JPH09275985A - サーモコッカス・プロフンダス由来の熱安定性ｄｎａポリメラーゼ、該酵素をコードする遺伝子およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な耐熱性細菌から熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼを得る。 【解決手段】 サーモコッカス・プロフンダス(Thermoc
occus profundus)由来の下記理化学的性質を有する熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼ。 作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳
型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触
媒する。 （２）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。 熱安定性：９５℃、３０分間処理で約４０％以上の残存
活性を有する。 分子量：約８６〜９２ＫＤａ 上記酵素をコードする単離されたＤＮＡ、該ＤＮＡをベ
クターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクター、該ＤＮＡ
組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主
細胞、該組換え宿主細胞を培養し、培養物からＤＮＡポ
リメラーゼを採取することを特徴とする熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なサーモコッカ
ス・プロフンダス(Thermococcus profundus)由来の熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼおよび該熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含むＤＮＡ組換
え発現ベクター、該組換え発現ベクターで形質転換され
た宿主細胞ならびに該組換え宿主細胞を使用する熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、大腸菌のような中温性細菌の
ＤＮＡポリメラーゼおよび中温性細菌に感染するファー
ジ由来のＤＮＡポリメラーゼに関しては、既に多くの研
究がなされている。また、最近、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲと略記する）等の核酸増幅法を用いる組換えＤ
ＮＡ技術に有用な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する
研究も多くなされている。ＰＣＲ反応に用いられる熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼは、主としてサーマス・サーモ
フィラス(Thermus thermophilus)由来のＤＮＡポリメラ
ーゼ(Tth DNAポリメラーゼ) や、サーマス・アクアチカ
ス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ(Taq
DNAポリメラーゼ) などが用いられてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来か
ら知られている熱安定性ＤＮＡポリメラーゼには、耐熱
性を有するものの、その熱安定性や、有機溶媒に対する
安定性に若干、問題を残しているものがある。また、核
酸の取り込みの際の正確性に欠ける点もあり、ＤＮＡ配
列決定やポリメラーゼ連鎖反応に、これらの酵素を用い
るにあたり、解決すべき課題が残っている。そのため、
これらの欠点を解消する新規な熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼが待ち望まれていた。

【０００４】また、パイロコッカス・フリオサス(Pyroc
occus furiosus) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ(P
fuポリメラーゼ、WO92/09689、特開平 5-328969 号公
報）、サーモコッカス・リトラリス(Termococcus litor
alis) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラ−ゼ(Tliポリメラ
ーゼ、特開平 6-7160 号公報）なども知られている。し
かしながら、これらの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、
核酸の取り込みの際の正確性はＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼやＴｔｈＤＮＡポリメラーゼに比べて優れているが、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに比べて、合成速度が遅いな
ど、完全なものではなく、新規な熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼが望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討し
た結果、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを生産する新規な
超好熱古細菌を得ることに成功し、さらにその遺伝子を
解明して、本発明に到達した。

【０００６】すなわち、本発明はサーモコッカス・プロ
フンダス(Thermococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼである。

【０００７】また、本発明はサーモコッカス・プロフン
ダス(Thermococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼをコードする単離されたＤＮＡである。

【０００８】さらに、本発明はサーモコッカス・プロフ
ンダス(Thermococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクター
に挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターである。

【０００９】また、本発明はサーモコッカス・プロフン
ダス(Thermococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポ
リメラ−ゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに
挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換さ
れた組換え宿主細胞である。

【００１０】本発明はサーモコッカス・プロフンダス(T
hermococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクタ−に挿入し
たＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組
換え宿主細胞を培養し、培養物からＤＮＡポリメラーゼ
を採取することを特徴とする熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼの製造方法である。

【００１１】また、本発明はサーモコッカス・プロフン
ダス(Thermococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに
挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換さ
れた組換え宿主細胞を培養し（ａ）組換え宿主細胞を集
めた後、破砕し、細胞抽出物を調製し、（ｂ）宿主細胞
由来の不純蛋白質を除去する工程を含ことを特徴とする
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法である。

【００１２】

【発明の実施態様】本発明の好ましい熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼは、超好熱古細菌の１種であるサーモコッカ
ス・プロフンダス(Thermococcus profundus)ＤＴ５４３
２（ＪＣＭ番号９３７８）から入手可能なＤＮＡポリメ
ラーゼである。サーモコッカス・プロフンダス(Thermoc
occus profundus)ＤＴ５４３２は、オキナワトラフの熱
水鉱床から単離した菌株である。この菌株の菌学的性質
は、System. Appl. Microbiol.(1994) 17: 232-246, Ko
bayashi et al.に詳しく記載されている。また、この菌
株は、ＪＣＭ（理化学研究所微生物系統保存施設）から
入手可能である。

【００１３】本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子のクロ−ニングは、既知である熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼの保存領域のアミノ酸配列に基づいたプローブを
合成し、ハイブリダイゼーションを行う方法または熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を指標にしてクローニン
グする方法などにより行う。

【００１４】本発明では、例えば、以下のクローニング
方法により行う。まず、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ (Nu
cleic Acids Research、1993, vol.21,259-265)および
ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ(Vent ＤＮＡポリメラーゼ）
(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, vol.89, 5577-5
581)の保存領域のアミノ酸配列に基づき、プライマーを
設計し、合成する。

【００１５】次いで、サーモコッカス・プロフンダス(T
hermococcus profundus)の染色体ＤＮＡを鋳型に、上記
調製したプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、ＤＮＡ断
片を増幅させる。増幅されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を
決定し、当初設定したアミノ酸配列をコードしているこ
とを確認した後、該ＤＮＡ断片をプローブとし、染色体
ＤＮＡの染色体ＤＮＡの制限酵素分解産物に対し、サザ
ンハイブリダイゼーションを実施する。目的とするＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のおおよその大
きさを約４〜７Ｋｂｐに限定することが好ましい。

【００１６】更に、約４〜７ＫｂｐのＤＮＡ断片をゲル
から回収し、これを用いて、大腸菌にてＤＮＡライブラ
リーを作製し、上記したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプロー
ブにしてプラークハイブリダイゼーションまたはコロニ
ーハイブリダイゼーションを行い、クローン株を取得す
る。

【００１７】本発明においてクローン化したサーモコッ
カス・プロフンダス(Thermococcusprofundus)ＤＴ５４
３２由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、２３２５塩基
（推定アミノ酸７７４個）から構成されている（配列番
号１）。他のＤＮＡポリメラーゼと比較したところ、本
発明の遺伝子には真核生物型であるαＤＮＡポリメラー
ゼの保存領域、Ｒｅｇｉｏｎ１〜５が存在している。ま
た該遺伝子のＮ末端側に３’→５’エキソヌクレアーゼ
モチーフであるＥＸＯ１〜３が存在している。

【００１８】サーモコッカス・プロフンダス(Thermococ
cus profundus)の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
を、同じサーモコッカス(Termococcus) 属由来の他の酵
素であるサーモコッカス・リトラリス(Thermococcus li
toralis)由来のＴｌｉ（Ｖｅｎｔ）のＤＮＡポリメラ−
ゼ遺伝子と比較したところ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子には、２種の介在配列が存在するが、本発明のサ
ーモコッカス・プロフンダス(Thermococcus profundus)
由来の遺伝子には介在配列が存在しない。

【００１９】本発明の遺伝子は、サーモコッカス・プロ
フンダス(Thermococcus profundus)由来のＤＮＡポリメ
ラーゼをコードするＤＮＡである。該ＤＮＡの一例は配
列番号２に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を含有する。また、このようなＤＮＡは配列番号１に
記載される塩基配列またはその一部分を含有する。

【００２０】本発明において使用するベクターは、サー
モコッカス・プロフンダス(Thermococcus profundus)由
来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよびそ
の発現を可能とするものであれば、いかなるものでもよ
く、たとえばファージまたはプラスミドが挙げられる。
プラスミドとしてはｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＬＥＤ−Ｍ１、ｐＳＰ７３、ｐＧ
Ｗ７、ｐＥＴ３Ａ、ｐＥＴ８ｃなどがあげられる。ファ
ージとしてはたとえばλｇｔ１１、λＤＡＳＨ、λＺＡ
ＰIIなどがあげられる。

【００２１】本発明において使用する宿主細胞として
は、大腸菌、酵母などが挙げられる。大腸菌としては、
例えばＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＰＲ
１、ＬＥ３９２、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが挙げられ
る。本発明では上記サーモコッカス・プロフンダス(The
rmococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼをコードする遺伝子を上記ベクターに挿入して組換え
発現ベクターとし、さらに、この組換え発現ベクターに
て宿主細胞を形質転換する。

【００２２】本発明の製造方法では、上記組換え宿主細
胞を培養して、サーモコッカス・プロフンダス(Thermoc
occus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子を誘導発現させる。組換え宿主細胞の培養に使用す
る培地ならびに条件は常法に従う。具体例としては、サ
ーモコッカス・プロフンダス(Thermococcus profundus)
ＤＴ５４３２株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにより形質転換され
た大腸菌を、例えばＴＢ培地にて培養する。

【００２３】本発明の精製法の１つでは、（ａ）組換え
宿主細胞を集めた後、破砕し、細胞抽出物を調製し、
（ｂ）宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程を含
む。組換え宿主細胞より産出された熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼは、宿主菌体を培地で培養後、培養液から遠心
分離等にて分離・回収する。該菌体を緩衝液に再懸濁し
た後、超音波処理・ダイノミル・フレンチプレンス等に
より菌体を破砕する。次いで、熱処理を実施し、上清よ
り熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを回収する。菌体破砕方
法は、超音波処理・ダイノミル・フレンチプレス法など
が好ましい。宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程
の一つとして、熱処理が好ましい。熱処理条件は、７０
℃以上、好ましくは８５℃以上である。他の不純タンパ
ク質の除去法としては、各種クロマトグラフィーなどを
実施する。

【００２４】サーモコッカス・プロフンダス(Thermococ
cus profundus)株由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの
１つは、下記理化学的性質を有する。 作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳
型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触
媒する。 （２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。 熱安定性：９５℃、３０分間処理で約４０％以上の残存
活性を有する。 分子量：約８６〜９２ＫＤａ 至適ｐＨ：約６．５〜９ 至適温度：約７０〜８０℃ ＤＮＡ合成速度：約２５〜４０塩基／秒以上

【００２５】

【発明の効果】本発明のサーモコッカス・プロフンダス
(Thermococcus profundus)株由来の熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅
反応に適した酵素である。

【００２６】

【実施例】次に本発明を実施例を用いて説明する。実施例１ サーモコッカス・プロフンダス(Thermococcu
s profundus)由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニ
ング サーモコッカス・プロフンダス(Thermococcus profundu
s)ＤＴ５４３２（ＪＣＭ番号９３７８））を８０℃にて
培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従
い、染色体ＤＮＡを調製した（Kobayashiら、System.Ap
pl.Microbiol.(1994) 17: 232-246参照）。染色体ＤＮ
Ａを制限酵素ＴｓｐＥＩで部分切断を行い、アガロース
ゲル電気泳動によってサイズ分画を行い、２〜８ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断されたλＺＡＰII（ストラタジーン社
製）に挿入し、ライブラリーを作製した。この組換えフ
ァージを大腸菌ＸＬ１ｂｌｕｅに感染させ、７×２５ｃ
ｍの角シャーレに１００００個のプラークが形成するよ
うＮＺＹ寒天プレート上に塗布した。４０℃で４時間培
養し、プラークを形成させた。

【００２７】０．１２５ｇ／ｍｌの活性化仔牛胸腺ＤＮ
Ａ溶液５ｍｌをサランラップの上に塗布し、その上に５
ｃｍ×２５ｃｍのナイロン膜（製品名バイオダインＢ）
を載せて３分間放置した。その後、ナイロン膜を乾いた
濾紙に置き、室温で３０分間風乾した。次に１ｍＭ Ｉ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）溶液３ｍｌをサランラップの上に塗布し、その上に
上記ナイロン膜を載せて３分間放置した。その後、ナイ
ロン膜を乾いた濾紙に置き、室温で３０分間風乾した。

【００２８】この膜をプラークを形成したプレートに載
せて、さらに３７℃で４時間培養した。培養後、ナイロ
ン膜をプレートから注意深く剥がし、ＴＢＳＴ緩衝液
(20mMTris-HCl(pH7.5),150mM NaCl, 0.005% Tween 20）
で３回洗浄した。このナイロン膜を熱処理緩衝液（50mM
Tris-HCl(pH8.8), 30mM NaCl, 7mM MgCl₂, 50μg/mlBS
A, 3mM 2-メルカプトエタノール、12μM dATP, 12μM d
TTP, 12μM dGTP) で７５℃で３０分処理した。

【００２９】その後、反応液（50mM Tris-HCl(pH8.8),
30mM NaCl, 7mM MgCl₂, 50μg/ml BSA, 3mM 2-メルカプ
トエタノール、12μM dATP, 12μM dTTP, 12μM dGTP、
6μM dCTPおよび 2μCi/ml の [α-³²P]dCTP)中で６５
℃、３０分間処理した後、膜を５％トリクロロ酢酸と１
％ピロリン酸ナトリウムの溶液中で５分間の洗浄を３回
行い、取り込まれなかった [α-³²P]dCTP を除去した。
−７０℃でのオートラジオグラフィーにより膜を分析し
た。複製した膜のＸ線フィルム上に１０個のシグナルを
確認した。

【００３０】シグナルの位置に相当する部分のプラーク
からプラスミドをレスキューした（ストラタジーン社マ
ニュアル参照）。ＤＮＡ挿入断片がもっとも小さいクロ
ーン（ｐＴｐｏｌ１１１と命名した。）について大腸菌
ＪＭ１０９に形質転換し、滅菌処理した１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Clonin
g, p.A.2に記載）で、３５℃で１６時間震盪培養した。
この培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに移
し、遠心分離により菌体を回収した。この菌体を、０．
６ｍｌの破砕緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 80mM KC
l, 5mM 2-メルカプトエタノール、1mM EDTS) に懸濁
後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞抽出物を得
た。更に、宿主細胞由来のＤＮＡポリメラーゼを不活化
するために、細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した。
遠心処理にて不溶画分を除去し、以下に示す方法にて熱
処理液のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。

【００３１】（試薬） Ａ： 40mM TrisＨＣｌ(pH7.5) 16mM 塩化マグネシウム 15mM ジチオスレイトール 100 μg/ml ＢＳＡ Ｂ： 2 μｇ／ｍｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ Ｃ： 1.5mM ｄＮＴＰ(250cpm/pmol [³H]dTTP) Ｄ： 20% トリクロロ酢酸（2mM ピロリン酸） Ｅ： 1 μg/ml キャリアーＤＮＡ

【００３２】（方法）Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各
５μｌならびに滅菌水１０μｌをエッペンドルフチュー
ブに加えて攪拌混合後、上記熱処理液５μｌを加えて７
５℃で１０分間反応した。その後、氷冷し、Ｅ液５０μ
ｌおよびＤ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０
分間氷冷した。この液をガラスフィルター（ワットマン
ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液およびエタノール
で充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレー
ションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型Ｄ
ＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性
の１単位は、この条件下で３０分当たり１０ナノモルの
ヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。

【００３３】上記方法に従い、熱処理液の酵素活性を測
定したところ、熱処理液１ｍｌあたり、７５単位のＤＮ
Ａポリメラーゼ活性が得られた。この力価は培養液１ｍ
ｌあたり、３０単位のＤＮＡポリメラーゼが発現したこ
とを示す。比較として、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを
コードしていないベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳ
Ｋ（−）で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を上記と同様
の操作に供し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したが検
出できなかった。

【００３４】実施例２ クローン化されたＤＮＡ断片の
塩基配列の決定 実施例１で取得したプラスミドＤＮＡ、ｐＴｐｏｌ１１
１を大量調製し、常法に従い、塩基配列の決定を行っ
た。更に、求められた塩基配列よりアミノ酸配列を推定
した（配列番号１）。サーモコッカス・プロフンダス(T
hermococcus profundus)由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
は２３２５塩基からなり、７７４個のアミノ酸がコード
されていた。アミノ酸配列から推定されるタンパク質の
分子量は、約９００００ダルトンであった。

【００３５】実施例３ サーモコッカス・プロフンダス
（Thermococcus profundus）ＤＮＡポリメラーゼの精製 滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ
ＴＢ培地（MolecularCloning, p.A.2に記載）６Ｌを１
０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ５０ｍｌのＬ
Ｂ培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキ
ストラクト、０．５％塩化ナトリウム、ギブコ社製）で
３０℃１６時間培養した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＴｐｏｌ
１１）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種し、３５
℃で１２時間通気攪拌培養した。培養液より菌体を遠心
分離により回収し、この菌体を破砕緩衝液４００ｍｌに
懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞破砕液
を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した
後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。さらにポリエ
チレンイミンを用いた除核酸処理、硫安分画、ヘパリン
セファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩
衝液（50mM Tris-pH8.0, 50mM 塩化カリウム、1mM ジチ
オスレイトール、0.1% Tween20,0.1% ノニデットP40, 5
0%グリセリン）に置換し、高度に精製されたサーモコッ
カス・プロフンダス（(Thermococcus profundus)由来の
耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを得た。上記精製工程のＤＮ
Ａポリメラーゼ活性は、実施例１と同様の操作で行っ
た。また酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプ
ルを希釈して測定を行った。本発明の酵素の至適ｐＨ
は、約６．５〜９であり、本発明の酵素の至適温度は、
約７０〜８０℃であった。

【００３６】実施例４ 熱安定性の確認 実施例３に記載のごとく精製したサーモコッカス・プロ
フンダス（Thermococcus profundus）のＤＮＡポリメラ
ーゼの熱安定性を以下の方法で測定した。精製したサー
モコッカス・プロフンダス（Thermococcus profundus）
ＤＴ５４３２株由来のＤＮＡポリメラーゼ５単位を１０
０μｌの緩衝液(20mM Tris-HCl,pH8.8, 25 ℃、10mM塩
化カリウム、10mM硫酸アンモニウム、2mM 硫酸マグネシ
ウム、0.1% Triton X-100, 0.1mg/ml BSA, 5mM 2- メル
カプトエタノール) に混合し、９５℃でプレインキュベ
ートした。この混合液から経時的に試料を採取し、実施
例１の方法にてポリメラーゼ活性を測定したところ、９
５℃、３０分間処理で約４０％以上の残存活性を有して
いた。

【００３７】実施例５ ＤＮＡ合成速度測定 サーモコッカス・プロフンダス（Thermococcus profund
us）のＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成速度を以下の方
法で測定した。サーモコッカス・プロフンダス（Thermo
coccus profundus）のＤＮＡポリメラーゼ５単位を１０
μｌの反応液(20mM Tris-HCl, (pH7.5), 8mM塩化マグネ
シウム、7.5mM ジチオスレイトール、100 μg/ml BSA,
0.1mM dNTP, 0.2 μCi [α-³²P]dCTP)で０．２μｇのプ
ライマー（CGCCAGGGTTTTCCCAGTCA）をアニーリングさせ
たＭ１３ｍｐ１８の１本鎖ＤＮＡと７５℃で３０秒、６
０秒、９０秒間反応させた。反応停止は等量の反応停止
液 (50mM 水酸化ナトリウム、10mM EDTA 、5%フィコー
ル、0.05% ブロムフェノールブルー) を加えることによ
り行った。上記ゲルを乾燥させオートグラフィーを行っ
た。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ／Ｈｉ
ｎｄIII を用いた。このマーカーのバンドを指標とし
て、合成されたＤＮＡのサイズを測定することによっ
て、ＤＮＡ合成速度を求めた。その結果、サーモコッカ
ス・プロフンダス（Thermococcus profundus）由来のＤ
ＮＡポリメラーゼは約２５〜４０塩基／秒以上の合成速
度を有していた。

【００３８】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：3731 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源：Thermococcus profundus 株名：DT5432 配列の特徴：43〜2364 CDS 配列 GAATTTATTA GCCCTTAACA GTACTAACCA TAGGTGTCCC TC ATG ATC CTC GAC 54 Met Ile Leu Asp 1 GCT GAC TAC GTC ACC GAG AAC GGA AAG CCC GTC ATA AGG ATT TTC AAG 102 Ala Asp Tyr Val Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile Arg Ile Phe Lys 5 10 15 20 AAG GAG AAA GGC GAG TTC AAG ATT GAC TAT GAT CGG ACT TTT GAG CCT 150 Lys Glu Lys Gly Glu Phe Lys Ile Asp Tyr Asp Arg Thr Phe Glu Pro 25 30 35 TAC ATC TAC GCC CTA CTG AAG GAT GAT TCA GCG ATT GAA GAA ATC AAG 198 Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile Glu Glu Ile Lys 40 45 50 AAG ATA ACC GCC GAG AGG CAC GGA ACG ATA GTG AGG GTC AAG AGA GCC 246 Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Ile Val Arg Val Lys Arg Ala 55 60 65 GAG AAA GTG AAG AAG AAG TTC CTC GGC AGG CCC ATT GAA GTG TGG AAG 294 Glu Lys Val Lys Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Glu Val Trp Lys 70 75 80 CTC TAC TTC ACC CAC CCA CAA GAC GTC CCG GCT ATA AGG GAC AAG ATA 342 Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile Arg Asp Lys Ile 85 90 95 100 AGG AAG CAT CCA GCT GTG GTT GAT ATC TAC GAG TAC GAC ATA CCC TTC 390 Arg Lys His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr Asp Ile Pro Phe 105 110 115 GCC AAG CGC TAC CTT ATT GAC AAG GGC TTA ATC CCG ATG GAA GGT GAA 438 Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro Met Glu Gly Glu 120 125 130 GAA GAG CTG AAA ATG CTC GCC TTT GAC ATT GAA ACG CTC TAC CAC GAG 486 Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu 135 140 145 GGC GAG GAG TTT GCG GAA GGC CCA ATC CTG ATG ATA AGC TAC GCC GAC 534 Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp 150 155 160 GAA GAA GGG GCG AGG GTT ATA ACA TGG AAG AAG GTG AAT CTG CCA TAC 582 Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Val Asn Leu Pro Tyr 165 170 175 180 GTT GAC GTC GTC TCA ACC GAG AAG GAG ATG ATA AAG CGC TTT CTA AGG 630 Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg 185 190 195 GTT GTT AAG GAG AAA GAC CCG GAC GTC CTC ATA ACC TAC AAC GGC GAT 678 Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp 200 205 210 AAC TTC GAC TTC GCC TAC CTG AAA AAG CGC TGT GAA AAG CTT GGA ATA 726 Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu Lys Leu Gly Ile 215 220 225 AAC TTC GCC CTC GGA AGG GAC GGG AGC GAG CCG AAG ATC CAG AGG ATG 774 Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys Ile Gln Arg Met 230 235 240 GGC GAT AGG TTC GCC GTT GAG GTG AAG GGG AGG GTA CAC TTT GAC CTC 822 Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Val His Phe Asp Leu 245 250 255 260 TAT CCC GTG ATA AGA AGA ACG ATA AAC CTG CCC ACT TAC ACT CTT GAG 870 Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu 265 270 275 GCC GTC TAT GAG GCT GTT TTT GGA AAG CCG AAG GAG AAG GTT TAC GCC 918 Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala 280 285 290 GAG GAG ATA GCC TCT GCC TGG GAG AGC GGT GAA GGC CTT GAG AGA GTA 966 Glu Glu Ile Ala Ser Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly Leu Glu Arg Val 295 300 305 GCC AGA TAC TCG ATG GAA GAT GCA AAA GTA ACA TAT GAA CTC GGA AAG 1014 Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr Glu Leu Gly Lys 310 315 320 GAG TTC TTC CCG ATG GAG GCC CAG CTT TCC CGC TTG ATC GGC CAA TCC 1062 Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu Ile Gly Gln Ser 325 330 335 340 CTC TGG GAC GTC TCC CGC TCC AGC ACG GGC AAT CTG GTG GAG TGG TTC 1110 Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe 345 350 355 CTC CTG AGG AAG GCC TAC GAG AGG AAC GAG CTG GCT CCG AAC AAG CCA 1158 Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro 360 365 370 GAT GAG AGG GAG TTG GCC AGA AGA AGG CAG AGC TAC GAG GGT GCC TAC 1206 Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr 375 380 385 GTT AAA GAG CCT GAG CGC GGT TTG TGG GAG AAC ATA GTG TAC TTA GAT 1254 Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile Val Tyr Leu Asp 390 395 400 TTC CGC TCT CTC TAC CCC TCA ATC ATC ATC ACC CAC AAC GTT TCG CCT 1302 Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val Ser Pro 405 410 415 420 GAT ACT CTC AAC CGT GAA GGC TGT AAG GAG TAT GAC GTA GCT CCA CAG 1350 Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp Val Ala Pro Gln 425 430 435 GTT GGC CAC CGC TTC TGC AAG GAC TTT CCG GGC TTC ATC CCG AGC CTG 1398 Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe Ile Pro Ser Leu 440 445 450 CTT GGG GAC CTC CTG GAG GAG AGG CAG AAG ATA AAG AGG AAG ATG AAG 1446 Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys Arg Lys Met Lys 455 460 465 GCC ACT ATT GAC CCG ATC GAG AGG AAG CTC CTC GAT TAC AGA CAG CGG 1494 Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp Tyr Arg Gln Arg 470 475 480 GCT ATT AAA ATC CTG GCC AAT TCT TAT TAC GGC TAC TAT GGC TAC GTA 1542 Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Val 485 490 495 500 AAA GCG CGC TGG TAT TGT AAA GAG TGC GCC GAG AGC GTC ACC GCG TGG 1590 Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp 505 510 515 GGT AGG GAG TAC ATT ACG ATG ACG ATC AAA GAG ATA GAG GAA AAA TAC 1638 Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile Glu Glu Lys Tyr 520 525 530 GGA TTT AAA GTC TTA TAT GCG GAC ACT GAC GGT TTC TTT GCG ACA ATA 1686 Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe Phe Ala Thr Ile 535 540 545 CCT GGA GCT GAT GCC GAG ACT GTC AAA AAG AAG GCC ATG GGG TTT CTC 1734 Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala Met Gly Phe Leu 550 555 560 AAG TAT ATC AAT AAG AAA CTT CCC GGT GCG CTT GAG CTT GAG TAC GAG 1782 Lys Tyr Ile Asn Lys Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu Leu Glu Tyr Glu 565 570 575 580 GGC TTC TAC AAG CGC GGT TTC TTC GTC ACA AAG AAG AAG TAT GCG CTG 1830 Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Leu 585 590 595 ATA GAC GAA GAG GGC AAG ATA ACG ACT CGT GGA CTC GAA ATA GTC AGG 1878 Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg 600 605 610 CGC GAC TGG AGC GAA ATA GCG AAG GAG ACG CAG GCT AAA GTC CTG GAG 1926 Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala Lys Val Leu Glu 615 620 625 GCT CTT CTA AAG GAC GGT GAC GTT GAG AAG GCC GTG AAA ATC GTC AAG 1974 Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val Lys Ile Val Lys 630 635 640 GAA GTT ACC GAA AAG CTT AGC AAG TAC GAG GTT CCT CCG GAG AAG CTG 2022 Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys Leu 645 650 655 660 GTT ATT CAT GAG CAG ATA ACG AGA GAC TTG AAG GAC TAC AAA GCG ACT 2070 Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Thr 665 670 675 GGT CCT CAC GTT GCA GTG GCT AAA AGA CTG GCC GCC AAG GGT ATC AAA 2118 Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gly Ile Lys 680 685 690 ATC CGC CCT GGA ACG GTG ATA AGT TAC ATC GTC CTC AAA GGG AGC GGA 2166 Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly 695 700 705 AGG ATT GGT GAC AGG GCG ATT CCC TTC GAC GAG TTC AAT CCG GCG AAG 2214 Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe Asn Pro Ala Lys 710 715 720 CAC AAG TAT GAC GCG GAA TAC TAC ATC GAG AAC CAG GTT CTT CCA GCA 2262 His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala 725 730 735 740 GTA GAG AGA ATC CTG AGG GCC TTT GGC TAC CGC AAG GAA GAT CTA CGC 2310 Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg 745 750 755 TAC CAG AGA ACG AGA CAA GTT GGC CTC GGG GCG TGG TTG AAG CCG AAG 2358 Tyr Gln Arg Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp Leu Lys Pro Lys 760 765 770 GGG AAG TAGGCAATTC 2374 Gly Lys

【００３９】配列番号２ 配列の長さ：774 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 Met Ile Leu Asp Ala Asp Tyr Val Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Lys Gly Glu Phe Lys Ile Asp Tyr Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Ile Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Ile Val Arg 50 55 60 Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Lys Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Lys His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro 115 120 125 Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Val 165 170 175 Asn Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Val 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Ser Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr 370 375 380 Glu Gly Ala Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Arg Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Val Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Met Gly Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Lys Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Leu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Lys Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val 625 630 635 640 Lys Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Lys Gly Ile Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asn Pro Ala Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Arg Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Gly Lys 770

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 掘越 弘毅 東京都練馬区桜台４丁目39番８号

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サーモコッカス・プロフンダス(Thermoc
   occus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
2. 【請求項２】 下記理化学的性質を有する請求項１記載
   の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。 作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳
   型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触
   媒する。 （２）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。 熱安定性：９５℃、３０分間処理で約４０％以上の残存
   活性を有する。 分子量：約８６〜９２ＫＤａ
3. 【請求項３】 サーモコッカス・プロフンダス(Thermoc
   occus profundus)が、サーモコッカス・プロフンダス(T
   hermococcus profundus)ＤＴ５４３２である請求項１記
   載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
4. 【請求項４】 下記理化学的性質を有する請求項１記載
   の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。 作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳
   型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触
   媒する。 （２）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。 熱安定性：９５℃、３０分間処理で約４０％以上の残存
   活性を有する。 分子量：約８６〜９２ＫＤａ 至適ｐＨ：約６．５〜９ 至適温度：約７０〜８０℃ ＤＮＡ合成速度：約２５〜４０塩基／秒以上
5. 【請求項５】 組換え宿主細胞を用いて生産される請求
   項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
6. 【請求項６】 配列表・配列番号２に記載されるアミノ
   酸配列を含有する請求項１記載の熱安定性ＤＮＡポリメ
   ラーゼ。
7. 【請求項７】 サーモコッカス・プロフンダス(Thermoc
   occus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを
   コードする単離されたＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列表・配列番号２に記載されるアミノ
   酸配列をコードする塩基配列を含有することを特徴とす
   る請求項７に記載される単離されたＤＮＡ。
9. 【請求項９】 サーモコッカス・プロフンダス(Thermoc
   occus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを
   コードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮ
   Ａ組換え発現ベクター。
10. 【請求項１０】 ベクターが、ｐＬＥＤ−Ｍ１またはｐ
    Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のベクタ−である請求項９に
    記載のＤＮＡ組換え発現ベクタ−。
11. 【請求項１１】 サーモコッカス・プロフンダス(Therm
    ococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
    をコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤ
    ＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え
    宿主細胞。
12. 【請求項１２】 宿主細胞が大腸菌である請求項１１記
    載の組換え宿主細胞。
13. 【請求項１３】 サーモコッカス・プロフンダス(Therm
    ococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
    をコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤ
    ＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え
    宿主細胞を培養し、培養物からＤＮＡポリメラーゼを採
    取することを特徴とする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの
    製造法。
14. 【請求項１４】 サーモコッカス・プロフンダス(Therm
    ococcus profundus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
    をコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤ
    ＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え
    宿主細胞を培養し、（ａ）該組換え宿主細胞を集めた
    後、破砕し、細胞抽出物を調製し、（ｂ）組換え宿主細
    胞由来の不純蛋白質を除去する工程を含むことを特徴と
    する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法。
15. 【請求項１５】 （ｂ）組換え宿主細胞由来の不純蛋白
    質を除去する工程が高温熱処理である請求項１４記載の
    熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法。
16. 【請求項１６】 高温熱処理条件が、７０℃以上、好ま
    しくは８５℃以上であることを特徴とする請求項１５記
    載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法。