JPH11243977A - １，３−β−グルカンシンターゼのエキノカンジン結合領域 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 真菌１，３−β−グルカンシンターゼを阻害
する化合物のスクリーニングに有用な、該グルカンシン
ターゼのエキノカンジン結合領域の提供。 【解決手段】 配列番号２で示される少なくとも４６個
の隣接するアミノ酸残基を含んでなる実質的に精製され
たエキノカンジン結合ペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えＤＮＡ技術
に関する。とりわけ、本発明は真菌グルカンシンター
ゼ、およびそのエキノカンジン結合活性と抗菌活性に介
在するサブ領域に関する。さらに、本発明は、グルカン
シンターゼに結合する化合物のスクリーニングにおける
該エキノカンジン結合領域の使用に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】生命
を脅かす真菌感染が警戒すべき速度で増加している。院
内真菌感染の約９０％は、Candida によって引き起こさ
れ、残りの１０％が Aspergillus、Cryptococcus、およ
び Pneumocystis によるものである。Candida に対する
効果的な抗菌化合物が開発されてきたが、他の病原性真
菌における耐性の増大に対する懸念が高まっている。抗
Candida 化合物が他の真菌に対して臨床上効果的であ
ることは稀であるので、抗菌治療に有効な新たな化合物
が必要とされている。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明は、結合しグルカ
ンシンターゼ活性を阻害する化合物の同定に有用な、真
菌１，３−β−グルカンシンターゼ（以下、「グルカン
シンターゼ」）のエキノカンジン結合領域を提供する。
本発明の構成によって、新しいより優れた抗菌化合物の
同定が可能になる。

【０００４】１つの態様において、本発明は真菌グルカ
ンシンターゼのエキノカンジン結合領域をコードする核
酸分子に関する。

【０００５】別の態様において、本発明は真菌グルカン
シンターゼのエキノカンジン結合部位を含むペプチドに
関する。

【０００６】別の態様において、本発明は、結合し真菌
グルカンシンターゼを阻害する化合物を同定する方法に
関する。

【０００７】「ＥＣＢ結合領域」または「ＥＣＢ結合部
位」または「ＥＣＢ結合フラグメント」は、酵母グルカ
ンシンターゼ分子（即ち、S. cerevisiae におけるＦＫ
Ｓ１遺伝子の産物）のサブ領域であって、該サブ領域が
単独または他のタンパク質と組合わさって例えば融合タ
ンパクとして、ＥＣＢなどのエキノカンジンと結合する
能力を有する領域を意味する。例えば、１つの態様で
は、本発明はアミノ酸５８３〜６７２を含んでなる配列
番号２のサブ領域に関する。ＥＣＢ結合フラグメント
は、ＥＣＢまたは他のエキノカンジン、またはパプロカ
ンジン、または関連する化合物に対する結合に関するい
ずれかの適当な試験によって変化し得る。

【０００８】「融合タンパク質」なる語は、自然界には
存在しないハイブリッドタンパク質分子を意味し、その
分子において２種またはそれ以上の異なるタンパク質ま
たはその断片が単一のポリペプチド鎖で共有結合してい
る翻訳的融合または酵素的融合を含む。

【０００９】「プラスミド」なる語は、染色体外の遺伝
的要素を意味する。本明細書に記載の出発プラスミドは
商業的に入手が可能であるか、制限されることなく公的
に入手可能であるか、または公開された方法にしたがっ
て入手可能なプラスミドから構築することができる。さ
らに、記載されたプラスミドと同等なプラスミドが当技
術分野において知られており、当業者には明らかであろ
う。

【００１０】本明細書に使用する「組換えＤＮＡクロー
ニングベクター」なる語は、プラスミドおよびファージ
を包含するがこれらに限定されない任意の自立的に複製
する物質を意味し、１またはそれ以上のさらなるＤＮＡ
セグメントが付加され得るまたは付加されているＤＮＡ
分子を含む。

【００１１】本明細書に使用する「組換えＤＮＡ発現ベ
クター」なる語は、プロモーターおよび他の調節エレメ
ントが存在して、挿入されたＤＮＡの転写を可能にする
任意の組換えＤＮＡクローニングベクター、例えばプラ
スミドまたはファージを意味する。

【００１２】本明細書に使用する「ベクター」なる語
は、外来ＤＮＡを宿主細胞中へ導入するために使用する
核酸化合物を意味する。ベクターは、１またはそれ以上
のタンパク質分子をコードすることができるヌクレオチ
ド配列を含んでいる。天然の状態の、または組換え処理
を施された、プラスミド、コスミド、ウイルスおよびバ
クテリオファージは、通常用いられるベクターの例であ
る。

【００１３】本明細書に使用する「相補的な」または
「相補性」なる語は、二本鎖の核酸分子においてプリン
およびピリミジンヌクレオチドが水素結合を介して会合
する能力を意味する。以下の塩基対は相補的である：グ
アニンとシトシン；アデニンとチミン；およびアデニン
とウラシル。

【００１４】「単離された核酸化合物」とは、構築され
たかまたは合成されたいずれかのＲＮＡまたはＤＮＡ配
列であって、所在がその自然界における所在とは異なる
ものを意味する。

【００１５】「プライマー」は、例えば核酸分子の酵素
的または合成的伸張のための開始基質として機能する核
酸断片である。「プロモーター」は、ＤＮＡからＲＮＡ
への転写を指図するＤＮＡ配列を意味する。本明細書に
使用する「プローブ」は、他の核酸化合物とハイブリダ
イズする標識された核酸化合物である。

【００１６】本明細書に使用する「ハイブリダイゼーシ
ョン」なる語は、一本鎖の核酸分子が塩基対を介して相
補的な鎖と合する過程を意味する。「選択的ハイブリダ
イゼーション」なる語は、ストリンジェンシーの高い条
件下で起こるハイブリダイゼーションを意味する。ハイ
ブリダイゼーションの程度は、例えば相補性の程度、ハ
イブリダイゼーションのストリンジェンシー、およびハ
イブリダイズする鎖の長さに依存する。

【００１７】「ストリンジェンシー」なる語は、ハイブ
リダイゼーション条件を意味する。高いストリンジェン
シー条件は非ホモローガスな塩基対形成を嫌う。低いス
トリンジェンシー条件は反対の効果を有する。ストリン
ジェンシーは、例えば温度や塩濃度によって変ことがで
きる。「低いストリンジェンシー」条件は、例えば、温
度が約３７℃かそれ以下、ホルムアミド濃度が約５０％
未満、および中〜低い塩濃度（SSC）；あるいは温度が
約５０℃かそれ以下で中〜高い塩濃度（SSPE）例えば１
Ｍ ＮaＣlを包含する。「高いストリンジェンシー」条
件は、例えば、温度が約４２℃かそれ以下、ホルムアミ
ド濃度が約２０％未満、および低い濃度（SSC）；ある
いは、別法として温度が約６５℃かそれ以下で低い濃度
（SSPE）を包含する。例えば、高いストリンジェンシー
条件は、０．５Ｍ ＮaＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中６５℃でのハイ
ブリダイゼーションを意味する（Ausubel, F. M.ら, Cu
rrent Protocols in Molecular Biology, Vol. I, 198
9; Green Inc., New York, 2.10.3）。

【００１８】「ＳＳＣ」は、ハイブリダイゼーションお
よび洗浄溶液を意味する。ストック２０Ｘ ＳＳＣ溶液
は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム
（ｐＨ７．０）を含む。「ＳＳＰＥ」は、ハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄溶液を意味する。１ＸＳＳＰＥ溶
液は、１８０ｍＭ ＮaＣl、９ｍＭ Ｎa₂ＨＰＯ₄、０．
９ｍＭ ＮaＨ₂ＰＯ₄、および１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．４）を含む。

【００１９】ペプチドまたはタンパク質に言及する際に
用いる「実質的に純粋な」なる語は、該ペプチドまたは
タンパク質が、他のタンパク質分子を含んでいる他のす
べての細胞質および非細胞質分子の大きな画分から分離
されていることを意味する。実質的に純粋な調製物は、
少なくとも約８５％純粋；好ましくは少なくとも約９５
％純粋であろう。例えば、本明細書に記載の「実質的に
純粋な」タンパク質は、ＩＭＡＣタンパク質精製法また
は他のいずれかの適当な方法によって製造することがで
きる。

【００２０】細胞壁は、菌類の生存にとって不可欠なも
のであるが、哺乳類細胞には存在しない。このことによ
り、真菌細胞壁の合成が抗菌化合物の有用な標的とな
る。２つの多糖類ポリマー、即ちキチンと１，３−β−
グルカンは、真菌細胞壁の必須の成分である。それゆ
え、これらのポリマーの合成を妨害する抗生物質は真菌
症の治療に有用である。多糖類は、Saccharomyces cere
visiae 細胞壁の８０〜９０％の量を占めると見積られ
ている。主な細胞壁ポリマーは、グルカンとマンナン、
そして少量のキチンである。

【００２１】S. cerevisiae では、細胞壁合成には、少
なくとも、ＦＫＳ１遺伝子によってコードされるグルカ
ンシンターゼのサブユニットが関与していると考えられ
ている（Douglasら, Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 12907
-911, 1994）。ＦＫＳ１は、ＥＣＢおよび他のエキノカ
ンジンの標的であるらしい１８７６アミノ酸残基の２１
５ｋＤの内在性膜タンパク質をコードする（同上）。例
えば、ＥＣＢおよび他のエキノカンジンに対する耐性は
ＦＫＳ１の座に対して位置する。より具体的には、アミ
ノ酸残基５８３〜６７２のＦＫＳ１の領域は、エキノカ
ンジン結合領域を構成するに必要にして十分であると考
えられている細胞質ループを規定している。

【００２２】

【発明の実施の形態】遺伝子単離方法 当業者は、例えばポリメラ−ゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅ま
たは de novo（ドゥノボ）ＤＮＡ合成を含む多くの適用
可能な遺伝子および組換えＤＮＡ技術によって本発明の
核酸を得ることができるということを認識するであろ
う。例えば、J.Sambrookら,Molecular Cloning,第2版
第14章 (1989)参照。

【００２３】当業者は、ＥＣＢ結合領域をコードする核
酸は、ＦＫＳ１の適当な領域（即ち、配列番号２のアミ
ノ酸残基５８７〜６７２をコードする）を標的とするオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いるいずれかの適当な
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって単離
し得るということを認識するであろう。ＰＣＲ増幅のた
めの好ましいテンプレートの源は、S. cerevisiae ゲノ
ムＤＮＡである。ＰＣＲ増幅の方法は、当技術分野にお
いて広く知られている。例えば、PCR Protocols: A Gui
de to Method and Application, Ed., M. Innis ら, Ac
ademic Press (1990)参照。増幅反応は、ゲノムＤＮ
Ａ、適当な酵素、プライマーおよび緩衝液を含み、DNA
Thermal Cycler(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)中
で行うのが便利である。アガロースゲル電気泳動の後に
適当な大きさにされたＤＮＡ断片を検出することによっ
てポジティブな結果を決定する。

【００２４】タンパク質製造法 本発明はさらに、実質的に精製された、エキノカンジン
結合部位として機能するグルカンシンターゼのサブ領域
を含んでなるペプチドまたは融合タンパク質に関する。

【００２５】当業者は、本発明のタンパク質およびペプ
チドは、固相化学的合成または組換え法を含むかなり多
くの異なる方法によって合成し得るということを認識す
るであろう。どちらの方法も、本明細書の一部を構成す
る米国特許第４，６１７，１４９号に記載されている。

【００２６】固相化学的合成の原理は当技術分野におい
てよく知られており、当分野の一般的なテキストにおい
て見出すことができる。例えば、H. Dugas および C. P
enney, Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verla
g, New York, 54-92を参照。例えば、ペプチドは、Appl
ied Biosystems 430A ペプチド合成装置 (Applied Bios
ystems, Foster City, CA)および Applied Biosystems
によって供給される合成サイクルを用いて固相法によっ
て合成することができる。ｔ−ブトキシカルボニルで保
護されたアミノ酸のような保護されたアミノ酸および他
の試薬は、多くの化学品供給会社より商業的に入手可能
である。

【００２７】本発明のペプチドはまた、クローン化され
た核酸を使用する組換えＤＮＡ法によって製造すること
もできる。高い収量が所望である場合は、組換え法が好
ましい。クローン化された核酸の発現は、当業者によく
知られた様々な適当な宿主細胞中で行うことができる。
例えば、クローン化されたＤＮＡを当業者によく知られ
たいずれかの適当な手段により宿主細胞に導入する。ク
ローン化された核酸の染色体組込みは本発明の範囲内で
あるが、その核酸が、適当な染色体外で維持される発現
ベクターの一部をなしていることが好ましい。

【００２８】本発明のペプチドの組換え的製造における
基本的な工程は、 ａ）該タンパク質、ペプチドまたは融合タンパク質をコ
ードする、天然の、合成のまたは半合成のＤＮＡを構築
すること； ｂ）該ＤＮＡを、そのタンパク質を単独または融合タン
パク質として発現させるのに適当な方法で発現ベクター
中へ組込むこと； ｃ）該ベクターを適当な真核または原核宿主細胞に形質
転換するかまたはそうでなければ導入して組換え宿主細
胞を形成すること； ｄ）該組換え宿主細胞を、そのタンパク質を発現するよ
うな方法で培養すること；および ｅ）そのタンパク質を、いずれかの適当な手段により回
収し実質的に精製することである。

【００２９】原核および真核宿主細胞における組換えＭ
urＤタンパク質の発現 一般に、原核生物を本発明のＤＮＡ配列のクローニング
およびベクターの構築に使用する。原核生物はまた、Ｅ
ＣＢ結合ペプチドの製造にも使用する。例えばEscheric
hia coli Ｋ１２株 ２９４（ＡＴＣＣ No.３１４４６）
は、外来タンパク質の原核生物での発現に特に有用であ
る。E. coliのその他の株、Bacillus subtilis などの
桿菌類、Salmonella typhimurium または Serratia mar
cescansなどの腸内細菌、様々な Pseudomonas属や Stre
ptomyces などの他の細菌もまた、本発明のクローニン
グおよび組換えタンパク質の発現における宿主として使
用することができる。

【００３０】原核生物において遺伝子を発現させるのに
適当なプロモーターには、ｂ−ラクタマーゼ（例えば、
ベクターｐＧＸ２９０７、ＡＴＣＣ３９３４４、レプリ
コンおよびｂ−ラクタマーゼ遺伝子を含む）、ラクトー
ス系［Changら, Nature(London), 275: 615 (1978); Go
eddelら, Nature(London), 281: 544 (1979)]、アルカ
リホスファターゼ、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プ
ロモーター系［ｔｒｐプロモーターの制御下でｔｒｐＥ
融合タンパク質としての読み取り枠の発現を促進するた
めに設計されたベクターｐＡＴＨ１(ＡＴＣＣ ３７６９
５)］が含まれる。ｔａｃプロモーター（プラスミドｐ
ＤＲ５４０、ＡＴＣＣ ３７２８２から単離可能）など
のハイブリッドプロモーターもまた適当である。さら
に、そのヌクレオチド配列が一般に知られている他の細
菌プロモーターによっても、当業者は必要な制限部位を
与えるリンカーまたはアダプターを用いてそのようなプ
ロモーター配列を本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａにライゲーションすることが可能である。細菌系にお
いて使用するためのプロモーターはまた、所望のポリペ
プチドをコードするＤＮＡに作動可能なように結合した
シャイン・ダルカーノ配列を含み得る。これらの例は、
限定的なものではなくむしろ説明のためのものである。

【００３１】本発明のペプチドは、de novo（ドゥノ
ボ）合成することができるか、または酵素的または化学
的開裂によって切り離すことができる他のタンパクまた
はペプチドとの翻訳的融合（translational fusion）と
して目的のペプチド（即ちＥＣＢ結合フラグメント）を
含んでなる融合タンパク質として製造することができ
る。融合タンパク質としての発現は、寿命を延長させ
る、所望のペプチドの収量を増加させる、およびタンパ
ク質を精製する便利な手段を提供することがしばしば観
察される。ポリペプチドを特異的な部位で開裂する（例
えば、エンテロキナーゼおよびトロンビン）またはペプ
チド鎖のアミノもしくはカルボキシ末端からペプチドを
消化する（例えば、ジアミノペプチダーゼ）ような様々
なペプチダーゼが知られている。さらに、特定の化学物
質（例えば、臭化シアン）は、ポリペプチド鎖を特定の
部位で開裂し得る。当業者は、部位特異的内部開裂部位
を挿入するために、アミノ酸配列（および、組換え法を
用いる場合、合成または半合成コード配列）に必要な修
飾を認識するだろう。例えば Protein Purification: F
rom Molecular Mechanisms to Large Scale Processes,
American Chemical Society, Washington,D.C., (199
0) 中の第１３章 P. Carter,“Site Specific Proteoly
sis of Fusion Proteins”を参照。

【００３２】本発明は、グルカンシンターゼのフラグメ
ントを、他のタンパク質と融合して含み、それによって
ＥＣＢ結合フラグメントの局在化、精製、および分析が
促進されるようなＥＣＢ結合融合タンパク質に関する。
融合タンパク質を製造するための様々な態様および方法
が、当技術分野において知られていて本発明に適当であ
る。例えば、外来タンパク質は、寄生虫である蠕虫 Sch
istosoma japonicumによってコードされる２６ｋＤのグ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｓｊ２６
のカルボキシ末端と融合し得る。そのような融合タンパ
ク質を、E. coli または他の適当な原核生物、または酵
母のような真核宿主中で発現させることができる。これ
について、SmithとJohnsonの方法とベクターが特に適当
である（その内容の全部が本明細書の一部を構成する G
ene,67,31-40,1988）。融合タンパク質が溶液中に存続
して精製が容易になることが望ましい。

【００３３】原核生物に加えて、様々な哺乳類細胞系お
よび酵母などの真核微生物は、タンパク質または融合タ
ンパク質の組換え発現のための適当な宿主細胞である。
酵母Saccharomyces cerevisiae は、最も一般的に使用
されている真核微生物である。Kluyveromyces lactis
やSchizosaccharomyces pombe などの他の多くの酵母も
また適当である。Saccharomyces における発現のため
に、例えばプラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ ４００５
３）が使用できる。例えば、D. Stinchcomb ら, Natur
e, 282: 39 (1979); J. Kingsman ら, Gene, 7: 141 (1
979); S. Tschemperら, Gene, 10: 157 (1980)を参照。
プラスミドＹＲｐ７は、ｔｒｐ１栄養要求性突然変異体
において用いるための選択マーカーを与えるＴＲＰ１遺
伝子を含んでいる。S. pombe における発現について、
適当なベクターには nmt１プロモーター並びに adhプロ
モーターおよびＳＶ４０プロモーターを含むベクターが
含まれる（例えば S. Forsburgら, Nuc. Acid. Res. 2
1, 2955, 1993参照）。

【００３４】組換え法で製造されたＥＣＢ結合ペプチド
の精製 ＥＣＢ結合領域をコードするクローン化された核酸を含
む発現ベクターを、標準的な方法を用いて適当な宿主細
胞中に形質転換または導入する。ベクターを含む細胞
を、そのペプチドの発現に適当な条件下で増殖させる。
遺伝子が、誘導可能なプロモーターによって制御されて
いれば、適当な増殖条件は適当な誘導因子を組み込んで
いる。組換え法で製造されたペプチドは、いずれかの適
当な手段によって形質転換された細胞の細胞抽出物から
精製することができる。ペプチド精製の１つの方法で
は、遺伝子を５’末端で修飾して、そのペプチドのアミ
ノ末端にいくつかのヒスチジン残基を組み込む。この
「ヒスチジン タグ」は、本明細書の一部を構成する米
国特許第４，５６９，７９４号に本質的に記載されてい
る「固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィ
ー（ＩＭＡＣ）」と呼ばれる１段階のタンパク質精製法
を可能にする。ＩＭＡＣ法は、粗製細胞抽出物を出発物
質とした実質的に純粋なペプチドの迅速な単離を可能に
する。

【００３５】本発明の他の態様は、配列番号２を含んで
なる単離された核酸配列であって、配列番号２のアミノ
酸残基５８３〜６７２をコードする配列を包含する。当
業者が認識し得るように、アミノ酸の大部分は遺伝コー
ドの縮重によって１以上のコドンによってコードされる
ので、本発明のアミノ酸化合物は、複数の異なる核酸配
列によってコードされ得る。これらの選択可能な核酸配
列が同じアミノ酸配列をコードし得るために、本発明は
さらにこれらの選択可能な核酸配列を包含する。

【００３６】配列番号２のＥＣＢ結合領域をコードする
核酸は合成法によって製造することができる。本明細書
に開示したタンパク質のフラグメントは、配列番号２の
適当な部分の化学的合成、配列番号２のタンパク質加水
分解消化、または最も好ましくは組換えＤＮＡ突然変異
誘発技術による方法を含む、当業者によく知られたかな
り多くの適当な技術によって作成することができる。例
えば、K. Struhl,“Reverse biochemistry: Methods an
d applications for synthesizing yeast proteins in
vitro,”Meth. Enzymol., 194, 520-535 参照。例え
ば、好ましい方法では、天然のグルカンシンターゼタン
パク質をコードする完全なＦＫＳ１遺伝子（配列番号
１）に１組の欠失突然変異を導入し、様々な量のタンパ
ク質コード領域がそのタンパク質分子のアミノ末端また
はカルボキシル末端から欠失し、その欠失によって配列
番号２の約６０５〜６５０またはより好ましくは約５８
３〜６７２のアミノ酸残基を保持する分子を生じさせ
る。カルボキシルおよびアミノ末端の両方が除去された
ている完全なタンパク質の内部の断片を製造することも
できる。いくつかのヌクレアーゼ、例えば Bal 31、ま
たは一本鎖の核酸分子の場合にはマングビーンヌクレア
ーゼを使用して欠失を起こすことができる。簡単のた
め、完全なＦＫＳ１遺伝子を、バクテリオファージＭ１
３のようなまたはそれと同等な一本鎖のクローニングベ
クターへクローニングすることが好ましい。所望なら
ば、生じた遺伝子欠失フラグメントを、いずれかの適当
な宿主細胞におけるそのフラグメントの増殖と発現のた
めに、いずれかの適当なベクターへサブクローンするこ
とができる。フラグメントをＥＣＢ結合領域を含んでな
る融合タンパク質の産生を可能にするプラスミド、例え
ばｐＧＥＸ−１（Smith & Johnson,Gene, 67 ,31, 198
8）にサブクローンすることが好ましい。

【００３７】本発明は、本明細書に開示した完全なグル
カンシンターゼタンパク質のフラグメントを提供し、そ
のフラグメントはＥＣＢまたは他のエキノカンジンまた
はパプロカンジンを結合する能力を保持している。

【００３８】本発明に開示した完全なタンパク質のＥＣ
Ｂ結合フラグメントは，上に記載したように、好ましく
は完全なＦＫＳ１遺伝子のフラグメントを製造するため
にクローニング技術を使用して製造することができる。
グルカンシンターゼのペプチドフラグメントまたはグル
カンシンターゼのペプチドフラグメントを含んでなる融
合タンパク質は、いずれかの適当な分析を用いて結合活
性について試験することができる。

【００３９】核酸の合成は、当技術分野においてよく知
られている。例えば、E.L.Brown, R.Belagaje, M.J.Rya
n,および H.G. Khorana, Methods in Enzymology, 68:
109-151 (1979)を参照。本発明の核酸は、ホスフォルア
ミダイト化学を用いる Applied Biosystems Model 380A
または 380B(Applied Biosystems,Inc., 850 Lincoln
Center Drive, Foster City, CA 94404)などの慣用のＤ
ＮＡ合成装置を使用して作成することができる。別法と
して、ホスホトリエステル化学を用いて本発明の核酸を
合成することができる。例えば、M.J.Gait,編, Oligonu
cleotide Synthesis, A Practical Approach, (1984)を
参照。

【００４０】別の方法、いわゆるＰＣＲでは、配列番号
１の一部またはすべてを含む核酸を、本明細書の一部を
構成する米国特許第４，８９９，８１８号に記載されて
いるように、配列番号１またはその領域に相補的な適当
なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、S. cerev
isiae ゲノムＤＮＡから作成することができる。ＰＣＲ
を行うための適当なプロトコルは、例えば PCR Protoco
ls: A Guide to Method and Applications, Ed., Micha
el A. Innisら, Academic Press, Inc. (1990)に開示さ
れている。

【００４１】本発明のリボ核酸は、前掲に記載のポリヌ
クレオチド合成法を用いて製造するかまたはＤＮＡテン
プレートを転写するためにＲＮＡポリメラーゼを用いて
酵素的に製造することができる。

【００４２】本発明のリボ核酸を製造するための最も好
ましい系は、バクテリオファージＴ７またはバクテリオ
ファージＳＰ６由来のＲＮＡポリメラーゼを用いる。こ
れらのＲＮＡポリメラーゼは特異性が高く、転写される
テンプレートの５’末端にバクテリオファージ特異的配
列の挿入を必要とする。J.Sambrookら, 前掲,18.82-18.
84 参照。

【００４３】本発明はさらに、配列番号２のＥＣＢ結合
領域をコードする核酸に相補的な、核酸、ＲＮＡまたは
ＤＮＡを提供する。

【００４４】本発明はさらに、例えば、ゲノムまたはサ
ブゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションスクリ
ーンを含む様々な分子生物学技術に有用なプローブおよ
びプライマーを提供する。配列番号１またはその相補的
な配列、またはその断片を含み、長さが少なくとも１８
塩基対であり、ＦＫＳ１をコードしている S. cerevisi
ae ＤＮＡまたはｍＲＮＡと選択的にハイブリダイズし
得る核酸化合物が提供される。好ましくは、１８または
それ以上の塩基対の化合物はＤＮＡである。長さが少な
くとも１８塩基対のプローブまたはプライマーは、理論
的および実践的な考慮すべき事柄に指図される。例え
ば、Methods in Enzymology, Vol.152, 432-442, Acade
mic Press (1987) 中の B. Wallace および G. Miyada,
“Oligonucleotide Probes for the Screening of Rec
ombinant DNA Libraries,”参照。

【００４５】これらのプローブおよびプライマーは、当
業者によく知られた酵素的方法によって製造することが
できる（例えば、Sambrookら,前掲を参照）。最も好ま
しい態様では、これらのプローブおよびプライマーを上
記のように化学的手段を用いて合成する。

【００４６】本発明の別の態様は、本発明の核酸を含ん
でなる組換えＤＮＡクローニングベクターおよび発現ベ
クターに関する。本発明に含まれるベクターの多くは上
に記載されている。好ましい核酸ベクターはＤＮＡを含
むものである。最も好ましい組換えＤＮＡベクターは、
配列番号２のＥＣＢ結合領域をコードする核酸を含む。

【００４７】当業者は、最も適当なクローニングベクタ
ーまたは発現ベクターを選択することは、制限酵素部位
の入手可能性、そのベクターがトラスフェクトまたは形
質転換される宿主細胞の種類、トランスフェクションま
たは形質転換の目的（例えば、染色体外エレメントとし
ての安定な形質転換、または宿主染色体への組込み）、
容易に分析可能なまたは選択可能なマーカー（例えば、
１種類または他の種類の抗生物質耐性および代謝マーカ
ー）の存在または不在、および宿主細胞内に存在する遺
伝子のコピー数を含む数多くの因子に依存する。

【００４８】本発明の核酸を運ぶのに適当なベクターに
は、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、溶菌バクテリオ
ファージ、溶原性バクテリオファージ、安定なバクテリ
オファージ、プラスミド、ウイロイドなどが含まれる。
最も好ましいベクターはプラスミドである。

【００４９】発現ベクターを調製するとき、当業者は、
例えば構成的プロモーターを使用するかまたは誘導可能
なプロモーターを使用するかといった、考慮すべき多く
の変化があることを理解する。誘導可能なプロモーター
は、作動可能なように結合した遺伝子の高レベルで調節
可能な発現を可能とするため好ましい。当業者は、例え
ば炭素源、金属イオン、熱などの様々な誘導因子に対応
した多くの誘導可能なプロモーターを認識するであろ
う。当業者はまた、製造する核酸またはタンパク質の量
が、幾分、発現系の選択を指図することを理解する。あ
る種のヌクレオチド配列の付加は、組換えタンパク質を
局在化させるのに有用である。例えば、遺伝子のコード
領域の前のシグナルペプチドをコードする配列は、生じ
たポリペプチドの細胞外輸送を指図するのに有用であ
る。

【００５０】本明細書はさらに、配列番号２のＥＣＢ結
合領域を発現することが可能な組換え宿主細胞を構築す
る方法を提供し、その方法は配列番号２の約５８３〜６
７２のアミノ酸残基をコードする単離されたＤＮＡ配列
を含む組換えＤＮＡベクターで宿主を形質転換またはそ
うでなければ宿主中へ導入することを含んでなる。好ま
しい宿主細胞には、外来から導入された遺伝子の高レベ
ルの発現に適応し得るE. coli または S. cerevisiae
のいずれかの株を含む。形質転換された宿主細胞は、Ｅ
ＣＢ結合領域が発現しそれにより ＥＣＢ結合ペプチド
がその組換え宿主細胞中で産生するような当業者によく
知られた条件下で培養することができる。

【００５１】ＥＣＢ結合領域に結合する薬剤は新しい抗
菌化合物を同定することができる。ＥＣＢ結合ペプチド
に結合する物質は、そのペプチドを試験化合物と接触さ
せ、いずれかの適当な手段によって相互作用をモニター
することによって同定することができる。

【００５２】本発明は、ＥＣＢ結合ペプチドに結合する
化合物を発見するためのスクリーニング法であって、以
下の工程： ａ）結合ペプチドを好ましくは融合タンパク質として調
製すること； ｂ）該ペプチドまたはタンパク質を試験化合物に暴露さ
せること；および ｃ）該ペプチドに対する該化合物の結合をいずれかの適
当な手段により定量することを含んでなる方法を提供す
る。

【００５３】１つの態様では，配列番号２の８９個のア
ミノ酸残基のＥＣＢ結合領域とＧＳＴタンパク質の融合
体を含んでなるタンパク質を、酵母または E. coli中で
発現させ、マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡスクリ
ーンに用いるために精製する。ＥＬＩＳＡスクリーン
は、ＥＣＢのＥＣＢ結合領域からの試験化合物による排
除を分析することを可能にする。結合したＥＣＢまたは
溶液中の遊離のＥＣＢは、標準的な方法を用いて調製し
たＥＣＢ特異的抗体を用いて検出することができる。試
験化合物がＥＣＢをその結合部位から置換したならば、
ＥＬＩＳＡシグナルの減少があろう。この方法では、マ
イクロタイタープレートのウェルを、例えばＧＳＴ−Ｆ
ＫＳ１融合タンパク質でコーティングする。残余の結合
部位をブロックした後、プレートをリンスして結合しな
かった融合タンパク質を除去し、次いでＥＣＢとインキ
ュベーションする。再びリンスして結合しなかったＥＣ
Ｂを除去し，試験化合物を加えてインキュベーション
し、リンスして結合しなかった試験化合物または排除さ
れたＥＣＢを除く。次いで、プレートを、アルカリホス
ファターゼと共有結合させたＥＣＢに対する抗体（抗Ｅ
ＣＢ−ＡＰ）とインキュベーションする。適当な物質、
例えば、発色検出についてはｐ−ニトロフェニルホスフ
ェートまたは蛍光検出については４−メチルウンベリフ
ェリルホスフェートを添加することによりプレートを顕
色させる。

【００５４】このスクリーニング法は、可能性のある治
療剤の効率的な大量スクリーニングを可能にするＰＡＮ
ＤＥＸ(登録商標)(Baxter-Dade Diagnostics)システム
のような自動化された方法に適合させることができる。

【００５５】このようなスクリーニングプロトコルにお
いて、ＥＣＢ結合ペプチドを本明細書に記載のように、
好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造する。試験化
合物はそのペプチドが入っている反応容器に入れる。

【００５６】当業者は、ＩＣ₅₀値が試験した化合物の選
択性に依存するということを認識する。例えば、１０ｎ
Ｍ未満のＩＣ₅₀値を有する化合物は、一般に薬剤治療の
ための優れた候補であると考えられる。しかし、より低
いアフィニティーでも、特定の標的に対して選択的であ
る化合物はより優れた候補となり得る。当業者は、特定
の化合物の阻害活性または選択性に関するいずれの情報
も医薬の技術分野において有益であるということを認識
する。

【００５７】以下の実施例は、本発明をより完全に記載
するものである。当業者は、記載された特定の試薬、器
具、および方法は単なる説明であって、いかなる意味に
おいても限定を意図するものではないことを認識するで
あろう。

【００５８】

【実施例】実施例１：ＥＣＢ結合領域をコードする発現
ベクター 酵母において融合タンパクを発現するための、酵母グル
カンシンターゼのＥＣＢ結合領域とグルチオン Ｓ−ト
ラスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含むベクターを以下のよう
に製造する。プラスミドｐＧＥＸ−１（Smith および J
ohnson, Gene,67, 31-40, 1988）は、ｔａｃプロモータ
ーとＳｊ２６（即ちＧＳＴ）の完全なコード配列含んで
なる E. coli 発現ベクターであり、該ベクターにおい
ては、正常な終止コドンが唯一のＢａｍＨ１，Ｓｍａ１
およびＥｃｏＲ１制限部位を含むポリリンカーで置き換
わっており、３つの読み取り枠すべてにおいて終止コド
ンが続いている。記載されたＧＳＴ遺伝子を含むｐＧＥ
Ｘ−１のフラグメントを、当業者によく知られたいずれ
かの適当なサブクローニング法によって単離する。後の
クローニング工程のため特定の制限酵素部位を含むｐＧ
ＥＸ−１オリゴヌクレオチドのＧＳＴ遺伝子を含むフラ
グメントに結合させることは必須ではないが便利であ
る。便利のため、このように記載されたＧＳＴフラグメ
ントを酵母発現ベクターｐＲＥＰ１（K. Maundrell, J.
Biol. Chem. 265, 10857, 1990）の複数のクローニン
グ部位に正しい方向で、ＬＥＵ２遺伝子およびｎｍｔ１
プロモーターの下流にクローニングする。ｐＲＥＰ１は
さらに宿主酵母における複製のためのＡＲＳエレメント
を含んでいる。ＥＣＢ結合領域におけるクローニングの
ため、得られたプラスミドｐＲＥＰ１−ＧＳＴを、ＧＳ
Ｔフラグメントの３’末端のＢａｍＨ１、Ｓｍａ１また
はＥｃｏＲ１のうちの１またはそれ以上の部位で線状化
する。

【００５９】配列番号２のＥＣＢ結合領域をコードする
ＤＮＡフラグメントはＰＣＲによって便利に製造する。
オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１のヌクレ
オチド位置１７４７〜２０１６から逆の鎖上でのＤＮＡ
合成をプライムするために調製する。後のクローニング
のためにＰＣＲプライマーの適当な５’または３’末端
に適当な制限部位を含めることは便利である。そのよう
に製造したＥＣＢ結合フラグメントをいずれかの適当な
方法、例えばゲル電気泳動による単離により精製する。
精製されたＥＣＢ結合フラグメントをｐＲＥＰ１−ＧＳ
ＴにライゲーションしてＥＣＢ結合フラグメントをＧＳ
Ｔ遺伝子の３’末端に結合させる。この構築物ｐＲＥＰ
１−ＧＳＴは、ＧＳＴ−ＥＣＢ結合領域を含んでなる融
合タンパク質を産生する。

【００６０】実施例２：ＥＣＢ結合領域をコードするE.
coli発現ベクター E.coliにおいて融合タンパク質を発現するための、酵母
グルカンシンターゼのＥＣＢ結合領域およびグルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含むベクターを
以下のように構築する。プラスミドｐＧＥＸ−１（Smit
h および Johnson, Gene, 67, 31-40,1998）は、ｔａｃ
プロモーターとＳｊ２６（即ちＧＳＴ）の完全なコード
配列を含む E. coli発現ベクターであり、該ベクターに
おいては、正常な終止コドンが唯一のＢａｍＨ１，Ｓｍ
ａ１およびＥｃｏＲ１制限部位を含むポリリンカーで置
き換わっており、３つの読み取り枠すべてにおいて終止
コドンが続いている。

【００６１】配列番号２のＥＣＢ結合領域をコードする
ＤＮＡフラグメントはＰＣＲによって便利に製造する。
オリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号１のヌクレ
オチド位置１７４７〜２０１６から逆の鎖上でＤＮＡ合
成をプライムするために調製する。後のクローニング工
程のため、末端での適当な制限部位をオリゴヌクレオチ
ド配列中に設計することは便利である。そのように製造
したＥＣＢ結合フラグメントをいずれかの適当な方法、
例えばゲル電気泳動からの単離により精製する。精製さ
れたＥＣＢ結合フラグメントをｐＧＥＸ−１にライゲー
ションしてＥＣＢ結合フラグメントをＧＳＴ遺伝子の
３’末端に結合する。この構築物ｐＧＳＴ−ＥＣＢは、
ＧＳＴ−ＥＣＢ結合領域を含んでなる融合タンパク質を
産生する。

【００６２】実施例３：S. pombe におけるＥＣＢ融合
タンパク質の発現 発現プラスミドｐＲＥＰ−ＧＳＴ−ＥＣＢ（実施例１）
を標準的な方法、例えばスフェロプラスト形質転換また
は酢酸リチウム形質転換（例えばSambrookら,前掲; Oka
zakiら, Nuc. Acid Res. 18, 6485-89(1990); Moreno
ら, Meth. Enzym. 194, 795-823(1991)）を用いて、S.
pombe のいずれかの適当な株、例えばleu１株（例え
ば、R. Sikorski & P. Hieter, Genetics, 122, 19-26,
1989; K. Maundrell, J. Biol. Chem. 265, 10857, 19
90参照）に形質転換する。無作為に選んだ形質転換体
を、クイックプラスミド調製物を用いるアガロースゲル
電気泳動によりプラスミドの存在について試験する。同
上。ｎｍｔ１プロモーターを誘導するのに適当な条件
下、例えばチアミンを欠く最小培地（Beach & Nurse, N
ature, 290, 140, 1981）中で形質転換体を一晩培養す
る。一晩培養した細胞を新鮮な培地に希釈し、対数中期
まで培養した。タンパク質精製のための調製では、誘導
された培養細胞を遠心分離によってペレットにした。

【００６３】実施例４：組換え法により製造したＥＣＢ
結合領域のアフィニティー精製 形質転換された E. coli または酵母細胞の一晩培養し
た細胞（例えば実施例３参照）を、ガラスビーズととも
に超音波処理するかまたは１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
（ＢＤＨ Chemicals）を含むＭＴＰＢＳ（１５０ｍＭ
ＮaＣl、１６ｍＭ Ｎa₂ＨＰＯ₄、４ｍＭ ＮaＨ₂ＰＯ
₄（ｐＨ７．３））中のスフェロプラスト形成により溶
菌する。溶菌した細胞を遠心分離（１０，０００×ｇ、
５分間、４℃）した。上清を回転させたプラットフォー
ム上で５０％グルタチオン−アガロースビーズ（イオウ
結合、Sigma）１〜２ｍLと混合する。２分間吸収させた
後、ビーズを５００ｇの短い遠心分離により集め、５０
ｍLのＭＴＰＢＳで３回洗浄した。融合タンパク質を、
５ｍＭ 還元グルタチオン（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．
５）を含む１ビーズ体積の５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣl（ｐ
Ｈ８．０）で２分間２回洗浄し、遊離グルタチオンとの
競合により溶出する。

【００６４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> Echinocandin Binding Domain of 1,3-β-Glucan Synthase <130> 163819 <150> US 60/068,658 <151> 1997-12-23 <160> 2 <210> 1 <211> 5631 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)...(5628) <400> 1 atg aac act gat caa caa cct tat cag ggc caa acg gac tat acc cag 48 Met Asn Thr Asp Gln Gln Pro Tyr Gln Gly Gln Thr Asp Tyr Thr Gln 1 5 10 15 gga cca ggt aac ggg caa agt cag gaa caa gac tat gac caa tat ggc 96 Gly Pro Gly Asn Gly Gln Ser Gln Glu Gln Asp Tyr Asp Gln Tyr Gly 20 25 30 cag cct ttg tat cct tca caa gct gat ggt tac tac gat cca aat gtc 144 Gln Pro Leu Tyr Pro Ser Gln Ala Asp Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Val 35 40 45 gct gct ggt act gaa gct gat atg tat ggt caa caa cca cca aac gag 192 Ala Ala Gly Thr Glu Ala Asp Met Tyr Gly Gln Gln Pro Pro Asn Glu 50 55 60 tct tac gac caa gac tac aca aac ggt gaa tac tat ggt caa ccg cca 240 Ser Tyr Asp Gln Asp Tyr Thr Asn Gly Glu Tyr Tyr Gly Gln Pro Pro 65 70 75 80 aat atg gct gct caa gac ggt gaa aac ttc tcg gat ttt agc agt tac 288 Asn Met Ala Ala Gln Asp Gly Glu Asn Phe Ser Asp Phe Ser Ser Tyr 85 90 95 ggc cct cct gga aca cct gga tat gat agc tat ggt ggt cag tat acc 336 Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Tyr Asp Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Thr 100 105 110 gct tct caa atg agt tat gga gaa cca aat tcg tcg ggt acc tcg act 384 Ala Ser Gln Met Ser Tyr Gly Glu Pro Asn Ser Ser Gly Thr Ser Thr 115 120 125 cca att tac ggt aat tat gac cca aat gct atc gct atg gct ttg cca 432 Pro Ile Tyr Gly Asn Tyr Asp Pro Asn Ala Ile Ala Met Ala Leu Pro 130 135 140 aat gaa cct tat ccc gct tgg act gct gac tct caa tct ccc gtt tcg 480 Asn Glu Pro Tyr Pro Ala Trp Thr Ala Asp Ser Gln Ser Pro Val Ser 145 150 155 160 atc gag caa atc gaa gat atc ttt att gat ttg acc aac aga ctc ggg 528 Ile Glu Gln Ile Glu Asp Ile Phe Ile Asp Leu Thr Asn Arg Leu Gly 165 170 175 ttc caa aga gac tcc atg aga aat atg ttt gat cat ttt atg gtt ctc 576 Phe Gln Arg Asp Ser Met Arg Asn Met Phe Asp His Phe Met Val Leu 180 185 190 ttg gac tct agg tcc tcg aga atg tct cct gat caa gct tta cta tct 624 Leu Asp Ser Arg Ser Ser Arg Met Ser Pro Asp Gln Ala Leu Leu Ser 195 200 205 tta cat gcc gac tac att ggt ggc gat act gct aac tat aaa aaa tgg 672 Leu His Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Asp Thr Ala Asn Tyr Lys Lys Trp 210 215 220 tat ttt gct gct cag tta gat atg gat gat gaa att ggt ttt aga aat 720 Tyr Phe Ala Ala Gln Leu Asp Met Asp Asp Glu Ile Gly Phe Arg Asn 225 230 235 240 atg agt ctt gga aaa ctc tca agg aag gca aga aaa gct aag aag aaa 768 Met Ser Leu Gly Lys Leu Ser Arg Lys Ala Arg Lys Ala Lys Lys Lys 245 250 255 aac aag aaa gca atg gaa gag gcc aat ccc gaa gac act gaa gaa act 816 Asn Lys Lys Ala Met Glu Glu Ala Asn Pro Glu Asp Thr Glu Glu Thr 260 265 270 tta aac aaa att gaa ggc gac aac tcc cta gag gct gct gat ttt aga 864 Leu Asn Lys Ile Glu Gly Asp Asn Ser Leu Glu Ala Ala Asp Phe Arg 275 280 285 tgg aag gcc aag atg aac cag ttg tct ccc ctg gaa aga gtt cgt cat 912 Trp Lys Ala Lys Met Asn Gln Leu Ser Pro Leu Glu Arg Val Arg His 290 295 300 atc gcc tta tat ctg tta tgt tgg ggt gaa gct aat caa gtc aga ttc 960 Ile Ala Leu Tyr Leu Leu Cys Trp Gly Glu Ala Asn Gln Val Arg Phe 305 310 315 320 act gct gaa tgt tta tgt ttt atc tac aag tgt gct ctt gac tac ttg 1008 Thr Ala Glu Cys Leu Cys Phe Ile Tyr Lys Cys Ala Leu Asp Tyr Leu 325 330 335 gat tcc cct ctt tgc caa caa cgc caa gaa cct atg cca gaa ggt gat 1056 Asp Ser Pro Leu Cys Gln Gln Arg Gln Glu Pro Met Pro Glu Gly Asp 340 345 350 ttc ttg aat aga gtc att acg cca att tat cat ttc atc aga aat caa 1104 Phe Leu Asn Arg Val Ile Thr Pro Ile Tyr His Phe Ile Arg Asn Gln 355 360 365 gtt tat gaa att gtt gat ggt cgt ttt gtc aag cgt gaa aga gat cat 1152 Val Tyr Glu Ile Val Asp Gly Arg Phe Val Lys Arg Glu Arg Asp His 370 375 380 aac aaa att gtc ggt tat gat gat tta aac caa ttg ttc tgg tat cca 1200 Asn Lys Ile Val Gly Tyr Asp Asp Leu Asn Gln Leu Phe Trp Tyr Pro 385 390 395 400 gaa ggt att gca aag att gtt ctt gaa gat gga aca aaa ttg ata gaa 1248 Glu Gly Ile Ala Lys Ile Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Leu Ile Glu 405 410 415 ctc cca ttg gaa gaa cgt tat tta aga tta ggc gat gtc gtc tgg gat 1296 Leu Pro Leu Glu Glu Arg Tyr Leu Arg Leu Gly Asp Val Val Trp Asp 420 425 430 gat gta ttc ttc aaa aca tat aaa gag acc cgt act tgg tta cat ttg 1344 Asp Val Phe Phe Lys Thr Tyr Lys Glu Thr Arg Thr Trp Leu His Leu 435 440 445 gtc acc aac ttc aac cgt att tgg gtt atg cat atc tcc att ttt tgg 1392 Val Thr Asn Phe Asn Arg Ile Trp Val Met His Ile Ser Ile Phe Trp 450 455 460 atg tac ttt gca tat aat tca cca aca ttt tac act cat aac tat caa 1440 Met Tyr Phe Ala Tyr Asn Ser Pro Thr Phe Tyr Thr His Asn Tyr Gln 465 470 475 480 caa ttg gtc gac aac caa cct ttg gct gct tac aag tgg gca tct tgc 1488 Gln Leu Val Asp Asn Gln Pro Leu Ala Ala Tyr Lys Trp Ala Ser Cys 485 490 495 gca tta ggt ggt act gtc gca agt ttg att caa att gtc gct act ttg 1536 Ala Leu Gly Gly Thr Val Ala Ser Leu Ile Gln Ile Val Ala Thr Leu 500 505 510 tgt gaa tgg tca ttc gtt cca aga aaa tgg gct ggt gct caa cat cta 1584 Cys Glu Trp Ser Phe Val Pro Arg Lys Trp Ala Gly Ala Gln His Leu 515 520 525 tct cgt aga ttc tgg ttt tta tgc atc atc ttt ggt att aat ttg ggt 1632 Ser Arg Arg Phe Trp Phe Leu Cys Ile Ile Phe Gly Ile Asn Leu Gly 530 535 540 cct att att ttt gtt ttt gct tac gac aaa gat aca gtc tac tcc act 1680 Pro Ile Ile Phe Val Phe Ala Tyr Asp Lys Asp Thr Val Tyr Ser Thr 545 550 555 560 gct gca cac gtt gtt gct gct gtt atg ttc ttt gtt gcg gtt gct acc 1728 Ala Ala His Val Val Ala Ala Val Met Phe Phe Val Ala Val Ala Thr 565 570 575 atc ata ttc ttc tcc att atg cca ttg ggg ggg ttg ttt acg tca tat 1776 Ile Ile Phe Phe Ser Ile Met Pro Leu Gly Gly Leu Phe Thr Ser Tyr 580 585 590 atg aaa aaa tct aca agg cgt tat gtt gca tct caa aca ttc act gct 1824 Met Lys Lys Ser Thr Arg Arg Tyr Val Ala Ser Gln Thr Phe Thr Ala 595 600 605 gca ttt gcc cct cta cat ggg tta gat aga tgg atg tcc tat tta gtt 1872 Ala Phe Ala Pro Leu His Gly Leu Asp Arg Trp Met Ser Tyr Leu Val 610 615 620 tgg gtt act gtt ttt gct gcc aaa tat tca gaa tcg tac tac ttt tta 1920 Trp Val Thr Val Phe Ala Ala Lys Tyr Ser Glu Ser Tyr Tyr Phe Leu 625 630 635 640 gtt tta tct ttg aga gat cca att aga att ttg tcc acc act gca atg 1968 Val Leu Ser Leu Arg Asp Pro Ile Arg Ile Leu Ser Thr Thr Ala Met 645 650 655 agg tgt aca ggt gaa tac tgg tgg ggt gcg gta ctt tgt aaa gtg caa 2016 Arg Cys Thr Gly Glu Tyr Trp Trp Gly Ala Val Leu Cys Lys Val Gln 660 665 670 ccc aag att gtc tta ggt ttg gtt atc gct acc gac ttc att ctt ttc 2064 Pro Lys Ile Val Leu Gly Leu Val Ile Ala Thr Asp Phe Ile Leu Phe 675 680 685 ttc ttg gat acc tac tta tgg tac att att gtg aat acc att ttc tct 2112 Phe Leu Asp Thr Tyr Leu Trp Tyr Ile Ile Val Asn Thr Ile Phe Ser 690 695 700 gtt ggg aaa tct ttc tat tta ggt att tct atc tta aca cca tgg aga 2160 Val Gly Lys Ser Phe Tyr Leu Gly Ile Ser Ile Leu Thr Pro Trp Arg 705 710 715 720 aat atc ttc aca aga ttg cca aaa aga ata tac tcc aag att ttg gct 2208 Asn Ile Phe Thr Arg Leu Pro Lys Arg Ile Tyr Ser Lys Ile Leu Ala 725 730 735 act act gat atg gaa att aaa tac aaa cca aag gtt ttg att tct caa 2256 Thr Thr Asp Met Glu Ile Lys Tyr Lys Pro Lys Val Leu Ile Ser Gln 740 745 750 gta tgg aat gcc atc att att tca atg tac aga gaa cat ctc tta gcc 2304 Val Trp Asn Ala Ile Ile Ile Ser Met Tyr Arg Glu His Leu Leu 755 760 765 atc gac cat gta caa aaa tta cta tat cat caa gtt cca tct gaa atc 2352 Ile Asp His Val Gln Lys Leu Leu Tyr His Gln Val Pro Ser Glu Ile 770 775 780 gaa ggt aaa aga act ttg aga gct cct acc ttc ttt gtt tct caa gat 2400 Glu Gly Lys Arg Thr Leu Arg Ala Pro Thr Phe Phe Val Ser Gln Asp 785 790 795 800 gac aat aat ttt gag act gaa ttt ttc cct agg gat tca gag gct gag 2448 Asp Asn Asn Phe Glu Thr Glu Phe Phe Pro Arg Asp Ser Glu Ala Glu 805 810 815 cgt cgt att tct ttc ttt gct caa tct ttg tct act cca att ccc gaa 2496 Arg Arg Ile Ser Phe Phe Ala Gln Ser Leu Ser Thr Pro Ile Pro Glu 820 825 830 cca ctt cca gtt gat aac atg cca acg ttc aca gta ttg act cct cac 2544 Pro Leu Pro Val Asp Asn Met Pro Thr Phe Thr Val Leu Thr Pro His 835 840 845 tac gcg gaa aga att ctg ctg tca tta aga gaa att att cgt gaa gat 2592 Tyr Ala Glu Arg Ile Leu Leu Ser Leu Arg Glu Ile Ile Arg Glu Asp 850 855 860 gac caa ttt tct aga gtt act ctt tta gaa tat cta aaa caa tta cat 2640 Asp Gln Phe Ser Arg Val Thr Leu Leu Glu Tyr Leu Lys Gln Leu His 865 870 875 880 ccc gtt gaa tgg gaa tgt ttt gtt aag gat act aag att ttg gct gaa 2688 Pro Val Glu Trp Glu Cys Phe Val Lys Asp Thr Lys Ile Leu Ala Glu 885 890 895 gaa acc gct gcc tat gaa gga aat gaa aat gaa gct gaa aag gaa gat 2736 Glu Thr Ala Ala Tyr Glu Gly Asn Glu Asn Glu Ala Glu Lys Glu Asp 900 905 910 gct ttg aaa tct caa atc gat gat ttg cca ttt tat tgt att ggt ttt 2784 Ala Leu Lys Ser Gln Ile Asp Asp Leu Pro Phe Tyr Cys Ile Gly Phe 915 920 925 aaa tct gct gct cca gaa tat aca ctt cgt acg aga att tgg gct tct 2832 Lys Ser Ala Ala Pro Glu Tyr Thr Leu Arg Thr Arg Ile Trp Ala Ser 930 935 940 ttg agg tcg cag act cta tat cgt acc att tca ggg ttc atg aat tat 2880 Leu Arg Ser Gln Thr Leu Tyr Arg Thr Ile Ser Gly Phe Met Asn Tyr 945 950 955 960 tca aga gct atc aaa tta ctg tat cgt gtg gaa aat cct gaa att gtt 2928 Ser Arg Ala Ile Lys Leu Leu Tyr Arg Val Glu Asn Pro Glu Ile Val 965 970 975 caa atg ttt ggt ggt aat gct gaa ggc tta gaa aga gag cta gaa aag 2976 Gln Met Phe Gly Gly Asn Ala Glu Gly Leu Glu Arg Glu Leu Glu Lys 980 985 990 atg gca aga aga aag ttt aaa ttt ttg gtc tct atg cag aga ttg gct 3024 Met Ala Arg Arg Lys Phe Lys Phe Leu Val Ser Met Gln Arg Leu Ala 995 1000 1005 aaa ttc aaa cca cat gaa ctg gaa aat gct gag ttt ttg ttg aga gct 3072 Lys Phe Lys Pro His Glu Leu Glu Asn Ala Glu Phe Leu Leu Arg Ala 1010 1015 1020 tac cca gac tta caa att gcc tac ttg gat gaa gag cca cct ttg act 3120 Tyr Pro Asp Leu Gln Ile Ala Tyr Leu Asp Glu Glu Pro Pro Leu Thr 1025 1030 1035 1040 gaa ggt gag gag cca aga atc tat tcc gct ttg att gat gga cat tgt 3168 Glu Gly Glu Glu Pro Arg Ile Tyr Ser Ala Leu Ile Asp Gly His Cys 1045 1050 1055 gaa att cta gat aat ggt cgt aga cgt ccc aag ttt aga gtt caa tta 3216 Glu Ile Leu Asp Asn Gly Arg Arg Arg Pro Lys Phe Arg Val Gln Leu 1060 1065 1070 tct ggt aac cca att ctt ggt gac ggt aaa tct gat aac caa aac cat 3264 Ser Gly Asn Pro Ile Leu Gly Asp Gly Lys Ser Asp Asn Gln Asn His 1075 1080 1085 gct ttg att ttt tac aga ggt gaa tac att caa tta att gat gcc aac 3312 Ala Leu Ile Phe Tyr Arg Gly Glu Tyr Ile Gln Leu Ile Asp Ala Asn 1090 1095 1100 caa gat aac tac ttg gaa gaa tgt ctg aag att aga tct gta ttg gct 3360 Gln Asp Asn Tyr Leu Glu Glu Cys Leu Lys Ile Arg Ser Val Leu Ala 1105 1110 1115 1120 gaa ttt gag gaa ttg aac gtt gaa caa gtt aat cca tat gct ccc ggt 3408 Glu Phe Glu Glu Leu Asn Val Glu Gln Val Asn Pro Tyr Ala Pro Gly 1125 1130 1135 tta agg tat gag gag caa aca act aat cat cct gtt gct att gtt ggt 3456 Leu Arg Tyr Glu Glu Gln Thr Thr Asn His Pro Val Ala Ile Val Gly 1140 1145 1150 gcc aga gaa tac att ttc tct gaa aac tct ggt gtg ctg ggt gat gtg 3504 Ala Arg Glu Tyr Ile Phe Ser Glu Asn Ser Gly Val Leu Gly Asp Val 1155 1160 1165 gcc gct ggt aaa gaa caa act ttt ggt aca tta ttt gcg cgt act tta 3552 Ala Ala Gly Lys Glu Gln Thr Phe Gly Thr Leu Phe Ala Arg Thr Leu 1170 1175 1180 tct caa att ggt ggt aaa ttg cat tat ggt cat ccg gat ttc att aat 3600 Ser Gln Ile Gly Gly Lys Leu His Tyr Gly His Pro Asp Phe Ile Asn 1185 1190 1195 1200 gct acg ttt atg acc act aga ggt ggt gtt tcc aaa gca caa aag ggt 3648 Ala Thr Phe Met Thr Thr Arg Gly Gly Val Ser Lys Ala Gln Lys Gly 1205 1210 1215 ttg cat tta aac gaa gat att tat gct ggt atg aat gct atg ctt cgt 3696 Leu His Leu Asn Glu Asp Ile Tyr Ala Gly Met Asn Ala Met Leu Arg 1220 1225 1230 ggt ggt cgt atc aag cat tgt gag tat tat caa tgt ggt aaa ggt aga 3744 Gly Gly Arg Ile Lys His Cys Glu Tyr Tyr Gln Cys Gly Lys Gly Arg 1235 1240 1245 gat ttg ggt ttc ggt aca att cta aat ttc act act aag att ggt gct 3792 Asp Leu Gly Phe Gly Thr Ile Leu Asn Phe Thr Thr Lys Ile Gly Ala 1250 1255 1260 ggt atg ggt gaa caa atg tta tct cgt gaa tat tat tat ctg ggt acc 3840 Gly Met Gly Glu Gln Met Leu Ser Arg Glu Tyr Tyr Tyr Leu Gly Thr 1265 1270 1275 1280 caa tta cca gtg gac cgt ttc cta aca ttc tat tat gcc cat cct ggt 3888 Gln Leu Pro Val Asp Arg Phe Leu Thr Phe Tyr Tyr Ala His Pro Gly 1285 1290 1295 ttc cat ttg aac aac ttg ttc att caa tta tct ttg caa atg ttt atg 3936 Phe His Leu Asn Asn Leu Phe Ile Gln Leu Ser Leu Gln Met Phe Met 1300 1305 1310 ttg act ttg gtg aat tta tct tcc ttg gcc cat gaa tct att atg tgt 3984 Leu Thr Leu Val Asn Leu Ser Ser Leu Ala His Glu Ser Ile Met Cys 1315 1320 1325 att tac gat agg aac aaa cca aaa aca gat gtt ttg gtt cca att ggg 4032 Ile Tyr Asp Arg Asn Lys Pro Lys Thr Asp Val Leu Val Pro Ile Gly 1330 1335 1340 tgt tac aac ttc caa cct gcg gtt gat tgg gtg aga cgt tat aca ttg 4080 Cys Tyr Asn Phe Gln Pro Ala Val Asp Trp Val Arg Arg Tyr Thr Leu 1345 1350 1355 1360 tct att ttc att gtt ttc tgg att gcc ttc gtt cct att gtt gtt caa 4128 Ser Ile Phe Ile Val Phe Trp Ile Ala Phe Val Pro Ile Val Val Gln 1365 1370 1375 gaa cta att gaa cgt ggt cta tgg aaa gcc acc caa aga ttt ttc tgc 4176 Glu Leu Ile Glu Arg Gly Leu Trp Lys Ala Thr Gln Arg Phe Phe Cys 1380 1385 1390 cac cta tta tca tta tcc cct atg ttc gaa gtg ttt gcg ggc caa atc 4224 His Leu Leu Ser Leu Ser Pro Met Phe Glu Val Phe Ala Gly Gln Ile 1395 1400 1405 tac tct tct gcg tta tta agt gat tta gca att ggt ggt gct cgt tat 4272 Tyr Ser Ser Ala Leu Leu Ser Asp Leu Ala Ile Gly Gly Ala Arg Tyr 1410 1415 1420 ata tcc acc ggt cgt ggt ttt gca act tct cgt ata cca ttt tca att 4320 Ile Ser Thr Gly Arg Gly Phe Ala Thr Ser Arg Ile Pro Phe Ser Ile 1425 1430 1435 1440 ttg tat tca aga ttt gca gga tct gct atc tac atg ggt gca aga tca 4368 Leu Tyr Ser Arg Phe Ala Gly Ser Ala Ile Tyr Met Gly Ala Arg Ser 1445 1450 1455 atg tta atg ttg ctg ttc ggt act gtc gca cat tgg caa gct cca cta 4416 Met Leu Met Leu Leu Phe Gly Thr Val Ala His Trp Gln Ala Pro Leu 1460 1465 1470 ctg tgg ttt tgg gcc tct cta tct tca tta att ttt gcg cct ttc gtt 4464 Leu Trp Phe Trp Ala Ser Leu Ser Ser Leu Ile Phe Ala Pro Phe Val 1475 1480 1485 ttc aat cca cat cag ttt gct tgg gaa gat ttc ttt ttg gat tac agg 4512 Phe Asn Pro His Gln Phe Ala Trp Glu Asp Phe Phe Leu Asp Tyr Arg 1490 1495 1500 gat tat atc aga tgg tta tca aga ggt aat aat caa tat cat aga aac 4560 Asp Tyr Ile Arg Trp Leu Ser Arg Gly Asn Asn Gln Tyr His Arg Asn 1505 1510 1515 1520 tcg tgg att ggt tac gtg agg atg tct agg gca cgt att act ggg ttt 4608 Ser Trp Ile Gly Tyr Val Arg Met Ser Arg Ala Arg Ile Thr Gly Phe 1525 1530 1535 aaa cgt aaa ctg gtt ggc gat gaa tct gag aaa gct gct ggt gac gca 4656 Lys Arg Lys Leu Val Gly Asp Glu Ser Glu Lys Ala Ala Gly Asp Ala 1540 1545 1550 agc agg gct cat aga acc aat ttg atc atg gct gaa atc ata ccc tgt 4704 Ser Arg Ala His Arg Thr Asn Leu Ile Met Ala Glu Ile Ile Pro Cys 1555 1560 1565 gca att tat gca gct ggt tgt ttt att gcc ttc acg ttt att aat gct 4752 Ala Ile Tyr Ala Ala Gly Cys Phe Ile Ala Phe Thr Phe Ile Asn Ala 1570 1575 1580 caa acc ggt gtc aag act act gat gat gat agg gtg aat tct gtt tta 4800 Gln Thr Gly Val Lys Thr Thr Asp Asp Asp Arg Val Asn Ser Val Leu 1585 1590 1595 1600 cgt atc atc att tgt acc ttg gcg cca atc gcc gtt aac ctc ggt gtt 4848 Arg Ile Ile Ile Cys Thr Leu Ala Pro Ile Ala Val Asn Leu Gly Val 1605 1610 1615 cta ttc ttc tgt atg ggt atg tca tgc tgc tct ggt ccc tta ttt ggt 4896 Leu Phe Phe Cys Met Gly Met Ser Cys Cys Ser Gly Pro Leu Phe Gly 1620 1625 1630 atg tgt tgt aag aag aca ggt tct gta atg gct gga att gcc cac ggt 4944 Met Cys Cys Lys Lys Thr Gly Ser Val Met Ala Gly Ile Ala His Gly 1635 1640 1645 gtt gct gtt att gtc cac att gcc ttt ttc att gtc atg tgg gtt ttg 4992 Val Ala Val Ile Val His Ile Ala Phe Phe Ile Val Met Trp Val Leu 1650 1655 1660 gag agc ttc aac ttt gtt aga atg tta atc gga gtc gtt act tgt atc 5040 Glu Ser Phe Asn Phe Val Arg Met Leu Ile Gly Val Val Thr Cys Ile 1665 1670 1675 1680 caa tgt caa aga ctc att ttt cat tgc atg aca gcg tta atg ttg act 5088 Gln Cys Gln Arg Leu Ile Phe His Cys Met Thr Ala Leu Met Leu Thr 1685 1690 1695 cgt gaa ttt aaa aac gat cat gcc aat aca gcc ttc tgg act ggt aag 5136 Arg Glu Phe Lys Asn Asp His Ala Asn Thr Ala Phe Trp Thr Gly Lys 1700 1705 1710 tgg tat ggt aaa ggt atg ggt tac atg gct tgg acc cag cca agt aga 5184 Trp Tyr Gly Lys Gly Met Gly Tyr Met Ala Trp Thr Gln Pro Ser Arg 1715 1720 1725 gaa tta acc gcc aag gta att gag ctt tca gaa ttt gca gct gat ttt 5232 Glu Leu Thr Ala Lys Val Ile Glu Leu Ser Glu Phe Ala Ala Asp Phe 1730 1735 1740 gtt cta ggt cat gtg att tta atc tgt caa ctg cca ctc att ata atc 5280 Val Leu Gly His Val Ile Leu Ile Cys Gln Leu Pro Leu Ile Ile Ile 1745 1750 1755 1760 cca aaa ata gat aaa ttc cac tcg att atg cta ttc tgg cta aag ccc 5328 Pro Lys Ile Asp Lys Phe His Ser Ile Met Leu Phe Trp Leu Lys Pro 1765 1770 1775 tct cgt caa att cgt ccc cca att tac tct ctg aag caa act cgt ttg 5376 Ser Arg Gln Ile Arg Pro Pro Ile Tyr Ser Leu Lys Gln Thr Arg Leu 1780 1785 1790 cgt aag cgt atg gtc aag aag tac tgc tct ttg tac ttt tta gta ttg 5424 Arg Lys Arg Met Val Lys Lys Tyr Cys Ser Leu Tyr Phe Leu Val Leu 1795 1800 1805 gct att ttt gca gga tgc att att ggt cct gct gta gcc tct gct aag 5472 Ala Ile Phe Ala Gly Cys Ile Ile Gly Pro Ala Val Ala Ser Ala Lys 1810 1815 1820 atc cac aaa cac att gga gat tca ttg gat ggc gtt gtt cac aat cta 5520 Ile His Lys His Ile Gly Asp Ser Leu Asp Gly Val Val His Asn Leu 1825 1830 1835 1840 ttc caa cca ata aat aca acc aat aat gac act ggt tcc caa atg tca 5568 Phe Gln Pro Ile Asn Thr Thr Asn Asn Asp Thr Gly Ser Gln Met Ser 1845 1850 1855 act tat caa agt cac tac tat act cat acg cca tca tta aag acc tgg 5616 Thr Tyr Gln Ser His Tyr Tyr Thr His Thr Pro Ser Leu Lys Thr Trp 1860 1865 1870 tca act ata aaa taa 5631 Ser Thr Ile Lys 1875 <210> 2 <211> 1876 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Asn Thr Asp Gln Gln Pro Tyr Gln Gly Gln Thr Asp Tyr Thr Gln 1 5 10 15 Gly Pro Gly Asn Gly Gln Ser Gln Glu Gln Asp Tyr Asp Gln Tyr Gly 20 25 30 Gln Pro Leu Tyr Pro Ser Gln Ala Asp Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Val 35 40 45 Ala Ala Gly Thr Glu Ala Asp Met Tyr Gly Gln Gln Pro Pro Asn Glu 50 55 60 Ser Tyr Asp Gln Asp Tyr Thr Asn Gly Glu Tyr Tyr Gly Gln Pro Pro 65 70 75 80 Asn Met Ala Ala Gln Asp Gly Glu Asn Phe Ser Asp Phe Ser Ser Tyr 85 90 95 Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Tyr Asp Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Thr 100 105 110 Ala Ser Gln Met Ser Tyr Gly Glu Pro Asn Ser Ser Gly Thr Ser Thr 115 120 125 Pro Ile Tyr Gly Asn Tyr Asp Pro Asn Ala Ile Ala Met Ala Leu Pro 130 135 140 Asn Glu Pro Tyr Pro Ala Trp Thr Ala Asp Ser Gln Ser Pro Val Ser 145 150 155 160 Ile Glu Gln Ile Glu Asp Ile Phe Ile Asp Leu Thr Asn Arg Leu Gly 165 170 175 Phe Gln Arg Asp Ser Met Arg Asn Met Phe Asp His Phe Met Val Leu 180 185 190 Leu Asp Ser Arg Ser Ser Arg Met Ser Pro Asp Gln Ala Leu Leu Ser 195 200 205 Leu His Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Asp Thr Ala Asn Tyr Lys Lys Trp 210 215 220 Tyr Phe Ala Ala Gln Leu Asp Met Asp Asp Glu Ile Gly Phe Arg Asn 225 230 235 240 Met Ser Leu Gly Lys Leu Ser Arg Lys Ala Arg Lys Ala Lys Lys Lys 245 250 255 Asn Lys Lys Ala Met Glu Glu Ala Asn Pro Glu Asp Thr Glu Glu Thr 260 265 270 Leu Asn Lys Ile Glu Gly Asp Asn Ser Leu Glu Ala Ala Asp Phe Arg 275 280 285 Trp Lys Ala Lys Met Asn Gln Leu Ser Pro Leu Glu Arg Val Arg His 290 295 300 Ile Ala Leu Tyr Leu Leu Cys Trp Gly Glu Ala Asn Gln Val Arg Phe 305 310 315 320 Thr Ala Glu Cys Leu Cys Phe Ile Tyr Lys Cys Ala Leu Asp Tyr Leu 325 330 335 Asp Ser Pro Leu Cys Gln Gln Arg Gln Glu Pro Met Pro Glu Gly Asp 340 345 350 Phe Leu Asn Arg Val Ile Thr Pro Ile Tyr His Phe Ile Arg Asn Gln 355 360 365 Val Tyr Glu Ile Val Asp Gly Arg Phe Val Lys Arg Glu Arg Asp His 370 375 380 Asn Lys Ile Val Gly Tyr Asp Asp Leu Asn Gln Leu Phe Trp Tyr Pro 385 390 395 400 Glu Gly Ile Ala Lys Ile Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Leu Ile Glu 405 410 415 Leu Pro Leu Glu Glu Arg Tyr Leu Arg Leu Gly Asp Val Val Trp Asp 420 425 430 Asp Val Phe Phe Lys Thr Tyr Lys Glu Thr Arg Thr Trp Leu His Leu 435 440 445 Val Thr Asn Phe Asn Arg Ile Trp Val Met His Ile Ser Ile Phe Trp 450 455 460 Met Tyr Phe Ala Tyr Asn Ser Pro Thr Phe Tyr Thr His Asn Tyr Gln 465 470 475 480 Gln Leu Val Asp Asn Gln Pro Leu Ala Ala Tyr Lys Trp Ala Ser Cys 485 490 495 Ala Leu Gly Gly Thr Val Ala Ser Leu Ile Gln Ile Val Ala Thr Leu 500 505 510 Cys Glu Trp Ser Phe Val Pro Arg Lys Trp Ala Gly Ala Gln His Leu 515 520 525 Ser Arg Arg Phe Trp Phe Leu Cys Ile Ile Phe Gly Ile Asn Leu Gly 530 535 540 Pro Ile Ile Phe Val Phe Ala Tyr Asp Lys Asp Thr Val Tyr Ser Thr 545 550 555 560 Ala Ala His Val Val Ala Ala Val Met Phe Phe Val Ala Val Ala Thr 565 570 575 Ile Ile Phe Phe Ser Ile Met Pro Leu Gly Gly Leu Phe Thr Ser Tyr 580 585 590 Met Lys Lys Ser Thr Arg Arg Tyr Val Ala Ser Gln Thr Phe Thr Ala 595 600 605 Ala Phe Ala Pro Leu His Gly Leu Asp Arg Trp Met Ser Tyr Leu Val 610 615 620 Trp Val Thr Val Phe Ala Ala Lys Tyr Ser Glu Ser Tyr Tyr Phe Leu 625 630 635 640 Val Leu Ser Leu Arg Asp Pro Ile Arg Ile Leu Ser Thr Thr Ala Met 645 650 655 Arg Cys Thr Gly Glu Tyr Trp Trp Gly Ala Val Leu Cys Lys Val Gln 660 665 670 Pro Lys Ile Val Leu Gly Leu Val Ile Ala Thr Asp Phe Ile Leu Phe 675 680 685 Phe Leu Asp Thr Tyr Leu Trp Tyr Ile Ile Val Asn Thr Ile Phe Ser 690 695 700 Val Gly Lys Ser Phe Tyr Leu Gly Ile Ser Ile Leu Thr Pro Trp Arg 705 710 715 720 Asn Ile Phe Thr Arg Leu Pro Lys Arg Ile Tyr Ser Lys Ile Leu Ala 725 730 735 Thr Thr Asp Met Glu Ile Lys Tyr Lys Pro Lys Val Leu Ile Ser Gln 740 745 750 Val Trp Asn Ala Ile Ile Ile Ser Met Tyr Arg Glu His Leu Leu Ala 755 760 765 Ile Asp His Val Gln Lys Leu Leu Tyr His Gln Val Pro Ser Glu Ile 770 775 780 Glu Gly Lys Arg Thr Leu Arg Ala Pro Thr Phe Phe Val Ser Gln Asp 785 790 795 800 Asp Asn Asn Phe Glu Thr Glu Phe Phe Pro Arg Asp Ser Glu Ala Glu 805 810 815 Arg Arg Ile Ser Phe Phe Ala Gln Ser Leu Ser Thr Pro Ile Pro Glu 820 825 830 Pro Leu Pro Val Asp Asn Met Pro Thr Phe Thr Val Leu Thr Pro His 835 840 845 Tyr Ala Glu Arg Ile Leu Leu Ser Leu Arg Glu Ile Ile Arg Glu Asp 850 855 860 Asp Gln Phe Ser Arg Val Thr Leu Leu Glu Tyr Leu Lys Gln Leu His 865 870 875 880 Pro Val Glu Trp Glu Cys Phe Val Lys Asp Thr Lys Ile Leu Ala Glu 885 890 895 Glu Thr Ala Ala Tyr Glu Gly Asn Glu Asn Glu Ala Glu Lys Glu Asp 900 905 910 Ala Leu Lys Ser Gln Ile Asp Asp Leu Pro Phe Tyr Cys Ile Gly Phe 915 920 925 Lys Ser Ala Ala Pro Glu Tyr Thr Leu Arg Thr Arg Ile Trp Ala Ser 930 935 940 Leu Arg Ser Gln Thr Leu Tyr Arg Thr Ile Ser Gly Phe Met Asn Tyr 945 950 955 960 Ser Arg Ala Ile Lys Leu Leu Tyr Arg Val Glu Asn Pro Glu Ile Val 965 970 975 Gln Met Phe Gly Gly Asn Ala Glu Gly Leu Glu Arg Glu Leu Glu Lys 980 985 990 Met Ala Arg Arg Lys Phe Lys Phe Leu Val Ser Met Gln Arg Leu Ala 995 1000 1005 Lys Phe Lys Pro His Glu Leu Glu Asn Ala Glu Phe Leu Leu Arg Ala 1010 1015 1020 Tyr Pro Asp Leu Gln Ile Ala Tyr Leu Asp Glu Glu Pro Pro Leu Thr 1025 1030 1035 1040 Glu Gly Glu Glu Pro Arg Ile Tyr Ser Ala Leu Ile Asp Gly His Cys 1045 1050 1055 Glu Ile Leu Asp Asn Gly Arg Arg Arg Pro Lys Phe Arg Val Gln Leu 1060 1065 1070 Ser Gly Asn Pro Ile Leu Gly Asp Gly Lys Ser Asp Asn Gln Asn His 1075 1080 1085 Ala Leu Ile Phe Tyr Arg Gly Glu Tyr Ile Gln Leu Ile Asp Ala Asn 1090 1095 1100 Gln Asp Asn Tyr Leu Glu Glu Cys Leu Lys Ile Arg Ser Val Leu Ala 1105 1110 1115 1120 Glu Phe Glu Glu Leu Asn Val Glu Gln Val Asn Pro Tyr Ala Pro Gly 1125 1130 1135 Leu Arg Tyr Glu Glu Gln Thr Thr Asn His Pro Val Ala Ile Val Gly 1140 1145 1150 Ala Arg Glu Tyr Ile Phe Ser Glu Asn Ser Gly Val Leu Gly Asp Val 1155 1160 1165 Ala Ala Gly Lys Glu Gln Thr Phe Gly Thr Leu Phe Ala Arg Thr Leu 1170 1175 1180 Ser Gln Ile Gly Gly Lys Leu His Tyr Gly His Pro Asp Phe Ile Asn 1185 1190 1195 1200 Ala Thr Phe Met Thr Thr Arg Gly Gly Val Ser Lys Ala Gln Lys Gly 1205 1210 1215 Leu His Leu Asn Glu Asp Ile Tyr Ala Gly Met Asn Ala Met Leu Arg 1220 1225 1230 Gly Gly Arg Ile Lys His Cys Glu Tyr Tyr Gln Cys Gly Lys Gly Arg 1235 1240 1245 Asp Leu Gly Phe Gly Thr Ile Leu Asn Phe Thr Thr Lys Ile Gly Ala 1250 1255 1260 Gly Met Gly Glu Gln Met Leu Ser Arg Glu Tyr Tyr Tyr Leu Gly Thr 1265 1270 1275 1280 Gln Leu Pro Val Asp Arg Phe Leu Thr Phe Tyr Tyr Ala His Pro Gly 1285 1290 1295 Phe His Leu Asn Asn Leu Phe Ile Gln Leu Ser Leu Gln Met Phe Met 1300 1305 1310 Leu Thr Leu Val Asn Leu Ser Ser Leu Ala His Glu Ser Ile Met Cys 1315 1320 1325 Ile Tyr Asp Arg Asn Lys Pro Lys Thr Asp Val Leu Val Pro Ile Gly 1330 1335 1340 Cys Tyr Asn Phe Gln Pro Ala Val Asp Trp Val Arg Arg Tyr Thr Leu 1345 1350 1355 1360 Ser Ile Phe Ile Val Phe Trp Ile Ala Phe Val Pro Ile Val Val Gln 1365 1370 1375 Glu Leu Ile Glu Arg Gly Leu Trp Lys Ala Thr Gln Arg Phe Phe Cys 1380 1385 1390 His Leu Leu Ser Leu Ser Pro Met Phe Glu Val Phe Ala Gly Gln Ile 1395 1400 1405 Tyr Ser Ser Ala Leu Leu Ser Asp Leu Ala Ile Gly Gly Ala Arg Tyr 1410 1415 1420 Ile Ser Thr Gly Arg Gly Phe Ala Thr Ser Arg Ile Pro Phe Ser Ile 1425 1430 1435 1440 Leu Tyr Ser Arg Phe Ala Gly Ser Ala Ile Tyr Met Gly Ala Arg Ser 1445 1450 1455 Met Leu Met Leu Leu Phe Gly Thr Val Ala His Trp Gln Ala Pro Leu 1460 1465 1470 Leu Trp Phe Trp Ala Ser Leu Ser Ser Leu Ile Phe Ala Pro Phe Val 1475 1480 1485 Phe Asn Pro His Gln Phe Ala Trp Glu Asp Phe Phe Leu Asp Tyr Arg 1490 1495 1500 Asp Tyr Ile Arg Trp Leu Ser Arg Gly Asn Asn Gln Tyr His Arg Asn 1505 1510 1515 1520 Ser Trp Ile Gly Tyr Val Arg Met Ser Arg Ala Arg Ile Thr Gly Phe 1525 1530 1535 Lys Arg Lys Leu Val Gly Asp Glu Ser Glu Lys Ala Ala Gly Asp Ala 1540 1545 1550 Ser Arg Ala His Arg Thr Asn Leu Ile Met Ala Glu Ile Ile Pro Cys 1555 1560 1565 Ala Ile Tyr Ala Ala Gly Cys Phe Ile Ala Phe Thr Phe Ile Asn Ala 1570 1575 1580 Gln Thr Gly Val Lys Thr Thr Asp Asp Asp Arg Val Asn Ser Val Leu 1585 1590 1595 1600 Arg Ile Ile Ile Cys Thr Leu Ala Pro Ile Ala Val Asn Leu Gly Val 1605 1610 1615 Leu Phe Phe Cys Met Gly Met Ser Cys Cys Ser Gly Pro Leu Phe Gly 1620 1625 1630 Met Cys Cys Lys Lys Thr Gly Ser Val Met Ala Gly Ile Ala His Gly 1635 1640 1645 Val Ala Val Ile Val His Ile Ala Phe Phe Ile Val Met Trp Val Leu 1650 1655 1660 Glu Ser Phe Asn Phe Val Arg Met Leu Ile Gly Val Val Thr Cys Ile 1665 1670 1675 1680 Gln Cys Gln Arg Leu Ile Phe His Cys Met Thr Ala Leu Met Leu Thr 1685 1690 1695 Arg Glu Phe Lys Asn Asp His Ala Asn Thr Ala Phe Trp Thr Gly Lys 1700 1705 1710 Trp Tyr Gly Lys Gly Met Gly Tyr Met Ala Trp Thr Gln Pro Ser Arg 1715 1720 1725 Glu Leu Thr Ala Lys Val Ile Glu Leu Ser Glu Phe Ala Ala Asp Phe 1730 1735 1740 Val Leu Gly His Val Ile Leu Ile Cys Gln Leu Pro Leu Ile Ile Ile 1745 1750 1755 1760 Pro Lys Ile Asp Lys Phe His Ser Ile Met Leu Phe Trp Leu Lys Pro 1765 1770 1775 Ser Arg Gln Ile Arg Pro Pro Ile Tyr Ser Leu Lys Gln Thr Arg Leu 1780 1785 1790 Arg Lys Arg Met Val Lys Lys Tyr Cys Ser Leu Tyr Phe Leu Val Leu 1795 1800 1805 Ala Ile Phe Ala Gly Cys Ile Ile Gly Pro Ala Val Ala Ser Ala Lys 1810 1815 1820 Ile His Lys His Ile Gly Asp Ser Leu Asp Gly Val Val His Asn Leu 1825 1830 1835 1840 Phe Gln Pro Ile Asn Thr Thr Asn Asn Asp Thr Gly Ser Gln Met Ser 1845 1850 1855 Thr Tyr Gln Ser His Tyr Tyr Thr His Thr Pro Ser Leu Lys Thr Trp 1860 1865 1870 Ser Thr Ile Lys 1875

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 コリーン・ケイ・ディクソン アメリカ合衆国27513ノースカロライナ州 キャリー、ウォルデンブルック・コート 105番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２の少なくとも４６個の隣接し
   たアミノ酸残基を含んでなる実質的に純粋なＥＣＢ結合
   ペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１のペプチドをコードする単離さ
   れた核酸化合物。
3. 【請求項３】 ＥＣＢ結合領域に結合する化合物を同定
   する方法であって、以下の工程： ａ）適当な反応緩衝液中で ｉ）請求項１記載の実質的に純粋なＥＣＢ結合ペプチ
   ド；および ｉｉ）試験阻害化合物 を混合すること；および ｂ）該ペプチドと該化合物との間の結合をいずれかの適
   当な手段により測定することを含む方法。