JP4250716B2 - 酵素的に活性な組換えカルボキシペプチダーゼbの製造 - Google Patents
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Description
発明の背景
本出願を通して、種々の参照文献がカッコ内にアラビア数字で引用される。これらの参照文献の完全な引用は、明細書の最後の請求の範囲の前に記載される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する当該分野の技術の現状を十分に記載するため、全体として引用により本明細書の一部とみなされる。
天然に存在するカルボキシペプチダーゼB[ペプチジル−L−リジン(−L−アルギニン)ヒドロラーゼ EC3.4.17.2]は、ペプチドからC−末端Arg、LysまたはOrnを特異的に除去する亜鉛含有性膵臓エキソペプチダーゼである(1、2)。
天然に存在するラットカルボキシペプチダーゼBは、シグナル配列(13アミノ酸)および活性化ペプチド(95アミノ酸)を含む108アミノ酸の長さのN−末端断片を含有する、前駆体タンパク質であるプレプロカルボキシペプチダーゼBから産生される。プレプロカルボキシペプチダーゼBは酵素的に不活性である。
小胞体へのプレプロカルボキシペプチダーゼBの輸送の間、シグナルペプチドは切断除去される。得られる酵素的に不活性なプロカルボキシペプチダーゼB前駆体は、細胞から分泌される。次に酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼBは、トリプシンによる活性化ペプチドの切断により生成する(7)。
成熟ラットのカルボキシペプチダーゼBは、307個のアミノ酸を含有し(5)、見かけの分子量35kDを有する。これは7つのシステイン残基(このうち6つはS−S結合で対になっている)を含有する。
カルボキシペプチダーゼBは、例えばインスリンや他の生物活性を有するポリペプチドの産生やタンパク質配列解析のような、販売目的および研究目的に広く利用されている。
ブタ膵臓から精製される市販のカルボキシペプチダーゼBは非常に高価であり、他のプロテアーゼが完全に混入していない訳ではない。
ブタの前駆体プロカルボキシペプチダーゼBの部分的アミノ酸配列およびウシのカルボキシペプチダーゼBの完全なアミノ酸配列は、公表されている(それぞれ3、4)。さらにラット遺伝子とヒトcDNAの完全なヌクレオチド配列が公表されている(それぞれ5、6)。
Yamamotoら(6)は、活性化ペプチドの最初の11アミノ酸が欠如した酵素的に不活性なヒトプロカルボキシペプチダーゼBの組換え発現を報告した。
かれらはまた、プロカルボキシペプチダーゼが活性化ペプチドの最初の11アミノ酸が欠如している、酵素的に不活性なβ−ガラクトシダーゼ−プロカルボキシペプチダーゼB融合蛋白の組換え発現を報告している。
ヨーロッパ公報第588118 A2号は、OSF−5と呼ぶ骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質を開示している。OSF−5は、接着分子または増殖因子として作用し、骨代謝疾患の治療薬として使用できると考えられている。しかし、OSF−5の実際の機能または活性は開示されておらず、天然に存在するかまたは組換え型の生物活性タンパク質の産生も証明されていない。
本発明は、組換え型の高度に精製された酵素的に活性な、かつ高価でないカルボキシペプチダーゼBの産生を開示する。酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼBは、まだ報告されておらず、その開示は新規である。
発明の概要
本発明は、DNAがプロカルボキシペプチダーゼBの発現を指令するように、プロカルボキシペプチダーゼBをコードするDNAを含有する組換え細胞を処理する工程、こうして発現されたプロカルボキシペプチダーゼBを細胞から回収する工程、回収されたプロカルボキシペプチダーゼBをプロカルボキシペプチダーゼBの折り畳み(folding)を可能にする条件下で処理する工程、折り畳まれたプロカルボキシペプチダーゼBを酵素切断に付して酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼを産生する工程、そして酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼBを精製する工程を含んでなる、酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼBの産生方法を提供する。
本発明はさらに、酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼBを提供する。
【図面の簡単な説明】
図2と3に示すプラスミドの制限地図は、必ずしもプラスミド上のすべての制限部位を記載していない。しかし、本発明の完全な理解に必要な制限部位は記載されている。
図1: 膵臓ラットプロカルボキシペプチダーゼBのアミノ酸と対応するcDNAヌクレオチド配列
成熟カルボキシペプチダーゼBヌクレオチド配列と活性化ペプチドヌクレオチド配列を含む、膵臓ラットプロカルボキシペプチダーゼBのcDNAヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。このDNA配列は、Clauserら(5)が公表しているDNA配列とは4ヌクレオチド異なり、そのうち2つはアミノ酸の変化を引き起こす:Lys14→AsnおよびArg142→Asp。
クローニング(実施例1)時に使用した3つのプライマーのDNAヌクレオチド配列も示す(大きい文字):プロカルボキシペプチダーゼB5’末端プライマー、成熟したカルボキシペプチダーゼB5’末端プライマーおよびカルボキシペプチダーゼB3’末端プライマー。
アミノ酸の番号は、ウシ膵臓由来のカルボキシペプチダーゼA(10、12)との相同性に従って番号をつけ、成熟ラットのカルボキシペプチダーゼBの最初のアミノ酸(Ala)を4番とする。星印(*)は、カルボキシペプチダーゼAに対してラットカルボキシペプチダーゼBが有する追加のアミノ酸(Leu)を示す。
図2: プラスミドpCPBとプラスミドpCPB−Cの作製
プラスミドpABNをBamHIとNcoIで消化した。2500塩基対の断片を単離し、940塩基対のBamHI−NcoIカルボキシペプチダーゼB cDNA断片に連結した(実施例1に記載のように得られた)。新たに得られたプラスミドをpCPBと命名し、大腸菌(E. coli)4300を形質転換するのに使用した。
大きな断片を単離するためにプラスミドpCPBをBamHIとNdeIで消化した。プラスミドpCPBはまた、大きな断片を単離するためにAseIとScaIで消化した。
2つの大きな断片を、部位特異的突然変異誘発(実施例1)について調製される5’末端リン酸化オリゴヌクレオチドとポリメラーゼ−リガーゼ緩衝液(5×緩衝液:32.5mMトリス−塩酸(pH7.5)、40mM MgCl2、5mM 2−メルカプトエタノール、0.5M NaCl)とともに混合して、ヘテロ2本鎖を形成した(9)。DNA鎖を変性させるために混合物を沸騰させ、DNAを復元するために徐々に冷却した。反応生成物を用いて大腸菌1645を電気穿孔法で形質転換した。形質転換体を、アンピシリン含有LB培地上での増殖と、突然変異のために調製された5’末端リン酸化オリゴヌクレオチドとのその場(in situ)のコロニー差別的ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
陽性コロニーからプラスミドDNAを抽出し、制限酵素解析とDNAヌクレオチド配列決定後、突然変異体SpeI部位を含有するクローンを選択した。新たに得られたプラスミドをpCPB−Cと命名し、これは290位のアミノ酸のシステインからセリンへの突然変異を有するカルボキシペプチダーゼBをコードする。プラスミドpCPB−Cを用いて大腸菌4300を形質転換した。
図3: プラスミドpProCPB−CとプラスミドpλProCPBの作製
活性化ペプチドとカルボキシペプチダーゼBの一部をコードする470塩基対の断片を単離するために、プロカルボキシペプチダーゼB cDNA(実施例1に記載のように得られた)をNdeIとClaIで切断した。
Cys290→Ser突然変異を含むカルボキシペプチダーゼBの残りをコードする760塩基対の断片を単離するために、プラスミドpCPB−CをBamHIとClaIで切断した。
細菌での発現に必要なすべての成分(実施例1を参照)をコードする2500塩基対の断片を単離するために、プラスミドpABをNdeIとBamHIで切断した。
上記の3つの断片を連結し、新たに得られたプラスミドをpProCPB−Cと命名した。
プラスミドpProCPB−CとpCPBをStuIとXhoIで切断した。細菌での発現に必要なすべての成分(実施例1を参照)、活性化ペプチド全体およびカルボキシペプチダーゼBの一部をコードする3700塩基対の断片を、プラスミドProCPB−Cから単離した。
カルボキシペプチダーゼBの残りをコードする440塩基対の断片をプラスミドpCPBから単離した。
2つの断片を連結し、新たに形成されたプラスミドをpλProCPBと命名した。
図4: 組換えカルボキシペプチダーゼBと天然に存在するカルボキシペプチダーゼBの活性の比較
市販のブタカルボキシペプチダーゼB(シグマ(Sigma))と実施例5に記載のように作成した組換えカルボキシペプチダーゼBの活性を、ヒプリルーL−Arg基質を用いてFolkの方法(11)に従って測定した。0.025〜1.0mMの間の基質濃度を用いて、触媒反応のV0を測定した。
発明の詳細な説明
プラスミドpλProCPBは、「特許手続のための微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約」の規定に従い、かつこれを満足するように、大腸菌中でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)(12301パークローンドライブ(Parklawn Drive)、ロックビル(Rockville)、メリーランド州20852)に、ATCC受託番号69673で1994年8月4日に寄託した。
本明細書において「CPB」は、組換えDNA法または他の方法で作成されたポリペプチドを意味し、これは天然に存在する哺乳動物のカルボキシペプチダーゼBと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。すなわち、CPBという用語は、天然に存在するカルボキシペプチダーゼBと、1つまたはそれ以上のアミノ酸、好ましくは約10以下のアミノ酸が異なるポリペプチドを含む。
本明細書において「ProCPB」は、組換えDNA法または他の方法で作成されたポリペプチドを意味し、これは天然に存在する哺乳動物のプロカルボキシペプチダーゼBと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。すなわち、ProCPBという用語は、天然に存在するプロカルボキシペプチダーゼBと、1つまたはそれ以上のアミノ酸、好ましくは約10以下のアミノ酸が異なるポリペプチドを含む。
当業者は、確立された公知の方法(例えば、ポリペプチドの細菌による発現をコードするDNA配列の設計と製造のための従来法、部位特異的突然変異誘発法によるcDNAとゲノム配列の修飾、組換えタンパク質および発現ベクターの作製、ポリペプチドの細菌による発現、および従来の生化学的測定法を用いるポリペプチドの生化学的活性の測定を含む)を用いて、どのアミノ酸残基が付加、欠失、または置換(そのような置換はどのアミノ酸で起きているかを含めて)されているかを容易に決定することができる。
本明細書において「酵素的に活性な」CPBは、天然に存在する哺乳動物カルボキシペプチダーゼBの生物活性を有するCPBを意味する。この定義において、天然に存在するカルボキシペプチダーゼBの生物活性とは、ペプチドからC−末端アルギニン、リジンまたはオルニチンを特異的に除去する能力である。
実質的に同じアミノ酸配列とは本明細書において、アミノ酸配列においてアミノ酸の置換および/または欠失および/または付加を包含し、Lehningerの「生化学」、第2版、ワース出版(Worth Pub.)、ニューヨーク(1975)、第4章;Creighton、「タンパク質の構造、実際的アプローチ(Protein Structure, a Practical Approach)」、オックスフォード大学出版(Oxford Univ. Press)のアイアールエスプレス(IRL Press)、オックスフォード、英国(1989);およびDayhoff、「タンパク質配列と構造のアトラス(Atlas of Protein Sequence and Structure)第5巻」、ナショナルバイオメディカル研究財団、メリーランド州(1972)、第9章により記載されている、相同的または同等の基に従って10個までの基を包含するものと定義される。そのような置換は当業者には公知である。
好適な実施態様において、ProCPBまたはCPBをコードするDNAは、ヒト、ラット、ウシ、またはブタ起源から得ることができる。DNAはまた逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、合成または半合成手段、またはこれらの方法の2つ以上または当該分野の他の方法により得ることができる。
ProCPBまたはCPBポリペプチドをコードするDNAは、当業者に公知の方法(例えば、Bauerら(1985)、Gene 37: 73-81)により突然変異され得る。突然変異された配列は、本明細書に記載の適当な発現ベクターに挿入され得、これは細胞に取り込まれ、次に突然変異されたDNAがポリペプチドの発現を指令するように処理される。
当業者は、本出願に関連して寄託されたプラスミドは、ポリペプチドの発現をコードするように公知の方法(例えば、部位特異的突然変異誘発またはリンカーの挿入)により容易に改変できることは理解されるであろう。そのような方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.(1989)モレキュラークローニング、実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されている。
CPBまたはProCPBをコードする核酸を発現するために使用され得るベクターの例としては、細菌ウイルスのようなウイルス、例えばバクテリオファージ(例えばファージラムダ)、コスミド、プラスミドおよび他のベクターがある。ProCPBまたはCPBをコードするcDNAは、当業者に公知の方法により適当なベクターに挿入される。例えば通常の制限エンドヌクレアーゼ酵素部位を用いて、挿入体およびベクターDNAの両方とも切断して、互いに塩基で対合する相補的な末端を作成し、次にDNAリガーゼを用いて連結することができる。あるいは、ベクターDNAの制限部位に相補的な塩基配列を有する合成リンカーを、挿入体DNAに連結し、次にこれをその部位で切断する制限酵素で消化することができる。他の手段も利用できる。
ProCPBまたはCPBをコードする配列を含む本発明のベクターは、一連の原核または真核宿主細胞、例えば細菌、酵母、カビ、昆虫細胞または他の哺乳動物細胞(例えば、CHO、ニワトリ胚、繊維芽細胞、腎臓または他の公知の細胞株)中での発現に適合させることもできる。
これらのベクターにはさらに、宿主細胞中でのクローン化された遺伝子の発現に必要な制限成分が、その発現を可能にするようにProCPBまたはCPBをコードする核酸に対して配置され、含有されている。
発現に必要な制御成分には、プロモーターおよびオペレーター配列およびリボゾーム結合部位が含まれる。例えば、細菌発現ベクターは、λPLOLまたはdeoプロモーターのようなプロモーター−オペレーター配列を含有することができる。翻訳の開始のためにλC11またはdeoリボゾーム結合部位を使用し得る。このようなベクターは市販されているか、または当業者に公知の方法(例えば、1989年5月16日発行の同一出願人の米国特許第4,831,120号、および1992年9月1日発行の同一出願人の米国特許第5,143,836号(これらはλPLプロモーターに関する方法を開示している)、並びに1989年2月22日公開の同一出願人のヨーロッパ特許出願第303,972号(これはdeoプロモーターに関する方法を開示している))により記載される配列から構築することができる。さらに適当な成分(例えばレプレッサーやエンハンサー)が存在し得る。当業者は、種々の発現系に適した制御成分の使用法を知っている。
本発明の発現プラスミドは、適当な宿主細胞中でProCPBまたはCPBポリペプチドの発現を可能にするように、ProCPBまたはCPBポリペプチドをコードするDNAに対してプラスミド内に位置している適当な制御成分を含んでなる。このような制御成分は、プロモーターおよびオペレーター(例えば、deoP1P2やλPL)、およびリボゾーム結合部位(例えば、deoおよびC11)、並びにレプレッサーやエンハンサーである。
本発明の好適な実施態様において、制御成分はProCPBまたはCPBをコードするDNAの近くおよびその上流に位置する。
本発明のプラスミドはまた、ATG開始コドンを含有する。ProCPBまたはCPBをコードするDNAはATG開始コドンと同じ相にある。
本発明のプラスミドはまた、宿主細胞中で自立的複製を可能にする細菌のプラスミドからの複製開始点を含んでなるDNA配列も含有する。適当な複製開始点は、多くの供給源(例えば、プラスミドpBR322(ATCC受託番号37017))から得られる。
本発明のプラスミドはまた、プラスミドが宿主細胞中に存在する時現れる選択可能なまたは同定可能な表現型形質に関連する遺伝子(例えば、アンピシリン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリンに対する耐性のような薬剤耐性)を含有するDNA配列も含む。
好適な細菌の宿主細胞は大腸菌細胞である。適当な大腸菌細胞の例は、4300株であるが、他の大腸菌株および他の細菌もプラスミドの宿主として使用することができる。
宿主として使用される細菌は、栄養要求株(例えばA1645)、原栄養株(例えばA4255)、および溶菌株;F+およびF-株;λプロファージのcI857レプレッサー配列を有する株(例えばA1645およびA4255)およびdeoレプレッサーおよび/またはdeo遺伝子のない株(1989年2月22日公開のヨーロッパ特許出願第0303972号を参照)を含む任意の株でよい。大腸菌4300株は、ATCC受託番号69363で寄託されている。
前述のすべての大腸菌宿主株は、当業者に公知の方法(例えば、R.P. NovickのBacteriol. Review 33, 210(1969)に記載の臭化エチジウム法)により、それらが有するプラスミドを「治療する(cure)」ことができる。
本発明は、DNAがProCPBの発現を指令するように、ProCPBをコードするDNAを含有する組換え細胞を処理する工程、こうして発現されたProCPBを細胞から回収する工程、回収されたProCPBをProCPBの折り畳みを可能にする条件下で処理する工程、折り畳まれたProCPBを酵素切断に付して酵素的に活性なCPBを産生する工程、そして酵素的に活性なCPBを精製する工程を含んでなる、酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼBの産生方法を提供する。
好適な態様において、組換え細胞からのProCPBの回収は、組換え細胞の細胞壁またはその断片を破壊して溶解物を産生する工程、溶解物から遠心分離により細胞内沈殿物を単離する工程、および適当な緩衝液中で細胞内沈殿物を可溶化する工程を含んでなる。
別の態様において、回収されたProCPBの処理は、室温で約20〜24時間の間pH約9〜9.5で、ProCPBをインキュベートすることを含んでなる。
また別の態様において、回収されたProCPBの処理は、室温で約20〜24時間の間pH約9〜9.5で、ZnCl2、酸化型グルタチオン(GSSG)および還元型グルタチオン(GSH)の存在下で、ProCPBをインキュベートすることを含んでなる。
折り畳まれたProCPBを酵素的切断に付すことは、pHを約8.5に調整して、トリプシンで37℃で約60分間ProCPBを切断することを含んで成ることを企図する。
さらに、酵素的に活性なCPBの精製はイオン交換クロマトグラフィーを含んでなることも企図される。
任意のイオン交換クロマトグラフィー法が使用できることは、当業者は理解できるであろう。DEAE−セファロースのような弱陰イオン性交換カラムが好ましい。弱陰イオン性交換カラムは通常、官能基として三級アミン(ジエチルアミノエチル)を有するが、四級アミノエチルまたは四級アミンも使用できる。
マトリックスは、無機化合物、合成樹脂、多糖類または有機ポリマーに基づくものでよい。可能なマトリックスは、アガロース、セルロース、トリスアクリル、デキストラン、ガラスビーズ、オキシランアクリルビーズ、アクリルアミド、アガロース/ポリアクリルアミド共重合体または親水性ビニルポリマーである。
また酵素的に活性なCPBの精製はイオン交換クロマトグラフィーと疎水性クロマトグラフィーを含んでなることも企図される。
任意の疎水性カラムが使用できることは、当業者は理解できるであろう。フェニル−セファロースが好ましい。官能基は、フェニル、ベンジル、オクチルまたはブチルであり得る。マトリックスは前述の任意のものであり得る。
さらに別の好適な実施態様において、酵素的に活性なCPBの精製はイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびダイアフィルトレーション(diafiltration)を含んでなる。
特に好適な態様において、ProCPBはATCC受託番号69673で寄託されたプラスミドpλProCPBにより発現される。
本発明はさらに、哺乳動物起源の他の物質を含まない酵素的に活性なCPBを提供する。
実施例
以下の実施例は本発明の理解を助けるために記載されるものであり、決して本発明の範囲を限定するものではなく、また限定するものと解釈してはならない。実施例は、ベクターの作製、このようなベクターへのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、または得られるプラスミドの宿主への導入で使用される従来法の詳細については記載されていない。実施例はまた、このような宿主ベクター系により産生されるポリペプチドの測定について用いられた従来法を詳細には記載しない。このような方法は当業者に公知であり、多くの刊行物に公表されており、それらの開示内容は引用により本明細書の一部とみなされる。それらには例として以下のものがある:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.(1989)モレキュラークローニング、実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press).
実施例1: ラットカルボキシペプチダーゼB cDNAのPCRによるクローニング
I. DNA増幅
スプラーグ−ドーレイ(Sprague-Dawley)ラットの膵臓から総RNAを抽出した。総RNAから40μgのポリA+ mRNAを単離した(オリゴdT−セルロースカラムによる)。こうして得られたポリA+ mRNAのアリコート(aliquot)(10μg)を、合成カルボキシペプチダーゼB 3’末端プライマー(5)(図1)の存在下で逆転写反応の鋳型として使用した。
1本鎖相補的DNA(ss−cDNA)の合成後、mRNAをエタノールで沈殿させた。次にss−cDNAのアリコートをPCR増幅に付した。
CPBをコードするDNA(940塩基対)の増幅のために、カルボキシペプチダーゼBの3’末端に対応する合成プライマーおよび成熟したカルボキシペプチダーゼBの5’末端に対応する合成プライマーを使用した(図1)。
ProCPBをコードするDNA(1230塩基対)の増幅のために、カルボキシペプチダーゼBの3’末端に対応する合成プライマーおよびプロカルボキシペプチダーゼBの5’末端に対応する合成プライマーを使用した(図1)。
PCR増幅条件は以下の通りであった:
1.プライマー3’末端 2μg
2.プライマー5’末端 2μg
3.ss−cDNA 5μl
4.緩衝液:
dNTP 0.2mM
トリス−塩酸 50mM
KCl 20mM
MgCl2 8mM
5.TaqポリメラーゼI 2.5単位
総量: 100μl
6.鉱物油(蒸発に対して) 50μl
7.1サイクル×[92℃で1分;40℃で2分;72℃で4分]
8.35サイクル×[92℃で1分;53℃で2分;72℃で3分]
9.1サイクル×[92℃で1分;53℃で2分;72℃で15分]
PCR増幅生成物を、1%アガロースゲルで解析した。非増幅対照とサイズマーカーも含めた。約940塩基対と約1230塩基対の2つの顕著なバンドが認められた。940塩基対のバンドはCPBヌクレオチド配列であり、1230塩基対のバンドは、活性化ペプチドヌクレオチド配列を含有するProCPBヌクレオチド配列である。
PCR増幅後に、クロロホルムやフェノール抽出並びに酢酸アンモニウムやイソプロパノール沈殿により反応混合物からDNAを精製した。
II. プラスミドpCPB
プラスミドpCPB(図2)は、CPBcDNAをBamHIとNcoIで消化し、ゲル精製後プラスミドpABNの2500塩基対のBamHIおよびNcoI断片中にサブクローニングして作成し、これは細菌での発現に必要な以下の成分を含有する:
(i)誘導により大腸菌細胞から遺伝子発現を可能にするλPLプロモーター、すなわち温度を30℃から42℃に移動させ、これは温度感受性レプレッサーcI857を不活性化する;
(ii)deoリボゾーム結合部位(rbs);
(iii)trp転写ターミネーター(8);
(iv)プラスミドpBR322からのアンピシリン耐性遺伝子;および
(v)pBR322複製開始点。
III. プラスミドpCPB−C
天然に存在するカルボキシペプチダーゼBのアミノ酸配列は、7つのシステイン残基を有し、そのうち6つはS−S結合で対になっており、1つ(Cys290)は、遊離のシステイン残基である(1)。我々は、この遊離のシステイン残基は組換えCPBの再折り畳み時に好ましくない分子間または分子内S−S結合を形成し得ると考えた。Cys290は、カルボキシペプチダーゼBの触媒部位にも基質結合部位にも存在せず、この酵素の酵素活性には必要がないようである(1、2)。従ってこのシステインがセリンで置換されているCPBを産生することに決めた;このCPBをCPB−Cと命名する。
2つのヌクレオチド置換を含有する5’末端リン酸化オリゴヌクレオチドを調製した:
図2に記載のように部位特異的突然変異誘発によりプラスミドpCPB中のセリンをコードするヌクレオチド配列で、Cys290をコードするヌクレオチド配列を置換するために、このオリゴヌクレオチドを使用した(9)。新たに得られたプラスミドをpCPB−Cと命名した。
IV. プラスミドpProCPB−C
ProCPB−Cヌクレオチド配列を有するpProCPB−Cと呼ぶプラスミド(Cys290→Ser突然変異を有する)を作製し(図3)、大腸菌4300を形質転換するのに使用した。
V. プラスミドpλProCPB
ProCPBヌクレオチド配列を含有するpλProCPBと呼ぶプラスミドを作製し(図3)、大腸菌4300を形質転換するのに使用した。このプラスミドは、1994年8月4日にATCC受託番号69673でATCCに寄託した。
プラスミドpCPB、pCPB−C、pλProCPB、pProCPB−CからプラスミドDNAを調製し、制限酵素解析とヌクレオチド配列決定を行い、正しい配列の存在を証明した。
実施例2: ProCPBとCPBの発酵、増殖条件および精製
I ストック培養物
プラスミドpλProCPBを有する大腸菌4300のストック培養物を、アンピシリンを補足(100μg/ml)したLB培地上で増殖させた。
II 接種物
接種物をアンピシリンを補足(100μg/ml)したLB培地上で30℃で、細胞濃度がO.D.660が2.0に達するまで増殖させた。
産生培地(LB培地+アンピシリン(100μg/ml))を接種し、30℃でインキュベートし、通気攪拌し、NH3でpHを7.2に維持した。20gのグルコースを増殖中の培養物に加えた。細胞濃度がO.D.660が12に達したら、温度を42℃に上げてProCPBの発現を可能にした。2時間後、細胞濃度はO.D.660が22〜29に達し、細菌を採取した。
III 精製
プラスミドpλProCPBにより発現させたProCPBが細胞内沈殿物中に蓄積し、これを以下の方法で単離した:40g(湿重量)の細菌ケーキを、1mMPMSF(シグマ(Sigma))、50mMトリス−塩酸(pH8)、10mMEDTAを含有する450mlの緩衝液に懸濁し、リゾチーム(シグマ(Sigma))で37℃で2時間処理して最終濃度50μg/mlにした。
次に混合物を超音波処理し、トリトンX−100(メルク(Merck))を最終濃度2%になるように加え、室温で2時間攪拌した。粗細胞内沈殿物を遠心分離(14000rpm、30分、4℃)してペレットにし、水で洗浄した。
ProCPBを含む細胞内沈殿物を、25mMNaCl、8M尿素、10mMDTT、20mMビス−トリス(pH7)を含有する緩衝液Bに溶解した。この溶液を、緩衝液Bで平衡化したDEAE−セファロースファーストフローカラム(Fast Flow column)で、クロマトグラフィーを行うと、タンパク質は、緩衝液B中約100mMNaClで溶出し、ProCPBを40%飽和の(NH4)SO4で0℃で沈殿させた。
後に、酵素的に活性なCPBは前駆体タンパク質の産生を介してのみ産生されることが発見された。しかし最初、ポリペプチドCPBとCPB−Cは、前述のProCPBの産生と同様に産生された。ProCPB−Cもまた同様に産生された。使用したプラスミドはそれぞれ、pCPB、pCPB−CおよびpProCPB−Cである(実施例1に記載)。これらのプラスミドを有する大腸菌の増殖条件とポリペプチドの精製は、20mMエタノールアミン(pH9)、10mMDTTおよび8M尿素を含有する組換えCPBまたはCPB−Cを含む細胞内沈殿物を溶解するのに使用した緩衝液を除いて、基本的にProCPBについて前述したものである。
各場合に、前述の産生され精製されたポリペプチドは酵素活性がなかったことに注目されたい。
酵素的に活性なタンパク質を産生するためのポリペプチドの折り畳みは実施例3に記載されている。
実施例3: ProCPB−Cの折り畳みと活性化
ポリペプチドCPBとCPB−Cは実施例2に記載のように産生したが、酵素活性はなかった。既知の折り畳み法(後述)を使用したが、酵素的に活性なタンパク質は得られなかった。
酵素的に活性なタンパク質が得られないという問題を解決するために、前駆体タンパク質の発現と折り畳みに続いて、折り畳まれた前駆体タンパク質の活性化ペプチド部分を除去するための処理を含む代替法を開発した。これにより後述の方法が得られた。
実施例2に記載のように産生したProCPB−Cを、8M尿素、5mM HClに10mg/mlで溶解し、100mMグリシン、0.2mM ZnCl2(pH9、10、および11)に1mg/mlで希釈した。これらが折り畳み溶液であった。
前記折り畳み溶液を室温で17時間インキュベートして折り畳みを行った。こうして産生されたProCPB−Cはこの段階で酵素活性がなかった(表Iを参照)。
次に折り畳まれたProCPB−Cを含有する溶液のpHを、塩酸で8.5に調整し、トリプシン(1:200w/w)で37℃で30分処理して活性化ペプチドを除去した。反応を停止させるために、PMSFを最終濃度0.1mMになるように加えた。
こうして得られた折り畳まれたCPB−Cの酵素活性を、Folk(1970)(11)の方法に従って試験した(表I)。1単位の活性(u)は、25℃において1分当たり1μモルのヒプリル−L−Arg基質の加水分解を触媒して、光路長1cm当たり254nmで吸光度0.12の増加をもたらす酵素の量であると規定する。市販のブタカルボキシペプチダーゼB(シグマ(Sigma))の比活性は230u/mgである。
表Iは、酵素的に活性なCPB−Cは、前記の予備的条件を用いてProCPB−Cの折り畳みおよび折り畳まれたProCPB−Cのトリプシン処理後に得られることを示す。
表Iはさらに、折り畳み混合物中のpHが10または11の時より、折り畳み混合物中のpHが9の時の方がCPB−Cの比活性が高いことを示す。
実施例4: 改良された折り畳み条件
以下の実験は、最適の折り畳み条件と活性化条件を確立するために行った。我々は、折り畳まれたProCPB−Cのトリプシン切断により得られるCPB−Cの比活性が高いほど、ProCPB−Cの折り畳み条件に適していると仮定した。「基質のみ」と「市販のブタカルボキシペプチダーゼ」対照を、下記の実験以外に行った。
まず、折り畳みをpH9.5で0.05〜0.1mg/mlのProCPB−Cを用いて行うと結果(実施例3に記載)が改善された。
I. ProCPB−Cの折り畳みに対する温度の影響
ProCPB−Cの折り畳みは、100mMグリシン(pH9.5)中の0.05mg/mlのポリペプチドを10〜37℃の間で90時間インキュベートして行った。折り畳まれたProCPB−Cの試料をトリプシン(1:200w/w)で処理し、こうして得られたCPB−Cの比活性を実施例3に記載のように測定した。20〜30℃の間でProCPB−Cの折り畳みを行った時、CPB−Cの最大の比活性が得られた。
II. ProCPB−Cの折り畳みに及ぼす酸化型および還元型グルタチオンの影響
ProCPB−Cの折り畳みは、100mMグリシン緩衝液(pH9.5)、0.01mM ZnCl2中の0.05mg/mlのポリペプチドを酸化型および/または還元型グルタチオン(GSSG/GSH)またはアスコルビン酸の存在下で25℃でインキュベートして行った(表II)。次にインキュベートした溶液を、トリプシン(1:200w/w)で37℃で1時間処理し、18時間および45時間後の得られたCPB−Cの比活性を測定した(実施例3に記載)。
表IIは、GSSGとGSHを一緒に加えるとCPB−Cの比活性が劇的に増加し、おそらくProCPB−Cの折り畳み効率が上昇することを示す。GSSH単独でもProCPB−Cの折り畳み効率が上昇し、アスコルビン酸でも上昇したが、程度は低かった。
別のシリーズの実験で、折り畳み溶液に0.1mMのGSSGと0.5mMのGSHを加えるとProCPB−Cの最適の折り畳みが得られたことがわかった。
III. トリプシンによる折り畳みProCPB−Cの活性化
インキュベートした折り畳み溶液をトリプシン1:50w/wで37℃で1時間処理する時、ProCPB−Cをトリプシン切断して活性化ペプチドを除去することにより、最も活性なCPB−Cが得られることが確立された。
IV. ProCPB−Cの折り畳みに及ぼすpHの影響
ProCPB−Cの折り畳みに及ぼすpHの影響は、すでに最適化された条件下で一連の反応で測定した。
ProCPB−Cの折り畳みは、100mMグリシン、0.02mM ZnCl2、0.5mM還元型グルタチオン(GSH)、0.1mM酸化型グルタチオン(GSSG)中0.1mg/mlで、種々のpH(8.75〜10.00の間)で25℃で24時間インキュベートして行った。折り畳まれたProCPB−Cの試料を、トリプシン(1:50w/w;1mM HCl、10mM CaCl2に溶解した)で処理し、こうして得られたCPB−Cの比活性を実施例3に記載のように測定した。
ProCPB−Cの折り畳みをpH9.25で行った時、CPB−Cの最大の比活性が得られた。
V. ProCPB−Cの折り畳みに及ぼすZnCl 2 の影響
ProCPB−Cの折り畳みに及ぼす折り畳み溶液中のZnCl2濃度の影響を、すでに最適化した条件下で一連の反応で測定した。予測されるCPB−C濃度(モル/モル)より2〜20倍高いZnCl2濃度で、産生されたCPB−Cの比活性が最大であった。ZnCl2を添加せずに折り畳みを行い、折り畳み混合物にEDTAを加えて残存する2価イオンをキレートさせると、CPB−Cの比活性はゼロに低下した。
VI. ProCPB−Cの折り畳みに及ぼすタンパク質濃度の影響
ProCPB−Cの折り畳みは、表IIIに示したタンパク質濃度で最適条件下で(前述)で24時間行った。トリプシン分解後、実施例3に記載のようにCPB−C活性を測定した。
表IIIは、タンパク質濃度0.05mg/mlの時、産生されるCPB−Cの比活性が最大になることを示す。
VII. CPB−Cの比活性の関数としての折り畳み時間
すでに最適化された条件下で一連の反応でProCPB−Cの最適折り畳み時間を測定した。
ProCPB−Cの折り畳みは、100mMグリシン(pH9.25)、0.1mM GSSG、0.5mM GSHおよび0.01mM ZnCl2中で0.1mg/mlで行った。折り畳まれたProCPB−Cの試料をトリプシン(1:50w/w)で処理し、こうして得られたCPB−Cの比活性を、折り畳みの開始から種々の時点(0〜40時間)で実施例3に記載のように測定した。
折り畳まれたProCPB−Cを折り畳みの開始後20時間日にトリプシンで切断する時、CPB−Cの最大の活性が得られた。20時間を超える折り畳みはCPB−Cの比活性を変化させなかった。
実施例5: 異なるCPBタンパク質の折り畳みと活性化
実施例2に記載のように産生し精製したCPB、CPB−C、ProCPBおよびProCPB−Cを、それぞれ100mMグリシン緩衝液(pH9.25)、0.01mM ZnCl2、0.5mM GSH、0.1mM GSSG中0.1mg/mlで室温で24時間(すなわち、使用した折り畳み条件は実施例4で確立された基本的に最適の条件である)で折り畳みを行った。
折り畳まれたCPB、CPB−C、ProCPBまたはProCPB−Cを含有する各溶液のpHを、HClで8.5に調整し、ProCPBとProCPB−Cを含有する溶液をトリプシン(1:50w/w)で37℃で1時間処理して活性化ペプチドを除去した。反応を停止させるため、PMSFを最終濃度0.1mMになるように加えた。CPB、CPB−C、ProCPBおよびProCPB−Cの比活性を、実施例3に記載のように測定した。
表IVは、活性化ペプチドを含有する前駆体を発現する細胞からのみ酵素的に活性なCPBが産生されることを示す。すなわち、活性化ペプチドはCPBの正しい折り畳みに必要である。
表IVはまた、遊離のCys290残基を含有するProCPB(プラスミドpλProCPBにより発現される)の折り畳みと活性化から産生され、Cys290→Ser突然変異を有するProCPB−Cの折り畳みと活性化からは産生されないことを示す。すなわち、Cys290はCPBの最適の折り畳みおよび/または最大の活性のために必要なようである。
実施例6: ProCPBの改良された折り畳み
I. 粗細胞内沈殿物からのProCPBの折り畳み
ProCPBの最適な折り畳み条件は、実施例4で測定したProCPB−Cの最適折り畳み条件と基本的に同じであった。
実施例2のIII部に記載の初期精製工程の必要性を省略して粗細胞内沈殿物を用いることにより、ProCPBの折り畳みと活性化の簡便法を行った。
ProCPB(実施例2に記載のように産生される)を含有する粗細胞内沈殿物は、100mMグリシン(pH9.5)と8M尿素中で高タンパク質濃度(表V)で溶解できることがわかった。
折り畳みは、最適条件下で室温で24時間行った。pHを最適pHの9.5(すでに決定されている)に上げた。折り畳まれたProCPBをトリプシン(1:50w/w)で切断し、実施例3に記載のようにCPBの比活性を測定した。
表Vは、粗細胞内沈殿物からProCPBを折り畳み、次にトリプシン消化することにより、酵素的に活性なCPBが得られることを示す。さらにCPBは、測定したすべてのタンパク質濃度で同様のレベルで酵素的に活性である。タンパク質濃度が折り畳み混合物中で増加する場合、折り畳み前にDEAE−セファロース(実施例2)で精製したCPBの比活性は低下したため、これは予想外の結果である。おそらく細胞内沈殿物がProCPBの折り畳みを助ける因子を含有するのであろう。
II. 粗細胞内沈殿物からのProCPBの折り畳みによるCPBのスケールアップ
(i)産生
プラスミドpλProCPBを有しProCPBを発現する42リットルの大腸菌4300から、ほとんど均一になるまでCPBを精製した。発酵と増殖条件は、基本的に実施例2に記載したものと同じである。
粗細胞内沈殿物を水中で洗浄し、100mMグリシン(pH9.5)、8M尿素中に20mg/mlで溶解し、100mMグリシン(pH9.5)、0.1mM ZnCl2、0.5mM GSHおよび0.1mM GSSG中で1mg/mlに希釈し、得られた折り畳み溶液を25℃で24時間インキュベートした。次にHClでpHを8.5に調整し、折り畳まれたProCPBをトリプシン(20μg/ml)で37℃で1時間消化した。トリプシンを0.1mM PMSFで不活性化した。
(ii)精製
酵素的に活性なCPBを、20mMトリス−塩酸(pH8)で樹脂1ml当たり20mgで平衡化したDEAE−セファロースファーストフローカラム(Fast Flow column)(ファルマシア(Pharmacia))にのせた。CPBを80mM NaCl、20mMトリス−塩酸(pH8)で溶出した。硫酸アンモニウム(0.8M)をDEAE溶出液プールに加え、これをさらに20mMトリス−塩酸(pH8)、0.8M硫酸アンモニウムで平衡化したDEAE−セファロースファーストフローカラム(Fast Flow column)(ファルマシア(Pharmacia))でクロマトグラフィーを行った。CPBは0.4M硫酸アンモニウムで溶出し、これを濃縮し、100mM NaCl、20mMトリス−塩酸(pH8)に対してダイアフィルトレーションを行い、−20℃で保存した。
上記精製法で、O.D.660=36のプラスミドpλProCPBを有する大腸菌4300の42リットルを、前述のように処理し、比活性637u/mgを有する酵素的に活性な1.25gのCPBを得た。総収率は約60%であった。
同じ実験条件で測定した市販のブタカルボキシペプチダーゼBの比活性は、298u/mgであった。
実施例7: 酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼBの性状解析
実施例5と6に記載のCPBは、ブタカルボキシペプチダーゼBに匹敵する生化学的および酵素的性質を有する。
そのアミノ酸組成から計算した組換えCPBの吸光係数は、ε1% 280=19.7である。市販のブタカルボキシペプチダーゼBの吸光係数は、ε1% 280=21.4である(1)。
組換えCPBは比活性637u/mg(ヒプリルーL−Arg基質)を有し、原子吸光法で測定すると酵素1モル当たり1モルのZnを含有する。
N−末端アミノ酸配列解析により、成熟ラットカルボキシペプチダーゼBのアミノ酸配列解析から予測される(5)ように、Ala−Ser−Gly−His−Serが明らかになった。
組換えCPB活性の最適pHは、25mMの緩衝液(NaOAc、pH4〜6;ビス−トリス、pH6〜7.5;トリス−塩酸、pH7.5〜9;およびグリシン、pH9〜12)を用いて測定した。CPBの比活性は実施例3に記載のように測定した。CPBの最適酵素活性は、pH8で得られた。55℃でCPBをインキュベートすると、活性が50%失われ、65℃では完全に失われた。
ヒプリルーL−Arg基質を用いて組換えCPBの速度論解析を行った(図4)。0.5mMを超える基質濃度でCPB活性が阻害された。
さらなる試験により、組換えCPBは触媒生成物アルギニン(これはカルボキシペプチダーゼBの競合的インヒビターである)により阻害されることが明らかになった。対応するLineweaver-Burk曲線は、Km値0.38mMを示した。
組換えCPBはまた、強い2価イオンキレート物質である1,10−フェナントロリンにより阻害され、従ってCPBの酵素活性にZnイオンが重要であることが証明された。1mMの1,10−フェナントロリンの存在下では、1mg/ml組換えCPBの活性の50%が失われることが観察された。
実施例8: CPBによるプロインスリンからインスリンへの変換
EP347781 B1に記載のミニ−プロインスリンは、実施例5と6において産生されたものと同様にトリプシンおよび組換えCPBで処理することによりインスリンに変換される。
トリプシンは、アルギニン残基とA鎖の間を特異的に切断する。次にCPBは、B鎖のC−末端からアルギニン残基を特異的に加水分解する。
市販のヒトインスリン(ベーリンガーマンハイム(Boehringer-Mannheim))は、標準物質、トリプシンと市販のブタカルボキシペプチダーゼBにより切断されるミニ−プロインスリン、およびトリプシンのみに切断されるミニ−精製インスリンとして使用できる。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人:バイオ−テクノロジー ジェネラル コープ
(ii)発明の名称:酵素的に活性な組換え型カルボキシペプチダーゼBの製造
(iii)配列の数:8
(iv)通信宛先:
(A)名宛人:クーパー&ダンハム エルエルピー
(B)通り:1185 アベニュー・オブ・ジ・アメリカズ
(C)市:ニューヨーク
(D)州:ニューヨーク
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:10036
(v)コンピュータ読取り可能な形態:
(A)媒体タイプ:フロッピーディスク
(B)コンピュータ:IBM・PCコンパチブル
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウエア:Patent In リリース#1.0、バージョン#1.30
(vi)現在の出願データ:
(A)出願番号:未だ知らされず
(B)出願日:1996年1月25日
(C)分類:
(viii)アトニー/エージェント情報
(A)氏名:ホワイト,ジョン P.
(B)登録番号:28,678
(C)参照/ドケット番号:0336/43847−A−PCT
(ix)電信情報:
(A)電話:(212)278−0400
(B)テレファックス:(212)391−0525
(2)配列認識番号1のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列の記載:配列認識番号1
(2)配列認識番号2のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:285塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:1..285
(xi)配列の記載:配列認識番号2
(2)配列認識番号3のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:95アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク
(xi)配列の記載:配列認識番号3
(2)配列認識番号4のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列の記載:配列認識番号4
(2)配列認識番号5のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:927塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:1..927
(xi)配列の記載:配列認識番号5
(2)配列認識番号6のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:309塩基対
(B)型:核酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク
(xi)配列の記載:配列認識番号6
(2)配列認識番号7のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(xi)配列の記載:配列認識番号7
(2)配列認識番号8のための情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:27塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(xi)配列の記載:配列認識番号8
Claims (9)
- 307アミノ酸を含有し、見かけの分子量が35kDであり、且つプロインスリンをインスリンに変換する機能をもった、天然に存在する哺乳類膵臓カルボキシペプチダーゼBのアミノ酸配列および酵素活性を有する酵素的に活性な哺乳類膵臓カルボキシペプチダーゼBを製造する方法であって:
(a)DNAがプロカルボキシペプチダーゼBの発現を指令するように、プロカルボキシペプチダーゼBをコードするDNAを含有する組換えバクテリア細胞を処理する工程と;
(b)そのようにして発現されたプロカルボキシペプチダーゼBを、pH7〜9.5において可溶化する工程と;
(c)該可溶化されたプロカルボキシペプチダーゼBを9〜9.5のpHでインキュベートして、該プロカルボキシペプチダーゼBを折り畳ませる工程と;
(d)該折り畳まれたプロカルボキシペプチダーゼBを酵素的切断に供し、酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼBを製造する工程と;
(e)該酵素的に活性なカルボキシペプチダーゼBを精製する工程と;
を含んでなる方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記可溶化する工程(b)が、
(i)前記組換え細胞の細胞壁を破壊し、溶解物を製造する工程と;
(ii)遠心分離により、前記溶解物から細胞内沈殿物を単離する工程と;
(iii)前記細胞内沈殿物を適切な緩衝液中に可溶化する工程と;
を含んでなる方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記インキュベーション工程(c)が、室温において20〜24時間行われる方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記インキュベーション工程(c)が、ZnCl2、酸化されたグルタチオンおよび還元されたグルタチオンの存在下に、室温で20〜24時間行われる方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記酵素的切断に供する工程(d)が、
(i)pHを8.5に調製する工程と、
(ii)37℃で60分間トリプシンによりプロカルボキシペプチダーゼBを切断する工程と
を含んでなる方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記精製工程(e)が、イオン交換クロマトグラフィーを含んでなる方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製工程(e)が、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーを含んでなる方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製工程(e)が、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびダイアフィルトイレーションを含んでなる方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記プロカルボキシペプチダーゼBがATCC受託番号69673の下に寄託されたプラスミドpγプロカルボキシペプチダーゼBにより発現される方法。
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