas mutantes, E354I,
D357Y y el doble mutante (DM) E354I/D357Y;
La Figura 4 muestra los espectros de emisión de
(a) enzima de tipo natural recombinante y (b) el doble mutante (DM)
E354I/D357Y;
La Figura 5 es un gráfico que muestra la
velocidad de extinción de las emisiones de fotones de la enzima de
tipo natural recombinante (\blacklozenge) r-tn y
un mutante D357K (\sqbullet).
La Figura 6 muestra un diagrama de modelado
molecular que ilustra un bolsillo de unión de CoA potencial en la
enzima luciferasa;
La Figura 7 muestra los espectros
bioluminiscentes in vivo emitidos por células de E.
coli que expresan la luciferasa de P. pyralis mutante
D357Y (a) cultivadas en LB; (b) cultivadas en medio mínimo y acetato
sódico; (c) cultivadas en medio mínimo y glucosa;
La Figura 8 muestra los espectros
bioluminiscentes in vivo emitidos por células de E.
coli que expresan la luciferasa de P. pyralis mutante
E354K/D357M (a) cultivadas en LB; (b) cultivadas en medio mínimo y
acetato sódico; (c) cultivadas en medio mínimo y glucosa;
La Figura 9 es un gráfico que muestra el efecto
de CoA sobre la distribución espectral de la luz emitida por la
luciferasa de P. pyralis mutante D357Y;
La Figura 10 es un gráfico que muestra los datos
normalizados del efecto de CoA sobre la distribución espectral de la
luz emitida por la luciferasa de P. pyralis mutante
D357Y;
La Figura 11 es un gráfico que muestra el efecto
de CoA sobre la distribución espectral de la luz emitida por la
luciferasa de P. pyralis mutante E354I/D357Y (Figura 11a) y
los datos normalizados (Figura 11b);
La Figura 12 ilustra las modificaciones de los
sitios de restricción utilizadas en la construcción de un gen
sintético de luciferasa;
La Figura 13 ilustra las construcciones usadas
en la síntesis de un gen de luciferasa;
La Figura 14 muestra la secuencia de cADN (ID
SEC Nº 1) del gen sintético de luciferasa (que incluye los
nucleótidos 1-8, que forman parte del sitio de unión
al ribosoma pero no son codificantes) y la secuencia de los
aminoácidos codificados que comienza en el residuo de metionina
indicado mediante la flecha hacia arriba (ID SEC Nº 2); y
La Figura 15 ilustra la termoestabilidad de los
mutantes, que incluyen el mutante codificado por el gen sintético a
50ºC.
Se prepararon dos bibliotecas de luciferasa de
luciérnaga (Photinus pyralis), creadas mediante el uso de
PCR propensa a errores [M. Fromant et al., Anal. Biochem.
(1995) 224, 347-353]. Una biblioteca consistió en
productos de PCR propensa a errores de la longitud completa del gen
luc, clonados en el sistema de expresión de T7 pET23a
(Novagen Inc., Madison, WI, EE.UU.). Una segunda biblioteca
consistió en los productos de PCR propensa a errores de una sección
corta del gen luc, que cubría los aminoácidos
199-352, clonados en el vector pBSK(+), (Stratagene,
La Jolla, CA, EE.UU.).
La biblioteca pET23a se expresó en la cepa de
E. coli BL21 (DE3), (E. coli B F dcm ompT hsdS
(r_{B}^{-}m_{B}^{-}) gal\lambda (DE3)).
La biblioteca pBSK(+) se expresó en células de
E. coli HB101 (supE44 aral4 galK2 lacY1
\Delta(gpt-proA) 62 rpsL20 (Str^{r})
xyl-5 mtl-1 recA13A
\Delta(rcC-mrr) HsdS^{-}
(r^{-}m^{-}). pET23a y pBSK(+) portan ambos el gen de
\beta-lactamasa y confieren resistencia a
ampicilina a las células de E. coli que albergan el
plásmido.
Se transformó una cepa de E. coli con la
biblioteca preparada mediante electroporación, mediante un
dispositivo E. coli Pulser de BIORAD, y se cultivó durante
la noche a 37ºC en agar LB, que contenía ampicilina a una
concentración de 50 \mug/ml. Las células se transfirieron a
membranas de nailon (Osmonics, Minnetonka, Minnesota, EE.UU.), y se
pulverizaron con disolución de luciferina
(D-luciferina 500 \muM, sal potásica, en tampón
de citrato sódico 100 mM, pH 5,0). Las colonias se examinaron
mediante el uso de un sistema de documentación y análisis
AlphaImager^{TM} 1200 (Flowgen, Lichfield, Staffordshire, R.U.).
Este integró la bioluminiscencia emitida a lo largo de un periodo
especificado de tiempo para producir una imagen de la luz emitida
por las colonias. El brillo de la luminiscencia se tomó como una
indicación de la termoestabilidad de la luciferasa.
Las colonias se cribaron después en función de
la termoestabilidad. Las colonias se seleccionaron en base al
brillo de la luz emitida y se aislaron para una caracterización
adicional. En algunos cribados las colonias de E. coli se
incubaron a 42ºC durante 2 horas antes del cribado, de forma que se
pudieran seleccionar los mutantes termoestables. Las colonias
aisladas a partir del cribado primario se transfirieron a membranas
de nailon y se cultivaron también durante la noche en medio LB que
contenía ampicilina. Las transferencias se pulverizaron con
disolución de luciferina y se observaron en el AlphaImager^{TM}.
Este cribado secundario ayudó a identificar positivamente los
clones para el análisis in vitro de la actividad luciferasa.
Los clones de E. coli que expresaban posibles enzimas
termoestables se ensayaron in vitro en función de la
actividad luciferasa y de la termoestabilidad.
Los ensayos in vitro de actividad
luciferasa se realizaron a temperatura ambiente mediante el uso del
sistema de ensayo de luciferasa de Promega (Promega Corporation,
Madison, WI, EE.UU.).
La reacción de luciferasa se inició mediante la
adición de 10 \mul de extracto celular bruto a 100 \mul de
mezcla de ensayo de luciferasa de Promega (dilución 1:2). La
bioluminiscencia resultante se midió mediante el uso de un
luminómetro M3 de Biotrace.
Se prepararon extractos celulares brutos como se
describe en el boletín técnico de Promega nº 101. Se lisaron
alícuotas de cultivos de E. coli realizados durante la noche
en reactivo de lisis de cultivo celular
(Tris-fosfato 25 mM de pH 7,8, ditiotreitol (DTT) 2
mM, ácido
1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacético
2 mM, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 1,25
mg/ml de lisozima de gallina) durante 10 minutos a temperatura
ambiente. El lisado bruto se almacenó después en hielo antes del
ensayo.
Las propiedades de las enzimas se analizaron
además en estudios de inactivación dependiente del tiempo. Se
incubaron tubos Eppendorf que contenían alícuotas de 50 \mul de
extracto celular bruto en un baño de agua a una temperatura dada.
Se extrajeron los tubos en los momentos fijados y se enfriaron en
hielo antes del ensayo. La actividad luciferasa restante se expresó
como un porcentaje de la actividad original.
Se trazaron gráficos logarítmicos de la
actividad restante en porcentaje frente al tiempo de incubación, y
se usaron para calcular los valores de t_{1/2}. t_{1/2} es el
tiempo que tarda la enzima en perder un 50% de su actividad
original tras la incubación a una temperatura dada. Los valores de
t_{1/2} (tiempo para que la actividad se reduzca a un 50% de la
actividad original) se determinaron en los extractos brutos a 37ºC a
partir de los gráficos logarítmicos del % de actividad restante
frente al tiempo (no mostrados).
Se secuenció el ADN plasmídico de los clones de
E. coli que expresaban la luciferasa más termoestable, tal
como se determinó anteriormente, para determinar las mutaciones
responsables de la termoestabilidad de la enzima.
Se preparó ADN plasmídico mediante el uso del
equipo QIAprep Spin Miniprep de QIAGEN (QIAGEN Ltd, Crawley, W.
Sussex, R.U.) siguiendo el protocolo para usar una microcentrífuga
(manual de QIAprep Miniprep
04/98).
04/98).
Toda la secuenciación del ADN fue llevada a cabo
por Babraham Technix, Cambridge, R.U., mediante el uso de un
secuenciador de ADN ABI PRISM^{TM} 377 y el equipo ABI
PRISM^{TM} BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction (Perkin Elmer Applied Biosystems) que se basa en el método
de terminación de cadena con didesoxi [F. Sanger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, (1977)
5463-5467].
Como resultado de este trabajo, se identificó el
mutante nuevo D357Y.
\newpage
La estructura cristalina de la luciferasa [E.
Conti et al., Structure, 4 (1996) 287-298]
muestra que la posición 357 está situada en la superficie de la
proteína y que está cercana a la posición 354, lo que puede afectar
tanto a la termoestabilidad como a las propiedades espectrales. Esto
indica que esta región podría ser importante en cuanto a la
termoestabilidad de la enzima.
D357Y es un mutante particularmente
termoestable, y es la luciferasa más termoestable, con un único
cambio de aminoácido.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar diferentes mutaciones en la
posición 357, se realizó mutagénesis dirigida mediante el uso del
equipo de mutagénesis dirigida QuikChange^{TM} de Stratagene
(Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Se usó el plásmido pPW601a J54
(PJW, MoD Report, 3/96) en todas las mutagénesis dirigidas. Todos
los productos de las reacciones de mutagénesis se transformaron en
la cepa de E. coli XL1-Blue,
[el4^{-}(mcrA^{-})
\Delta(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171
endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC
umuC::Tn5 (Kan^{r}) uvrC [F' proAB lacl^{q}Z\DeltaM15 Tn 10
(Tet^{r}) Amy Cam^{r}]]. Los cebadores oligonucleotídicos
fueron sintetizados por Sigma-Genosys Ltd.,
Cambridge, R.U., y se diseñaron mediante el uso de un sistema de
dopaje inteligente [A.R. Arkin et al.,
Bio-technology, (1992) 10, 297-300,
W. Huang et al., Anal. Biochem. 218,
454-457], que se usó para diseñar cebadores
oligonucleotídicos degenerados para producir grupos de mutaciones
posibles, en lugar de usar cebadores individuales para cada
sustitución de aminoácido.
De esta forma, se produjeron bibliotecas de
mutantes de luciferasa con aminoácidos sustituidos.
Se usaron los siguientes oligonucleótidos (y sus
moléculas complementarias):
Las bibliotecas de mutantes se cribaron como
anteriormente en función de la termoestabilidad. El número de
colonias a cribar se calculó mediante el uso de la ecuación [S.
Climie et al., J. Biol. Chem. 265 (1990)
18776-18779]
N =
[ln(1-P)]/[ln((n-1)/n)]
En la que N es el número de colonias a cribar, n
es el número de codones posibles en la posición de interés y P es
la probabilidad de que cada codón de la mezcla se tome como muestra
para el cribado al menos una vez. El cálculo se basa en P=0,95. Los
mutantes obtenidos a partir de la mutagénesis dirigida se ensayaron
en cuanto a la actividad luciferasa y se caracterizaron en estudios
de termoinactivación dependiente del tiempo.
Los mutantes identificados como deseables de
esta manera se cultivaron en 400 ml de medio LB que contenía
ampicilina hasta A_{260} \approx 0,5. Después se indujo la
expresión de luciferasa mediante la adición de
isopropil-\beta-tiogalactósido
(IPTG) hasta una concentración final de 1 mM. Las células se
incubaron después a 30ºC con agitación durante 3 horas antes de
recogerlas mediante centrifugación. El sedimento celular resultante
se resuspendió en 10 ml de reactivo de extracción de proteínas
B-PER^{TM} (Pierce Chemical Company, Rochford,
EE.UU.), DTT 1 mM para producir un extracto bruto, siguiendo el
protocolo de B-PER^{TM} para la extracción de
proteínas bacterianas Maxi-Scale. Se añadió una
mezcla reconstituida de inhibidores de proteasas de Sigma, 500
\mul (producto nº P8465, Sigma, Saint Louis, Missouri, EE.UU.), a
la disolución B-PER^{TM} para inhibir las
proteasas endógenas. El lisado celular se centrifugó después a
30.000 g durante 30 minutos.
El sobrenadante del extracto bruto se sometió a
fraccionamiento con sulfato amónico. La fracción que precipitó
entre el 30% y el 55% de saturación contuvo actividad luciferasa.
Este material se resuspendió en 0,5 ml de Tris-HCl
de pH 8,0, DTT 1 mM y se usó para los estudios de termoinactivación
y para los estudios espectrales.
Se introdujeron las sustituciones D357L, T, V,
W, R, I, S, K, N y F. Estos mutantes se caracterizaron en estudios
de termoinactivación in vitro de los extractos brutos.
Los extractos parcialmente purificados se
diluyeron, 1:11, en un tampón de termoinactivación: tampón de
fosfato potásico 50 mM de pH 7,8 que contenía un 10% de sulfato
amónico saturado, ditiotreitol 1 mM y 0,2% de BSA.
Se incubaron alícuotas de 110 \mul de
disolución de proteínas a 40ºC o 45ºC durante periodos especificados
de tiempo y se enfriaron en hielo antes del ensayo. Después se
midió la actividad luciferasa como se describió en el Ejemplo 1,
mediante el uso del reactivo de ensayo de luciferasa de Promega
(dilución 1:2).
Los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3 y
en la Figura 1. Los valores de t_{1/2} se determinaron en los
extractos brutos a 40ºC (Tabla 2) y 45ºC (Tabla 3).
Todas las sustituciones exhibieron una
termoestabilidad incrementada en comparación con el tipo natural
recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó también que las sustituciones de
aminoácidos en la posición 357 afectaban a los espectros in
vivo de la luz emitida por la enzima. Se cultivó una alícuota
(250 \mul) de los cultivos de células de E. coli, como se
describió en el Ejemplo 2, durante la noche a 37ºC, se centrifugó en
una microcentrífuga y se eliminó el sobrenadante. Las células que
expresaban luciferasas mutantes diferentes se incubaron en un
tampón citrato (pH 5,0) que contenía 150 \mul de
D-luciferina, y se analizó la luz emitida por la
reacción in vivo midiendo los espectros de emisión mediante
el uso de un espectrofluorímetro de microplacas SPECTRAmax®
(Molecular Devices Corp. California, EE.UU.). Se observaron grandes
cambios en el máximo espectral así como en la distribución de las
longitudes de onda para los mutantes D357Y, F e I (Figura
2(a)-(g)). Estos resultados se resumen en la Tabla 4
siguiente.
Además, se determinó la luminiscencia in
vivo de los mutantes visualmente en una habitación oscura. Los
mutantes D357 exhibieron una diversidad de colores en sus espectros
de luminiscencia. En particular, D357Y, F e I mostraron
desplazamientos significativos a longitudes de onda más largas de la
luz emitida.
En algunos casos, (p. ej. D357F), el cambio de
color de la emisión de luz pareció ser debido no solamente a un
desplazamiento de \lambda_{max}, sino también a una diferencia
en las contribuciones a los espectros de las diferentes longitudes
de onda de la luz visible.
Se usó la enzima de tipo natural recombinante
(r-tn) para la comparación de \lambda_{max} de
la emisión de luz in vivo de algunos de los mutantes en 357.
D357Y, F e I exhiben desplazamientos considerables en sus longitudes
de onda del máximo.
\vskip1.000000\baselineskip
D357Y se purificó parcialmente mediante
precipitación con sulfato amónico, como se describió en el Ejemplo
1. Esta enzima D357Y parcialmente purificada (5 \mul) se mezcló
con 150 \mul de reactivo de ensayo de luciferasa de Promega. Otra
alícuota se mezcló con un tampón de ensayo equivalente en el que no
hay CoA (Tris-tricina 25 mM de pH 7,8, MgSO_{4}
5,0 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 2 mM, D-luciferina 470
\muM, ATP 530 \muM). Se midieron los espectros de emisión de
las dos reacciones, y se muestran en las Figuras 9 y 10.
Los espectros exhiben una diferencia marcada en
la emisión bioluminiscente en ausencia y presencia de CoA, con un
desplazamiento drástico de \lambda_{max}. El efecto de CoA sobre
la cinética de la relación de luciferasa se puede observar también
mediante la diferencia de las escalas de URL (URL: unidades
relativas de luz).
Esta diferencia en la emisión da lugar a la
posibilidad de usar la enzima en un ensayo para detectar la
presencia de CoA.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante el uso de la mutagénesis dirigida como
se describió en el Ejemplo 2, se modificó un doble mutante de E354I
+ D357Y para estudiar cualquier efecto acumulativo sobre la
termoestabilidad y el color de la emisión de luz.
El doble mutante parcialmente purificado, E354I
+ D357Y, se diluyó, 1:11, en un tampón de termoinactivación: tampón
de fosfato potásico 50 mM de pH 7,8 que contenía un 10% de sulfato
amónico saturado, ditiotreitol 1 mM y 0,2% de BSA.
Se incubaron alícuotas de 110 \mul de la
disolución de proteínas a 45ºC durante periodos especificados de
tiempo y se enfriaron en hielo antes del ensayo. La actividad
luciferasa se midió después como anteriormente, mediante el uso del
reactivo de ensayo de luciferasa de Promega (dilución 1:2).
El doble mutante exhibió un incremento marcado
de termoestabilidad en comparación con los mutantes simples E354I y
D357Y individualmente (véase la Figura 3). Los estudios de
termoinactivación del doble mutante parcialmente purificado
confirmaron la termoestabilidad incrementada del mutante, que
proporciona un valor de t_{1/2} de 7,7 min cuando se inactivó a
45ºC.
Se observó que el doble mutante exhibe un color
rojo mucho más intenso de luminiscencia que los mutantes
individuales de E354I y D357Y, por lo que exhibe la adición del
color de luminiscencia.
También se midieron los espectros de emisión del
tipo natural recombinante y del extracto bruto del doble mutante
E354I + D357Y mediante el uso del tampón de ensayo descrito en el
Ejemplo 3.
Los espectros de emisión medidos in vivo
proporcionaron una \lambda_{max} de 611 nm. Sin embargo, el
espectro tiene una contribución mayor de luminiscencia de la región
roja de las longitudes de onda, lo que conduce a su apariencia roja
más intensa cuando se observa visualmente. Los espectros de emisión
de los extractos brutos exhibieron un cambio indudable de la forma
espectral y un desplazamiento de la longitud de onda de 44 nm,
respecto de rTN (véase la
Figura 4).
Figura 4).
El espectro de emisión in vivo del doble
mutante muestra una agudización de la anchura de la banda para la
longitud de onda del máximo de la luz emitida (613 nm) y una
disminución de la contribución de las longitudes de onda de la luz
en la región de 540-560 nm.
El efecto drástico de estas mutaciones indica la
importancia de esta región de la enzima para el color de la luz
bioluminiscente.
Se observó que la bioluminiscencia in
vivo de las células de E. coli que expresan el mutante
D357K era muy brillante respecto de los otros mutantes en esta
posición. La cinética luminiscente de esta enzima se analizó
mediante el uso de un luminómetro, que pudo medir la velocidad de la
emisión de fotones a lo largo del tiempo. Se añadieron alícuotas de
extractos exentos de células de E. coli que contenían la
enzima de tipo natural recombinante o el mutante D357 a una mezcla
de ensayo de luciferasa que no contenía ningún reactivo que
estimulase la cinética luminiscente, p. ej. coenzima A. La velocidad
de extinción de la emisión de fotones se midió a lo largo del
tiempo (15 s) para ambas enzimas, y se observó que era
significativamente más lenta para el mutante D357K (Figura 5). En
otras palabras, la enzima mutante tiene una cinética de reacción
que se inhibe en menor grado que la de la enzima de tipo natural
recombinante a lo largo de al menos los primeros 15 segundos de la
reacción.
Etapa
1
Se introdujeron dos sitios de restricción nuevos
únicos en el gen luc, en el plásmido pW601a/J54, mediante el
uso de dos pares de oligonucleótidos sintéticos (véase más
adelante). Un total de seis mutaciones sinónimas introdujeron en el
gen dos sitios de restricción SpeI y KpnI separados 63 pares de
bases. El plásmido que contenía estos dos sitios nuevos se llamó
pPW601aJ54SpeI/KpnI. La presencia y proximidad de estos sitios de
restricción hace posible usar la mutagénesis con casete combinatorio
para investigar el efecto de las sustituciones aleatorias en las
posiciones de los aminoácidos 354 y 357 en la secuencia primaria de
la luciferasa de luciérnaga.
| SpeI (a) | 5'-gggctcactgagactacTAGTgctattatgattacacccg-3' nt 1021-nt 1060 | (ID SEC Nº 8) |
| SpeI (b) | 5'-cgggtgtaatcagaatagcACTAgtagtctcagtgagccc-3' | (ID SEC Nº 9) |
| KpnI (a) | 5'-ggcgcggtcggtaaagtGgtAccattttttgaagcg-3' nt 1078- nt 1113 | (ID SEC Nº 10) |
| KpnI (b) | 5'-cgcttcaaaaaatggTacCactttaccgaccgcgcc-3' | (ID SEC Nº 11) |
Los nucleótidos destacados en negrita forman el
sitio de reconocimiento de la endonucleasa, y los que están en
mayúsculas indican la posición de las mutaciones puntuales
necesarias para crear el sitio.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Se sintetizó un par de oligonucleótidos
sintéticos que cuando se hibridaron crearon un casete bicatenario
que se podía ligar directamente en el plásmido pPW601aJ54SpeI/KpnI
digerido en los sitios de restricción nuevos. El casete se diseñó
para introducir todas las combinaciones posibles de los 20
aminoácidos naturales en las posiciones 354 y 357 de la secuencia
primaria.
Looplib2A
\hskip0.3cm5'-ctagtgctattctgattacacccNNG/CggggatNNG/Caaaccgggcgcggtcggtaaagtg gta-3'
\hskip0.3cm(ID SEC Nº 12)
Looplib2B
\hskip0.3cm5'-cactttaccgaccgcgcccggtttG/CNNatccccG/CNNgggtgtaatcagaatagca-3'
\hskip1.5cm(ID SEC Nº 13)
Se mezclaron 2 \mug de cada uno de los
oligonucleótidos de la biblioteca de giros en un tampón que contenía
Tris-HCl 50 mM de pH 7,4, NaCl 25 mM, y se calentó
a 100ºC durante 3 min. Esta disolución se enfrió después lentamente
en un bloque calefactor a <50ºC para hibridar las secuencias
complementarias. Los oligonucleótidos hibridados se ligaron después
en el plásmido pPW601aJ54SpeI/KpnI, que se había digerido con SpeI y
KpnI. Las alícuotas de la reacción de ligadura se usaron después
para transformar células de E. coli HB101 mediante el uso de
electroporación. Después de la electroporación, las células
transformadas se colocaron en placas de agar LB que contenían 50
\mug/ml de ampicilina y se cultivaron durante la noche a 37ºC. Al
día siguiente se recogieron aleatoriamente 869 colonias de las
placas y se usaron para inocular 1 ml de LB que contenía ampicilina
en placas de 96 pocillos cuadrados (Beckman). Las placas se
cubrieron y las células se cultivaron durante la noche a 37ºC con
agitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
A la mañana siguiente se transfirieron alícuotas
de 50 \mul de los cultivos de la noche en fase estacionaria a dos
placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo de
plástico transparente (Dynex). Una placa se cubrió y se incubó en
un bloque calefactor durante 8 minutos (temperatura de la superficie
del bloque 45ºC) mientras la otra se mantuvo a 37ºC. La actividad
luciferasa in vivo en las células de ambas placas se detectó
después y se registró, a temperatura ambiente, mediante la adición
de 50 \mul de un tampón de citrato sódico 100 mM de pH 5,0 que
contenía D-luciferina 0,5 mM a los pocillos y
después mediante la transferencia de la placa a un sistema de
captura de imágenes con videocámara (Alpha Imager). La luz emitida
por los cultivos calentados y de control se integró durante 1 ó 2
minutos, y la imagen se registró en una película de papel
térmico.
Se seleccionaron setenta y nueve cultivos que
exhibían la mayor bioluminiscencia, determinada mediante el brillo
de la imagen registrada en la película, para una segunda ronda de
cribado. Esta vez los cultivos se incubaron durante 16 minutos en
el bloque calefactor antes de analizarlos. De los 55 clones
seleccionados de los cribados de termoestabilidad in vivo se
eligieron 25 para el análisis espectral in vivo. Estos
clones se cultivaron durante la noche en LB a 37ºC y a la mañana
siguiente se centrifugaron 200 \mul de los cultivos de la noche,
y los sedimentos de células de E. coli se resuspendieron en
150 \mul de tampón de citrato sódico 100 mM de pH 5,0 que
contenía D-luciferina 0,5 mM. Las células
resuspendidas se colocaron después en una placa de microtitulación
de plástico blanco y se analizó el espectro de emisión
bioluminiscente emitido por cada luciferasa mutante mediante el uso
de un fluorímetro de placas de 96 pocillos Spectramax de Molecular
Devices. Los resultados se resumen en la Tabla 5 más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
4
Se preparó el ADN plasmídico de los 25 clones
seleccionados mediante cribado in vivo y se secuenció
mediante el uso de cebadores de secuenciación específicos del gen.
Se identificaron las mutaciones que dieron como resultado cambios
de aminoácidos en las posiciones 354 y 357 de la secuencia primaria.
Un mutante contuvo además una mutación adicional que dio como
resultado una sustitución de aminoácido en la posición I351 (Tabla
5).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron varias luciferasas mutantes de
los ensayos in vivo en función de la termoestabilidad. La
mayoría de estas luciferasas muestran también grandes cambios en el
espectro in vivo de la luz emitida, y muchas muestran
contribuciones mayores de las longitudes de onda más largas de la
luz (>580 nm). Varios espectros mostraron también un
estrechamiento significativo de la anchura de la banda alrededor de
un único máximo a 610-614 nm.
Las sustituciones de E354 y D357 con un
aminoácido hidrofóbico y un aminoácido aromático, respectivamente,
p. ej. E354V, D357Y, da como resultado el mayor cambio en el
espectro in vivo que muestra un único máximo, de anchura de
banda estrecha, a alrededor de 612 nm.
Se prepararon extractos exentos de células de
los clones seleccionados mediante lisis, y se determinó la
termoestabilidad de la luciferasa de cada extracto en un
experimento de inactivación térmica. Se colocaron 50 \mul de cada
extracto en un tubo Eppendorf y se incubaron en un baño de agua
calentado a 45ºC durante 4, 9 y 16 minutos. En el momento adecuado
se extrajo la alícuota y se midió la actividad luciferasa restante.
La Tabla 6 muestra el porcentaje de actividad restante frente al
tiempo para todas las enzimas mutantes, así como para la de tipo
natural recombinante.
Los resultados indican que las luciferasas más
termoestables fueron aquellas con un aminoácido aromático en la
posición 357 (Y, F o W) y un aminoácido grande hidrofóbico (V o I),
polar (N) o cargado positivamente (K o R) en la posición 354.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó el efecto de las diferentes fuentes
de carbono sobre el espectro de la luz emitida en células de E.
coli BL21 (DE3) que expresaban las luciferasas mutantes D357Y o
E354K + D357M (7, anteriormente mencionado).
Se incubó un cultivo de 50 ml de células hasta
la fase media logarítmica en medio LB y después se recogió mediante
centrifugación. El sedimento celular se resuspendió en 1 ml de agua
destilada estéril y después se usó una alícuota de 100 \mul de
esta suspensión para inocular 5 ml de LB fresco, medio mínimo M9 +
acetato sódico 2 mM o medio mínimo M9 + glucosa 2 mM en un tubo
Sterilin de 25 ml. Los cultivos se dejaron continuar creciendo a
37ºC con agitación, y después de 90 minutos (D357Y) o 120 minutos
(enzima 7) se extrajo una alícuota de 200 \mul de las células, se
centrifugó y se resuspendió en 150 \mul de tampón de citrato
sódico 100 mM de pH 5,0 que contenía D-luciferina
0,5 mM. Las células resuspendidas se colocaron después en una placa
de microtitulación y el espectro de emisión bioluminiscente in
vivo emitido por cada una de las luciferasas mutantes se
analizó mediante el uso de un fluorímetro de placas de 96 pocillos
Spectramax de Molecular Devices. Los resultados se muestran en
las
Figuras 7 y 8.
Figuras 7 y 8.
Los resultados muestran que el cambio desde un
medio rico (LB) (Figura 7a, 8a) hasta un medio mínimo definido con
acetato (Figura 7b, 8b) o glucosa (Figura 7c, 8c) como única fuente
de carbono dio como resultado desplazamientos a longitudes de onda
más largas de la luz emitida y una reducción en la contribución de
las longitudes de onda más cortas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificó la enzima de Photinus pyralis
de tipo natural recombinante y las luciferasas mutantes D357Y y
E354I + D357Y hasta homogeneidad para analizar el efecto del
cofactor coenzima A sobre el espectro de la reacción
bioluminiscente. Las tres luciferasas se purificaron en forma de
fusiones a un módulo de unión a carbohidratos (CBM) de 143
aminoácidos del hongo anaeróbico Piromyces equii. Se ha
demostrado que este CBM se une de forma selectiva a la celulosa
hinchada con ácido y a los carbohidratos solubles galactomanano y
glucomanano, por lo que forma la base de un esquema simple de
purificación por afinidad en una única etapa.
Las luciferasas fusionadas al CBM se pueden unir
a celulosa en los extractos brutos exentos de células, lavarlas, y
después eluirlas de forma selectiva mediante el uso de polisacáridos
solubles. Las proteínas de fusión purificadas de esta manera se
usaron en ensayos para medir las longitudes de onda de la luz
emitida en mezclas de reacción que contenían diferentes cantidades
de coenzima A. Se añadió enzima (5 \mul) a 100 \mul de reactivo
de ensayo, Tris-tricina 25 mM de pH 7,8, MgSO_{4}
5,0 mM, EDTA 0,1 mM, ATP 530 \muM y D-luciferina
470 \muM, que contenía diferentes cantidades de coenzima A. Las
Figuras 9-11 muestran el efecto de las
concentraciones crecientes de coenzima A sobre el espectro de la
luz emitida por las luciferasas purificadas D357 y E354I +
D357Y.
Los ensayos in vivo del espectro de la
luz bioluminiscente emitida por las células de E. coli que
expresaban luciferasa de luciérnaga fusionada al extremo
C-terminal del CBM fúngico no mostraron ninguna
diferencia significativa respecto de las células que expresaban la
luciferasa nativa. De forma similar, los ensayos in vitro
del espectro de la luz bioluminiscente emitida por una fuente
comercial de luciferasa recombinante purificada (Promega) fueron
idénticos al espectro emitido por la proteína de fusión.
Las diferencias observadas están asociadas por
lo tanto a las concentraciones de CoA. A medida que la concentración
de coenzima A se incrementa, la distribución espectral se altera, y
a las concentraciones más elevadas de CoA el espectro está dominado
por las longitudes de onda de la región de 590-630
nm, con un máximo pronunciado a 610 nm. El desplazamiento espectral
es más marcado para el doble mutante, en el que existe un
estrechamiento significativo de la anchura de banda alrededor de un
único máximo de longitud de onda de 610 nm (Figura 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñó y se construyó un gen luc
sintético a partir de pares de oligonucleótidos mediante el uso de
la estrategia de síntesis resumida anteriormente. Se modificó la
secuencia del gen para crear una luciferasa con los aminoácidos
214C, 354K y 357F.
Veintinueve pares de oligonucleótidos sintéticos
solapantes fueron sintetizados por Sigma-Genosys
Ltd, se purificaron mediante PAGE y se ligaron en tres
construcciones de aproximadamente 550 pb (IDRIS 1, 2 y 3, Figura
13). Cada construcción se ligó después por separado en el vector
pBSK(+), y las construcciones resultantes se usaron para
transformar células de E. coli XL1-Blue. Se
preparó el ADN plasmídico a partir de los clones que contenían los
insertos incorporados y se secuenció para confirmar la fidelidad de
los ORFs. La presencia de n-1 oligonucleótidos
(subproductos de la oligosíntesis) en las construcciones complicó el
proceso de construcción. La secuenciación del ADN identificó una
única construcción correcta de IDRIS 2, y se usó la PCR para
corregir una construcción de IDRIS 3 que contenía una deleción de
un único par de bases en el extremo 5' de la construcción. La
construcción del ORF completo se consiguió ligando una mezcla de
plásmidos que contenían IDRIS 1 con IDRIS 2 y 3.
El ADN ligado se usó después para transformar
células de E. coli XL1-Blue, y los clones que
expresaban la enzima activa se seleccionaron mediante el uso de un
ensayo in vivo. Se seleccionaron y secuenciaron varios
clones para confirmar la presencia y fidelidad del gen luc
sintético que tiene la secuencia mostrada en la Figura 14. El ORF
completo se denominó IDRIS (FA).
El gen sintético se incorporó en el vector
pBSK(+) entre los sitios BamH I y Sal I del poliligador. En esta
posición el gen no está en el marco de lectura del péptido alfa, y
está a una distancia significativa del promotor lac. Sin embargo,
se produce suficiente luciferasa para permitir la caracterización
preliminar de la enzima. Se prepararon extractos brutos exentos de
células de E. coli XL1-Blue que expresaban
IDRIS (FA), a partir de cultivos realizados durante la noche,
mediante el método de lisis de Promega.
La termoestabilidad de la enzima del extracto se
analizó después a 50ºC durante 20 minutos y se comparó con el
mutante termoestable E354I+D357Y. El triple mutante optimizado con
el nuevo codón fue significativamente más termoestable que el
mutante E354I+D357Y (Figura 15).
<110> El Secretario de Estado de
Defensa
\hskip1cmWhite, Peter J
\hskip1cmWilley, Tara L
\hskip1cmPrice, Rachel L
\hskip1cmMurphy, Melanie J
\hskip1cmSquirrell, David
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Enzima nueva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DERA/IPD/P1247/WOD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9925161.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-10-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0016744.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-7-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 1661
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> CDS
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<222> (3)...(1661)
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de cADN de gen sintético de luciferasa
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<400> 1
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\newpage
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de aminoácidos codificada de la secuencia de
cADN de gen sintético de luciferasa
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1661
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de cADN de gen sintético de luciferasa
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipcacccgaggg ggattataaa ccgggcgcgg
\hfill30
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<210> 5
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipcacccgaggg ggatvycaaa ccgggcgcgg tcgg
\hfill34
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<210> 6
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipcacccgaggg ggattdsaaa ccgggcgcgg tcgg
\hfill34
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<210> 7
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipcacccgaggg ggatmrsaaa ccgggcgcgg tcgg
\hfill34
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<210> 8
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipgggctcactg agactactag tgctattatg attacacccg
\hfill40
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<210> 9
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipcgggtgtaat cagaatagca ctagtagtct cagtgagccc
\hfill40
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<210> 10
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipggcgcggtcg gtaaagtggt accatttttt gaagcg
\hfill36
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcttcaaaa aatggtacca ctttaccgac cgcgcc
\hfill36
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<210> 12
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<211> 62
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> (24)...(25)
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<223> n=a o g o c o t
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> (33)...(34)
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<223> n=a o g o c o t
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtgctat tctgattaca cccnnsgggg atnnsaaacc gggcgcggtc ggtaaagtgg
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipta
\hfill62
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<210> 13
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<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a o g o c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> (35)...(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a o g o c o t
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactttacch acchcgcccg gtttsnnatc cccsnngggt gtaatcagaa tagca
\hfill55
Claims (22)
Hide Dependent
translated from
Claims (22)
Hide Dependent
translated from
1. Una proteína recombinante que tiene actividad
luciferasa y al menos un 90% de similitud respecto de una luciferasa
de tipo natural de Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola
cruciata o Luciola lateralis, Hotaria parvula, Pyrophorus
plagiophthalamus, Lampyris noctiluca, Pyrocoelia miyako o
Phrixothrix, en la que en la secuencia de la enzima el
residuo de aminoácido que corresponde al residuo 357 en la
luciferasa de Photinus pyralis está mutada en comparación con
la luciferasa de tipo natural correspondiente, de forma que la
enzima luciferasa es capaz de emitir luz a una longitud de onda
diferente en comparación con la luciferasa de tipo natural
correspondiente, y/o tiene una termoestabilidad incrementada en
comparación con la luciferasa de tipo natural correspondiente, y en
la que la similitud se determina mediante el uso de un algoritmo de
alineamiento definido por Lipman y Pearson (1985, Science 227:
1435-1441) con los parámetros ktup = 1, penalización
por hueco = 4 y penalización por longitud de hueco = 12.
2. Una proteína recombinante según la
reivindicación 1, en la que la secuencia de luciferasa de tipo
natural es de la luciferasa de Photinus pyralis, Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis.
3. Una proteína recombinante según la
reivindicación 1, en la que dicha secuencia de luciferasa de tipo
natural es de la luciferasa de Photinus pyralis, Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis, Hotaria
parvula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris noctiluca o
Pyrocoelia miyako, y el residuo de aminoácido que corresponde
al residuo 357 en la luciferasa de Photinus pyralis está
mutado por otro distinto de ácido aspártico o ácido glutámico.
4. Una proteína recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en la que el residuo de aminoácido
que corresponde al residuo 357 en la luciferasa de Photinus
pyralis está mutado por otro distinto de ácido aspártico, ácido
glutámico o valina.
5. Una proteína recombinante según la
reivindicación 1, en la que dicha secuencia de luciferasa de tipo
natural es de la luciferasa de Phrixothrix, y el residuo de
aminoácido que corresponde al residuo 357 en la luciferasa de
Photinus pyralis está mutado por otro distinto de
leucina.
6. Una proteína recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en la que el residuo de aminoácido
que corresponde al residuo 357 en la luciferasa de Photinus
pyralis está mutado por tirosina, fenilalanina, triptófano,
asparagina, glutamina, serina o treonina.
7. Una proteína recombinante según la
reivindicación 6, en la que el residuo de aminoácido que corresponde
al residuo 357 en la luciferasa de Photinus pyralis está
mutado por tirosina.
8. Una proteína según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que tiene al menos una de las
siguientes mutaciones en comparación con la luciferasa de tipo
natural:
(a) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 354 de la luciferasa de Photinus pyralis o al
aminoácido 356 en la luciferasa de Luciola está mutado;
(b) el residuo de aminoácido que corresponde a
la posición 215 en la luciferasa de Photinus pyralis o a la
posición 217 en la luciferasa de Luciola es un aminoácido
hidrofóbico diferente; o
(c) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 214 en la luciferasa de Photinus pyralis o al residuo
216 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata
o Luciola lateralis;
(d) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 232 en la luciferasa de Photinus pyralis o al residuo
234 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata
o Luciola lateralis;
(e) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo 295 en la luciferasa de Photinus pyralis o al residuo
297 de la luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata
o Luciola lateralis;
(f) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 14 de la luciferasa de Photinus pyralis o al
residuo 16 de la luciferasa de Luciola mingrelica, o 17 en
Luciola cruciata o Luciola lateralis;
(g) el residuo de aminoácido que corresponde al
aminoácido 35 de la luciferasa de Photinus pyralis o al
residuo 37 de la luciferasa de Luciola mingrelica, o al
residuo 38 de Luciola cruciata o Luciola
lateralis;
(h) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 105 de la luciferasa de Photinus
pyralis o al residuo 106 de la luciferasa de Luciola
mingrelica, 107 de Luciola cruciata o Luciola
lateralis;
(i) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 234 de la luciferasa de Photinus
pyralis o al residuo 236 de la luciferasa de Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis;
(j) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 420 de la luciferasa de Photinus
pyralis o al residuo 422 de la luciferasa de Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis;
(k) el residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de aminoácido 310 de la luciferasa de Photinus
pyralis o al residuo 312 de la luciferasa de Luciola
mingrelica, Luciola cruciata o Luciola lateralis;
es diferente del aminoácido que
aparece en la secuencia de tipo natural correspondiente, y en el que
la enzima luciferasa tiene una termoestabilidad incrementada en
comparación con una enzima que tiene el aminoácido de la luciferasa
de tipo natural correspondiente en esta
posición.
9. Una proteína según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el residuo de aminoácido
correspondiente al aminoácido 354 de la luciferasa de Photinus
pyralis (356 en la luciferasa de Luciola) está
mutado.
10. Una proteína según la reivindicación 9, en
la que el residuo de aminoácido que corresponde al residuo 214 en la
luciferasa de Photinus pyralis o al residuo 216 de la
luciferasa de Luciola mingrelica, Luciola cruciata o
Luciola lateralis está mutado por un aminoácido hidrofóbico
diferente que consiste en el grupo de isoleucina, leucina, valina,
metionina, triptófano, fenilalanina, prolina, cisteína y alanina, en
particular por isoleucina, leucina o valina.
11. Un ácido nucleico que codifica una
luciferasa según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
12. Un ácido nucleico según la reivindicación 11
que comprende un gen sintético.
13. Un ácido nucleico según la reivindicación
11, en el que el uso de los codones se ha optimizado para un
hospedador de expresión particular y/o se han introducido sitios de
restricción únicos.
14. Un ácido nucleico según la reivindicación 11
o la reivindicación 12, que comprende los nucleótidos
9-1661 de la ID SEC Nº 1, o una secuencia que tiene
al menos un 90% de similitud con ella.
15. Un vector que comprende un ácido nucleico
según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.
16. Una célula transformada con un vector según
la reivindicación 15.
17. Un método para producir una proteína según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el cual comprende
cultivar una célula según la reivindicación 16.
18. El uso de una proteína según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10 en un ensayo bioluminiscente.
19. Un equipo que comprende una proteína según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
20. Un equipo según la reivindicación 19 que
comprende además luciferina.
21. Un ensayo para determinar la presencia de
CoA en una muestra, el cual comprende añadir a una muestra que se
sospecha que contiene CoA luciferasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 anteriores, junto con otros reactivos que
son necesarios para provocar una reacción luciferasa/luciferina,
medir la longitud de onda de la luz emitida por la muestra y
relacionar esto con la presencia o ausencia de CoA.
22. Un ensayo según la reivindicación 21 para el
uso en el diagnóstico de diabetes.