JP2000060563A

JP2000060563A - アルデヒド脱水素酵素、その遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びアルデヒド脱水素酵素の製造法

Info

Publication number: JP2000060563A
Application number: JP10236691A
Authority: JP
Inventors: Keiko Kurosawa; 恵子黒澤; Akira Matsuyama; 旭松山
Original assignee: Research Institute of Innovative Technology for the Earth RITE
Current assignee: Research Institute of Innovative Technology for the Earth RITE
Priority date: 1998-08-24
Filing date: 1998-08-24
Publication date: 2000-02-29

Abstract

(57)【要約】（修正有）【解決手段】以下の理化学的性質を有するアルデヒド
脱水素酵素、 (1)作用：ハイドロキシピルブアルデヒド＋ＮＡＤ⁺→
ハイドロキシピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ (2)基質特異性：ハイドロキシピルブアルデヒド等の２
−オキソアルデヒドに特異的に作用し、n=３〜５の直鎖
アルデヒドにもわずかに作用する。 (3)至適pH：約10付近 (4)安定pH範囲：５〜９ (5)作用適温の範囲：10〜80℃ 以下の(a)又は(b)のアルデヒド脱水素酵素、特定のアミ
ノ酸配列からなるアルデヒド脱水素酵素、これをコード
する遺伝子、該遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡ、該組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又
は形質導入体、これによるアルデヒド脱水素酵素の製造
法、及びシュードモナス属に属しアルデヒド脱水素酵素
生産能を有する微生物を培養してアルデヒド脱水素酵素
を製造する方法。【効果】新規なアルデヒド脱水素酵素を効率よく生産
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アルデヒド脱水素
酵素、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びアルデヒド脱
水素酵素の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルデヒド脱水素酵素は、グリセロール
からセリンまたはシステインを酵素的に合成する際、有
用である。ハイドロキシピルブアルデヒドに働く酵素と
しては、ヒツジ肝臓中の２−オキソアルデヒド脱水素酵
素が知られている（J.B.C.、vol242、4603−4609、196
7）。しかしながらこのハイドロキシピルブアルデヒド
に働く２−オキソアルデヒド脱水素酵素はヒツジ肝臓中
より部分精製されたのみであり、詳細は不明であった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、セリンまた
はシステインを酵素的に生産することを目的として、ア
ルデヒド脱水素酵素、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及
びアルデヒド脱水素酵素の製造法を提供することにあ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記目的に鑑み鋭意研究を行ない、シュードモナス属に
属する細菌由来の新規アルデヒド脱水素酵素とその遺伝
子の単離、及び遺伝子の構造を決定することに成功し、
更にまた、アルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子を
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この
組み換え体をエッシェリシア(Escherichia)属に属する
菌株に含ませたアルデヒド脱水素酵素生産能を有する菌
株を培地に培養することにより、効率よくアルデヒド脱
水素酵素が生産されること等を見出し、本発明を完成し
た。

【０００５】即ち、本発明は、以下の理化学的性質を有
するアルデヒド脱水素酵素である。 (1)作用：ハイドロキシピルブアルデヒド＋ＮＡＤ⁺→ハ
イドロキシピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ (2)基質特異性：ハイドロキシピルブアルデヒド、グリ
セルアルデヒド、メチルグリオキサール等、２−オキソ
アルデヒドに特異的に作用し、n=３〜５の直鎖アルデヒ
ドにもわずかに作用する。 (3)至適pH：約10.0 (4)安定pH範囲：５〜９ (5)作用至適の範囲：10〜80℃

【０００６】また、本発明は、以下の(a)または(b)の組
換えアルデヒド脱水素酵素である。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつハイドロキシピルブアルデヒド脱水素酵素活性
を有するタンパク質

【０００７】また、本発明は、以下の(a)または(b)のタ
ンパク質をコードするアルデヒド脱水素酵素遺伝子であ
る。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質また本発明は、上記アルデヒド脱水素酵素遺伝子をベク
ターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮ
Ａである。また本発明は、上記組み換え体ＤＮＡを含む
形質転換体または形質導入体である。また本発明は、上
記形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物
からアルデヒド脱水素酵素を採取することを特徴とする
アルデヒド脱水素酵素の製造法である。

【０００８】更にまた、本発明は、シュードモナス属に
属し、アルデヒド脱水素酵素生産能を有する微生物を培
地に培養し、培養物からアルデヒド脱水素酵素を採取す
ることを特徴とするアルデヒド脱水素酵素の製造法であ
る。なお、ここで得られる酵素は非組み換えアルデヒド
脱水素酵素である。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵素の製造には、本発明らが土壌から分離した
7-12株が用いられる。また、これらの菌株を人工変異方
法、例えば、紫外線照射、X線照射、変異誘起剤処理等
により変異処理した変異株あるいは自然発生による変異
株でも該酵素を生産するものであれば本発明に用いるこ
とができる。この7-12株の菌学的性質は、以下の通りで
ある。

【００１０】 (a)形態的性質 1)形態桿菌 2)運動性あり(鞭毛；極多毛) 3)胞子なし (b)生理学的性質 1)グラム染色性陰性 2)酸素に対する態度好気性 3)オキシダーゼ陽性 4)カタラーゼ陽性 5)O-Fテスト O 6)蛍光色素の生成陽性 7)PHBの蓄積陽性 8)アルギニンジヒドロラーゼ陽性 9)41℃での生育陰性 10)硝酸塩の還元陰性 11)脱窒反応陰性 12)ゼラチン液化陰性 13)デンプン分解陰性 14)資化性 (1)グルコース陽性 (2)トレハロース陰性 (3)2-ケトグルコネイト陽性 (4)meso-イノシトール陰性 (5)ゲラニオール陰性 (6)L-バリン陽性 (7)β-アラニン陽性 (8)DL-アルギニン陽性 15)キノン系 Q-9を含有する 16)菌体内ＤＮＡのGC含量 61モル％

【００１１】この菌学的性質について、バージス・マニ
ュアル・オブ・ディターミネイテブ・バクテリオロジー
(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)第
８版を用いて検索するとこの菌株と一致する公知菌とし
てシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida) が挙
げられる。そこで、この株をシュードモナス・プチダ7-
12 株と同定した。そして、このシュードモナス・プチ
ダ 7-12 株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM P-16426として寄託されている。本発明の酵素の製造
には、上記7-12株の他、シュードモナス属に属し、アル
デヒド脱水素酵素生産能を有する微生物であれば如何な
る菌株でも用いることができる。

【００１２】本発明アルデヒド脱水素酵素遺伝子は、例
えば、次のようにして得ることができる。先ず、シュー
ドモナス・プチダ7-12株を、例えば、Current Protocol
s in Molecular Biology（WILEY Intersciense,1989）
記載の方法等により培養し、得られた菌体１ gを得、得
られた菌体から染色体ＤＮＡを抽出する。次いで、精製
アルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列、シュードモナス
・プチダに属する微生物のコドン使用頻度を考慮して、
合成ＤＮＡを作製し、上記で得られた染色体ＤＮＡを鋳
型として、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、PCR法と略称
する。）を行ない、アルデヒド脱水素酵素の一部をコー
ドするＤＮＡを得る。

【００１３】上記で得られた染色体ＤＮＡを、例えば、
Sau3AI等の制限酵素で部分消化し、常法に従いベクター
ＤＮＡに組み込むのである。用いられるベクターＤＮＡ
としては、例えば、pUC19（宝酒造社製）、pBR322（宝
酒造社製）、pBluescript SK⁺（Stratagene社製）、pMA
L-C2（NEW EnglandLabs社製）等のプラスミドＤＮＡ、
λENBL3（Stratagene社製）、λDASH II（フナコシ社
製）等のバクテリオファージＤＮＡ等が挙げられる。

【００１４】得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例え
ば、大腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM109（東洋紡社
製）、XL1-Blue（フナコシ社製）等を形質転換または形
質導入して夫々の形質転換体または形質導入体を得る。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌等の細菌、酵母、か
び、放線菌、動物細胞等が用いられる。

【００１５】この形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの
方法（Method in Enzymology,68,326-331,1979）により
行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.Ho
hnの方法（Method in Enzymology,68,299-309,1979）に
より行なうことができる。

【００１６】上記形質転換体または形質導入体より純化
された組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、P.Guerry
等の方法〔J.Bacteriology、第116巻、第1064〜1066頁
(1973年)〕、D.B.Clewellの方法〔J.Bacteriology、第1
10巻、第667〜676頁(1972年)〕等により得ることができ
る。

【００１７】更に、上記アルデヒド脱水素酵素遺伝子を
含有するＤＮＡを用いて、後述の実施例２項目(6)に示
す３７０ＤＮＡシークエンス・システム（パーキンエル
マー社製）を用いてアルデヒド脱水素酵素遺伝子の全塩
基配列の解析を行ない（配列番号１参照）、次いで、前
記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペプ
チドのアミノ酸の一次配列を確定する。（配列番号２参
照）なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列におい
て、１もしくは複数、好ましくは、数個のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されており、かつ、アルデヒド脱
水素酵素活性をもたらすアミノ酸配列をコードするアル
デヒド脱水素酵素遺伝子は、全て本発明に含まれる。

【００１８】そして、配列番号２に示されるアミノ酸配
列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換も
しくは付加されており、かつ、アルデヒド脱水素酵素活
性をもたらすアミノ酸配列をコードするアルデヒド脱水
素酵素遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例え
ば、遺伝子に点変異または欠失変異を生じさせるための
周知技術である部位特定変異誘導法、遺伝子を選択的に
開裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除去または
付加し、遺伝子を連結する方法、オリゴヌクレオチド変
異誘導法等が挙げられる。

【００１９】上記のようにして得られたアルデヒド脱水
素酵素生産能を有する形質転換体または形質導入体、例
えば、エッシェリシア属に属する菌株またはシュードモ
ナス属に属し、アルデヒド脱水素酵素生産能を有する微
生物を用いてアルデヒド脱水素酵素を製造するには、下
記のようにして行なうことができる。上記微生物を培養
するには、通常の固体培養法で培養してもよいが、液体
培養法を採用して培養するのが好ましい。

【００２０】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液
等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン
酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。また更に、培地中に誘導物
質としてグリセロール等を添加することもできる。

【００２１】なお、培地の初発pHは、7〜9に調整するの
が適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で6〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりアルデヒド脱水素酵素を採取するには、通常
の酵素採取手段を用いることができる。培養物から、例
えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗
菌する。この菌体からアルデヒド脱水素酵素を採取する
ことが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いること
もできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミ
ル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リ
ゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶
解する方法、トリトンＸ-100等の界面活性剤を用いて菌
体から酵素を抽出する方法等により、菌体からアルデヒ
ド脱水素酵素を採取するのが好ましい。

【００２２】このようにして得られた粗酵素液からアル
デヒド脱水素酵素を単離するには、通常の酵素精製に用
いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機
溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過ク
ロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等
を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。得られたアル
デヒド脱水素酵素の理化学的性質は、以下に示す通りで
ある。

【００２３】(1)作用：ハイドロキシピルブアルデヒド
＋ＮＡＤ⁺→ハイドロキシピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ (2)基質特異性：ハイドロキシピルブアルデヒド、グリ
セルアルデヒド、メチルグリオキサール等、２−オキソ
アルデヒドに特異的に作用し、n=３〜５の直鎖アルデヒ
ドにもわずかに作用する。 (3)至適pH：約10.0 (4)安定pH範囲：５〜９ (5)作用適温の範囲：10〜80℃、特に70℃が最適であ
る。

【００２４】（1）酵素活性測定法（活性測定法）（試薬）Ａ 200ｍＭりん酸緩衝液、pH8.0 Ｂ 10ｍＭＮＡＤ水溶液Ｃ 200ｍＭハイドロキシピルブアルデヒド水溶液Ｄ酵素希釈液（10％グリセロールを含む、50ｍＭりん
酸緩衝液 pH8.0）

【００２５】（手順）１．下記反応混液をキュベット（ｄ＝1.0ｃｍ）に調製
し、37℃で約5分間予備加温する。 0.5ｍｌりん酸緩衝液（pH8.0） 0.4ｍｌＮＡＤ水溶液 0.4ｍｌハイドロキシピルブアルデヒド水溶液 0.6ｍｌ水

【００２６】２．酵素溶液0.1ｍｌを添加し、混和後水
を対照に37℃に制御された分光光度計で340ｎｍの吸光
度変化を4〜5分間記録し、その初期直線部分から1分間
当りの吸光度変化を求める（△ｔｅｓｔ）。盲検は、酵
素溶液の代わりに酵素希釈液を0.1ｍｌ加え、上記と同
様に操作を行なって1分間当りの吸光度変化を求める
（△ｂｌａｎｋ）。

【００２７】Ａ＝6.22×1.0×0.1（ｍｌ）Ｂ＝△ＯＤ／ｍｉｎ（△ｔｅｓｔ−△ｂｌａｎｋ）×2.
0（ｍｌ）×希釈倍数

【００２８】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。〔実施例１〕シュードモナス・プチダ7-12株 (FERM P-1
6426) の産生するアルデヒド脱水素酵素の製造例を示
す。

【００２９】30Lジャーファーメンターを用いて20Lの培
地（２％グリセロール、0.1％イーストエキス、0.3％ポ
リペプトン、0.05％グルタミン酸ナトリウム、0.2％硫
安、0.6％りん酸水素２カリウム、0.05％硫酸マグネシ
ウム、pH７）でシュードモナス・プチダ7-12株 (FERM P
-16426) を30℃で23時間培養して、集菌し、菌体約40ｇ
を得た。この内約７L培養液分の菌体を0.1％トリトンX-
100、４mM EDTAを含む50mMりん酸バッファー100mlに懸
濁し、フレンチプレスで菌体を破砕した。その遠心上清
をDEAEセファロースカラム（ 0〜0.1M NaClの直線勾配
で溶出）、ブチルトヨパールカラム（１〜0 M 硫安の直
線勾配で溶出）及び5'-AMPセファロースカラム（０〜５
mM NADの直線勾配で溶出）により精製し、アルデヒド脱
水素酵素を4.47mg得た。得られたアルデヒド脱水素酵素
をSDS-PAGEで分析したところ、約51.2kDaの単一バンド
を示した。

【００３０】次に、アルデヒド脱水素酵素の基質特異性
は次の通りであった。ピルビンアルデヒド 124 ％ハイドロキシピルブアルデヒド 100 ％プロピオンアルデヒド 36 ％グリセルアルデヒド 23 ％吉草酸アルデヒド 13 ％ n-ブチルアルデヒド 16 ％グリオキサール 20 ％アセトアルデヒド 4 ％

【００３１】次に、アルデヒド脱水素酵素の性質を調べ
たところ、本酵素の至適pHは、約10.0（図1参照）であ
った。安定pHの範囲を調べたところ、25℃、30分処理で
5〜9の範囲で安定であった（図2参照）。また、作用適
温の範囲は、特に70℃で最適であった（図3参照）。さ
らに、作用適温の範囲を調べたところ、25mMリン酸バッ
ファー（pH6.5）中で10分の処理では0〜60℃まで安定で
あった（図4参照）。

【００３２】〔実施例２〕 (1)シュードモナス・プチダ7-12株の染色体の調製シュードモナス・プチダ7-12株を1％のグルコースを添
加したＬＢ培地〔Current Protocols in Molecular Bio
logy（WILEY Intersciense,1989）〕100ml に接種し
て、30℃で20時間振とう培養し、培養物を得た。この培
養物を6,000r.p.m.で10分間遠心分離することにより集
菌して菌体を得た。この菌体よりCurrent Protocols in
Molecular Biology（WILEY Intersciense,1989）記載
の方法に従い、染色体ＤＮＡ1.2 mgを得た。

【００３３】(2)プライマーの合成シュードモナス・プチダ7-12株由来の精製アルデヒド脱
水素酵素150μgをプロテインシークエンサー（パーキン
エルマー473A）に供し、N末端アミノ酸配列を決定し
た。また、シュードモナス・プチダ7-12株由来の精製ア
ルデヒド脱水素酵素150μgをトリプシン消化し、ＨＰＬ
Ｃで分取したペプチド5をプロテインシークエンサーに
供し、内部アミノ酸配列を決定した。更に、シュードモ
ナス・プチダ7-12株に属する微生物のコドン使用頻度を
検討した。これらの情報により配列番号３及び４に記載
したプライマーをアマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク株式会社のカスタム受託合成により合成した。

【００３４】(3)PCR 反応液を下記の組成で調製し、変性を94℃、1分間、ア
ニールを62℃、2分間、伸長反応を74℃、2分間で30サイ
クルの反応条件でPCRを行なった。（反応液組成）染色体ＤＮＡ 1μg プライマー 50pmoles *10×Ex Taq緩衝液 10μl dNTP溶液各0.2mM 塩化マグネシウム 1mM *Ex Taqポリメラーゼ 2.5ユニット水最終容量100μlになるよう加える。 *宝酒造社製 PCR終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した
ところ、約1kbに目的の断片と思われるバンドが確認さ
れたので、そのバンドを切り出し、GENECLEAN II（フナ
コシ社製）にて精製した。

【００３５】(4)形質転換株大腸菌JM109(pHPA2)の作製先ず、上記ＤＮＡ断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造社製）を用い、付属のマニュアルに従いリン酸
化を行なった。また、別にpUC19（宝酒造社製）を制限
酵素HincII（宝酒造社製）を用いて消化し、常法に従い
脱リン酸化したＤＮＡ断片を作製した。この上記2種類
のＤＮＡ断片を用いてligation反応を行ないpHPA2を作
製した。次いで、D.M.Morrisonの方法（Method in Enzy
mology,68,326-331,1979）に従い、プラスミドpHPA2を
用いて大腸菌JM109（東洋紡社製）を形質転換し、形質
転換株、大腸菌(E.coli)JM109(pHPA2)を得た。この形質
転換株を75μg/mlのアンピシリンを含むTY培地（1％バ
クトトリプトン、0.5％バクトイースト・エクストラク
ト、0.5％ NaCl、pH 7.0）10mlにて一晩培養し、常法に
従いプラスミドＤＮＡ 0.2mgを調製した。このプラスミ
ドＤＮＡを370ＤＮＡシークエンシス・システム（パー
キンエルマー社製）を用いて塩基配列の決定及び解析を
行なったところ、決定した塩基配列より予想されるアミ
ノ酸配列に前述のアミノ酸配列(Pro Ser Glu Gly Leu I
le Glu Val Tyr)が確認された。このことより、上記のP
CRで増幅したＤＮＡ断片にはアルデヒド脱水素酵素遺伝
子の一部の配列が存在していることが確認された。

【００３６】(5)シュードモナス・プチダ7-12株のゲノ
ミックライブラリーの作製先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
ＤＮＡ合成機（パーキンエルマー 392）で合成した。こ
れと上記のpHPA2とDIG・PCRラベリング・キット（ベーリ
ンガーインゲルハイム社製）用いてプローブを作製し
た。このプローブを用いてサザンブロッティングを行な
ったところ約10kbのEcoRI-BamHI断片とハイブリダイズ
した。これをプローブとし、アルデヒド脱水素酵素遺伝
子の全領域を取得するためゲノミックライブラリーを作
製することとした。先ず、前述の染色体ＤＮＡを用いて
Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory P
ress1989）記載の方法に従い、制限酵素EcoRI及びBamHI
による分解物を得た。分解物をアガロース電気泳動にか
け、約９〜11kbの部分をゲルから切り出し、定法に従っ
てＤＮＡ断片を調製した。一方、pUC19を制限酵素EcoRI
及びBamHIで消化し、アガロース電気泳動にかけ約2.6kb
のＤＮＡ断片をゲルより切り出し、定法に従ってＤＮＡ
断片を得た。これら２つのＤＮＡ断片を用いてライゲー
ション反応を行ない、D.M.Morrisonの方法（Method in
Enzymology,68,326-331,1979）に従い、大腸菌JM109
（東洋紡社製）を形質転換し、ゲノミックライブラリー
を作製した。

【００３７】(6)アルデヒド脱水素酵素遺伝子のスクリ
ーニング及び形質転換株大腸菌JM109(pHPA201)の作製上記のプローブとライブラリーを用い常法に従ってコロ
ニーハイブリダイゼーションを行なったところ、いくつ
かの陽性クローンを得た。これらを2mlのTY培地で37℃1
8時間培養し、常法に従ってプラスミドを調製した。一
方、解析して得られたアルデヒド脱水素酵素部分ＤＮＡ
配列よりプライマーを設計し（配列番号５及び６）、ア
マシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社のカスタ
ム受託合成により合成した。この合成プライマーと前述
のプラスミドを用いてPCR反応を行ない、アガロース電
気泳動により増幅されたＤＮＡ断片を解析したところ、
一つの形質転換株JM109(ｐHPA201)について得られるべ
き長さのＤＮＡ断片が増幅され、そのＤＮＡ配列を370
ＤＮＡシークエンシス・システム（パーキンエルマー社
製）を用いて塩基配列の決定及び解析を行なったところ
前述の部分ＤＮＡ配列が確認された。これより、上記の
プラスミドは、目的のアルデヒド脱水素酵素遺伝子を含
むことが判明した。該形質転換株、即ち、大腸菌JM109
(pHPA201)は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFER
M P-16904として寄託されている。

【００３８】(7)活性の確認大腸菌JM109(pHPA201)菌体１白金耳を、75μg/mlのアン
ピシリンを含むTY培地（１％バクトトリプトン、0.5％
バクトイースト・エクストラクト、0.5％ NaCl、pH7.
0）10mlにて37℃で14時間振とう培養した後、この培養
液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ulutrasonicgenerato
r、Nissei社製)を用いて2分間処理した。これをエッペン
ドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、12,000r.p.
m.で10分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に分離
し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し換え、前
述した酵素活性測定法によりアルデヒド脱水素酵素活性
を測定したところ、0.271 U/mlであった。

【００３９】(8)アルデヒド脱水素酵素遺伝子の解析大腸菌JM109(pHPA201)のハイドロキシピルブアルデヒド
脱水素酵素活性が確認されたので、ｐHPA201の挿入断片
がアルデヒド脱水素酵素遺伝子を含むことが明らかとな
った。そこで、このプラスミドＤＮＡについて370ＤＮ
Ａシークエンス・システム（パーキンエルマー社製）を
用いて塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列を
配列番号１に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に夫々示した。ア
ルデヒド脱水素酵素遺伝子は、1428bpのコーディング領
域を有し、476個のアミノ酸をコードしていた。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、新規なアルデヒド脱水素
酵素、その遺伝子、該遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ、
該換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体及び新
規なアルデヒド脱水素酵素の製法が提供される。そし
て、新規なアルデヒド脱水素酵素を効率よく生産するこ
とができる。

【００４１】

【配列表】ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ <110> Research Institute of Innovative technology for the Earth <120> Aldehyde Dehydrogenase、its gene and recombinant DNA、and Preparation method of aldehyde dehydrogenase <130> P98-0416 <160> 6 <210> 1 <211> 1428 <212> DNA <213> Pseudomonas putida7-12 <400> 1 atgactgaag agatctacca aaagtacatc gacaacgcct tcgtacccag cgaggggctg 60 atcgaagtgt acaacccggc caacgcgcag ttactggggc gtgtgccgga gtcgccggtc 120 gaacaggtgg agcgggccat tgcagcggca cgcaaagcgc aaaaaggctg ggcagcgaag 180 cctgccatcg aacgcgccgg ctacctgcgc cagatcgccg ccaaggtgcg tgccaatgcc 240 gaccgcctag cgcgcatcat cacccaggaa ggcggcaagg tgccggggct ggcgcaggtc 300 gaggtgaact tcaccgccga ctacctcgac tacatggcgg aatgggcgcg gcgccttgaa 360 ggcgaggtgc tgaccagcga ccgtgccaac cagcacattt tcctgatgcg caaaccgctg 420 ggtgtggtgg ctgggatact gccctggaac ttcccgttct tcctcatcgc ccgcaagatg 480 gcgccggcgc tgctcacggg caataccatc gtgatcaagc ccagtgaaga aacgcccatc 540 aactgctatg agttcgccaa gctggtggcc gagaccgatc tgccagcggg ggtgttcaac 600 gtggtcgggg gcaagggggc cagcgtcggc catgggctgt cgagccatgc cggtatcgac 660 ttggtcagct ttaccggcag cgtcgccacg ggcgcacgga tcatggcggc ggcagcgccg 720 aacatcacca agctcaacct tgaactgggc ggcaaggccc cagcgatcgt gctggcggac 780 gctgacctgg acttggcgac gaaagccatt gttgcctcgc gggtgatcaa tactggccaa 840 gtgtgcaact gcgccgagcg ggtgtatgtg gcgcgcaagg tggccgacgc gttcgttgac 900 aaggtggccc aagccatggc agcgacccgt tacggcgacc cgtcgcgcca ggccgacctg 960 gacatggggt cgctgatcaa ccaggccggg ctcgacaagg tagcgcagat ggtgcgcacg 1020 gcggtcgggc agggcgccca gttggtgacc ggcgggcagg tggcggacct gggggccggg 1080 ttccattacc agccgaccgt gctcgcgtgc gccgccgaca tggagatcat gcgcaaggag 1140 atttttgggc cggtgctgcc gatccaggtg gtcgttgacc tggacgaggc gattgccttg 1200 gccaatgaca gcgagtacgg gctgacgtct tcgctgtaca cccgcgacct gaacgcggcg 1260 ttgaaggcta tccgcgagat cgattttggc gagacctaca tcaaccgcga gaacttcgag 1320 gctatgcagg gcttccatgc cggggcgcgc aagtccggga tcggcggggc ggatggcaag 1380 cacgggttgt atgagtacac gcgcacgcag gtggtgtaca tccaggga 1428 <210> 2 <211> 476 <212> PRT <213> Pseudomonas putida7-12 <400> 2 Met Thr glu Glu Ile Tyr Gln Lys Tyr Ile Asp Asn Ala Phe Val 5 10 15 Pro Ser Glu Gly Leu Ile Glu Val Tyr Asn Pro Ala Asn Ala Gln 20 25 30 Leu Leu Gly Arg Val Pro Glu Ser Pro Val Glu Gln Val Glu Arg 35 40 45 Ala Ile Ala Ala Ala Arg Lys Ala Gln Lys Gly Trp Ala Ala Lys 50 55 60 Pro Ala Ile Glu Arg Ala Gly Tyr Leu Arg Gln Ile Ala Ala Lys 65 70 75 Val Arg Ala Asn Ala Asp Arg Leu Ala Arg Ile Ile Thr Gln Glu 80 85 90 Gly Gly Lys Val Pro Gly Leu Ala Gln Val Glu Val Asn Phe Thr 95 100 105 Ala Asp Tyr Leu Asp Tyr Met Ala Glu Trp Ala Arg Arg Leu Glu 110 115 120 Gly Glu Val Leu Thr Ser Asp Arg Ala Asn Gln His Ile Phe Leu 125 130 135 Met Arg Lys Pro Leu Gly Val Val Ala Gly Ile Leu Pro Trp Asn 140 145 150 Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Arg Lys Met Ala Pro Ala Leu Leu 155 160 165 Thr Gly Asn Thr Ile Val Ile Lys Pro Ser Glu Glu Thr Pro Ile 170 175 180 Asn Cys Tyr Glu Phe Ala Lys Leu Val Ala Glu Thr Asp Leu Pro 185 190 195 Ala Gly Val Phe Asn Val Val Gly Gly Lys Gly Ala Ser Val Gly 200 205 210 His Gly Leu Ser Ser His Ala Gly Ile Asp Leu Val Ser Phe Thr 215 220 225 Gly Ser Val Ala Thr Gly Ala Arg Ile Met Ala Ala Ala Ala Pro 230 235 240 Asn Ile Thr Lys Leu Asn Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ala Pro Ala 245 250 255 Ile Val Leu Ala Asp Ala Asp Leu Asp Leu Ala Thr Lys Ala Ile 260 265 270 Val Ala Ser Arg Val Ile Asn Thr Gly Gln Val Cys Asn Cys Ala 275 280 285 Glu Arg Val Tyr Val Ala Arg Lys Val Ala Asp Ala Phe Val Asp 290 295 300 Lys Val Ala Gln Ala Met Ala Ala Thr Arg Tyr Gly Asp Pro Ser 305 310 315 Arg Gln Ala Asp Leu Asp Met Gly Ser Leu Ile Asn Gln Ala Gly 320 325 330 Leu Asp Lys Val Ala Gln Met Val Arg Thr Ala Val Gly Gln Gly 335 340 345 Ala Gln Leu Val Thr Gly Gly Gln Val Ala Asp Leu Gly Ala Gly 350 355 360 Phe His Tyr Gln Pro Thr Val Leu Ala Cys Ala Ala Asp Met Glu 365 370 375 Ile Met Arg Lys Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu Pro Ile Gln Val 380 385 390 Val Val Asp Leu Asp Glu Ala Ile Ala Leu Ala Asn Asp Ser Glu 395 400 405 Tyr Gly Leu Thr Ser Ser Leu Tyr Thr Arg Asp Leu Asn Ala Ala 410 415 420 Leu Lys Ala Ile Arg Glu Ile Asp Phe Gly Glu Thr Tyr Ile Asn 425 430 435 Arg Glu Asn Phe Glu Ala Met Gln Gly Phe His Ala Gly Ala Arg 440 445 450 Lys Ser Gly Ile Gly Gly Ala Asp Gly Lys His Gly Leu Tyr Glu 455 460 465 Tyr Thr Arg Thr Gln Val Val Tyr Ile Gln Gly 470 475 476 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> 12番目のaはイノシン <223> 15番目のaはイノシン <223> 21番目のaはイノシン <400> 3 ggatccatct aacaaaacta aatcgacaac gccttcgt 38 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> 10番目のaはイノシン <223> 19番目のaはイノシン <223> 25番目のaはイノシン <223> 28番目のaはイノシン <400> 4 ggatccggca tggaagccat gcatagcatc gaagtt 36 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ctgatcgaag tgtacaaccc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 gtctcgccaa aatcgatctc 20

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明アルデヒド脱水素酵素の至適pHを示す
図。

【図２】本発明アルデヒド脱水素酵素の安定pHの範囲を
示す図。

【図３】本発明アルデヒド脱水素酵素の作用適温の範囲
を示す図。

【図４】本発明アルデヒド脱水素酵素の作用適温の範囲
を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA08 CA03 DA06 EA04 4B050 CC03 DD02 LL05 4B065 AA26X AA44Y AB01 AC14 BA02 BA24 CA28 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の理化学的性質を有するアルデヒド
脱水素酵素。 (1)作用：ハイドロキシピルブアルデヒド＋ＮＡＤ⁺→
ハイドロキシピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ (2)基質特異性：ハイドロキシピルブアルデヒド、グリ
セルアルデヒド、メチルグリオキサール等、２−オキソ
アルデヒドに特異的に作用し、n=３〜５の直鎖アルデヒ
ドにもわずかに作用する。 (3)至適pH：約 10.0 (4)安定pH範囲：５〜９ (5)作用適温の範囲：10〜80℃
【請求項２】以下の(a)または(b)のアルデヒド脱水素
酵素。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質
【請求項３】以下の(a)または(b)のタンパク質をコー
ドするアルデヒド脱水素酵素遺伝子。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質
【請求項４】請求項３記載のアルデヒド脱水素酵素遺
伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み
換え体ＤＮＡ。
【請求項５】請求項４記載の組み換え体ＤＮＡを含む
形質転換体または形質導入体。
【請求項６】請求項５記載の形質転換体または形質導
入体を培地に培養し、培養物からアルデヒド脱水素酵素
を採取することを特徴とするアルデヒド脱水素酵素の製
造法。
【請求項７】シュードモナス属に属し、アルデヒド脱
水素酵素生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物
からアルデヒド脱水素酵素を採取することを特徴とする
アルデヒド脱水素酵素の製造法。