JP2002034574A - ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 - Google Patents
ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
する遺伝子、(a)甲虫由来の特定のアミノ酸配列からな
るタンパク質(b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複
数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつルシフェリンを再生する能力を有す
るタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子をベ
クターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡ、上記組み換
え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体及び上記の
形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から
ルシフェリン再生能力を有するタンパク質を採取するル
シフェリン再生能力を有するタンパク質の製造法。 【効果】上記によれば、ルシフェリン再生能力を有する
タンバク質を効率よく生産することができる。
する遺伝子、(a)甲虫由来の特定のアミノ酸配列からな
るタンパク質(b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複
数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつルシフェリンを再生する能力を有す
るタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子をベ
クターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡ、上記組み換
え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体及び上記の
形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から
ルシフェリン再生能力を有するタンパク質を採取するル
シフェリン再生能力を有するタンパク質の製造法。 【効果】上記によれば、ルシフェリン再生能力を有する
タンバク質を効率よく生産することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ルシフェリンを再
生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組
み換え体ＤＮＡ及びルシフェリンを再生する能力を有す
るタンパク質の製造法に関する。
生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組
み換え体ＤＮＡ及びルシフェリンを再生する能力を有す
るタンパク質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物発光酵素ルシフェラーゼの基質であ
るルシフェリンは、ルシフェラーゼによる発光後オキシ
ルシフェリンに変換される。ルシフェラーゼを用いたＡ
ＴＰ測定法は、医療や食品衛生分野で広く使われている
が、基質として用いられるルシフェリンが高価であるこ
と、また、ルシフェラーゼ反応が反応後生成されるオキ
シルシフェリンにより阻害されることから、オキシルシ
フェリンの除去、またはルシフェリンへの再生がルシフ
ェラーゼＡＴＰ測定法の発展をさらに進めるものと考え
られる。オキシルシフェリンをルシフェリンに再生する
ことのできるホタル由来のタンパク質が見い出されてい
る（U.S.Pat.No.5814504）が、ホタル体内からは、微量
にしか抽出できず、工業的な利用は困難であった。ルシ
フェリンを再生する能力を有するタンパク質をルシフェ
リン−ルシフェラーゼ反応系に添加すれば、発光を持続
させることができ、また使用するルシフェラーゼ及びル
シフェリンの量を低減させることができる。
るルシフェリンは、ルシフェラーゼによる発光後オキシ
ルシフェリンに変換される。ルシフェラーゼを用いたＡ
ＴＰ測定法は、医療や食品衛生分野で広く使われている
が、基質として用いられるルシフェリンが高価であるこ
と、また、ルシフェラーゼ反応が反応後生成されるオキ
シルシフェリンにより阻害されることから、オキシルシ
フェリンの除去、またはルシフェリンへの再生がルシフ
ェラーゼＡＴＰ測定法の発展をさらに進めるものと考え
られる。オキシルシフェリンをルシフェリンに再生する
ことのできるホタル由来のタンパク質が見い出されてい
る（U.S.Pat.No.5814504）が、ホタル体内からは、微量
にしか抽出できず、工業的な利用は困難であった。ルシ
フェリンを再生する能力を有するタンパク質をルシフェ
リン−ルシフェラーゼ反応系に添加すれば、発光を持続
させることができ、また使用するルシフェラーゼ及びル
シフェリンの量を低減させることができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ルシフェリ
ンを再生する能力を有するタンパク質を生産する組み換
え体を用い、ルシフェリンを再生する能力を有するタン
パク質の製造法を提供することを目的とする。
ンを再生する能力を有するタンパク質を生産する組み換
え体を用い、ルシフェリンを再生する能力を有するタン
パク質の製造法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記目的に鑑み鋭意検討を行なった結果、甲虫類由来の
ルシフェリン再生能力を有するタンパク質をコードする
遺伝子の単離、及び遺伝子の構造を決定し、更にルシフ
ェリン再生能力を有するタンパク質をコードする遺伝子
をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得るこ
とに成功した。次いで、この組み換え体ＤＮＡを宿主細
胞に含ませた形質転換体または形質導入体を培養する
と、効率よくルシフェリン再生能力を有するタンパク質
が生産されること等を見い出し、本発明を完成した。
上記目的に鑑み鋭意検討を行なった結果、甲虫類由来の
ルシフェリン再生能力を有するタンパク質をコードする
遺伝子の単離、及び遺伝子の構造を決定し、更にルシフ
ェリン再生能力を有するタンパク質をコードする遺伝子
をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得るこ
とに成功した。次いで、この組み換え体ＤＮＡを宿主細
胞に含ませた形質転換体または形質導入体を培養する
と、効率よくルシフェリン再生能力を有するタンパク質
が生産されること等を見い出し、本発明を完成した。
【０００５】即ち、本願の第１の発明は、以下の(a)ま
たは(b)のタンパク質をコードする遺伝子である。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつルシフェリンを再生する能力を有するタンパク
質 本願の第２の発明は、以下の(a)または(b)のＤＮＡから
なる遺伝子である。 (a)配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ (b)(a)の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖配列とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェ
リンを再生する能力を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ 本願の第３の発明は、上記ルシフェリンを再生する能力
を有するタンパク質をコードする遺伝子をベクターＤＮ
Ａに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡであ
る。本願の第４の発明は、上記組み換え体ＤＮＡを含む
形質転換体または形質導入体である。本願の第５の発明
は、上記の形質転換体または形質導入体を培地に培養
し、培養物からルシフェリンを再生する能力を有するタ
ンパク質を採取することを特徴とするルシフェリンを再
生する能力を有するタンパク質の製造法である。なお、
以下では上記ルシフェリン再生能力を有するタンパク質
を、単に「ルシフェリン再生酵素」と略称することがあ
る。また、ルシフェリン再生能力を有するタンパク質を
コードするＤＮＡまたはルシフェリン再生能力を有する
タンパク質をコードし、さらに非翻訳領域を含むＤＮＡ
を、「ルシフェリン再生酵素遺伝子」と略称することが
ある。
たは(b)のタンパク質をコードする遺伝子である。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつルシフェリンを再生する能力を有するタンパク
質 本願の第２の発明は、以下の(a)または(b)のＤＮＡから
なる遺伝子である。 (a)配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ (b)(a)の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖配列とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェ
リンを再生する能力を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ 本願の第３の発明は、上記ルシフェリンを再生する能力
を有するタンパク質をコードする遺伝子をベクターＤＮ
Ａに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡであ
る。本願の第４の発明は、上記組み換え体ＤＮＡを含む
形質転換体または形質導入体である。本願の第５の発明
は、上記の形質転換体または形質導入体を培地に培養
し、培養物からルシフェリンを再生する能力を有するタ
ンパク質を採取することを特徴とするルシフェリンを再
生する能力を有するタンパク質の製造法である。なお、
以下では上記ルシフェリン再生能力を有するタンパク質
を、単に「ルシフェリン再生酵素」と略称することがあ
る。また、ルシフェリン再生能力を有するタンパク質を
コードするＤＮＡまたはルシフェリン再生能力を有する
タンパク質をコードし、さらに非翻訳領域を含むＤＮＡ
を、「ルシフェリン再生酵素遺伝子」と略称することが
ある。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のルシフェリンを再生する能力を有するタンパク
質をコードする遺伝子は、ルシフェリン-ルシフェラー
ゼ反応を有する甲虫類より得ることができる。本発明の
ルシフェリン再生能力を有するタンパク質をコードする
遺伝子とは、発現したときにルシフェリン再生能力活性
を有するものであればすべて含まれるが、好ましくは、
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードす
る遺伝子、又は配列表の配列番号１に示される塩基配列
からなる遺伝子が挙げられる。なお、配列表の配列番号
２に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子とは、コ
ドンの縮重を考慮すると種々の塩基配列が包含される。
即ち、このような種々の塩基配列の中から、遺伝子発現
系の諸要素、例えば宿主細胞の種類等による優先コド
ン、転写されたＲＮＡにより形成される高次構造の回避
などを考慮して選択すればよい。選択された塩基配列
は、自然界からクローニングされたＤＮＡであっても、
人為的に化学合成されたＤＮＡであってもよい。
本発明のルシフェリンを再生する能力を有するタンパク
質をコードする遺伝子は、ルシフェリン-ルシフェラー
ゼ反応を有する甲虫類より得ることができる。本発明の
ルシフェリン再生能力を有するタンパク質をコードする
遺伝子とは、発現したときにルシフェリン再生能力活性
を有するものであればすべて含まれるが、好ましくは、
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードす
る遺伝子、又は配列表の配列番号１に示される塩基配列
からなる遺伝子が挙げられる。なお、配列表の配列番号
２に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子とは、コ
ドンの縮重を考慮すると種々の塩基配列が包含される。
即ち、このような種々の塩基配列の中から、遺伝子発現
系の諸要素、例えば宿主細胞の種類等による優先コド
ン、転写されたＲＮＡにより形成される高次構造の回避
などを考慮して選択すればよい。選択された塩基配列
は、自然界からクローニングされたＤＮＡであっても、
人為的に化学合成されたＤＮＡであってもよい。
【０００７】本発明のルシフェリン再生酵素遺伝子を取
得するためには、先ず、ヘイケボタルから以下の方法
で、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを調製する。甲虫類組織か
らの全ＲＮＡの抽出には、効率よく損傷の少ないＲＮＡ
が得られるならば方法は制限されず、例えば、フェノー
ル／ＳＤＳ法、グアニジンイソチオシアネート／塩化セ
シウム法等、公知のいずれの方法によっても可能であ
る。こうして得た全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）担体を用
いてｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡを分離できる。また、全Ｒ
ＮＡを抽出せずにｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを得 ることの
できるキット（ＭＰＧ Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＣＰＧ，ＩＮＣ．社等）
を使用してもよい。
得するためには、先ず、ヘイケボタルから以下の方法
で、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを調製する。甲虫類組織か
らの全ＲＮＡの抽出には、効率よく損傷の少ないＲＮＡ
が得られるならば方法は制限されず、例えば、フェノー
ル／ＳＤＳ法、グアニジンイソチオシアネート／塩化セ
シウム法等、公知のいずれの方法によっても可能であ
る。こうして得た全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）担体を用
いてｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡを分離できる。また、全Ｒ
ＮＡを抽出せずにｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを得 ることの
できるキット（ＭＰＧ Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＣＰＧ，ＩＮＣ．社等）
を使用してもよい。
【０００８】次いで、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型に
し、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマー等
を用い、逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成す
る。更に、グブラ−ホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈ
ｏｆｆｍａｎ）法、オカヤマ−バーグ（Ｏｋａｙａｍａ
−Ｂｅｒｇ）法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ、１９８９）等により二本鎖ｃＤ
ＮＡを合成する。酵素遺伝子の発現量が少ない場合に
は、ＰＣＲを利用したｃＤＮＡライブラリー作製キット
〔ＣａｐｆｉｎｄｅｒＰＣＲ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ
社）等〕を用いて、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅して
もよい。このようにして合成したｃＤＮＡは、平滑末端
化、リンカーの付加、ＰＣＲによる制限酵素サイトの付
加等を行なうことにより、ファージベクター、プラスミ
ド等のクローニングベクターにクローニングできる。
し、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマー等
を用い、逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成す
る。更に、グブラ−ホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈ
ｏｆｆｍａｎ）法、オカヤマ−バーグ（Ｏｋａｙａｍａ
−Ｂｅｒｇ）法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ、１９８９）等により二本鎖ｃＤ
ＮＡを合成する。酵素遺伝子の発現量が少ない場合に
は、ＰＣＲを利用したｃＤＮＡライブラリー作製キット
〔ＣａｐｆｉｎｄｅｒＰＣＲ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ
社）等〕を用いて、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅して
もよい。このようにして合成したｃＤＮＡは、平滑末端
化、リンカーの付加、ＰＣＲによる制限酵素サイトの付
加等を行なうことにより、ファージベクター、プラスミ
ド等のクローニングベクターにクローニングできる。
【０００９】以上のようにして得られたｃＤＮＡ又はｃ
ＤＮＡライブラリーを鋳型としてPCR（polymerase chai
n reaction）を行なうことで、目的遺伝子の部分配列を
得ることができる。このとき用いるプライマーにはルシ
フェリン再生酵素のアミノ酸配列のどの部分に基づいて
もよいが、コドンの縮重が少なくかつ複雑な高次構造を
形成しないと思われる配列を選ぶのが望ましい。なお、
コドンの縮重がある場合、混合プライマー又はイノシン
を含むプライマーも使用することができる。PCRにより
得られた増幅産物は、370AＤＮＡシークエンス・システ
ム（パーキンエルマー社製）を用いた塩基配列の解析に
より、ルシフェリン再生酵素遺伝子の一部であるか、容
易に確認することができる。増幅産物がルシフェリン再
生酵素遺伝子の一部であることが確認されたら、その配
列からプライマーを作成し、5'RACE及び3'RACE （Rapid
Amplification of cDNA End: PCR PROTOCOLS A Guidet
o Methods and Applications, ACADEMIC press INC.p28
-38）を行なうことで、未知の５末端領域及び３'末端領
域を決定することができる。以上の操作により、容易に
完全長のルシフェリン再生酵素遺伝子の配列を決定する
ことができる。なお、5'RACE、 3'RACEには、例えば、
5'-Full RACE Core Set(TaKaRa社製)、 3'-Full RACE C
ore Set (TaKaRa社製)等を用いることができる。
ＤＮＡライブラリーを鋳型としてPCR（polymerase chai
n reaction）を行なうことで、目的遺伝子の部分配列を
得ることができる。このとき用いるプライマーにはルシ
フェリン再生酵素のアミノ酸配列のどの部分に基づいて
もよいが、コドンの縮重が少なくかつ複雑な高次構造を
形成しないと思われる配列を選ぶのが望ましい。なお、
コドンの縮重がある場合、混合プライマー又はイノシン
を含むプライマーも使用することができる。PCRにより
得られた増幅産物は、370AＤＮＡシークエンス・システ
ム（パーキンエルマー社製）を用いた塩基配列の解析に
より、ルシフェリン再生酵素遺伝子の一部であるか、容
易に確認することができる。増幅産物がルシフェリン再
生酵素遺伝子の一部であることが確認されたら、その配
列からプライマーを作成し、5'RACE及び3'RACE （Rapid
Amplification of cDNA End: PCR PROTOCOLS A Guidet
o Methods and Applications, ACADEMIC press INC.p28
-38）を行なうことで、未知の５末端領域及び３'末端領
域を決定することができる。以上の操作により、容易に
完全長のルシフェリン再生酵素遺伝子の配列を決定する
ことができる。なお、5'RACE、 3'RACEには、例えば、
5'-Full RACE Core Set(TaKaRa社製)、 3'-Full RACE C
ore Set (TaKaRa社製)等を用いることができる。
【００１０】また、ストリンジェントな条件のハイブリ
ダイゼーションにより、ｃＤＮＡライブラリーからルシ
フェリン再生酵素遺伝子をスクリーニングすることも可
能である。プローブに用いるＤＮＡ断片は、ルシフェリ
ン再生酵素のアミノ酸配列に基 づいて合成したオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとするPCRによって得ること
ができる。得られたＤＮＡ断片はラベルしてプローブと
することができる。ラベルにはラジオアイソトープ、ビ
オチン等、種々のものを用いることができるが、ランダ
ムプライミング法でラベルすることが望ましい。なお、
ｃＤＮＡライブラリーの作成は、例えば、STRATAGENE社
のZAP Express Vector Kitを用いて行なうことができ
る。ＤＮＡ断片の標識と、ハイブリダイゼーションの検
出は、例えば、DIG DNA標識・検出システム（ベーリン
ガー・マンハイム社製）等を用いて行なうことができ
る。なお前述した“ストリンジェントな条件”とは、特
異的なハイブリッドのみが選択的に形成され、シグナル
が検出されるが、非特異的なハイブリッドは形成されな
い条件である。このような条件は、個々の生物種により
若干異なるが、常法によりハイブリダイゼーションと洗
いの際の塩濃度又は温度をいくつか検討するのみで容易
に決定することができる。このような条件としては、例
えば、ハイブリダイゼーションは、5×SSC、1.0 %(W/V)
核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベー
リンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V) N-ラウロイル
サルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間
程度）で行なう。洗いは、0.1×SSC、0.1%(W/V)SDSを用
い、SSC濃度は0.1倍までの範囲で、また温度は３７℃で
の洗浄から始めて、６５℃までの範囲で変化させ、固定
されたＤＮＡ由来のシグナル がバックグラウンドと区
別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プ
ローブの検出を行う。
ダイゼーションにより、ｃＤＮＡライブラリーからルシ
フェリン再生酵素遺伝子をスクリーニングすることも可
能である。プローブに用いるＤＮＡ断片は、ルシフェリ
ン再生酵素のアミノ酸配列に基 づいて合成したオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとするPCRによって得ること
ができる。得られたＤＮＡ断片はラベルしてプローブと
することができる。ラベルにはラジオアイソトープ、ビ
オチン等、種々のものを用いることができるが、ランダ
ムプライミング法でラベルすることが望ましい。なお、
ｃＤＮＡライブラリーの作成は、例えば、STRATAGENE社
のZAP Express Vector Kitを用いて行なうことができ
る。ＤＮＡ断片の標識と、ハイブリダイゼーションの検
出は、例えば、DIG DNA標識・検出システム（ベーリン
ガー・マンハイム社製）等を用いて行なうことができ
る。なお前述した“ストリンジェントな条件”とは、特
異的なハイブリッドのみが選択的に形成され、シグナル
が検出されるが、非特異的なハイブリッドは形成されな
い条件である。このような条件は、個々の生物種により
若干異なるが、常法によりハイブリダイゼーションと洗
いの際の塩濃度又は温度をいくつか検討するのみで容易
に決定することができる。このような条件としては、例
えば、ハイブリダイゼーションは、5×SSC、1.0 %(W/V)
核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベー
リンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V) N-ラウロイル
サルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間
程度）で行なう。洗いは、0.1×SSC、0.1%(W/V)SDSを用
い、SSC濃度は0.1倍までの範囲で、また温度は３７℃で
の洗浄から始めて、６５℃までの範囲で変化させ、固定
されたＤＮＡ由来のシグナル がバックグラウンドと区
別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プ
ローブの検出を行う。
【００１１】このような条件でハイブリダイズするよう
なＤＮＡは、ルシフェリン再生酵素活性を有するポリペ
プチドをコードしている蓋然性が高いが、ルシフェリン
再生酵素活性を失うような変異を有するものも含まれ
る。しかし、それらについては、形質転換を行なった後
に、形質転換体のルシフェリン再生酵素活性の産生能を
測定することにより容易に取り除くことが可能である。
なＤＮＡは、ルシフェリン再生酵素活性を有するポリペ
プチドをコードしている蓋然性が高いが、ルシフェリン
再生酵素活性を失うような変異を有するものも含まれ
る。しかし、それらについては、形質転換を行なった後
に、形質転換体のルシフェリン再生酵素活性の産生能を
測定することにより容易に取り除くことが可能である。
【００１２】以上のような方法により、ルシフェリン再
生酵素遺伝子を取得したのち、常法に従いベクターＤＮ
Ａに組み込む。用いるベクターＤＮＡとしては、例え
ば、pUC19（宝酒造社製）、pBR322（宝酒造社製）、pT7
Blue（Novagen社製）、pBluescript SK+（Stratagene社
製）、pMAL-C2（NEW England Labs社製）等のプラスミ
ドＤＮＡ、λENBL3（Stratagene社製）、λDASH II（フ
ナコシ社製）等のバクテリオファージＤＮＡ等が挙げら
れる。得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大
腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM109（東洋紡社製）、Ｄ
Ｈ ５α（東洋紡社製）、XL1-Blue（フナコシ社製）等
を形質転換又は形質導入して夫々の形質転換体又は形質
導入体を得る。宿主細胞としては、上記以外に、例え
ば、大腸菌K-12以外の大腸菌等の細菌、酵母、かび、放
線菌、蚕、動物細胞等が用いられる。
生酵素遺伝子を取得したのち、常法に従いベクターＤＮ
Ａに組み込む。用いるベクターＤＮＡとしては、例え
ば、pUC19（宝酒造社製）、pBR322（宝酒造社製）、pT7
Blue（Novagen社製）、pBluescript SK+（Stratagene社
製）、pMAL-C2（NEW England Labs社製）等のプラスミ
ドＤＮＡ、λENBL3（Stratagene社製）、λDASH II（フ
ナコシ社製）等のバクテリオファージＤＮＡ等が挙げら
れる。得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大
腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM109（東洋紡社製）、Ｄ
Ｈ ５α（東洋紡社製）、XL1-Blue（フナコシ社製）等
を形質転換又は形質導入して夫々の形質転換体又は形質
導入体を得る。宿主細胞としては、上記以外に、例え
ば、大腸菌K-12以外の大腸菌等の細菌、酵母、かび、放
線菌、蚕、動物細胞等が用いられる。
【００１３】この形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの
方法（Method in Enzymology,68,326-331,1979）により
行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.Ho
hnの方法（Method in Enzymology,68,299-309,1979）に
より行なうことができる。上記形質転換体又は形質導入
体より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、
例えば、P.Guerry等の方法〔J.Bacteriology、第116
巻、第1064〜1066 頁(1973年)〕、D.B.Clewellの方法
〔J.Bacteriology、第110巻、第667〜676頁(1972年)〕
等により得ることができる。更に、上記ルシフェリン再
生酵素遺伝子を含有するＤＮＡを用いて、後述の実施例
１項目(9)に示す370AＤＮＡシークエンス・ システム
（パーキンエルマー社製）を用いてルシフェリン再生能
力を有するタンパク質をコードする遺伝子の全塩基配列
の解析を行ない（配列番号１参照）、次いで、前記塩基
配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペプチドの
アミノ酸の一次配列を確定する。（配列番号２参照） なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１
もしくは複数、好ましくは数個のアミノ酸が欠失、置換
もしくは付加されており、かつ、ルシフェリン再生能力
を有するアミノ酸配列をコードするルシフェリン再生能
力を有するタンパク質遺伝子は、全て本発明に含まれ
る。また配列番号２に示されるアミノ酸配列と60％以
上、好ましくは80％以上の相同性を有し、かつルシフェ
リンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺
伝子は、全て本発明に含まれる。そして、配列番号２に
示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、ルシ
フェリン再生能力を有するアミノ酸配列をコードするル
シフェリン再生能力を有するタンパク質遺伝子を得るに
は、如何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異ま
たは欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特
定変異誘導法、遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選択
されたヌクレオチドを除去または付加し、遺伝子を連結
する方法、オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられ
る。
方法（Method in Enzymology,68,326-331,1979）により
行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.Ho
hnの方法（Method in Enzymology,68,299-309,1979）に
より行なうことができる。上記形質転換体又は形質導入
体より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、
例えば、P.Guerry等の方法〔J.Bacteriology、第116
巻、第1064〜1066 頁(1973年)〕、D.B.Clewellの方法
〔J.Bacteriology、第110巻、第667〜676頁(1972年)〕
等により得ることができる。更に、上記ルシフェリン再
生酵素遺伝子を含有するＤＮＡを用いて、後述の実施例
１項目(9)に示す370AＤＮＡシークエンス・ システム
（パーキンエルマー社製）を用いてルシフェリン再生能
力を有するタンパク質をコードする遺伝子の全塩基配列
の解析を行ない（配列番号１参照）、次いで、前記塩基
配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペプチドの
アミノ酸の一次配列を確定する。（配列番号２参照） なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１
もしくは複数、好ましくは数個のアミノ酸が欠失、置換
もしくは付加されており、かつ、ルシフェリン再生能力
を有するアミノ酸配列をコードするルシフェリン再生能
力を有するタンパク質遺伝子は、全て本発明に含まれ
る。また配列番号２に示されるアミノ酸配列と60％以
上、好ましくは80％以上の相同性を有し、かつルシフェ
リンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺
伝子は、全て本発明に含まれる。そして、配列番号２に
示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、ルシ
フェリン再生能力を有するアミノ酸配列をコードするル
シフェリン再生能力を有するタンパク質遺伝子を得るに
は、如何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異ま
たは欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特
定変異誘導法、遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選択
されたヌクレオチドを除去または付加し、遺伝子を連結
する方法、オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられ
る。
【００１４】上記のようにして得られたルシフェリン再
生能力を有する形質転換体又は形質導入体、例えば、エ
ッシェリシア属に属する菌株を用いてルシフェリン再生
能力を有するタンパク質を生産するには、下記のように
して行なうことができる。上記微生物を培養するには、
通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体培
養法を採用して培養するのが好ましい。また、上記微生
物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプ
トン、肉エキス、コーンステイープリカーあるいは大豆
もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン
酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン
等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質
原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。な
お、培地の初発pHは、7〜9に調整するのが適当である。
また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃前後で6〜24時
間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により
実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物よりルシ
フェリン再生能力を有するタンパク質を採取するには、
通常の酵素採取手段を用いることができる。
生能力を有する形質転換体又は形質導入体、例えば、エ
ッシェリシア属に属する菌株を用いてルシフェリン再生
能力を有するタンパク質を生産するには、下記のように
して行なうことができる。上記微生物を培養するには、
通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体培
養法を採用して培養するのが好ましい。また、上記微生
物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプ
トン、肉エキス、コーンステイープリカーあるいは大豆
もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン
酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン
等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質
原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。な
お、培地の初発pHは、7〜9に調整するのが適当である。
また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃前後で6〜24時
間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により
実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物よりルシ
フェリン再生能力を有するタンパク質を採取するには、
通常の酵素採取手段を用いることができる。
【００１５】培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からルシ
フェリン再生酵素を採取することが好ましい。この場
合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕
機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を
用いて菌体を破壊する方法、リゾチーム等の細胞壁溶解
酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ-1
00等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法
等により、菌体からルシフェリン再生酵素を採取するの
が好ましい。このようにして得られたルシフェリン再生
酵素を含む菌体破砕液からルシフェリン再生酵素を単離
するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用でき
る。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換
クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着ク
ロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行な
うのが好ましい。
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からルシ
フェリン再生酵素を採取することが好ましい。この場
合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕
機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を
用いて菌体を破壊する方法、リゾチーム等の細胞壁溶解
酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ-1
00等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法
等により、菌体からルシフェリン再生酵素を採取するの
が好ましい。このようにして得られたルシフェリン再生
酵素を含む菌体破砕液からルシフェリン再生酵素を単離
するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用でき
る。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換
クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着ク
ロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行な
うのが好ましい。
【００１６】ルシフェリン再生能力は、以下に示す方法
により測定することができる。 （ルシフェリン再生能力測定法） （試薬） Ａ 0.1mM オキシルシフェリン Ｂ 0.01mM D-システイン Ｃ 25mM グリシルグリシン＋5.4mM 硫酸マグネシウ
ム Ｄ 10mM ATP（pH7.8） Ｅ 5mg/ml ルシフェラーゼ （手順） １ 下記反応混液を調製する。 0.005ml Ａ 0.010ml Ｂ 0.085ml Ｃ ２ タンパク質溶液0.01mlを添加し、37℃で一定時間反
応させる。 ３ 反応液0.01mlとＣ0.1mlを混合する。 ４ 下記ルシフェラーゼ混液を調整する。 10ml Ｄ 1ml Ｅ ５ 項目３の混合液に項目４の混液を0.1ml添加し、ル
ミノメーターで発光量を測定する。
により測定することができる。 （ルシフェリン再生能力測定法） （試薬） Ａ 0.1mM オキシルシフェリン Ｂ 0.01mM D-システイン Ｃ 25mM グリシルグリシン＋5.4mM 硫酸マグネシウ
ム Ｄ 10mM ATP（pH7.8） Ｅ 5mg/ml ルシフェラーゼ （手順） １ 下記反応混液を調製する。 0.005ml Ａ 0.010ml Ｂ 0.085ml Ｃ ２ タンパク質溶液0.01mlを添加し、37℃で一定時間反
応させる。 ３ 反応液0.01mlとＣ0.1mlを混合する。 ４ 下記ルシフェラーゼ混液を調整する。 10ml Ｄ 1ml Ｅ ５ 項目３の混合液に項目４の混液を0.1ml添加し、ル
ミノメーターで発光量を測定する。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。 実施例１ (1)ヘイケボタルｍＲＮＡの調製 ヘイケボタル尾部10ｇを、乳鉢と乳棒で粉砕し、ＲＮＡ
抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）10mlに縣濁し、
2700 r.p.m.で５分遠心分離することによりＲＮＡ画分
を得た。これより、Current Protocols in MolecularBi
ology（WILEY Interscience,1989）記載の方法に従い、
ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ 0.5mgを得た。 (2)プライマーの合成 本発明者等が別途取得した、ヘイケボタル由来のルシフ
ェリン再生酵素（U.S.Pat. No.5814504, Example 3）を
もとにプライマーを作製することにした。先ず、ヘイケ
ボタル由来のルシフェリン再生酵素をペプチダーゼで断
片化し、これを逆相クロマトグラフィーに供しピークを
分取した。得られた数種のペプチドについて、ABI470A
プロテインシークエンサー（パーキンエルマー製）を用
いてアミノ酸配列を決定した。このようにして決定した
アミノ酸配列をもとにして、HR12（配列番号４）及びKN
14（配列番号３）のプライマーを設計し、アマシャム・
ファルマシア・バイオテク株式会社のカスタムＤＮＡ受
託サービスにて合成した 。
明する。 実施例１ (1)ヘイケボタルｍＲＮＡの調製 ヘイケボタル尾部10ｇを、乳鉢と乳棒で粉砕し、ＲＮＡ
抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）10mlに縣濁し、
2700 r.p.m.で５分遠心分離することによりＲＮＡ画分
を得た。これより、Current Protocols in MolecularBi
ology（WILEY Interscience,1989）記載の方法に従い、
ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ 0.5mgを得た。 (2)プライマーの合成 本発明者等が別途取得した、ヘイケボタル由来のルシフ
ェリン再生酵素（U.S.Pat. No.5814504, Example 3）を
もとにプライマーを作製することにした。先ず、ヘイケ
ボタル由来のルシフェリン再生酵素をペプチダーゼで断
片化し、これを逆相クロマトグラフィーに供しピークを
分取した。得られた数種のペプチドについて、ABI470A
プロテインシークエンサー（パーキンエルマー製）を用
いてアミノ酸配列を決定した。このようにして決定した
アミノ酸配列をもとにして、HR12（配列番号４）及びKN
14（配列番号３）のプライマーを設計し、アマシャム・
ファルマシア・バイオテク株式会社のカスタムＤＮＡ受
託サービスにて合成した 。
【００１８】(3) RT-PCR 反応液を、以下の組成で調整し、42℃で30分間逆転写反
応を行なった後、99℃で5分間変性させ、５℃で保存し
た。 （反応組成液） 使用量 25 mM MgCl2 4 μl *10x RNA PCR バッファー 2 μl 10 mM dNTP Mixture 2 μl 40 U/ μl RNase Inhibitor 0.5 μl 5 U/ μl *AMV逆転写酵素XL 1 μl 2.5 pmol/ μl *oligo dT-Adaptor プライマー 1 μl mRNA １μｇ 滅菌蒸留水 最終容量20μlになるよう加える。 *宝酒造社製 次いで、下記の組成で調製した反応液80μｌを逆転写を
行なったチューブに添加した。変性を94℃で30秒間、ア
ニールを62℃で30秒間、伸長反応を72℃で1.5分間を１
サイクルとし、30サイクルの反応によりPCRを行なっ
た。 （反応液組成） 使用量 20 pmol/ μl フ゜ライマー KN14（配列番号３） 1 μl 20 pmol/ μl フ゜ライマー HR12（配列番号４） 1 μl *10×RNA PCR バッファー 8 μl 25 mM MgCl2 6 μl 5 U/ μl *Taqポリメラーゼ 0.5 μl 滅菌蒸留水 63.5 μl *宝酒造社製 PCR終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した
ところ、約600bpの位置に目的の増幅断片と思われるバ
ンドが確認されたので、そのバンドを切り出しGENECLEA
N II（BIO 101社製）にて精製した。
応を行なった後、99℃で5分間変性させ、５℃で保存し
た。 （反応組成液） 使用量 25 mM MgCl2 4 μl *10x RNA PCR バッファー 2 μl 10 mM dNTP Mixture 2 μl 40 U/ μl RNase Inhibitor 0.5 μl 5 U/ μl *AMV逆転写酵素XL 1 μl 2.5 pmol/ μl *oligo dT-Adaptor プライマー 1 μl mRNA １μｇ 滅菌蒸留水 最終容量20μlになるよう加える。 *宝酒造社製 次いで、下記の組成で調製した反応液80μｌを逆転写を
行なったチューブに添加した。変性を94℃で30秒間、ア
ニールを62℃で30秒間、伸長反応を72℃で1.5分間を１
サイクルとし、30サイクルの反応によりPCRを行なっ
た。 （反応液組成） 使用量 20 pmol/ μl フ゜ライマー KN14（配列番号３） 1 μl 20 pmol/ μl フ゜ライマー HR12（配列番号４） 1 μl *10×RNA PCR バッファー 8 μl 25 mM MgCl2 6 μl 5 U/ μl *Taqポリメラーゼ 0.5 μl 滅菌蒸留水 63.5 μl *宝酒造社製 PCR終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した
ところ、約600bpの位置に目的の増幅断片と思われるバ
ンドが確認されたので、そのバンドを切り出しGENECLEA
N II（BIO 101社製）にて精製した。
【００１９】(4) 精製したＤＮＡ断片を370AＤＮＡシー
クエンス・システム（パーキンエルマー社製）にて塩基
配列の決定及び解析を行なった。決定した塩基配列から
予想されるアミノ酸配列に、(2)で得られたペプチド断
片が含まれていることを確認した。 (5) 3'-RACEによる下流領域の解析 先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
アマシャム・ファルマシアバイオテク社の受託サービス
により合成した（HN003、配列番号５）。これと上記の
ｍＲＮＡと3'-Full RACE CoreSet（宝酒造社製）用い
て3'-RACEを行ない、3'未知領域の増幅を行なった。反
応液をアガロース電気泳動にかけ、約400bpのＤＮＡ断
片をRecoChip（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシー
クエンサーで塩基配列の決定及び解析を行なったとこ
ろ、決定した塩基配列の5'領域に上記ルシフェリン再生
能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の配列と同
じ配列を含んでいることが確認された。
クエンス・システム（パーキンエルマー社製）にて塩基
配列の決定及び解析を行なった。決定した塩基配列から
予想されるアミノ酸配列に、(2)で得られたペプチド断
片が含まれていることを確認した。 (5) 3'-RACEによる下流領域の解析 先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
アマシャム・ファルマシアバイオテク社の受託サービス
により合成した（HN003、配列番号５）。これと上記の
ｍＲＮＡと3'-Full RACE CoreSet（宝酒造社製）用い
て3'-RACEを行ない、3'未知領域の増幅を行なった。反
応液をアガロース電気泳動にかけ、約400bpのＤＮＡ断
片をRecoChip（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシー
クエンサーで塩基配列の決定及び解析を行なったとこ
ろ、決定した塩基配列の5'領域に上記ルシフェリン再生
能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の配列と同
じ配列を含んでいることが確認された。
【００２０】(6) 5'-RACEによる上流領域の解析 先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
アマシャム・ファルマシアバイオテク社の受託サービス
により合成した〔HR101（配列番号６）、 HR102（配列
番号７）、 HR103（配列番号８）、 HN104（配列番号
９）、 HN105（配列番号１０）〕。これと上記ヘイケボ
タルｍＲＮＡと5'-Full RACE CoreSet（宝酒造社製）
用いてＲＴ−ＰＣＲを行ない、5'未知領域の増幅を行な
った。反応液をアガロース電気泳動にかけ、約300bpの
ＤＮＡ断片をRecoChip（宝酒造社製）で 精製抽出し、
ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の決定及び解析を行な
った。決定した塩基配列の3'領域に上記ルシフェリン再
生能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の配列と
同じ配列を含むことが確認された。 (7)ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子断片の取得 上記３つの塩基配列より、翻訳開始コドンと終止コドン
を推定し、Ｎ末領域とＣ末領域に相当する塩基配列のプ
ライマーＤＮＡをアマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社の受託サービスにより合成した〔porf101（配列番
号１１）, porf102（配列番号１２）〕。これらと上記
ヘイケボタルｍＲＮＡによりＲＴ−ＰＣＲを行ない、反
応液をアガロース電気泳動で解析した。その結果、約90
0ｂｐのバンドが確認された。このバンドに含まれるＤ
ＮＡ断片をRecoChip（宝酒造社製）で精製した。精製し
たＤＮＡ断片をプラスミドpT7Blue（Novagen社製）にク
ローニングし、得られたプラスミドでE. coli JM109を
形質転換した。該形質転換株、即ち、大腸菌JM109(pHlr
e)は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢ
Ｐ−７２４８として寄託されている。
アマシャム・ファルマシアバイオテク社の受託サービス
により合成した〔HR101（配列番号６）、 HR102（配列
番号７）、 HR103（配列番号８）、 HN104（配列番号
９）、 HN105（配列番号１０）〕。これと上記ヘイケボ
タルｍＲＮＡと5'-Full RACE CoreSet（宝酒造社製）
用いてＲＴ−ＰＣＲを行ない、5'未知領域の増幅を行な
った。反応液をアガロース電気泳動にかけ、約300bpの
ＤＮＡ断片をRecoChip（宝酒造社製）で 精製抽出し、
ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の決定及び解析を行な
った。決定した塩基配列の3'領域に上記ルシフェリン再
生能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の配列と
同じ配列を含むことが確認された。 (7)ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子断片の取得 上記３つの塩基配列より、翻訳開始コドンと終止コドン
を推定し、Ｎ末領域とＣ末領域に相当する塩基配列のプ
ライマーＤＮＡをアマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社の受託サービスにより合成した〔porf101（配列番
号１１）, porf102（配列番号１２）〕。これらと上記
ヘイケボタルｍＲＮＡによりＲＴ−ＰＣＲを行ない、反
応液をアガロース電気泳動で解析した。その結果、約90
0ｂｐのバンドが確認された。このバンドに含まれるＤ
ＮＡ断片をRecoChip（宝酒造社製）で精製した。精製し
たＤＮＡ断片をプラスミドpT7Blue（Novagen社製）にク
ローニングし、得られたプラスミドでE. coli JM109を
形質転換した。該形質転換株、即ち、大腸菌JM109(pHlr
e)は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢ
Ｐ−７２４８として寄託されている。
【００２１】(8)活性の確認 大腸菌JM109(pHlre)菌体を、75μg/mlのアンピシリンを
含むTY培地（１％ バクトトリプトン、0.5％ バクトイ
ースト・エクストラクト、0.5％ NaCl、pH7.0）10mlに
て37℃でクレット100まで振とう培養した後、IPTGを終
濃度１ｍMとなるよう添加し、更に、４時間培養した。
この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicg
enerator、Nissei社製)を用いて20秒４回処理した。これ
をエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、
12,000r.p.m.で10分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画
分に分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し
かえた。前述した酵素活性測定法によりルシフェリン再
生能力を測定したところ、ベクターのみ含む大腸菌が0.
95 kcount/mlであるのに対し、JM109(pHlre)は8.6kcoun
t/mlとルシフェリン再生能力を有していた。 (9)ルシフェリン再生能力を有するタンパク質をコード
する遺伝子の解析 大腸菌JM109(pHlre)のルシフェリン再生能力が確認され
たので、pHlreの挿入断片にルシフェリン再生酵素遺伝
子が含まれていることが明らかとなった。そこで、この
プラスミドＤＮＡについて370AＤＮＡシークエンス・シ
ステム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決
定を行なった。決定した塩基配列を配列番号１に、ま
た、該ＤＮＡ配列から翻訳されると予想されるアミノ酸
配列を配列番号２に夫々示した。ルシフェリン再生酵素
遺伝子は、924bpのコーディング領域を有し、307個のア
ミノ酸をコードしていた。
含むTY培地（１％ バクトトリプトン、0.5％ バクトイ
ースト・エクストラクト、0.5％ NaCl、pH7.0）10mlに
て37℃でクレット100まで振とう培養した後、IPTGを終
濃度１ｍMとなるよう添加し、更に、４時間培養した。
この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicg
enerator、Nissei社製)を用いて20秒４回処理した。これ
をエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、
12,000r.p.m.で10分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画
分に分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し
かえた。前述した酵素活性測定法によりルシフェリン再
生能力を測定したところ、ベクターのみ含む大腸菌が0.
95 kcount/mlであるのに対し、JM109(pHlre)は8.6kcoun
t/mlとルシフェリン再生能力を有していた。 (9)ルシフェリン再生能力を有するタンパク質をコード
する遺伝子の解析 大腸菌JM109(pHlre)のルシフェリン再生能力が確認され
たので、pHlreの挿入断片にルシフェリン再生酵素遺伝
子が含まれていることが明らかとなった。そこで、この
プラスミドＤＮＡについて370AＤＮＡシークエンス・シ
ステム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決
定を行なった。決定した塩基配列を配列番号１に、ま
た、該ＤＮＡ配列から翻訳されると予想されるアミノ酸
配列を配列番号２に夫々示した。ルシフェリン再生酵素
遺伝子は、924bpのコーディング領域を有し、307個のア
ミノ酸をコードしていた。
【００２２】実施例２ プラークハイブリダイゼーション ZAP Express Vector Kit (ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製)
を用いてヘイケボタルcDNAライブラリーを作製した。次
いで、実施例１（３）のRT-PCRにより得られた約600bp
の増幅断片をテンプレート、HR12（配列番号４）、 KN1
4（配列番号３）をプライマーとして、PCRによりジゴキ
シゲニン(DIG)ラベルされたDNAプローブを作製した。条
件は、0.2ml容量のPCR用チューブに滅菌蒸留水37.75 μ
l、10×バッファー5μl、プライマーDNAの100pmol/μl
溶液1 μl×2種、テンプレートDNA溶液1μl、PCR DIGミ
ックス10倍濃度(ベーリンガー・マンハイム社製)4μl
及びExTaqDNAポリメラーゼ0.25μl を入れ、混和した
後、ミネラルオイル20μl を滴下しRoboCycler Gradien
t 96にセットした。1)95℃30秒、2)95℃30秒、3)62℃30
秒、4)72℃40秒、2)〜4)を45サイクル、5)72℃2分のプ
ログラムをセットし、反応を実施した。反応液よりエタ
ノール沈殿によって増幅断片を回収し、50μl のTEバッ
ファーに溶解してDIGラベルプローブを得た。
を用いてヘイケボタルcDNAライブラリーを作製した。次
いで、実施例１（３）のRT-PCRにより得られた約600bp
の増幅断片をテンプレート、HR12（配列番号４）、 KN1
4（配列番号３）をプライマーとして、PCRによりジゴキ
シゲニン(DIG)ラベルされたDNAプローブを作製した。条
件は、0.2ml容量のPCR用チューブに滅菌蒸留水37.75 μ
l、10×バッファー5μl、プライマーDNAの100pmol/μl
溶液1 μl×2種、テンプレートDNA溶液1μl、PCR DIGミ
ックス10倍濃度(ベーリンガー・マンハイム社製)4μl
及びExTaqDNAポリメラーゼ0.25μl を入れ、混和した
後、ミネラルオイル20μl を滴下しRoboCycler Gradien
t 96にセットした。1)95℃30秒、2)95℃30秒、3)62℃30
秒、4)72℃40秒、2)〜4)を45サイクル、5)72℃2分のプ
ログラムをセットし、反応を実施した。反応液よりエタ
ノール沈殿によって増幅断片を回収し、50μl のTEバッ
ファーに溶解してDIGラベルプローブを得た。
【００２３】以上により作製した、ヘイケボタルｃＤＮ
Ａライブラリー及びＤＮＡプローブを用いてプラーク・
ハイブリダイゼーションを行なった。キットのマニュア
ルに従い、5枚の寒天培地に１枚あたり約5×103個のプ
ラークを形成させた。これらの寒天 培地上のプラーク
からHyBond-N+ナイロントランスファーメンブレン(アマ
シャム社製)に、メンブレンの説明書に従ってＤＮＡを
トランスファーした。なお、この際、非特異のシグナル
を排除するために、1枚の寒天培地につき2枚のメンブレ
ンにトランスファーを行なった。上記メンブレンについ
て、作成したDIG-DNAプローブ、DIGシステム(ベーリン
ガー・マンハイム社製)を用いて「DIGシステムを用いて
ハイブリダイゼーションを行うためのユーザーガイド」
37-40頁、ベーリンガー・マンハイム社(1996)に従って
ハイブリダイゼーション・検出を行なった。このスクリ
ーニングにおいて陽性クローンの候補株を４株得た。得
られた候補株について同様の二次スクリーニングを行な
い、純化した陽性クローンを１株取得した。このファー
ジクローンについて、キットの説明書に従い、in vitro
excisionを行ない、プラスミドpHPとして回収した。こ
のプラスミドpHPで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形
質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を解
析するための試料とした。挿入ｃＤＮＡの塩基配列の解
析にはＴａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（パーキンエ
ルマー社製）を用いる従来公知の方で行なった。この結
果、挿入ｃＤＮＡは配列表の配列番号１と同一の塩基配
列を有することが明らかとなり、ヘイケボタル由来のル
シフェリン再生酵素をコードする遺伝子であることが確
認された。
Ａライブラリー及びＤＮＡプローブを用いてプラーク・
ハイブリダイゼーションを行なった。キットのマニュア
ルに従い、5枚の寒天培地に１枚あたり約5×103個のプ
ラークを形成させた。これらの寒天 培地上のプラーク
からHyBond-N+ナイロントランスファーメンブレン(アマ
シャム社製)に、メンブレンの説明書に従ってＤＮＡを
トランスファーした。なお、この際、非特異のシグナル
を排除するために、1枚の寒天培地につき2枚のメンブレ
ンにトランスファーを行なった。上記メンブレンについ
て、作成したDIG-DNAプローブ、DIGシステム(ベーリン
ガー・マンハイム社製)を用いて「DIGシステムを用いて
ハイブリダイゼーションを行うためのユーザーガイド」
37-40頁、ベーリンガー・マンハイム社(1996)に従って
ハイブリダイゼーション・検出を行なった。このスクリ
ーニングにおいて陽性クローンの候補株を４株得た。得
られた候補株について同様の二次スクリーニングを行な
い、純化した陽性クローンを１株取得した。このファー
ジクローンについて、キットの説明書に従い、in vitro
excisionを行ない、プラスミドpHPとして回収した。こ
のプラスミドpHPで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形
質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を解
析するための試料とした。挿入ｃＤＮＡの塩基配列の解
析にはＴａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（パーキンエ
ルマー社製）を用いる従来公知の方で行なった。この結
果、挿入ｃＤＮＡは配列表の配列番号１と同一の塩基配
列を有することが明らかとなり、ヘイケボタル由来のル
シフェリン再生酵素をコードする遺伝子であることが確
認された。
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、ルシフェリン再生能力
を有するタンバク質を効率よく生産することができるの
で、本発明は、産業上極めて有用である。
を有するタンバク質を効率よく生産することができるの
で、本発明は、産業上極めて有用である。
【００２５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KIKKOMAN CORPORATION <120> A gene coding protein having the ability to regeneate luciferin, recombinant DNA and process for the preparation of protein having the ability to regeneate luciferin <130> P2172 <160> 12 <210> 1 <211> 924 <212> DNA <213> Luciola lateralis <400> 1 atgtcgccag ttattgaaca gatcactgaa gtagacaatt tccaaatcgg agagggtcca 60 cactgggata ccgaaacaca aagtttgtat tttgtggata ttctagaaaa atccatacac 120 aaatacgtac catcgacaaa acaacatact aaaatgattt tgaataaacg tccgtctttt 180 attataccaa taaaagaaac atctgatcgg tttgtcataa gtttagaacg agacatttgc 240 gttcttactt gggatggtgt tagtgccacg ccaagtcatt tagaaacaat agttaccgtt 300 gatacgggaa tcgaaggaaa tacattcaat gatggtaaag cagatgcgtt tggcaatttg 360 tgggcaggta cattatatag taaattcgat attgaaaaac aaggtcctaa tacaggaaca 420 ttgtacagcc tgtctaataa gcagttaaga aaacatattt ctaatatctt cctatcaaat 480 ggcctagcct ggaataaaga ctcaaaaaaa ttttatttta tcgactccaa taaaagaaca 540 atagatcagt ttgattatga ttctgaaaat ttaattatat caaattgtca accattgttt 600 actctggaca aacatgggat acagggttta cctgatgccc aaacgataga tgaaaatgat 660 aatttatggg ttgctatagt tcgaggagga aaagttataa atattggtac taagcaaccc 720 gaatctttgc ttggtgttat taacatgcct gaaagtttga taacttcagt ttgttttgga 780 ggatcaaagt tggacgaact ttatgtaacg acttctggta tcaaagagta tgaaactgac 840 tctacaaaac tagtaaaggg tggattgtac agagttactg gattaggtgt taaaggttta 900 cccgcacaca gattcagtct ctaa 924
【００２６】 <210> 2 <211> 307 <212> PRT <213> Luciola lateralis <400> 2 Met Ser Pro Val Ile Glu Gln Ile Thr Glu Val Asp Asn Phe Gln Ile 1 5 10 15 Gly Glu Gly Pro His Trp Asp Thr Glu Thr Gln Ser Leu Tyr Phe Val 20 25 30 Asp Ile Leu Glu Lys Ser Ile His Lys Tyr Val Pro Ser Thr Lys Gln 35 40 45 His Thr Lys Met Ile Leu Asn Lys Arg Pro Ser Phe Ile Ile Pro Ile 50 55 60 Lys Glu Thr Ser Asp Arg Phe Val Ile Ser Leu Glu Arg Asp Ile Cys 65 70 75 80 Val Leu Thr Trp Asp Gly Val Ser Ala Thr Pro Ser His Leu Glu Thr 85 90 95 Ile Val Thr Val Asp Thr Gly Ile Glu Gly Asn Thr Phe Asn Asp Gly 100 105 110 Lys Ala Asp Ala Phe Gly Asn Leu Trp Ala Gly Thr Leu Tyr Ser Lys 115 120 125 Phe Asp Ile Glu Lys Gln Gly Pro Asn Thr Gly Thr Leu Tyr Ser Leu 130 135 140 Ser Asn Lys Gln Leu Arg Lys His Ile Ser Asn Ile Phe Leu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Leu Ala Trp Asn Lys Asp Ser Lys Lys Phe Tyr Phe Ile Asp Ser 165 170 175 Asn Lys Arg Thr Ile Asp Gln Phe Asp Tyr Asp Ser Glu Asn Leu Ile 180 185 190 Ile Ser Asn Cys Gln Pro Leu Phe Thr Leu Asp Lys His Gly Ile Gln 195 200 205 Gly Leu Pro Asp Ala Gln Thr Ile Asp Glu Asn Asp Asn Leu Trp Val 210 215 220 Ala Ile Val Arg Gly Gly Lys Val Ile Asn Ile Gly Thr Lys Gln Pro 225 230 235 240 Glu Ser Leu Leu Gly Val Ile Asn Met Pro Glu Ser Leu Ile Thr Ser 245 250 255 Val Cys Phe Gly Gly Ser Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Val Thr Thr Ser 260 265 270 Gly Ile Lys Glu Tyr Glu Thr Asp Ser Thr Lys Leu Val Lys Gly Gly 275 280 285 Leu Tyr Arg Val Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Leu Pro Ala His Arg 290 295 300 Phe Ser Leu 305
【００２７】 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ggn gar ggn ccn cay tgg ga 20
【００２８】 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 crt cda tng tyt gnc crt cng g 22
【００２９】 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gga caa aca tgg gat aca gg 20
【００３０】 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 cag gct gta caa tgt tcc tgt 21
【００３１】 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gac aaa ccg atc aga tgt ttc 21
【００３２】 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 gtt gtt ttg tcg atg gta cg 20
【００３３】 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ctt ggg atg gtg tta gtg cc 20
【００３４】 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 tac cgt tga tac ggg aat cg 20
【００３５】 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 atg tcg cca gtt att gaa cag 21
【００３６】 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tta gag act gaa tct gtg tgc 21
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA14 4B050 CC03 DD11 LL03 4B065 AA26X AA90Y AB01 AC14 BA24 CA28 CA46
Claims (5)
- 【請求項１】以下の(a)または(b)のタンパク質をコード
する遺伝子。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつルシフェリンを再生する能力を有するタンパク
質 - 【請求項２】以下の(a)または(b)のＤＮＡからなる遺伝
子。 (a)配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ (b)(a)の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖配列とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつルシフェ
リンを再生する能力を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ - 【請求項３】請求項１または２記載のルシフェリンを再
生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子をベ
クターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体Ｄ
ＮＡ。 - 【請求項４】請求項３記載の組み換え体ＤＮＡを含む形
質転換体または形質導入体。 - 【請求項５】請求項４記載の形質転換体または形質導入
体を培地に培養し、培養物からルシフェリンを再生する
能力を有するタンパク質を採取することを特徴とするル
シフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造
法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000228227A JP4158956B2 (ja) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
| DE60124921T DE60124921T2 (de) | 2000-07-28 | 2001-07-26 | GENE, WELCHE FüR LUZIFERIN REGENERIERENDE PROTEINE KODIEREN, REKOMBINANTE DNA UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES LUZIFERIN REGENERIERENDEN PROTEINS |
| AT01954353T ATE346927T1 (de) | 2000-07-28 | 2001-07-26 | Gene, welche für luziferin regenerierende proteine kodieren, rekombinante dna und verfahren zur herstellung eines luziferin regenerierenden proteins |
| US10/333,740 US7101694B2 (en) | 2000-07-28 | 2001-07-26 | Genes encoding proteins capable of regenerating luciferin, recombinant DNA and process for producing protein capable of regenerating luciferin |
| EP01954353A EP1306435B1 (en) | 2000-07-28 | 2001-07-26 | Genes encoding proteins capable of regenerating luciferin, recombinant dna and process for producing protein capable of regenerating luciferin |
| PCT/JP2001/006455 WO2002010384A1 (fr) | 2000-07-28 | 2001-07-26 | Genes codant des proteines capables de regenerer la luciferine, adn recombine et methode de production de proteines capables de regenerer la luciferine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000228227A JP4158956B2 (ja) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
Publications (2)
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|---|---|
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| EP (1) | EP1306435B1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010013295A (ja) * | 2008-07-01 | 2010-01-21 | Kyocera Corp | 圧電磁器およびそれを用いた圧電素子 |
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|---|---|---|---|---|
| US7290471B2 (en) * | 2005-11-15 | 2007-11-06 | 3M Innovative Properties Company | Cutting tool having variable rotation about a y-direction transversely across a work piece for making microstructures |
| US7350441B2 (en) * | 2005-11-15 | 2008-04-01 | 3M Innovative Properties Company | Cutting tool having variable movement at two simultaneously independent speeds in an x-direction into a work piece for making microstructures |
| US7293487B2 (en) * | 2005-11-15 | 2007-11-13 | 3M Innovative Properties Company | Cutting tool having variable and independent movement in an x-direction and a z-direction into and laterally along a work piece for making microstructures |
| US7350442B2 (en) * | 2005-11-15 | 2008-04-01 | 3M Innovative Properties Company | Cutting tool having variable movement in a z-direction laterally along a work piece for making microstructures |
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| US20120021923A1 (en) * | 2010-05-04 | 2012-01-26 | Contag Christopher H | Methods and systems to diagnose a condition in an individual |
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|---|---|---|---|---|
| US5814504A (en) * | 1996-08-22 | 1998-09-29 | Kikkoman Corporation | Protein involved in regenerating firefly luciferin |
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2001
- 2001-07-26 WO PCT/JP2001/006455 patent/WO2002010384A1/ja active IP Right Grant
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- 2001-07-26 AT AT01954353T patent/ATE346927T1/de not_active IP Right Cessation
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- 2001-07-26 US US10/333,740 patent/US7101694B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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