JP2001103972A - ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 - Google Patents
ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 オキシルシフェリンとD-システインに作
用してルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質
をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを
特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ、上記組み換え体Ｄ
ＮＡを含む形質転換体または形質導入体及び上記の形質
転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物からル
シフェリンを再生する能力を有するタンパク質を採取す
ることを特徴とするルシフェリンを再生する能力を有す
るタンパク質の製造法。 【効果】 本発明によれば、ルシフェリン再生能力を有
するタンパク質を効率よく生産することができるので、
本発明は、産業上極めて有用である。
用してルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質
をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを
特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ、上記組み換え体Ｄ
ＮＡを含む形質転換体または形質導入体及び上記の形質
転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物からル
シフェリンを再生する能力を有するタンパク質を採取す
ることを特徴とするルシフェリンを再生する能力を有す
るタンパク質の製造法。 【効果】 本発明によれば、ルシフェリン再生能力を有
するタンパク質を効率よく生産することができるので、
本発明は、産業上極めて有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ルシフェリンを再
生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、新
規な組み換え体ＤＮＡ及びルシフェリンを再生する能力
を有するタンパク質の製造法に関する。
生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、新
規な組み換え体ＤＮＡ及びルシフェリンを再生する能力
を有するタンパク質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ルシフェリンは、生物発光酵素ルシフェ
ラーゼの基質であり、ルシフェラーゼによる発光後オキ
シルシフェリンに変換される。ルシフェラーゼを用いた
ＡＴＰ測定法は、医療や食品衛生分野で広く使われてい
るが、基質として用いられるルシフェリンが高価である
こと、また、ルシフェラーゼ反応が反応後生成されるオ
キシルシフェリンにより阻害されることから、オキシル
シフェリンの除去、またはルシフェリンへの再生がルシ
フェラーゼＡＴＰ測定法の発展をさらに進めるものと考
えられる。オキシルシフェリンをルシフェリンに再生す
ることのできるホタル由来のタンパク質が見い出されて
いる（U.S.Pat.No.5814504）が、ホタル体内からは、微
量にしか抽出できず、工業的な利用は困難であった。ル
シフェリンを再生する能力を有するタンパク質をルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ反応系に添加すれば、発光を持
続させることができ、また使用するルシフェラーゼ及び
ルシフェリンの使用量を軽減させることができる。
ラーゼの基質であり、ルシフェラーゼによる発光後オキ
シルシフェリンに変換される。ルシフェラーゼを用いた
ＡＴＰ測定法は、医療や食品衛生分野で広く使われてい
るが、基質として用いられるルシフェリンが高価である
こと、また、ルシフェラーゼ反応が反応後生成されるオ
キシルシフェリンにより阻害されることから、オキシル
シフェリンの除去、またはルシフェリンへの再生がルシ
フェラーゼＡＴＰ測定法の発展をさらに進めるものと考
えられる。オキシルシフェリンをルシフェリンに再生す
ることのできるホタル由来のタンパク質が見い出されて
いる（U.S.Pat.No.5814504）が、ホタル体内からは、微
量にしか抽出できず、工業的な利用は困難であった。ル
シフェリンを再生する能力を有するタンパク質をルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ反応系に添加すれば、発光を持
続させることができ、また使用するルシフェラーゼ及び
ルシフェリンの使用量を軽減させることができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ルシフェリ
ンを再生する能力を有するタンパク質を生産する組み換
え体を用いるルシフェリンを再生する能力を有するタン
パク質の製造法を提供することを目的とする。
ンを再生する能力を有するタンパク質を生産する組み換
え体を用いるルシフェリンを再生する能力を有するタン
パク質の製造法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記目的に鑑み鋭意検討を行なった結果、甲虫類に属す
る昆虫由来のルシフェリン再生能力を有するタンパク質
をコードする遺伝子の単離、及び遺伝子の構造を決定
し、更にまた、ルシフェリン再生能力を有するタンパク
質をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡを得ることに成功した。次いで、この組み
換え体ＤＮＡを宿主細胞に含ませた形質転換体または形
質導入体を培養すると、効率よくルシフェリン再生能力
を有するタンパク質が生産されること等を見い出し、本
発明を完成した。
上記目的に鑑み鋭意検討を行なった結果、甲虫類に属す
る昆虫由来のルシフェリン再生能力を有するタンパク質
をコードする遺伝子の単離、及び遺伝子の構造を決定
し、更にまた、ルシフェリン再生能力を有するタンパク
質をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡを得ることに成功した。次いで、この組み
換え体ＤＮＡを宿主細胞に含ませた形質転換体または形
質導入体を培養すると、効率よくルシフェリン再生能力
を有するタンパク質が生産されること等を見い出し、本
発明を完成した。
【０００５】即ち、本願の第１の発明は、オキシルシフ
ェリンとD-システインに作用してルシフェリンを再生す
る能力を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
本願の第２の発明は、発光能力を有する生体由来の上記
の遺伝子である。本願の第３の発明は、以下の(a)また
は(b)のタンパク質をコードするルシフェリンを再生す
る能力を有するタンパク質遺伝子である。(a)配列番号
２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(b)アミ
ノ酸配列(a)において、１もしくは複数のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質本願
の第４の発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と
50％以上の同一性があり、かつルシフェリンを再生する
能力を有するタンパク質遺伝子である。本願の第５の発
明は、上記のルシフェリンを再生する能力を有するタン
パク質をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した
ことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡである。本願
の第６の発明は、上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換
体または形質導入体である。本願の第７の発明は、上記
の形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物
からルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質を
採取することを特徴とするルシフェリンを再生する能力
を有するタンパク質の製造法である。
ェリンとD-システインに作用してルシフェリンを再生す
る能力を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
本願の第２の発明は、発光能力を有する生体由来の上記
の遺伝子である。本願の第３の発明は、以下の(a)また
は(b)のタンパク質をコードするルシフェリンを再生す
る能力を有するタンパク質遺伝子である。(a)配列番号
２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(b)アミ
ノ酸配列(a)において、１もしくは複数のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質本願
の第４の発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と
50％以上の同一性があり、かつルシフェリンを再生する
能力を有するタンパク質遺伝子である。本願の第５の発
明は、上記のルシフェリンを再生する能力を有するタン
パク質をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した
ことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡである。本願
の第６の発明は、上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換
体または形質導入体である。本願の第７の発明は、上記
の形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物
からルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質を
採取することを特徴とするルシフェリンを再生する能力
を有するタンパク質の製造法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のルシフェリンを再生する能力を有するタンパク
質をコードする遺伝子は、甲虫類より得られる。
本発明のルシフェリンを再生する能力を有するタンパク
質をコードする遺伝子は、甲虫類より得られる。
【０００７】本発明のルシフェリンを再生する能力を有
するタンパク質遺伝子は、例えば、次のようにして得る
ことができる。先ず、アメリカホタル発光器よりｍＲＮ
Ａを抽出する。次いで、精製したルシフェリン再生能力
を有するタンパク質のアミノ酸配列、アメリカホタルの
コドン使用頻度を考慮して、合成ＤＮＡを作製し、上記
で得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写ポリメラーゼ
連鎖反応（以下、RT-PCR法と略称する。）を行ない、ル
シフェリン再生能力を有するタンパク質の一部をコード
するＤＮＡを得る。
するタンパク質遺伝子は、例えば、次のようにして得る
ことができる。先ず、アメリカホタル発光器よりｍＲＮ
Ａを抽出する。次いで、精製したルシフェリン再生能力
を有するタンパク質のアミノ酸配列、アメリカホタルの
コドン使用頻度を考慮して、合成ＤＮＡを作製し、上記
で得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写ポリメラーゼ
連鎖反応（以下、RT-PCR法と略称する。）を行ない、ル
シフェリン再生能力を有するタンパク質の一部をコード
するＤＮＡを得る。
【０００８】上記で得られたｍＲＮＡより逆転写酵素を
用いてｃＤＮＡを合成し、そのまま、またはPCR法を用
いてルシフェリン再生能力を有するタンパク質をコード
する遺伝子を増幅した後、常法に従いベクターＤＮＡに
組み込む。用いられるベクターＤＮＡとしては、例え
ば、pUC19（宝酒造社製）、pBR322（宝酒造社製）、pBl
uescript SK+（Stratagene社製）、pMAL-C2（NEW Engla
nd Labs社製）等のプラスミドＤＮＡ、λENBL3（Strata
gene社製）、λDASH II（フナコシ社製）等のバクテリ
オファージＤＮＡ等が挙げられる。得られた組み換え体
ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌K-12、好ましくは大腸
菌JM109（東洋紡社製）、ＤＨ５α（東洋紡社製）、XL1
-Blue（フナコシ社製）等を形質転換または形質導入し
て夫々の形質転換体または形質導入体を得る。宿主細胞
としては、上記以外に、例えば、大腸菌K-12以外の大腸
菌等の細菌、酵母、かび、放線菌、蚕、動物細胞等が用
いられる。
用いてｃＤＮＡを合成し、そのまま、またはPCR法を用
いてルシフェリン再生能力を有するタンパク質をコード
する遺伝子を増幅した後、常法に従いベクターＤＮＡに
組み込む。用いられるベクターＤＮＡとしては、例え
ば、pUC19（宝酒造社製）、pBR322（宝酒造社製）、pBl
uescript SK+（Stratagene社製）、pMAL-C2（NEW Engla
nd Labs社製）等のプラスミドＤＮＡ、λENBL3（Strata
gene社製）、λDASH II（フナコシ社製）等のバクテリ
オファージＤＮＡ等が挙げられる。得られた組み換え体
ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌K-12、好ましくは大腸
菌JM109（東洋紡社製）、ＤＨ５α（東洋紡社製）、XL1
-Blue（フナコシ社製）等を形質転換または形質導入し
て夫々の形質転換体または形質導入体を得る。宿主細胞
としては、上記以外に、例えば、大腸菌K-12以外の大腸
菌等の細菌、酵母、かび、放線菌、蚕、動物細胞等が用
いられる。
【０００９】この形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの
方法（Method in Enzymology,68,326-331,1979）により
行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.Ho
hnの方法（Method in Enzymology,68,299-309,1979）に
より行なうことができる。
方法（Method in Enzymology,68,326-331,1979）により
行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.Ho
hnの方法（Method in Enzymology,68,299-309,1979）に
より行なうことができる。
【００１０】上記形質転換体または形質導入体より純化
された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、P.
Guerry等の方法〔J.Bacteriology、第116巻、第1064〜1
066頁(1973年)〕、D.B.Clewellの方法〔J.Bacteriolog
y、第110巻、第667〜676頁(1972年)〕等により得ること
ができる。
された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、P.
Guerry等の方法〔J.Bacteriology、第116巻、第1064〜1
066頁(1973年)〕、D.B.Clewellの方法〔J.Bacteriolog
y、第110巻、第667〜676頁(1972年)〕等により得ること
ができる。
【００１１】更に、上記ルシフェリン再生能力を有する
タンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを用い
て、後述の実施例項目(9)に示す373AＤＮＡシークエン
ス・システム（パーキンエルマー社製）を用いてルシフ
ェリン再生能力を有するタンパク質をコードする遺伝子
の全塩基配列の解析を行ない（配列番号１参照）、次い
で、前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポ
リペプチドのアミノ酸の一次配列を確定する。（配列番
号２参照）
タンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを用い
て、後述の実施例項目(9)に示す373AＤＮＡシークエン
ス・システム（パーキンエルマー社製）を用いてルシフ
ェリン再生能力を有するタンパク質をコードする遺伝子
の全塩基配列の解析を行ない（配列番号１参照）、次い
で、前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポ
リペプチドのアミノ酸の一次配列を確定する。（配列番
号２参照）
【００１２】なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列
において、１もしくは複数、好ましくは数個のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、ルシフェ
リン再生能力を有するアミノ酸配列をコードするルシフ
ェリン再生能力を有するタンパク質遺伝子は、全て本発
明に含まれる。また、配列番号２に示されるアミノ酸配
列と50％以上の同一性があり、かつルシフェリンを再生
する能力を有するタンパク質遺伝子は、全て本発明に含
まれる。
において、１もしくは複数、好ましくは数個のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、ルシフェ
リン再生能力を有するアミノ酸配列をコードするルシフ
ェリン再生能力を有するタンパク質遺伝子は、全て本発
明に含まれる。また、配列番号２に示されるアミノ酸配
列と50％以上の同一性があり、かつルシフェリンを再生
する能力を有するタンパク質遺伝子は、全て本発明に含
まれる。
【００１３】そして、配列番号２に示されるアミノ酸配
列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換も
しくは付加されており、かつ、ルシフェリン再生能力を
有するアミノ酸配列をコードするルシフェリン再生能力
を有するタンパク質遺伝子を得るには、如何なる方法で
もよく、例えば、遺伝子に点変異または欠失変異を生じ
させるための周知技術である部位特定変異誘導法、遺伝
子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌクレオチド
を除去または付加し、遺伝子を連結する方法、オリゴヌ
クレオチド変異誘導法等が挙げられる。
列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換も
しくは付加されており、かつ、ルシフェリン再生能力を
有するアミノ酸配列をコードするルシフェリン再生能力
を有するタンパク質遺伝子を得るには、如何なる方法で
もよく、例えば、遺伝子に点変異または欠失変異を生じ
させるための周知技術である部位特定変異誘導法、遺伝
子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌクレオチド
を除去または付加し、遺伝子を連結する方法、オリゴヌ
クレオチド変異誘導法等が挙げられる。
【００１４】上記のようにして得られたルシフェリン再
生能力を有する形質転換体または形質導入体、例えば、
エッシェリシア属に属する菌株を用いてルシフェリン再
生能力を有するタンパク質を生産するには、下記のよう
にして行なうことができる。上記微生物を培養するに
は、通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液
体培養法を採用して培養するのが好ましい。
生能力を有する形質転換体または形質導入体、例えば、
エッシェリシア属に属する菌株を用いてルシフェリン再
生能力を有するタンパク質を生産するには、下記のよう
にして行なうことができる。上記微生物を培養するに
は、通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液
体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【００１５】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液
等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン
酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。
は、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液
等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン
酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。
【００１６】なお、培地の初発pHは、7〜9に調整するの
が適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で6〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりルシフェリン再生能力を有するタンパク質を
採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができ
る。
が適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で6〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりルシフェリン再生能力を有するタンパク質を
採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができ
る。
【００１７】培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からルシ
フェリン再生能力を有するタンパク質を採取することが
好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもでき
るが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の
種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチー
ム等の細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方
法、トリトンＸ-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵
素を抽出する方法等により、菌体からルシフェリン再生
能力を有するタンパク質を採取するのが好ましい。
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からルシ
フェリン再生能力を有するタンパク質を採取することが
好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもでき
るが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の
種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチー
ム等の細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方
法、トリトンＸ-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵
素を抽出する方法等により、菌体からルシフェリン再生
能力を有するタンパク質を採取するのが好ましい。
【００１８】このようにして得られた粗ルシフェリン再
生能力を有するタンパク質液からルシフェリン再生能力
を有するタンパク質を単離するには、通常の酵素精製に
用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有
機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過
クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法
等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。
生能力を有するタンパク質液からルシフェリン再生能力
を有するタンパク質を単離するには、通常の酵素精製に
用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有
機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過
クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法
等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。
【００１９】得られたルシフェリン再生能力を有するタ
ンパク質は、オキシルシフェリンとD-システインに作用
してルシフェリンを再生することができる。 （ルシフェリン再生能力測定法） （試薬） Ａ 0.1mM オキシルシフェリン Ｂ 0.01mM D-システイン Ｃ 25mM グリシルグリシン＋5.4mM 硫酸マグネシウ
ム Ｄ 10mM ATP（pH7.8） Ｅ 5mg/ml ルシフェラーゼ
ンパク質は、オキシルシフェリンとD-システインに作用
してルシフェリンを再生することができる。 （ルシフェリン再生能力測定法） （試薬） Ａ 0.1mM オキシルシフェリン Ｂ 0.01mM D-システイン Ｃ 25mM グリシルグリシン＋5.4mM 硫酸マグネシウ
ム Ｄ 10mM ATP（pH7.8） Ｅ 5mg/ml ルシフェラーゼ
【００２０】（手順） １ 下記反応混液を調製する。 0.005ml Ａ 0.010ml Ｂ 0.085ml Ｃ ２ タンパク質溶液0.01mlを添加し、37℃で一定時間反
応させる。 ３ 反応液0.01mlとＣ0.1mlを混合する。 ４ 下記ルシフェラーゼ混液を調整する。 10ml Ｄ 1ml Ｅ ５ 項目３の混合液に項目４の混液を0.1ml添加し、ル
ミノメーターで発光量を測定する。
応させる。 ３ 反応液0.01mlとＣ0.1mlを混合する。 ４ 下記ルシフェラーゼ混液を調整する。 10ml Ｄ 1ml Ｅ ５ 項目３の混合液に項目４の混液を0.1ml添加し、ル
ミノメーターで発光量を測定する。
【００２１】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。
明する。
【００２２】
【実施例１】(1)アメリカホタルｍＲＮＡの調製 アメリカホタル尾部（シグマ社製）10ｇを乳鉢と乳棒を
用いて粉砕したものを、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ
（和光純薬社製）10mlに縣濁し、2700 r.p.m.で5分間遠
心分離することによりＲＮＡ画分を得た。これより、Cu
rrent Protocolsin Molecular Biology（WILEY Intersc
iense,1989）記載の方法に従い、ｍＲＮＡ 0.51mgを得
た。
用いて粉砕したものを、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ
（和光純薬社製）10mlに縣濁し、2700 r.p.m.で5分間遠
心分離することによりＲＮＡ画分を得た。これより、Cu
rrent Protocolsin Molecular Biology（WILEY Intersc
iense,1989）記載の方法に従い、ｍＲＮＡ 0.51mgを得
た。
【００２３】(2)プライマーの合成 項目(1)により精製したルシフェリン再生能力を有する
タンパク質約10μgをプロテインシークエンサー（パー
キンエルマー社製）に供し、N末端アミノ酸配列を決定
した。また、項目(1)により精製したルシフェリン再生
能力を有するタンパク質約10μgをトリプシン消化し、
ＨＰＬＣで分取したペプチド６個をプロテインシークエ
ンサーに供し、内部アミノ酸配列を決定した。更に、ア
メリカホタルのコドン使用頻度を検討した。これらの情
報により配列番号３及び４に記載したプライマーをアマ
シャム・ファルマシア・バイオテク株式会社のカスタム
受託合成により合成した。
タンパク質約10μgをプロテインシークエンサー（パー
キンエルマー社製）に供し、N末端アミノ酸配列を決定
した。また、項目(1)により精製したルシフェリン再生
能力を有するタンパク質約10μgをトリプシン消化し、
ＨＰＬＣで分取したペプチド６個をプロテインシークエ
ンサーに供し、内部アミノ酸配列を決定した。更に、ア
メリカホタルのコドン使用頻度を検討した。これらの情
報により配列番号３及び４に記載したプライマーをアマ
シャム・ファルマシア・バイオテク株式会社のカスタム
受託合成により合成した。
【００２４】(3)RT-PCR 反応液を以下の組成で調製し、42℃で30分逆転写反応を
行なった後、99℃で5分間変性させ、5℃で保存した。 （反応組成液） 塩化マグネシウム 5mM *10xRNA PCR バッファー 2μｌ 水 8.5μｌ dNTP 各1mM RNaseインヒビター 1U/μｌ *AMV逆転写酵素XL 0.25U/μｌ *oligo dTアダプタープライマー 0.125μM ｍＲＮＡ 1μｇ *宝酒造社製 次いで、下記の組成で調製した反応液80μｌを逆転写を
行なったチューブに添加し、変性を94℃で30秒間、アニ
ールを62℃で30秒間、伸長反応を72℃で1.5分間で30サ
イクルの反応条件でPCRを行なった。 （反応液組成） プライマー（配列番号３） 0.2μM プライマー（配列番号４） 0.2μM *10×RNA PCR バッファー 8μl 塩化マグネシウム 2.5mM *Taqポリメラーゼ 2.5ユニット 水 最終容量80μlになるよう加える。 *宝酒造社製 PCR終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した
ところ、約0.75kbに目的の断片と思われるバンドが確認
されたので、そのバンドを切り出し、GENECLEAN II（BI
O 101社製）にて精製した。
行なった後、99℃で5分間変性させ、5℃で保存した。 （反応組成液） 塩化マグネシウム 5mM *10xRNA PCR バッファー 2μｌ 水 8.5μｌ dNTP 各1mM RNaseインヒビター 1U/μｌ *AMV逆転写酵素XL 0.25U/μｌ *oligo dTアダプタープライマー 0.125μM ｍＲＮＡ 1μｇ *宝酒造社製 次いで、下記の組成で調製した反応液80μｌを逆転写を
行なったチューブに添加し、変性を94℃で30秒間、アニ
ールを62℃で30秒間、伸長反応を72℃で1.5分間で30サ
イクルの反応条件でPCRを行なった。 （反応液組成） プライマー（配列番号３） 0.2μM プライマー（配列番号４） 0.2μM *10×RNA PCR バッファー 8μl 塩化マグネシウム 2.5mM *Taqポリメラーゼ 2.5ユニット 水 最終容量80μlになるよう加える。 *宝酒造社製 PCR終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した
ところ、約0.75kbに目的の断片と思われるバンドが確認
されたので、そのバンドを切り出し、GENECLEAN II（BI
O 101社製）にて精製した。
【００２５】(4)精製したＤＮＡ断片の塩基配列の決定
及び解析 精製したＤＮＡ断片を373AＤＮＡシークエンシス・シス
テム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決定
及び解析を行なったところ、決定した塩基配列より予想
されるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列(His Glu Thr
Gln Thr LeuTyr Phe Val Asp Thr)が確認された。この
ことより、上記のRT-PCRで増幅したＤＮＡ断片にはルシ
フェリン再生能力を有するタンパク質をコードする遺伝
子の一部の配列が存在していることが確認された。
及び解析 精製したＤＮＡ断片を373AＤＮＡシークエンシス・シス
テム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決定
及び解析を行なったところ、決定した塩基配列より予想
されるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列(His Glu Thr
Gln Thr LeuTyr Phe Val Asp Thr)が確認された。この
ことより、上記のRT-PCRで増幅したＤＮＡ断片にはルシ
フェリン再生能力を有するタンパク質をコードする遺伝
子の一部の配列が存在していることが確認された。
【００２６】(5)３'ＲＡＣＥによる下流領域の解析 先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
アマシャム・ファルマシアバイオテク社により合成した
（配列番号５）。これと上記のｍＲＮＡと3'-Full RAC
E CoreSet（宝酒造社製）用いてRT-PCRを行ない、3'未
知領域の増幅を行なった。反応液をアガロース電気泳動
にかけ、約650ｂｐのＤＮＡ断片をRecoChip（宝酒造社
製）で精製抽出し、ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の
決定及び解析を行なったところ、決定した塩基配列の5'
領域に上記ルシフェリン再生能力を有するタンパク質を
コードする遺伝子の部分配列の3'配列と同じ配列を含む
ことが確認された。また、決定した塩基配列より予想さ
れるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列（Ile Pro Asp
Pro Gln Val Thr Ser Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Le
u Asp Glu）が確認された。
アマシャム・ファルマシアバイオテク社により合成した
（配列番号５）。これと上記のｍＲＮＡと3'-Full RAC
E CoreSet（宝酒造社製）用いてRT-PCRを行ない、3'未
知領域の増幅を行なった。反応液をアガロース電気泳動
にかけ、約650ｂｐのＤＮＡ断片をRecoChip（宝酒造社
製）で精製抽出し、ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の
決定及び解析を行なったところ、決定した塩基配列の5'
領域に上記ルシフェリン再生能力を有するタンパク質を
コードする遺伝子の部分配列の3'配列と同じ配列を含む
ことが確認された。また、決定した塩基配列より予想さ
れるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列（Ile Pro Asp
Pro Gln Val Thr Ser Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Le
u Asp Glu）が確認された。
【００２７】(6)5'ＲＡＣＥによる上流領域の解析 先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
アマシャム・ファルマシアバイオテク社により合成した
（配列番号６〜９）。これと上記のｍＲＮＡと5'-Full
RACE CoreSet（宝酒造社製）用いてRT-PCRを行な
い、5'未知領域の増幅を行なった。反応液をアガロース
電気泳動にかけ、約400ｂｐのＤＮＡ断片をRecoChip
（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシークエンサーで
塩基配列の決定及び解析を行なったところ、決定した塩
基配列に上記ルシフェリン再生能力を有するタンパク質
をコードする遺伝子の部分配列と同じ配列を含むことが
確認された。また、決定した塩基配列より予想されるア
ミノ酸配列に前述のアミノ酸配列（Gly Pro Val Val Gl
u Lys Ile Ala Glu Leu Gly Lys ）が確認された。
アマシャム・ファルマシアバイオテク社により合成した
（配列番号６〜９）。これと上記のｍＲＮＡと5'-Full
RACE CoreSet（宝酒造社製）用いてRT-PCRを行な
い、5'未知領域の増幅を行なった。反応液をアガロース
電気泳動にかけ、約400ｂｐのＤＮＡ断片をRecoChip
（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシークエンサーで
塩基配列の決定及び解析を行なったところ、決定した塩
基配列に上記ルシフェリン再生能力を有するタンパク質
をコードする遺伝子の部分配列と同じ配列を含むことが
確認された。また、決定した塩基配列より予想されるア
ミノ酸配列に前述のアミノ酸配列（Gly Pro Val Val Gl
u Lys Ile Ala Glu Leu Gly Lys ）が確認された。
【００２８】(7)RT-PCRによる遺伝子断片の取得 上記３つの塩基配列より、翻訳開始コドンと終止コドン
を推定し、Ｎ末領域とＣ末領域のプライマーＤＮＡをア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社により合成した
（配列番号10及び11）。これらと上記ｍＲＮＡよりRT-P
CRを行ない、反応液をアガロース電気泳動で解析した。
その結果、約900ｂｐのバンドが確認された。このバン
ドに含まれるＤＮＡ断片をRecoChip（宝酒造社製）で精
製抽出し、更に制限酵素EcoRI及びPstI（いずれも宝酒
造社製）で消化した。一方、プラスミドpKK223-3（ファ
ルマシア社製）を制限酵素EcoRI及びPstIで消化後、ア
ガロース電気泳動により精製し、上記精製抽出したＤＮ
Ａ断片とライゲーション反応を行ない、大腸菌JM109
（東洋紡社製）を形質転換した。該形質転換株、即ち、
大腸菌JM109(pLRE)は、工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６９０８として寄託されてい
る。
を推定し、Ｎ末領域とＣ末領域のプライマーＤＮＡをア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社により合成した
（配列番号10及び11）。これらと上記ｍＲＮＡよりRT-P
CRを行ない、反応液をアガロース電気泳動で解析した。
その結果、約900ｂｐのバンドが確認された。このバン
ドに含まれるＤＮＡ断片をRecoChip（宝酒造社製）で精
製抽出し、更に制限酵素EcoRI及びPstI（いずれも宝酒
造社製）で消化した。一方、プラスミドpKK223-3（ファ
ルマシア社製）を制限酵素EcoRI及びPstIで消化後、ア
ガロース電気泳動により精製し、上記精製抽出したＤＮ
Ａ断片とライゲーション反応を行ない、大腸菌JM109
（東洋紡社製）を形質転換した。該形質転換株、即ち、
大腸菌JM109(pLRE)は、工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６９０８として寄託されてい
る。
【００２９】(8)活性の確認 大腸菌JM109(pLRE)菌体を、50μg/mlのアンピシリンを
含むTY培地（１％ バクトトリプトン、0.5％ バクトイ
ースト・エクストラクト、0.5％ NaCl、pH7.0）10mlに
て37℃でクレット100まで振とう培養した後、IPTGを終
濃度１ｍMとなるよう添加し、更に4時間培養した。この
培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgener
ator、Nissei社製)を用いて20秒4回処理した。これをエ
ッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、12,0
00r.p.m.で10分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に
分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移しか
え、前述した酵素活性測定法によりルシフェリン再生能
力を測定したところ、ベクターのみを含む大腸菌は、0.
94 kcount/mlであるのに対し、大腸菌JM109(pLRE)は、
10.58 kcount/mlとルシフェリン再生能力を有してい
た。
含むTY培地（１％ バクトトリプトン、0.5％ バクトイ
ースト・エクストラクト、0.5％ NaCl、pH7.0）10mlに
て37℃でクレット100まで振とう培養した後、IPTGを終
濃度１ｍMとなるよう添加し、更に4時間培養した。この
培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgener
ator、Nissei社製)を用いて20秒4回処理した。これをエ
ッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、12,0
00r.p.m.で10分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に
分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移しか
え、前述した酵素活性測定法によりルシフェリン再生能
力を測定したところ、ベクターのみを含む大腸菌は、0.
94 kcount/mlであるのに対し、大腸菌JM109(pLRE)は、
10.58 kcount/mlとルシフェリン再生能力を有してい
た。
【００３０】(9)ルシフェリン再生能力を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子の解析 大腸菌JM109(pLRE)のルシフェリン再生能力が確認され
たので、pLREの挿入断片がルシフェリン再生能力を有す
るタンパク質の遺伝子を含むことが明らかとなった。そ
こで、このプラスミドＤＮＡについて373AＤＮＡシーク
エンス・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩
基配列の決定を行なった。決定した塩基配列を配列番号
１に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチド
のアミノ酸配列を配列番号２に夫々示した。ルシフェリ
ン再生能力を有するタンパク質の遺伝子は、924bpのコ
ーディング領域を有し、308個のアミノ酸をコードして
いた。
ク質をコードする遺伝子の解析 大腸菌JM109(pLRE)のルシフェリン再生能力が確認され
たので、pLREの挿入断片がルシフェリン再生能力を有す
るタンパク質の遺伝子を含むことが明らかとなった。そ
こで、このプラスミドＤＮＡについて373AＤＮＡシーク
エンス・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩
基配列の決定を行なった。決定した塩基配列を配列番号
１に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチド
のアミノ酸配列を配列番号２に夫々示した。ルシフェリ
ン再生能力を有するタンパク質の遺伝子は、924bpのコ
ーディング領域を有し、308個のアミノ酸をコードして
いた。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、ルシフェリン再生能力
を有するタンパク質を効率よく生産することができるの
で、本発明は、産業上極めて有用である。
を有するタンパク質を効率よく生産することができるの
で、本発明は、産業上極めて有用である。
【００３２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KIKKOMAN CORPORATION <120> A gene coding protein having the ability to regenerate luciferin,n ovel recombinant DNA,process for the preparation of protein having the a bility to regenerate luciferin <130> P2113 <160> 11 <210> 1 <211> 924 <212> DNA <213> Photinus pyralis <400> 1 atggggccag ttgttgaaaa aattgcagaa cttggcaagt atacggttgg agaaggtcct 60 cactgggatc atgaaactca gaccttatat ttcgtcgaca ccgtagagaa aacttttcat 120 aaatatgtac cttctcagaa aaaatacacg ttttgtaaag tagataaact ggtttctttc 180 attattcccc ttgctggatc ccctggccgt tttgtagtca gtttggaacg tgaaatagcc 240 attcttacat gggatggcgt tagtgctgca cctacaagca tagaagctat tgttaatgtc 300 gaaccacaca ttaaaaataa cagactcaat gatggcaaag cagatcccct tggcaatcta 360 tggacaggta caatggctat tgacgctggt ctccccgtag gaccggtcac tggcagttta 420 tatcatttag gggctgataa aaaggtaaaa atgcacgaga gcaacatagc tatagcaaat 480 gggctcgcgt ggagtaatga tttgaagaaa atgtattata ttgattcggg gaaaagaaga 540 gtagacgagt acgattatga tgcttctaca ttatccatca gcaatcaacg gccattattt 600 acttttgaaa agcatgaagt gcctggatat ccagatggtc aaacaattga tgaggagggt 660 aatttatggg ttgccgtttt ccaaggacag cgaattatta aaatcagtac ccaacaaccg 720 gaagtgttac tggataccgt aaaaatacca gatcctcagg tcacctctgt agcatttggc 780 ggtccgaatt tggatgaact gcatgtaaca tctgctggtc ttcagcttga cgacagttct 840 ttngacaaaa gtttagttaa tgggcacgtc tacagagtaa caggtttagg cgtcaaaggt 900 ttcgcgggag ttaaagtgaa gcta 924
【００３３】 <210> 2 <211> 308 <212> PRT <213> Photinus pyralis <400> 2 Met Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Ala Glu Leu Gly Lys Tyr Thr Val 1 5 10 15 Gly Glu Gly Pro His Trp Asp His Glu Thr Gln Thr Leu Tyr Phe Val 20 25 30 Asp Thr Val Glu Lys Thr Phe His Lys Tyr Val Pro Ser Gln Lys Lys 35 40 45 Tyr Thr Phe Cys Lys Val Asp Lys Leu Val Ser Phe Ile Ile Pro Leu 50 55 60 Ala Gly Ser Pro Gly Arg Phe Val Val Ser Leu Glu Arg Glu Ile Ala 65 70 75 80 Ile Leu Thr Trp Asp Gly Val Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ile Glu Ala 85 90 95 Ile Val Asn Val Glu Pro His Ile Lys Asn Asn Arg Leu Asn Asp Gly 100 105 110 Lys Ala Asp Pro Leu Gly Asn Leu Trp Thr Gly Thr Met Ala Ile Asp 115 120 125 Ala Gly Leu Pro Val Gly Pro Val Thr Gly Ser Leu Tyr His Leu Gly 130 135 140 Ala Asp Lys Lys Val Lys Met His Glu Ser Asn Ile Ala Ile Ala Asn 145 150 155 160 Gly Leu Ala Trp Ser Asn Asp Leu Lys Lys Met Tyr Tyr Ile Asp Ser 165 170 175 Gly Lys Arg Arg Val Asp Glu Tyr Asp Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ser 180 185 190 Ile Ser Asn Gln Arg Pro Leu Phe Thr Phe Glu Lys His Glu Val Pro 195 200 205 Gly Tyr Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Glu Glu Gly Asn Leu Trp Val 210 215 220 Ala Val Phe Gln Gly Gln Arg Ile Ile Lys Ile Ser Thr Gln Gln Pro 225 230 235 240 Glu Val Leu Leu Asp Thr Val Lys Ile Pro Asp Pro Gln Val Thr Ser 245 250 255 Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu His Val Thr Ser Ala 260 265 270 Gly Leu Gln Leu Asp Asp Ser Ser Leu Asp Lys Ser Leu Val Asn Gly 275 280 285 His Val Tyr Arg Val Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Phe Ala Gly Val 290 295 300 Lys Val Lys Leu 308
【００３４】 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gttggagaag gaccgatttg ggat 24
【００３５】 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 tcatccaagt tggggccgcc aaacgcgac 29
【００３６】 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggacaggtac aatggctatt 20
【００３７】 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 atcgtactcg tctactcttc 20
【００３８】 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 taggtgcagc actaacgcca tc 22
【００３９】 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ttcacgttcc aaactgacta c 21
【００４０】 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ctcgcgtgga gtaatgattt gaa 23
【００４１】 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ggaattcatg gggccagttg ttgaaaaaat tgc 33
【００４２】 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 aactgcagtc atagcttcac tttaactccc gcgaa 35
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 BA08 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA11 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA13 4B065 AA26X AA90Y AC10 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 AA20 BA10 CA51 DA89 EA50 FA74 GA15
Claims (11)
- 【請求項１】オキシルシフェリンとD-システインに作用
してルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質を
コードする遺伝子。 - 【請求項２】発光能力を有する生体由来の請求項１記載
の遺伝子。 - 【請求項３】発光能力を有する生体が、甲虫類である請
求項２記載の遺伝子。 - 【請求項４】発光能力を有する生体が、ホタルである請
求項２記載の遺伝子。 - 【請求項５】発光能力を有する生体が、北米産ホタルで
ある請求項２記載の遺伝子。 - 【請求項６】発光能力を有する生体が、アメリカホタル
である請求項２記載の遺伝子。 - 【請求項７】以下の(a)または(b)のタンパク質をコード
するルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質遺
伝子。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において、１もしくは複数のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつルシフェリンを再生する能力を有するタンパク
質 - 【請求項８】配列番号２に示されるアミノ酸配列と50％
以上の同一性があり、かつルシフェリンを再生する能力
を有するタンパク質遺伝子。 - 【請求項９】請求項１〜８記載のルシフェリンを再生す
る能力を有するタンパク質をコードする遺伝子をベクタ
ーＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体
ＤＮＡ。 - 【請求項１０】請求項９記載の組み換え体ＤＮＡを含む
形質転換体または形質導入体。 - 【請求項１１】請求項１０記載の形質転換体または形質
導入体を培地に培養し、培養物からルシフェリンを再生
する能力を有するタンパク質を採取することを特徴とす
るルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製
造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28525899A JP2001103972A (ja) | 1999-10-06 | 1999-10-06 | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
| EP00961208A EP1229114B1 (en) | 1999-10-06 | 2000-09-22 | Gene encoding protein capable of regenerating luciferin, novel recombinant dna and process for producing protein capable of regenerating luciferin |
| US10/089,986 US6838270B1 (en) | 1999-10-06 | 2000-09-22 | Gene encoding protein capable of regenerating luciferin, novel recombinant DNA, and process for producing protein capable of regenerating luciferin |
| DE60032380T DE60032380T2 (de) | 1999-10-06 | 2000-09-22 | Gen, welches ein protein kodiert, das luciferin regeneriert, neue rekombinante dna und verfahren zur herstellung des genannten proteins |
| AT00961208T ATE348160T1 (de) | 1999-10-06 | 2000-09-22 | Gen, welches ein protein kodiert, das luciferin regeneriert, neue rekombinante dna und verfahren zur herstellung des genannten proteins |
| PCT/JP2000/006527 WO2001025426A1 (fr) | 1999-10-06 | 2000-09-22 | Gene codant une proteine pouvant regenerer la luciferine, nouvel adn recombinant, et procede de production d'une proteine pouvant regenerer la luciferine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28525899A JP2001103972A (ja) | 1999-10-06 | 1999-10-06 | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001103972A true JP2001103972A (ja) | 2001-04-17 |
Family
ID=17689179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28525899A Pending JP2001103972A (ja) | 1999-10-06 | 1999-10-06 | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6838270B1 (ja) |
| EP (1) | EP1229114B1 (ja) |
| JP (1) | JP2001103972A (ja) |
| AT (1) | ATE348160T1 (ja) |
| DE (1) | DE60032380T2 (ja) |
| WO (1) | WO2001025426A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3891323B2 (ja) * | 2000-07-28 | 2007-03-14 | キッコーマン株式会社 | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
| JP4158956B2 (ja) | 2000-07-28 | 2008-10-01 | キッコーマン株式会社 | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
| JP2005509426A (ja) * | 2001-11-14 | 2005-04-14 | イギリス国 | 細胞内ａｔｐおよび／または遺伝子発現の測定方法 |
| US9220700B2 (en) * | 2009-08-19 | 2015-12-29 | Cornell University | Cysteine for physiological injection |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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