HU215948B - Eljárás urát-oxidáz aktivitással rendelkező protein, azt kódoló gén, expressziós vektor és mikroorganizmusok előállítására - Google Patents

Eljárás urát-oxidáz aktivitással rendelkező protein, azt kódoló gén, expressziós vektor és mikroorganizmusok előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU215948B
HU215948B HU906046A HU604690A HU215948B HU 215948 B HU215948 B HU 215948B HU 906046 A HU906046 A HU 906046A HU 604690 A HU604690 A HU 604690A HU 215948 B HU215948 B HU 215948B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
thr
lys
ser
leu
glu
Prior art date
Application number
HU906046A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT56884A (en
HU906046D0 (en
Inventor
Daniel Caput
Pascual Ferrara
Jean-Claude Guillemot
Mourad Kaghad
Elisabeth Larbre
Patrick Laurent
Richard Legoux
Pascal Leplatois
Gérard Loison
Johannes Lupker
Marc Louis Victor Salome
Original Assignee
Sanofi S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR8909550A external-priority patent/FR2649720A1/fr
Priority claimed from FR8917466A external-priority patent/FR2656530B1/fr
Application filed by Sanofi S.A. filed Critical Sanofi S.A.
Publication of HU906046D0 publication Critical patent/HU906046D0/hu
Publication of HUT56884A publication Critical patent/HUT56884A/hu
Publication of HU215948B publication Critical patent/HU215948B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Electrical Discharge Machining, Electrochemical Machining, And Combined Machining (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás egy új, űrát-őxidáz-aktivitással rendelkezőfehérje előállítására, amely a következő szekvenciával rendelkezik:Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg ValTyr Lys ValHis Lys Asp Glű Lys Thr Gly Val Gln Thr Val TyrGlű Met Thr Val Cys ValLeű Leű Glű Gly Glű Ile Glű Thr SerT r Thr Lys Ala Asp Asn Ser Val IleVal Ala Thr Asp Ser IleLys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn PrőVal Thr PrőPrő Glű Leű Phe Gly Ser Ile Leű Gly Thr His Phe Ile GlűLysTyr Asn His Ile His Ala Ala His Val Asn Ile Val Cys His ArgTrp ThrArg Met Asp Ile Asp Gly Lys Prő His Prő His Ser PheIle Arg Asp Ser GlűGlű Lys Arg Asn Val Gln Val Asp Val ValGlű Gly Lys Gly Ile Asp Ile L sSer Ser Leű Ser Gly Leű ThrVal Leű Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp GlyPhe Leű Arg AspGlű Tyr Thr Thr Leű Lys Glű Thr Trp Asp Arg Ile Leű SerThrAsp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leű GlnGlű ValArg Ser His Val Prő Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala ThrAla Arg Glű Val ThrLeű Lys Thr Phe Ala Glű Asp Asn Ser AlaSer Val Gln Ala Thr Met Tyr LysMet Ala Glű Gln Ile Leű A aArg Gln Gln Leű Ile Glű Thr Val Glű Tyr SerLeű Prő Asn LysHis Tyr Phe Glű Ile Asp Leű Ser Trp His Lys Gly Leű GlnAsnThr Gly Lys Asn Ala Glű Val Phe Ala Prő Gln Ser Asp Prő AsnGly LeűI e Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leű Lys Ser LysLeű amelyet kívánt esetben megelőz egy metiőnincsőpőrt, illetve ezzel aszekvenciával lényeges hőmőlógiával rendelkezik. A találmány tárgyatővábbá eljárás az ezt a fehérjét tartalmazó gyógyszerekelőállítására, valamint a fehérje előállítására használt génsebészetimódszerek. ŕ

Description

Budapest (54) Eljárás urát-oxidáz-aktivitással rendelkező protein, azt kódoló gén, expressziós vektor és mikroorganizmusok előállítására
KIVONAT
A találmány tárgya eljárás egy új, urát-oxidáz-aktivitással rendelkező fehéije előállítására, amely a következő szekvenciával rendelkezik:
Ser Alá Val Lys Alá Alá Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gin Thr Val Tyr Glu Met Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Alá Asp Asn Ser Val Ile Val Alá Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Alá Lys Gin Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Alá Alá His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Val Gin Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Alá Thr Trp Gin Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gin Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Alá Thr Trp Alá Thr Alá Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Alá Glu Asp Asn Ser Alá Ser Val Gin Alá Thr Met Tyr Lys Met Alá Glu Gin Ile Leu Alá
A leírás terjedelme 58 oldal (ezen belül 16 lap ábra)
HU 215 948 B
HU 215 948 Β
Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gin Asn Thr Gly Lys Asn Alá Glu Val Phe Alá Pro Gin Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu amelyet kívánt esetben megelőz egy metionincsoport, A találmány tárgya továbbá eljárás az ezt a fehéijét illetve ezzel a szekvenciával lényeges homológiával tartalmazó gyógyszerek előállítására, valamint a fehérje rendelkezik. előállítására használt génsebészeti módszerek.
A találmány tárgya eljárás új, urát-oxidáz-tulajdonsággal rendelkező fehéije; ezt a fehérjét tartalmazó gyógyszerek, valamint az ennek a fehérjének az előállítására használt génsebészeti eszközök, nevezetesen az ezt a fehérjét kódoló rekombináns gén, az ezt a gént hordozó expressziós vektor, valamint az ezzel az expressziós vektorral transzformált eukarióta sejtek vagy prokariota mikroorganizmusok előállítására.
Az urát-oxidáz (EC 1.7.3.3.), amelyet urikáz néven is ismernek, a purinlebontási reakciósor egyik enzime. Ez az enzim nem létezik a főemlősökben (például az emberben), a madarakban, néhány hüllőben és a legtöbb rovarban. Ezenkívül nem található meg még néhány kutyában sem, például a dalmatinerben.
Az emberben a purinbázisok - az adenin és a guanin - xantinná konvertálódnak. A xantint a xantinoxidáz oxidálja húgysavvá a következő reakcióegyenlet szerint:
xantin+H2O+O2—>húgysav +O2
Az O2 -gyököt, amely a szuperoxid diszmutáz szubsztrátja, az utóbbi hidrogén-peroxiddá konvertálja.
A húgysav, amely a vérben jelenlevő metabolit, általában oldható mononátriumsó formájában található. Azonban bizonyos emberekben előfordulhat, hogy a húgysav kicsapódik és vesekövet képez. A hiperurikémia, ami a vérben keringő húgysav mennyiségének a megnövekedése, okozza, hogy a húgysav kiválik a porcos szövetekben, ez vezet a köszvényhez. A hiperurikémiának hatása lehet a vesékre is; a vizeletben és a vesékben feleslegben levő húgysav nefrolitiázist eredményez, azaz a vesekövek felhalmozódását, ami nagyon fájdalmas lehet, és tönkreteheti a vesét. Ezek a vesekövek húgysavból, és valószínűleg ezzel asszociálódva foszfátból és oxalátsókból állnak. A húgysav túltermelésének több oka lehet: veleszületett metabolizmus defektusok, Lesch-Nyhan-szindróma, purin vagy fehérjék fölöslegben való emésztése, „uricisuric” gyógyszerekkel való kezelés, a hemopátiák kezelése, főleg a rákos hemopátiák kezelése citolitikus anyagokkal (kemoterápia) vagy radioterápiával [Gutmen, A. B. and YU, T. F„ Am. J. Med., 45 (756-779) (1968)].
Az urát-oxidáz az az enzim, amely a húgysav allantoinná bomlását katalizálja (ez egy olyan vegyület, amely sokkal jobban oldódik, mint a húgysav, és nem kristályosodik ki abban a koncentrációban, amelyet a biológiai folyadékokban elér), ezért terápiás értéke van. Injekcióban alkalmazva számos előnnyel rendelkezik a hiperurikémia és nefrolitiázis kezelésében: a hiperurikémiás hatás sebessége (a hiperurikémia 50% alá csökkentése 24 óránál rövidebb idő alatt), a vese jobb védelme litiázissal szemben, más gyógyszerekkel, például allopurinollal összehasonlítva (ez egy xantin-oxidáz inhibitor) stb. Ezt az enzimet jelenleg főleg adjuvánsként használják a citolitikus ágensek mellett a kemoterápiában.
A jelenleg gyógyszerként használt urát-oxidázt egy olyan eljárással állítják elő, amelyben az Aspergillus flavus micéliumát tenyésztik, majd az urát-oxidázt extrakcióval izolálják a tenyészléből, majd számos lépésben tisztítják ezt a fehéijét. Ez a módszer lehetővé teszi, hogy nagy tisztaságban előállítsuk az urátoxidázt, mindamellett vannak hátrányai. Az tény, hogy az Aspergillus flavus fiziológiájával és genetikájával nehéz dolgozni [Woloshuk et al., Applied Environ. Microbiol., 55, 86-90 (1989)]. Például lehetetlen olyan törzset előállítani, amely ezt az enzimet nagy mennyiségben termeli. Az Aspergillus flavus emellett hajlamos arra, hogy alfatoxinokat termeljen, amelyektől néha nehéz megszabadulni. A tisztított terméket tehát következetesen meg kell vizsgálni, hogy biztosítsuk, hogy mentes legyen ezektől a toxinoktól.
Tehát szükség van egy tisztább Aspergillus flavus urát-oxidáz enzimre, valamint olyan génsebészeti eszközökre és technikákra, amelyekkel ezeket a hátrányokat ki lehet küszöbölni.
Megtisztítottuk az Aspergillus flavusból extrahált urát-oxidázt, azaz az urát-oxidáz-kivonatot olyan mértékben, amely ez idáig ismeretlen volt erre a fehérjére. Meghatároztuk ennek a fehérjének a részleges szekvenciáját, és ennek alapján előállítottunk két jelzett próbakeveréket, amelyek képesek ennek a fehéijének az említett két részletét kódoló nukleotidokkal hibridizálni.
Ezután előállítottunk egy, a fehéijét kódoló cDNS-t tartalmazó expressziós vektort, egy Escherichia coli KI2 törzset transzformált vele, az említett törzset tenyésztettük, és izoláltuk, hogy a sejtek lizátuma tartalmazott a várt molekulatömeggel rendelkező fehéijét, amely urát-oxidáz-aktivitással rendelkezik (képes a húgysavat allantoinná oxidálni).
Említett előállítottunk számos, eukarióta sejtekben való expresszióra alkalmas vektort, amelyek urát-oxidázt kódoló rekombináns gént tartalmaznak, szekvenciájukban variációk vannak az izolált cDNS-hez viszonyítva, amelyeket azért vittünk be a szekvenciába, hogy az eukarióta sejtekben megszokott kodonokat építsen
HU 215 948 Β be, különböző eukarióta sejteket transzformáltunk ezekkel a vektorokkal, az említett sejteket tenyésztettük mind kis, mind nagy térfogatban (fermentor), és megállapítottuk, hogy a sejtek lizátumai jelentős arányban tartalmazták a várt molekulatömegű, urát-oxidáz-aktivitással rendelkező rekombináns fehéijét. Megtisztítottuk ezt a rekombináns fehérjét, és részlegesen jellemeztük az urát-oxidáz-kivonathoz viszonyítva.
A jelen találmány tehát egy új, legalább 16 U/mg specifikus urát-oxidáz-aktivitással rendelkező fehéije 5 előállítására vonatkozik, amely a következő szekvenciával rendelkezik:
Ser Alá Val Lys Alá Alá Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val
Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gin Thr Val Tyr
Glu Hét Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser
Tyr Thr Lys Alá Asp Asn Ser Val Ile Val Alá Thr ASp Ser Ile
Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Alá Lys Gin Asn Pro Val Thr Pro
Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys
Tyr Asn His Ile His Alá Alá His val Asn Ile val cys His Arg
Trp Thr Arg Hét Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe
Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Val Gin Val Asp Val Val
Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys : Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr
val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp
Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr
A3? Val ASP Alá Thr Trp Gin Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gin
GlU Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Alá Thr Trp Alá Thr
Alá Arg GlU Val Thr Leu Lys Thr Phe Alá GlU Asp Asn Ser Alá
Ser Val Gin Alá Thr Hét Tyr Lys Hét Alá Glu Gin i Ile Leu Alá
Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys
His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gin Asn
Thr Gly Lys Asn Alá GlU Val Phe Alá Pro Gin Ser Asp Pro Asn
Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys
Leu , amelyet adott esetben megelőz egy metionin, ami lényeges mértékű homológiát jelent ezzel a szekvenciával.
A találmány szerinti eljárással előállított fehérjespecifikus urát-oxidáz-aktivitása körülbelül 30 U/mg.
Ebből a típusból előnyösnek tekintjük azt a fehérjét, amely kétdimenziós gélen egy körülbelül 33,5 kDa méretű, és 8,0 körüli izoelektromos ponttal rendelkező pontként jelenik meg, és legalább 90 tömeg%-át jelenti az összes fehérjének.
A találmány szerinti eljárással előállított fehéije tisztasági foka C8 ojtott szilikátoszlopon folyadékkromatográfiával meghatározva magasabb 80%-nál.
Ebből a típusból van egy érdekes fehérje, amelynek izoelektromos pontja 8,0. Ennek a fehérjének az ami60 noterminális szerincsoportja egy blokkolócsoportot tar3
HU 215 948 Β talmaz, amely előnyösen egy 43 atomtömegű csoport, például egy acetilcsoport.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás olyan gyógyszerek előállítására, amelyek a találmány szerinti fehérjét gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal kom- 5 binálva tartalmazzák. A találmány szerinti eljárással előállított fehéije előnyösen helyettesítheti a különböző alkalmazási módokban a körülbelül 8 U/mg specifikus urát-oxidáz-aktivitással rendelkező urát-oxidáz-kivonatot, amelyet injektálható formában „Uricozyme” kereskedelmi név alatt árulnak (Vidal 1990).
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan rekombináns gén előállítására, amely az alábbi szekvenciával rendelkező fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz:
Met Ser Alá Val Lys Alá Alá Arg Tyr Gly Lys Asp Asn val Arg
Val Tyr Lys val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly val Gin Thr Val
Tyr Glu Met Thr Val Cys Val Leu Leu GlU Gly Glu Ile Glu Thr
Ser Tyr Thr Lys Alá Asp Asn Ser Val Ile Val Alá Thr ASP Ser
Ile : Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Alá Lys Gin Asn Pro val Thr
Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu
Lys Tyr Asn His Ile His Alá Alá His val Asn Ile Val l y s His
Arg Trp Thr Arg Hét Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro HiS Ser
Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Val Gin val ASp Val
Val GlU Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Giy Le u
Thi' val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Phe Leu Arg
Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp > Asp • Arg Ile Leu Ser
Thr Asp Val Asp Alá Thr Trp Gin Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu
Gin Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Fhe Asp Alá Thr Trp Alá
Thr Alá Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Alá Glu Asp Asn Ser
Alá Ser Val Gin Alá Thr Met Tyr Lys Met Alá Glu Gin Ile Leu
AlH Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn
Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gin
Asn Thr Gly Lys Asn Alá Glu Val Phe Alá Pro Gin Ser Asp Pro
Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg CCi Ser Leu Lys Ser
Lys Leu.
A genetikai kód degenerációja következtében számos olyan DNS-szekvencia létezik, amely a fentiekben megadott szekvenciájú fehétjét kódolja. Egy előnyös DNS- 55 szekvencia, amely különösen prokarióta mikroorganizmusokban való expresszióra alkalmas, a következő:
HU 215 948 Β
ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC
CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT
CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG
AAGGACAATG
CC AGA'_-GGTG
AGACCTCTTA
ATTAAGAACA
CGAGCTGTTC
ACATCCATGC
GACATTGACG
GAAGCGGAAT
AGTCGTCTCT
TGGGGCTTCC
TATCCTGAGC
GACTTCAGGA
ACTGCTCGCG
CGTGCAGGCC
AGCTGATCGA
ATCGACCTGA
GGTCTTCGCT
GCCGGTCCTC
GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC
CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC
TGGGCACACÁ CTTCATTGAG AAGTACAACC
AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG
CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA
ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA
ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC
GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG
ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG
CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC
GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG
AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC
TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA
GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA
ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG
AAATTG.
TTCGCGTCTA
TACGAGATGA
CACCAAGGGC
CCATTTACAT
G6CTCCATCC
CGCTCACGTC
GCAAUvL·ACA
GTGCAGGT3G
GTCCGGCCTG
TGCGTGACGA
A /“'«“••'T * í-*/·
ΛΝ·'ν^Λ'-·\5 X
GGTAAGCTCG
AGGTCACTCT
ACTATGTACA
GACTGTCGAG
GCTGGCACAA
CCTCAGTCGG
TCTGAAGTCT
Egy másik előnyös DNS-szekvencia, amely különösen alkalmas eukarióta sejtekben, például élesztőben való expresszióra, a következő :
ATGTCTGCTű
CAAGGTTCAC
CCGTCTGTGT
GACAACAGCG
CACCGCCAAG
TGGGCACACA * * .«« A mrp) Γ-τρ,—«Γ!·«ι
X '•-z X 'w
TTAAGGCTGC
AAGGACGAGA
GCTTCTGGAG
TCATTGTCGC
CAGAACCCCG
CTTCATTGAG
GCCACCGCTG
TTCATCCGCG
TAGATACGGT
AGACCGGTGT
GGTGAGATTG
AACCGACTCC
TTACTCCTCC
AAGTACAACC
GACCCGGATG
ACAGCGAGGA
AAGGACAACG
CCAGACGGTG
AGACCTCTTA
ATTAAGAACA
CGAGCTGTTC
TTAGAGTCTA
TACGAGATGA
CACCAAGGGC
ACATCCATGC
CCATTTACAT
GGCTCCATCC
CGCTCACGTC fx 4 Λ ΓΠ'Τ’ΖΪ * Z-.-. λ ν λ 1 1 ο η
GCAÁG
GAAGCGGAAT
AGG rnz-»Z*» X S3S2
HU 215 948 Β
ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT
ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC
ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTTCAGGA
CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG
GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA
TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA
GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC
AAATTG.
Egy másik előnyös DNS-szekvencia, amely állati sejtekben való expresszálásra alkalmas, a következő: 25
5'-ATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT
CAATGTTCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC
CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA
TCTTACACCA AGGGCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG
GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT
TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC
TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC
GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA
TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC
CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG
TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT
CAGGAGGTAA GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT
TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT
AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG
ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT
GTCCGGCCTG
TGCGTGACGA
ACCGACGTCG
GGTAAGCTCG
AGGTCACTCT
ACTATGTACA
GACTGTCGAG
GCTGGCACAA
CCTCAGTCGG
TCTGAAGTCT
ACGGCAAGGA
GGTGTCCAGA
GATTGAGACC
ACTCCATTAA
CCTCCCGAGC
CAACCACATC
GGATGGACAT
GAGGAGAAGC
TATCAAGTCG
AGTTCTGGGG
GACCGTATCC
CAGTGGACTT
GGGCCACTGC
GCCAGCGTGC
CCAGCAGCTG
TCGAAATCGA
HU 215 948 Β
CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCGG
TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G, amelyet megelőz egy nem transzlálódó 5’ szekvencia, amely elősegíti az expressziót állati sejtekben. Egy előnyös nem transzlálódó 5’ szekvencia ebből a típusból az, amely tartalmazza az AGCTTGCCGCCACT szekvenciát, közvetlenül az előzőekben leírt szekvencia előtt.
Meg kell jegyezni, hogy a fentiekben megadott cDNS-szekvencia által kódolt fehérje átalakulhat a metionil-amino-peptidáz hatására, amely lehasíthatja az aminoterminális metionincsoportot.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan expressziós vektor előállítására, amely a fentiekben meghatározott rekombináns gént hordozza, az expresszálásához szükséges környezettel együtt.
Prokarióta mikroorganizmusokban, főleg E. coli-ban való expresszálás céljából a kódoló szekvenciát be kell építeni egy expressziós vektorba, amely egy különösen aktív promotert tartalmaz, ezt követi egy riboszomális kötőhely az expresszálandó gén előtt, majd az expreszszálandó gén után egy szintén hatékony transzkripciós stop-szekvencia. Ennek a plazmidnak tartalmaznia kell még egy replikációs origót és egy szelekciós markert. Az összes említett szekvenciát a gazdasejtben való működés szempontjából kell megválasztani.
Eukarióta sejtekben való expresszálás céljából a találmány szerinti expressziós vektor tartalmazza az előzőkben említett rekombináns gént az expresszálásához szükséges környezettel, az eukarióta sejtekben való replikálódáshoz, valamint a transzformált sejtek szelektálá- 35 sához szükséges elemekkel együtt. Ez a vektor előnyösen tartalmaz egy szelekciós markert, amelyet például úgy választunk meg, hogy komplementálja a befogadó eukarióta sejt egy mutációját, ami lehetővé teszi, hogy szelektáljuk azokat a sejteket, amelyek nagy számban 40 integrálták a rekombináns gén kópiáit akár a genomjukba, akár egy több példányban előforduló vektorba.
Állati sejtekben való expresszálás céljából, főleg az aranyhörcsög-petefészek (CHO) sejtekben való expreszszálás esetében a kódoló szekvenciát beillesztjük egy plazmidba (például egy pBR322 eredetű plazmidba), amely két expressziós egységet tartalmaz. Az első egységbe illesztjük bele a rekombináns gént egy hatékony promoter mögé (például egy SV40 korai promoter mögé). Az iniciációs ATG körüli szekvenciát előnyösen a Kozák által leírt konszenzusszekvencia szerint választjuk meg [Kozák, M., Cell., 75, 1109-1123 (1978)]. Egy intronszekvenciát, például az egér α-globinjának az intronját építhetjük be a rekombináns gén elé, majd egy poliadenilezési helyet (például az SV40 poliadenilezési helyét) építjük be a rekombináns gén mögé. A második expressziós egység egy szelekciós markert tartalmaz (például egy DNS-szekvenciát), amely dihidrofolátreduktázt kódol (a továbbiakban DHFR-nek rövidítjük).
A plazmidot állati sejtekbe transzfektáljuk, például
DHFR CHO-sejtekbe, amely nem képes a DHFR expresszálására). Egy metotrexát rezisztens sejtvonalat 10 szelektálunk: ebben a rekombináns gén számos másolata épült be a genomba, és expresszálja az említett rekombináns gént megfelelő mértékben.
Eukarióta sejtekben, úgymint élesztőkben, például a Saccharomyces cerevisiaeben való expresszálás céljából 15 a kódoló szekvenciát beillesztjük egy hatékony promoterként ismert szekvencia és egy transzkripciós terminátor közé. A promoter/kódoló szekvencia/terminátor tömböt, amit expressziós kazettaként ismerünk, vagy egy élesztőplazmid vektorba (egypéldányos vagy több20 példányos) klónozzuk, vagy több másolatban beépítjük az élesztő genomjába.
A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti expreszsziós vektorral transzformált eukarióta sejtek előállítására. Ezek közül az eukarióta sejtek közül fontosak a 25 Saccharomyces cerevisiae faj törzsei, főleg azok, amelyek mutációt tartalmaznak a leucin vagy uracil szintéziséért felelős gének közül egyben, például a LEUZ2 vagy URA3 génben.
A találmány tárgya továbbá eljárás az ezt a rekom30 bináns gént az expresszálásához szükséges környezettel együtt tartalmazó állati sejtek előállítására. Az említett rekombináns gént például a fenti expressziós vektor transzfektálásával lehet bejuttatni a sejtekbe, vagy az említett expressziós vektort hordozó vírus, illetve retrovírus fertőzésével, vagy mikroinjektálással.
A találmány tárgya továbbá eljárás rekombináns urát-oxidáz előállítására, ami a következő lépésekből áll:
1. az előzőekben meghatározott transzformált sejteket tenyésztjük;
2. a tenyésztett sejteket feltárjuk;
3. a kapott lizátumban levő urát-oxidázt izoláljuk és tisztítjuk.
A találmány jobban érthető az alábbi példák segít45 ségével.
A leírt technikák közül számos, amely jól ismert a szakterületen jártas szakemberek számára, részletesen leírva megtalálható a Maniatis és munkatársai által publikált szakkönyvben: „Molecular cloning: a laboratory 50 manual”, Cold Spring Harbor Press, New York, 1984.
1. példa
Messenger RNS izolálása Aspergillus flavusból
Az urát-oxidázt termelő Aspergillus flavus törzset 55 (ATCC 20047, letétbe helyezve 1968. 02. 14-én) az urát-oxidáz termeléséhez alkalmas körülmények között tenyésztjük, azaz olyan táptalajban, amely húgysavat tartalmaz, és összetétele az alábbi: glükóz 15 g/1, MgSO4.7H2O 1 g/1, KH2PO4 0,75 g/1, CaCO3 1,2 g/1, 60 húgysav 1,2 g/1, KOH 0,5 g/1, szójaolaj 0,66 ml/1,
HU 215 948 Β
FeSO4.7H2O 10 mg/1, CuSO4.5H2O 1 mg/1,
ZnSO4.7H2O 3 mg/1, MnSO4.H2O 1 mg/1. A táptalaj pH-ját 1 mólos kénsawal 7-re állítjuk, majd 120 °C-on sterilezzük 80 percig.
Egy 5 literes Erlenmeyer-lombikban 1,5 liter táptalajt körülbelül 1-3 107 spórával oltunk be.
A tenyészetet körülbelül 40 órán át 30 °C-on inkubáljuk, kevertetés közben (120 rpm). A micéliumot gézen kiszűrjük, vízzel mossuk, és folyékony nitrogénben lefagyasztjuk.
g micéliumot (nedves tömeg) megolvasztunk, 45 ml lizáló pufferben szuszpendáljuk, majd azonos térfogatú, 0,45 pm átmérőjű gyöngyökkel keverjük össze. A lizáló puffer összetétele 4 mol/1 guanidintiocianát, TRIS-HC1 10 mmol/1 pH = 7,6, EDTA 10 mmol/1, β-merkapto-etanol 50 ml/1. A micéliumszuszpenziót Zellmühler-malomban (vibrációs) őröljük 5 percig.
A megőrölt anyagot kinyerjük, majd a gyöngyöket elöntjük. A felülúszót eltávolítjuk (körülbelül 45 ml), lítium-kloridból 3 mólos koncentrációt állítunk be, majd 0 °C-on tároljuk.
Két nap elteltével 60 percig centrifugáljuk 10000/perc fordulatszámmal. A felülúszót elöntjük, majd a maradékot 40 ml 3 mólos LiCl-ban vesszük föl, és ismét 10000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk másfél órán át.
A következő oldatokat adjuk hosszá: proteináz K (Sigma) 40 pg/ml, SDS (0,1 v%) és EDTA 20 mmol/1. Az elegyet 3 órán át 37 °C-on inkubáljuk. 2 térfogat etanollal végzett kicsapás után 70%-os etanollal mossuk. A maradékot 0,5 ml TE pufferben vesszük fel (TRIS-HC1 10 mmol/1, EDTA 1 mmol/1, pH=7,5), majd az oldatot kétszer extraháljuk kloroformmal, és etanollal kicsapjuk. Az RNS-eket -80 °C-on alkoholban tároljuk.
2. példa
Az RNS-ekpoliA + -frakciójának tisztítása
Körülbelül 1 mg RNS-t kicsapunk 20 percig 4 °Con (15 000/perc), majd 70%-os etanollal mossuk és szárítjuk. A maradékot 1 ml TE pufferben felvesszük, majd vortexes keveréssel újra felszuszpendáljuk. 3-as típusú oligo-dT-cellulózt (árulja a Collaborativa Research Inc., Biomedicals Product Division) készítünk az előállító előírásai szerint. Az RNS-t az oligo-dT-re juttatjuk, gyengén kevertetjük a gyöngyök szuszpendálása céljából, majd 1 percre 65 °C-ra melegítjük.
A szuszpenzióban 0,5 mol/1 NaCl-koncentrációt állítunk be, majd 10 percig óvatosan kevertetjük. Ezután 1 percig 1000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk, majd a maradékot kétszer mossuk 1 ml TE pufferrel, amely 0,5 mol/1 NaCl-t tartalmaz. A felülúszókat eltávolítjuk. Az RNS-ek poliadenilezett frakcióját (amely tartalmazza a messenger RNS-t) eluáljuk oly módon, hogy a gyöngyöket 1 ml TE pufferben szuszpendáljuk, majd ezt a szuszpenziót 1 percre 60 °C-ra melegítjük, majd ezt követően 10 percig rázóasztalon kevertetjük. Ezután egy percig 1000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk, ami lehetővé teszi, hogy egyrészt kinyerjük a szabad mRNS-oldatot tartalmazó felülúszót, másrészt kinyequk a cellulózgyöngyök maradékát. A fenti műveleti sorrendet megismételjük. Az ily módon kapott felülúszókat egyesítjük, a fölöslegben levő gyöngyöket centrifugálással eltávolítjuk, majd a felülúszót NaCl-tartalmú etanollal kicsapjuk a szokásos módszerekkel (Maniatis, i. m.).
3. példa cDNS-könyvtár készítése
Az előző példában leírt módon izolált messenger RNS-t használjuk cDNS-bank készítésére pTZ19R vektorban (árulja a PHARMACIA). Ez a vektor egy olyan plazmid, amely egyedülálló restrikciós helyekkel rendelkező polilinkert tartalmaz.
Az alkalmazott klónozási technika a Caput és munkatársai által leírt [primer-adapter technika: Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok, 83, 1670-1674(1986)].
Ez elsősorban abból áll, hogy a vektort PstI restrikciós enzimmel emésztjük, a túlnyúló véghez poli-dC-farkat ragasztunk hozzá, majd a keletkező plazmidot BamHl restrikciós enzimmel emésztjük. A vektornak megfelelő fragmenst Sepharose CL4B oszlopon (Pharmacia) tisztítjuk. Ezek után a vektor az egyik végén egy poli-dCfarkat tartalmaz, a másik vége pedig egy BamHl típusú ragadós vég. A messenger RNS-t ezután revert transzkripciónak vetjük alá, ami egy 5’-GATCCGGGCCCT-3’ indító molekuláról indul. így a cDNS-ek az 5’ végükön a BamHl ragadós véggel komplementer GATCC szekvenciát tartalmazzák. A reverz transzkriptáz hatására kapott RNS-DNS-hibrideket alkalikus hidrolízisnek vetjük alá, ezzel eltávolítjuk az RNS-t. Az egyszálú cDNS-eket ezután két menetben tisztítjuk Sepharose CL4B oszlopon, majd terminális transzferázzal kezeljük, ezzel polidG-szekvenciát illesztünk a 3’ véghez. A cDNS-eket egyszálú formában illesztjük bele egy, az alábbiak szerint előállított vektorba. Egy második oligonukleotid, az adapter, amely komplementer az indító molekulával, szükséges ahhoz, hogy a cDNS-ek 5’ végén egy „nyílt” BamHl helyet hozzunk létre. A vektor, a cDNS és az adapter hibridizálása után a rekombináns molekulákat T4 fág ligázzal cirkularizáljuk. Az egyszálú régiókat ezután T4 fág DNS-polimerázzal feltöltjük. Az így kapott plazmidkeveréket ezután MCI061 törzs transzformálására (ampicillinrezisztencia kialakítása) használjuk [Casabadan, Chou and Cohen, J. Bact., 143, 971-980(1980)].
4. példa
Az Aspergillus flavusból extrahált urát-oxidáz tisztítása és jellemzése
1. Az Aspergillus flavusból extrahált urát-oxidáz tisztítása
Egy Aspergillus flavusból kivont urát-oxidáz-készítményt (Uricozyme - Laboratories Clin Midy), amelynek a specifikus urát-oxidáz-aktivitása 8 U/ml (a specifikus urát-oxidáz-aktivitás a 9. példában leírt teszttel mért urát-oxidáz-aktivitás és a Bradford-módszerrel
HU 215 948 Β (Anal. Biochem., 72, 248-254) mért összfehérje-menynyiség aránya) tovább tisztítjuk Red-agarose 120 ojtott agaróz (Sigma) oszlopon végzett kromatográfiával, ultraszűréssel és Ultrogel Aca 44-en (IBF) végzett betöményítéssel, majd poliakrilamid gélelektroforézissel, a következő kísérleti leírás szerint:
1. lépés: Affinitáskromatográfia ojtott agarózon
Hőmérséklet: 4 °C
Oszlop: Pharmacia K50/3 0
- átmérő=50 mm
- hossz=33 cm
Gyanta: Red 120 Agarose (3000 CL/R-0503
SIGMA) (a gél térfogata=410 ml a gél magassága=20 cm)
Egyensúlyozó puffer: glicin/NaOH 20 mmol/1, pH=8,3
Eluáló puffer: glicin/NaOH 20 mmol/1, NaCl mol/1, pH=8,3
Kondicionáló áramlási sebesség: 250 ml/óra Működési áramlási sebesség: 160 ml/óra Elúciós áramlási sebesség: 60 ml/óra
1. Az Uricozyme oldatot az oszlop tetejére juttatjuk egy konstans áramlási sebességű szivattyúval.
2. Abszorpció után az oszlopot az oszloptérfogat kétszeresét kitevő egyensúlyozó pufferrel mossuk.
3. Egy ionerősség-gradienssel eluáljuk, amelynek a következő az összetétele:
glicin, NaOH, 20 mmol/1 pH = 8,3/glicin, NaOH, 20 mmol/1+2 mol/1 NaCl, pH=8,3 A gradiens össztérfogata az oszloptérfogat tízszerese, egyenlően felosztva a két komponens között.
A kromatogramot lambda=280 nm-en rögzítjük, azokat az urát-oxidáz-frakciókat gyűjtjük és egyesítjük, amelyekben a specifikus urát-oxidáz-aktivitás nagyobb vagy egyenlő 16 U/mg-nál.
2. lépés: Az egyesített urát-oxidáz-frakciók betöményítése ultraszűréssel, egy 10 kDA ultraszűrőmembránt tartalmazó Biopass rendszer segítségével
3. lépés
Hőmérséklet: 4 °C
Oszlop: Pharmacia K50/100
- átmérő=50 mm
- hossz=100 cm
Gyanta: poliakril-amid- agaróz amin- és hidroxilcsoportokkal: Ultrogel ACA 44 (IBF) (a gél térfogata: 1,61 a gél magassága=80 cm)
Egyensúlyozó puffer: glicin/NaOH 20 mmol/1, pH=8,3 Kondicionáló áramlási sebesség: 40 ml/óra Működési áramlási sebesség: 24 ml/óra
1. A betöményített urát-oxidáz-oldatokat az oszlop tetejére juttatjuk egy állandó áramlási sebességű szivattyúval.
2. Miután a mintát felvittük, tovább áramoltatjuk az oszlopra a glicin/NaOH 20 mmol/1, pH=8,3 puffért.
3. Kromatográfia után 2 mólos NaCl-oldattal mossuk, míg az UV-abszorbancia értéke (lambda=280 nm) <0,05.
mólos NaCl alatt tároljuk 4 °C-on.
A kromatogramot lambda=280 nm-en rögzítjük; azokat az urát-oxidáz-frakciókat egyesítjük, amelyek egyszerre rendelkeznek a következő tulajdonságokkal :
- specifikus urát-oxidáz-aktivitásuk nagyobb vagy egyenlő 20 U/mg-nál; és
- denaturáló körülmények között végzett (SDS jelenlétében) elektroforézis és ezüst-nitrátos előhívás (BioRad festőkit) során csak két csíkot adnak, nevezetesen
- egy fő, 33-34 kDa méretű csíkot,
- egy minor, 70-71 kDa méretű csíkot.
2. Az Aspergillus flavusból extrahált, tisztított urátoxidáz jellemzése
a) Részleges szekvenálás
A fehérje közvetlen aminoterminális szekvenálását kíséreltük meg, hogy a tisztított urát-oxidáz-kivonat aminosav-szekvenciájára nézve adatokat kapjunk, ezzel lehetővé téve a cDNS klónozásához szükséges próbák megszintetizálását. Ez a szekvenálás nem volt sikeres a fehérje aminoterminális blokkolása miatt (lásd f), az alábbiakban).
Ennélfogva a következő stratégiát követtük az urátoxidáz részleges szekvenciájának meghatározására:
- az enzimet proteolitikus enzimekkel hasítottuk (a tripszint és a Staphylococcus aureus V8 enzimét használtuk),
- a kapott polipeptideket reverz fázisú HPLC-vel választottuk el,
- a tisztított peptidek szekvenciáját meghatároztuk, a) Az urát-oxidáz hidrolízise tripszinnel, a peptidek tisztítása és szekvenálása
Az urát-oxidáz-enzimet (9 mg/ml koncentrációban, 100 mmol-os pH = 8,9 ammónium-karbonát pufferben) tripszinnel emésztjük (Worthington, TPCK), urát-oxidáz/tripszin 30/1 tömegarányban, 30 °C-on 24 órán át. A triptikus hidrolízis után az emésztett urát-oxidázból 60 μg-ot közvetlenül injektálunk fordított fázisú Brownlee G18 ojtott szilikát HPLC-oszlopra (az oszlop méretei: 10x0,2 cm), amelyet 1 tf%-os acetonitril és 0,1 tf%-os trifluor-ecetsav vizes oldatával hozunk egyensúlyba. A peptideket ezután acetonitril lineáris gradiensével eluáljuk, amely 0,1 tf%-os trifluorecetsav vizes oldatában készült, az acetonitril gradiens 1-60 tf% között változik 60 perc alatt, 150 μΐ/perc áramlási sebesség mellett. Az oszlopot elhagyó peptideket 218 nm-en mért optikai denzitás alapján detektáljuk.
Az elúciós profilt az 1. ábrán mutatjuk be, amelyben a T betűt (tripszin) követő számok megfelelnek az azonosított csúcsoknak.
Mindegyik csúcsot gyűjtjük, majd -20 °C-on tároljuk, amíg egy kromatográffal felszerelt (430A modell, Applied Biosystems) fehérjeszekvenálón (470A modell, Applied Biosystems) nem elemezzük, amely folyamatosan analizálja a minden egyes degradációs ciklusban keletkező fenil-tiohidantion-származékokat. Az alább következő táblázatban a 9 azonosított csúcs peptidszekvenciáját látjuk.
HU 215 948 Β
β) Az urát-oxidáz hidrolízise V8 proteázzal, a peptidek tisztítása és szekvenálása
Az urát-oxidáz enzimet (2 mg/ml koncentrációban, 100 mmol-os pH = 6,8 ammónium-karbonát pufferben) Staphylococcus aureus V8 proteázzal (Boehringer Mannheim) emésztjük urát-oxidáz/V8 proteáz 60/1 tömegarányban, 30 °C-on 72 órán át. Az emésztett urátoxidázból 160 pg-ot közvetlenül injektálunk fordított fázisú Brownlee G18 ojtott szilikát HPLC-oszlopra (az oszlop méretei: 10x0,2 cm, a részecskeméret 7x0,03 pm), amelyet 1 tf%-os acetonitril és 0,1 tf%-os trifluor-ecetsav vizes oldatával hozunk egyensúlyba. A peptideket ezután acetonitril lineáris gradiensével eluáljuk, amely 0,1 tf%-os trifluor-ecetsav vizes oldatában készült, az acetonitril gradiens 1-60 tf% között változik 60 perc alatt, 150 pl/perc áramlási sebesség mellett. Az oszlopot elhagyó peptideket 218 nm-en mért optikai denzitás alapján detektáljuk.
Az elúciós profilt a 2. ábrán mutatjuk be, amelyben a V betűt (V8 proteáz) követő számok megfelelnek az azonosított csúcsoknak.
Mindegyik csúcsot gyűjtjük, majd -20 °C-on tároljuk, amíg egy kromatográfiai felszerelt (430A modell, Applied Biosystems) fehérjeszekvenálón (470A mo10 deli, Applied Biosystems) nem elemezzük, amely folyamatosan analizálja a minden egyes degradációs ciklusban keletkező fenil-tiohidantion-származékokat. Az alább következő I. táblázatban az 5 azonosított csúcs peptidszekvenciáját látjuk.
I. táblázat
Γ -1 1
(A hidrolízissel kapott termékek szekvenálása 1
1 1 IT17 Asn-Val-Gin-Val-Asp-Val-Val-Glu-Gly-Lys j
1 1 IT2O Asn-Phe-Ser-Gly-Leu-Gin-Glu-Val |
IT23 Phe-Asp-Alá-Thr-Trp-Alá 1
1 1 ]T27 His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp-Leu-Ser ]
ITripszinnel 1 1 1T2S Ile-Leu-Ser-Thr-Asp-Val-Asp-Alá-Thr-Trp- |
| Gin-Trp-Lys 1
1 1 1T29 His-Tyr-Phe-Glu-He-Asp-Leu-Ser-Trp-His- 1
i Lys 1
IT31 Ser-Thr-Asn-Ser-Gin-Phe-Trp-Gly-Phe-Leu- j
| Arg j
1 1 IT32 Gin-Asn-Pro-Val-Thr-Pro-Pro-Glu-Leu-Phe- 1
I Gly-Ser-Ile-Leu-Gly-Thr |
1 1 IT33 Gin-Asn-Pro-Val-Thr-Pro-Pro-Glu-Leu-Phe- 1
1 ) Gly-Ser-Ile-Leu-Gly-Thr 1 » ------ — »
HU 215 948 Β
I. táblázat (folytatás)
Vl Tyr-Ser-Leu-Pro-Asn-Lys-His -Tyr-Phe-Glu Ile -Asp -Leu -Ser -Trp -His -Lys
V£ Val -Thr -Leu -Lys -Thr -Phe -Alá -Glu -Asp -Asn Ser -Alá -Ser -Val -Gin -Alá
Vfi proteázzal
V 3 Thr -Ser -Tyr -Thr -Lys -Alá -Asp -Asn -Ser -Val Ile -Val -lAsa -Thr -Asp -Ser -Ile -Lys -Asn -Thr Ile-Tyr-Ile-Thr
V 5 Gly -Lys -Gly -Ile - Asp -He -Lys -Ser -Ser -Leu Ser -Gly -Leu -Thr - Val -Leu -Lys -Ser -Thr -Asn Ser -Gin -Phe -Trp -Gly -Phe -Leu -Arg
I |V6 Gly-Lys-Gly-Ile-Asp-Ile-Lys-Ser-Ser-LeuI I Ser-Gly-Leu-Thr-Val-Leu-Lys
b) Specifikus aktivitás
A tisztított urát-oxidáz-kivonat specifikus aktivitása körülbelül 30 U/mg.
c) Elektroforézis denaturáló körülmények között
A tisztított urát-oxidáz-kivonat elektroforézise poliakril-amid-gélen SDS (nátrium-dodecil-szulfát) jelenlétében, majd ezüsttel való előhívás után egy körülbelül 33-34 kDa méretű erős intenzitású csíkot mutat, valamint egy gyenge intenzitású, körülbelül 70-71 kDa méretű csíkot.
d) Az izoelektromos pont meghatározása
Előre elkészített gélt használunk, nevezetesen a Pharmacia által készített LKB Ampholine géllemezeket, a pH-tartomány 3,5-9,5, illetve 5-8 között változik.
Felviszünk 10 μΐ LKB standard fehérjét (a standard fehéijék izoelektromos pontja 3,5-9,5 között változik), valamint 4, illetve 8 pg tisztított urát-oxidázt (két külön csíkban).
óra 30 percen át futtatjuk 12V feszültség mellett 6 °C-on.
Ezután Coomassie Blue-val festjük (0,1%, 25% etanol, 8% ecetsav összetételű oldatban) a fehérjéket, ezt követően a fölösleges festéket eltávolítjuk egy 25% etanol-8% ecetsav összetételű oldattal (a háttér eltávolítása céljából).
Eredmények: Két egymás melletti csík figyelhető meg (duplett), izoelektromos pontjuk 8,1 és 7,9, mindkét sávban.
e) Kétdimenziós gélanalízis
A kétdimenziós gélanalízis lehetővé teszi, hogy a fehéijéket az első lépésben az izoelektromos pontjuk szerint válasszuk el, majd a második lépésben a molekulatömegük szerint.
Kísérleti leírás
Minta: tisztított urát-oxidáz-kivonat oldata glicin pufferben (20 mmol, pH=8,3).
A minta elkészítése
Két minta van, az egyik 5, a másik 10 pg urát-oxidázt tartalmaz.
A mintákat vákuumcentrifugálással beszárítjuk, majd
5 pl lízis pufferben vesszük fel, melynek összetétele a következő: 2,5 mol/1 karbamid, 2 térfogat% CHAPS [3(3-kolamido-propil)-dimetil-ammoniopropán-1 -szulfonát (SIGMA), Amfolinok 5-8 és 3,5-9 közötti pH-tartományban, valamint 5%-os merkapto-etanol.
Izoelektromosfokuszálógél
A következő oldatot készítjük el: 9,5 mól karbamid,
5% CHAPS, LKB Ampholinok (pH=3,5-9,5, 1%; pH=5-8,1%), akril-amid-biszakril-amid (28,4%/l ,7%), 3,5% végkoncentrációban, víz.
Az oldatot leszűrjük, gázmentesítjük, majd hozzáadunk 0,075% tetrametilén-diamint (Temed, Pharmacia) és 0,015% ammónium-perszulfátot.
Az oldatot 16x0,12 cm méretű csövekbe tesszük, majd éjszakán át szobahőmérsékleten hagyjuk polime60 rizálódni.
HU 215 948 Β
Katód oldat: NaOH 0,1 mol/1 gázmentesítve
Anód oldat: H3PO4 25 mmol/1
Előfüttatás 45 perc, 4 mA (feszültség
300 V-U000 V).
A mintákat a katódhoz helyezzük.
órán át futtatunk 1000 V feszültséggel 20 °C-on.
A géleket kivesszük a formákból, és 10 percig áztatjuk 20 °C-on egy pufferben, melynek összetétele a következő: TRIS 0,375 mol/1 pH=8,8, SDS 3%, ditiotreitol (DTT) 50 mmol/1.
PA GE/SDS denaturálógél
Egy akril-amid/biszakril-amid (30%/0,8%) 15%-os végkoncentrációjú oldat készítése TRIS—HC1 (pH=8,8) 0,375 mol/1 vizes pufferben.
Az oldat szűrése és gázmentesítése, ezt követően SDS (0,1%), ammónium-perszulfát (0,05%) és Temed (0,05%) hozzáadása.
Polimerizálás éjszakán át 4 °C-on (a gél mérete: 16x20x0,15 cm).
Egyensúlyba hozás után az izoelektromos fokuszálógélt a PAGE/SDS gélre helyezzük, azt követően agarózzal lezáijuk.
Elektroforézis puffer: TRIS-HC1 25 mmol/1 pH=8,3, glicin 0,192 mol/1, SDS 0,1%).
Futtatás 100 mA, 6 óra 6 °C.
A gélt 50%-os metanol, 10%-os ecetsav összetételű oldatban fixáljuk, ezt követően ezüst-nitráttal festjük [Blum, H., Electrophoresis, 8, 93-99 (1987)].
A gélt Visage 2000 képanalizátorral (Kodak) letapogatjuk az egyes foltok optikai sűrűségének és felületének meghatározása céljából, ebből pedig kiszámítjuk a foltok közötti mennyiségi arányt.
Meghatározzuk a fehérje molekulatömegét egy kétdimenziós gél készítésével, Amersham standard fehérjék jelenlétében.
Eredmények
Két folt figyelhető meg 33,5 kDa körül, az egyik a fő folt, izoelektromos pontja 8,0 körül van, intenzitása 5,2 (a fehérjék tömegének 93%-át képviseli), a másik a kis folt, izoelektromos pontja 7,4 körül van, intenzitása 0,41 (a fehérjék tömegének körülbelül 7%-át képviseli).
f) Az aminoterminális szekvencia és a blokkoló aminoterminális csoport tömegének meghatározása a) Az aminoterminális szekvencia blokkolt természetének igazolása
Az aminoterminális szekvenciát egy Applied Biosystems 470A szekvenátorral analizáltuk, amely egy Applied Biosystem 120A, fenil-tiohidantoin-származék elemzőhöz volt kapcsolva.
A tisztított urát-oxidázt (200 pmol, aminosavanalízissel ellenőrizve) a szekvenálóba visszük 20 ριηοΐβlaktoglobulin, egy standard fehéije jelenlétében.
Az urát-oxidáz-szekvenciának megfelelő aminoterminális szekvencia nem volt kimutatható (ezzel ellentétben, a standard fehéije aminoterminális szekvenciája meghatározható volt, jelezve, hogy a szekvenáló működik).
Tehát az Aspergillus flavus urát-oxidáz aminoterminálisa blokkolva van.
β) Egy 32 aminosavból álló aminoterminális peptid szekvenciájának, valamint az aminoterminális blokkolócsoport tömegének meghatározása.
Módszer: Emésztés brómciánnal
A tisztított urát-oxidáz-kivonatot gélszűrésnek vetjük alá Sephadex G25 gélen (PD10, Pharmacia) (a gélt dextrán epiklór-hidrines térhálósításával állítják elő), amelyet 7% hangyasavat tartalmazó oldattal hozunk egyensúlyba, ezzel lehetővé téve a sók eltávolítását és a pufferváltást. A hangyasav koncentrációját vákuumcentrifugálással 70%-ra növeljük. Ezután brómciánt adunk hozzá 0,2 mól végkoncentrációban, majd a folyamatot argonatmoszférában hagyjuk lejátszódni 20 órán át, a fényt kizárva, szobahőmérsékleten.
A fehérje brómciános emésztéséből származó peptidek elválasztása ioncserélő kromatográfiával A peptideket ioncserélő oszlopon választjuk el, amely mono S hidrofil gyanta alapú (Pharmacia).
A puffer: ammónium-acetát 10 mmol/1, pH=6,2 B puffer: ammónium-acetát 1 mol/1, pH=6,2 Áramlási sebesség: 0,6 ml/perc, a csúcsokat 278 nm-en való optikai denzitás mérésével mutatjuk ki. Gradiens: 0-100% B, 30 perc alatt, 1 ml-es frakciók szedésével.
Az ioncserélő lépésből származó frakciókat PAGE/SDS géllel vizsgáljuk Schagger és Von Jagow módszere szerint [Anal. Biochem., 166, 368—379 (1987)].
Az aminoterminális peptid tisztítása fordított fázisú
HPLC-vel, majd elemzése tömegspektrometriával
Az ioncserélő lépésből származó peptidet, melynek molekulatömege körülbelül 4000 Da (PAGE/SDS gélen), Beckman Altex Cl8 oszlopon tisztítjuk (250x2,1 mm), amely Cl8 ojtott szilikát alapú fordított fázisú HPLC-oszlop.
Áramlási sebesség: 0,3 ml/perc, a csúcsokat a 218 nmen mért optikai sűrűség alapján mérjük.
A puffer: H2O/0,l% TFA (trifluor-ecetsav)
B puffer: acetonitril/0,1% TFA Gradiens: 1-50% B 60 perc alatt.
Az első fordított fázisú HPLC-lépés után kinyert peptidet ugyanazon a fordított fázisú HPLC-oszlopon tisztítjuk, de eltérő gradienst alkalmazva.
Gradiens: l-50%B 10perc alatt.
Az összegyűjtött csúcsokat gyorsatom-bombázásos tömegspektrometriának vetjük alá (FAB/MS), glicerin+tioglicerin hordozó.
Az aminoterminális peptid emésztése kimotripszinnel, majd a fordított fázisú HPLC-vel tisztított kimotriptikus peptidek aminosavanalízise A fordított fázisú HPLC-vel tisztított peptid szekvenciájának a meghatározásához az említett peptidet kimotripszinnel emésztjük. A kimotriptikus peptideket fordított fázisú HPLC-vel választjuk el Beckman Altex Cl8 oszlopon (250x2,1 mm).
Áramlási sebesség: 0,3 ml/perc, a csúcsot a 218 nm-en mért optikai denzitás alapján azonosítjuk.
A puffer: H2O/0,ll%TFA
B puffer: acetonitril/0,08% TFA
Gradiens: 1-50% B 60 perc alatt, a csúcsok gyűjtésével.
HU 215 948 Β
A kimotriptikus fehérjéket aminosavanalízissel azonosítjuk Applied Biosystem analizátoron (420-130A modell).
Eredmények
Az alábbiakban ismertetett eredményeket, amelyeket az Aspergillus flavus urát-oxidáz cDNS-szekvenciájának meghatározása, valamint az ebből eredő aminosavszekvencia meghatározása után kaptunk, csak a következők fényében lehet megérteni:
Az aminoterminális peptid tömegspektrometriás analízise
Körülbelül 42 atomtömegnyi különbség figyelhető meg a tömegspektrometriával meghatározott két mole5 kulatömeg között, 3684 és 3666, valamint az alábbi szekvenciából meghatározott elméleti molekulatömeg között (az Aspergillus flavus urát-oxidáz cDNS-éből kikövetkeztetett aminosavszekvencia, az aminoterminális metionincsoport lehasításával, valamint az első metionincsoport után a peptid brómciános hasításával):
Ser Alá Val Lys Alá Alá Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Tűr Gly Val Gin Thr Val Tyr
Glu a karboxiterminális metionincsoport módosítva a brómciános reakcióval, amely vagy homoszerint (3642), vagy homoszerin-laktont eredményez.
Létezik egy blokkolócsoport az aminoterminális szerinen, amely felelős a 42 atomtömegnyi plusztömegért, ami valószínűleg megfelel az említett aminoterminális szerin acetilezésének (a CH3CO tömege mínusz a H tömege=42 atomtömegegység).
A kimotriptikus peptidek aminosavanalízise
Ez az analízis tette lehetővé, hogy egyértelműen igazoljuk, hogy a brómciános emésztéssel kapott aminoterminális peptid szekvenciája megfelel a fentiekben leírtaknak. Az urát-oxidáz komplett aminosavszekvenciáját az alábbiakban mutatjuk be.
Ser Alá Val Lys Alá Alá Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg. Val
Tyr Lys val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gin Thi' Val Tyr
Glu Hét Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser
Tyr Thr Lys Alá Asp Asn Ser Val Ile Val Alá Thr Asp Ser Ile
Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Alá Lys Gin Asn Pro Val Thr Pro
Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Fhe Ile Glu Lys
Tyr Asn His Ile His Alá Alá His Val Asn Ile Val Cys His Arg
Trp Thr Arg Hét Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro HiS Ser Phe
Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Val Gin Val ASp Val Val
Glu Gly Lys Gly Ile . Asp Ile Lys Ser Ser 1 Leu Ser Gly Leu Thr
Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Fhe Leu Arg Asp
Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr
Asp Val Asp Alá Thr Trp Gin Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gin
Glu Val Arg Ser His Val Fro Lys j Phe Asp Alá Thr Trp Alá Thr
Alá Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Alá Glu Asp Asn Ser Alá
Ser Val Gin Alá Thr Hét Tyr Lys Hét . Alá . Glu . Gin Ile Leu Alá
HU 215 948 Β
Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr
His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu
Thr Gly Lys Asn Alá Glu Val
Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val
Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys
Trp His Lys Gly Leu Gin Asn
Alá Pro Gin Ser Asp Pro Asn
Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys
Leu
5. példa
A baktériumok átvizsgálása
1. A jelzett próbák előállítása
Két, a fehéije aminosavsorrendjéből kikövetkeztetett próbakeveréket szintetizálunk egy Biosearch 4600 DNS-szintetizátorral. Az első keverék megfelel a His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp aminosavszekvenciának (a T27 szekvencia egy részlete), azaz az 5’—>3’ irányban:
A T G G G
TCGAT TC AA TA TG
T C A A A
Ez a keverék valójában 24 x 3 =48 különböző oligonukleotidot tartalmaz, és képviseli az összes lehetséges kombinációt. A második keverék megfelel a Gln-PheTrp-Gly-Phe-Leu aminosavszekvenciának (a V5 szekvencia része), azaz az 5’—>3’ irányban:
GG A G T
A AAGCCCCA AA TG
AA C A C
T
Ez a keverék 24 x 4= 64 kombinációt tartalmaz. A próbákat a terminális dezoxinukleotid transzferáz enzimmel jelöljük (TdT, gyártja az IBI Inc.).
A reakciót 100 ng oligonukleotid-keverék oldatán hajtjuk végre (100 mg/ml) „Cobalt” reakciópufferben (10-szeres töménységű koncentrátum formájában árulja az IBI Inc.): 1,4 mól kálium-kakodilát pH = 7,2, 300 mmol/1 ditiotreitol, 1 μΐ terminális dezoxinukleotid transzferáz enzim (IBI Inc.), valamint 50 pCi dezoxicitidil-trifoszfát (dCTP), P32-vel jelezve. A reakciót 37 °C-on hajtjuk végre 10 percig, majd 1 μΐ 0,5 mólos EDTA hozzáadásával állítjuk le. Egy fenolos extrakciót végzünk, majd az extraktumot Biogel P10 poliakrilamid-oszlopon dializáljuk (Biorad: 150-1050).
2. Az urát-oxidáz cDNS-t tartalmazó telepek hibridizálása és kimutatása
Körülbelül 40 000 telepet vizsgálunk át in situ hibridizációs technikával [Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok, 72, 3961 (1975)]. Körülbelül 6000 baktériumsejtet szélesztünk ki Petri-csészékre oly módon, hogy izolált telepeket adjanak. Miután 24 órán át 37 °C-on inkubáltuk, mindegyik Petri-csészét 2 szűrőlapra replikázzuk azzal a céllal, hogy a két keverékpróba közül az egyikkel kezeljük, így az összes kapott telepet párhuzamosan vizsgáljuk a két keverékpróbával.
A szűrőlapokat a két keverékpróba közül az egyikkel hibridizáljuk a következő összetételű pufferben 6xSSC, lOxDenhardt-oldat és 100 pg/ml ultrahanggal összetört és denaturált heringsperma DNS (SIGMA). A hibridizációt 16 órán át végezzük 42 °C-on. A 6 χ SSC-oldatot a 20xSSC-oldat hígításával kapjuk. A 20xSSC-oldat készítését Maniatis, Fritsch and Sambrook írják le (i. m.). Összefoglalva, ez a puffer 175,3 g NaCl-t és 88,2 g/1 nátrium-citrátot tartalmaz, pH-ját néhány csepp 10 normál NaOH-val 7-re állítjuk. A lOxDenhardt-oldat tartalmaz 1 g Ficoll-t, 1 g polivinil-pirrolidont és 1 g humán szérumalbumint 500 ml végtérfogatban.
Miután a szűrőket 6 χ SSC-oldatban mossuk 42 °Con (3 óra, 5 fürdőcsere), letöröljük Joseph-papírral, és autoradiográfiának vetjük alá. A szűrőket 16 óra elteltével hívjuk elő. A telepek körülbelül 0,5%-a hibridizált a két keverékpróbával.
Ebből a frakcióból 5 telepet választunk ki, és megtisztítjuk. Mindegyik említett telepből izoláljuk a plazmid DNS-t, majd ezt a DNS-t elemezzük BamHI, Hindlll vagy BamHI és Hindlll enzimekkel együttesen emésztve.
Agarózgélen végzett analízis után úgy találtuk, hogy a kapott 5 plazmidot a BamHI és Hindlll enzimek linearizálják. A dupla emésztések hatására egy olyan fragmens szabadult fel, amely megfelel a teljes klónozott cDNS-nek. Ennek a fragmensnek a mérete körülbelül 1,2 kb 3 esetben, és körülbelül 0,9 kb a másik 2 esetben. Az ezt követő meghatározás céljára az egyik 0,9 kb méretű ffagmenst és az egyik 1,2 kb méretű ffagmenst kiválasztjuk és újra klónozzuk (lásd az alábbi, 6. példát).
6. példa
Az urát-oxidáz cDNS szekvenciájának meghatározása
Az egyik 0,9 kb méretű fragmens (9A klón) és az egyik 1,2 kb méretű fragmens (9C klón) az Ml3 egyszálú fág replikatív formájában klónozzuk. Az M13 kiónok DNS-ét, amely vagy a 0,9 kb méretű, vagy az 1,2 kb méretű ffagmenst tartalmazza, exonukleázzal emésztjük, hogy átfedő Ml3 kiónokat kapunk („Cyclone I Biosystem” eljárás, IBI). Az említett kiónokat didezoxi-nukleotid módszerrel szekvenáljuk [Sanger et
HU 215 948 Β al., Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok, 14, 5463-5467(1977)].
A 9C klón nukleotidszekvenciáját a 3. ábrán láthatjuk, amelyen nyíllal jelöljük a 9A klón kezdetét, majd egy csillaggal * a 9A klón szekventált nukleotidjainak azt a részét, amely nem azonos a 9C klón megfelelő nukleotidjaival (ha illesztjük a két szekvenciát, és az Acél, valamint a BamHI restrikciós helyeket használjuk a következő konstrukciókban [lásd 10. példa]).
Az tapasztaltuk, hogy
- a hosszabb fragmens (9C klón) nukleotidszekvenciája átfed a rövidebb fragmensével (9A klón), de két különbség van (lásd 3. ábra). Az egyik különbség nem okoz változást, de a másik különbség hatására az egyik triptofán glicenre változik. Ezek a különbségek származhatnak az izolált messenger RNS-ekből (lásd a fenti 2. példa), vagy a cDNS-könyvtár elkészítésekor használt reverz transzkriptáz reakció hibáiból (lásd az előző 3. példa). Az Aspergillus flavus urát-oxidáz genomiális DNS-ének szekvenálása lehetővé tette, hogy feloldjuk ezt a bizonytalanságot: ez egy triptofáncsoport (ezért valószínűleg a reverz transzkriptáz reakció a hibás).
A hosszabb fragmens esetében egy ATG-kodon (a
3. ábrán a 109-es pozícióban van) egy 302 aminosavból álló polipeptidnek megfelelő nyitott leolvasási keretet indít, amely polipeptid molekulatömege körülbelül 34240 Da, szekvenciája pedig megfelel a tisztított Aspergillus flavus urát-oxidáz részleges szekvenciájának (lásd 4. példa).
A 4. ábrán az ATG-kodonnal induló DNS-szekvenciát és az általa kódolt polipeptidet látjuk, majd a kódolt polipeptiddel szembeni nyilakkal jelezve az Aspergillus flavus urát-oxidáz tripszines és V8 proteázos hidrolízisével kapott szekvenált peptideket (lásd 4. ábra).
Azt találtuk, hogy a polipeptidszekvencia Ser-LysLeu triplettel végződik, ami tipikus a peroxiszomális elhelyezkedésű enzimek esetében [Gold S. J. et al., J. Cell Biology, 108, 1657-1664 (1989)].
7. példa
Expressziós vektor készítése az urát-oxidáz cDNS expresszálására
Előállítjuk a p466 vektort, amely egy E. coli expressziós vektor. Tartalmaz egy pBR327 fragmens (replikációs origó és ampicillinrezisztencia gén); tartalmaz egy szintetikus E. coli promotert [R. Rodriguez and M. Chamberlain, „Promoters-Structure and function, Preager, (1982)], egy Shine-Dalgamo-szekvenciát, majd ezt követően egy polilinkert, benne az egyedülálló Ndel és Kpnl hasítási helyekkel, egy transzkripciós terminátort (az fd fágból származik) és a lac i gént.
Ezt a plazmidot a hGH E. coliban való expreszszálására készített expressziós plazmidból (p462) állítjuk elő, a hGH gént hordozó fragmens az urát-oxidáz cDNS-sel helyettesítve.
A p466 plazmid előállítását a továbbiakban részletesen ismertetjük, és hivatkozunk az 5., 6., 7., 8. és 9. ábrákra.
Az 5. ábrán a pl63,1 plazmid restrikciós képét látjuk. A különböző restrikciós szakaszokat önkényesen jelöljük, és az alábbi magyarázattal látjuk el:
- A pBR322 plazmidból származó
-------------- DNS-szegmens
A replikációs origó helye
A7777T,
- A hGH természetes prekurzorát kódoló
- szekvenciát tartalmazó DNS-szakasz , ~ .—- Az fd fág transzkripciós terminátorát tar-L—- talmazó DNS-szakasz
Egy triptofán-laktóz UV5 hibrid promoter-operátort tartalmazó DNS-szakasz
-¾¾¾¾¾ β-laktamázt kódoló DNS-szakasz (ApR:
itsiJSíSi- ampicillinrezisztencia)
A 6. ábrán a pl 60 plazmid restrikciós térképét látjuk, a PvuI-XhoI-BamHI(l) és a PvuI-ORI-BamHI(2) fragmensek a pl63,1, illetve a pBR327 plazmidból származnak, amelynek a kis BamHI(2)-BamHI(l) frag20 mense az alábbiakban ismertetendő 3-as fragmens.
A 7. ábrán a p373,2 plazmid restrikciós térképét látjuk. A különböző restrikciós szakaszokat önkényesen jelöljük, és az alábbi magyarázat tartozik hozzájuk:
A pBR327 plazmidból származó 25 Pvul-BamHI szekvencia
- A p 162,1 plazmidból származó
------------ Pvul-Xhol szekvencia , A pl63,1 plazmidból származó ////Πt L. Xhol-HincII szekvencia
Az alábbiakban ismertetendő 4-es fragmens (HincII) Clal Ndel PstI 35 QooóoeoooQo y ·,' 'i / v' Az alábbiakban ismertetendő 3-as ' fragmens ————— Az fd fág transzkripciós terminátorát tar-L—- talmazó DNS-szakasz
A 8. ábrán a p462 plazmid restrikciós térképét látjuk, az alábbiakban meghatározandó szintetikus BGlII-HindlII fragmenst a következőképpen jelöljük:
A 9. ábrán a p466 plazmid restrikciós térképét mutatja, amelyen az urát-oxidázt kódoló Ndel-KpnI fragmenst a következőképpen jelöljük:
Δ A AAA A A A A A
1. A p373,2 plazmid előállítása Az alkalmazott stratégia széles körben elérhető, létező plazmidokból nyert fragmenseket alkalmaz, valamint szintetikus fragmenseket, amelyeket általánosan használt technikákkal állítunk elő. A klónozó technikák a T. Maniatis. E. F. Fritsch and J. Sambrook által leírtak [Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Az oligonukleotidokat egy Biosearch 4600 DNS-szintetizátorral ál60 lítjuk elő.
HU 215 948 Β
A pl63,1 plazmidot (5. ábra), amelyet a 0245138 számú európai szabadalmi bejelentésben írtunk le, és a CNCM-törzsgyűjteménynél helyeztük letétbe 1-530 sorszám alatt 1986. február 17-én, Pvul és BamHl restrikciós enzimekkel emésztjük. Ez a plazmid tartalmazza a hGH-t kódoló gént. A Pvul-BamHI fragmenst - a továbbiakban 1-es fragmenst -, amely tartalmazza az Xhol restrikciós enzim hasítási helyét és az 5. ábrán látható, megtisztítjuk.
Hasonlóképpen, a pBR.327 plazmidot, amely a szakemberek számára jól ismert (Soberon, X. et al., Gene, 9,
287-305 (1980)], Pvul és BamHl restrikciós enzimekkel emésztjük. A Pvul-BamHI fragmens - a továbbiakban 2-es fragmens -, amely tartalmazza a replikációs origót, megtisztítjuk.
Ezután a 3-as fragmenst állítjuk elő; ez egy szintetikus BamHI(l)-BamHI(2) fragmens, amely tartalmazza a lac i gént és promoterét, és szekvenciája az alábbiakban látható. A szekvenciában a szálak két végét 1-es, illetve 2-es számmal jelöljük, hogy meghatározzuk a 6.
és 7. ábrákon leírt plazmidokban az orientációját:
3-as fragmens
BamHI(l)
GATCC GCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT
GAGCTAACTC ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG
GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA
GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CCAGGGTGGT TTTTCTTTTC ACCAGTGAGA
CGGGCAACAG CTGATTGCCC TTCACCGCCT GGCCCTGAGA GAGTTGCAGC
AAGCGGTCCA CGCTGGTTTG CCCCAGCAGG CGAAAATCCT GTTTGATGGT
GGTTGACGGC GGGATATAAC ATGAGCTGTC TTCGGTATCG TCGTATCCCA
CTACCGAGAT ATCCGCACCA ACGCGCAGCC CGGACTCGGT AATGGCGCGC
ATTGCGCCCA GCGCCATCTG ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CAGTGGGAAC
GATGCCCTCA TTCAGCATTT GCATGGTTTG TTGAAAACCG GACATGGCAC
TCCAGTCGCC TTCCCGTTCC GCTATCGGCT GAATTTGATT GCGAGTGAGA
TATTTATGCC AGCCAGCCAG ACGCAGACGC GCCGAGACAG AACTTAATGG
GCCCGCTAAC AGCGCGATTT GCTGGTGACC CAATGCGACC AGATGCTCCA
CGCCCAGTCG CGTACCGTCT TCATGGGAGA AAATAATACT GTTGATGGGT
GTCTGGTCAG AGACATCAAG AAATAACGCC GGAACATTAG TGCAGGCAGC
TTCCACAGCA ATGGCATCCT GGTCATCCAG CGGATAGTTA ATGATCAGCC
CACTGACGCG TTGCGCGAGA AGATTGTGCA CCGCCGCTTT ACAGGCTTCG
ACGCCGCTTC GTTCTACCAT CGACACCACC ACGCTGGCAC CCAGTTGATC
GGCGCGAGAT TTAATCGCCG CGACAATTTG CGACGGCGCG TGCAGGGCCA
GACTGGAGGT GGCAACGCCA ATCAGCAACG ACTGTTTGCC CGCCAGTTGT
TGTGCCACGC GGTTGGGAAT GTAATTCAGC TCCGCCATCG CCGCTTCCAC
TTTTTCCCGC GTTTTCGCAG AAACGTGGCT GGCCTGGTTC ACCACGCGGG
AAACGGTCTG ATAAGAGACA CCGGCATACT CTGCGACATC GTATAACGTT
HU 215 948 Β
3-as fragmens (folytatás)
ACTGGTTTCA CATTCACCAC CCTGAATTGA CTCTCTTCCG GGCGCTATCA
TGCCATACCG CGAAAGGTTT TGCGCCATTC GATGGTGTCC G
Az 1,2,3-as fragmenseket ezután összeligáljuk, így kapjuk a pl60-at, amely a 6. ábrán látható.
Ez a plazmidot részlegesen emésztjük HincII és PstI restrikciós enzimekkel. A nagy HincII-PstI fragmens, amely a replikációs origót tartalmazza és a 6. ábrán
BamHI(2) látható, ezután a 4-es fragmenssel ligáljuk (alább mutat10 juk meg), amely egy szintetikus DNS-fragmenst, a hGH természetes prekurzorának első 44 aminosavát kódoló szekvenciát tartalmaz, majd ez előtt a szekvencia előtt szabályozó szekvenciákat.
4-es fragmens
Ctal v
5' TCGAGCTGACTGACC'G TÍGCTTATATTACATCGA
TAGCGTATAATGTGTGG ι'*jCιCGnC TG»tCΓ G G A C Λ A C G η η Γ Λ1 Λ Λ T G Τ n G C T
Δ üdéi
....................... _ _ 7 \TtGTGfv.*.Cu»OV*.Cr*>tt i *enCn^í/Gl * ImaCTÍ oxAGAAGG.aGAi ΑΤΑΓΑ.Τ
Λ ΐ CC-ΛΐΛΤ TACACACC HAACAC TCGCC TATTGTTA;
v >G íb TG T C.1 v
ATTGAAATTCTÍCCTCTAIATGTA
ATG GCT ACC GGA TCC CGG ACT AGT C
CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG
TAC CGA TGG CCT AGG GCC TGA TCA GAC GAG GAC CGA ΛΑΑ CCG GAC GAC ACG GAC
A
H A T G S R I 5 L L L Λ F G L L C L
Xbal
CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC TÍC CCA ACC ATT CCC ΤΤΛ 1CT AGA CIT TTT
GGG ACC GAA GTT CTC CCG TCA CGG AAG GGT TGG ΤΑΛ GGG ΛΛΤ AGA TCT GAA Λ.ΑΛ PWLQEG5AFPIIPLSRLF
-1 1
HU 215 948 Β
4-es fragmens (folytatás)
GAC AAC GCT A'FG CTG GGC GGC CAF CGI C Hi CAC CAG CFG GCC 1FF GAC ACC iAC
CTG TTG CGA TAC GAG GCG CGG GTA GCA GAC CFG GFC GAC CGG ΛΛΛ CFG TGG ATC Ο Μ A rl L P. A H R L H (1 L A F L T Ϊ i’St 1
CAG GAG TTT GAA GAA GCC ΓΛΓ ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA UC C1G CA
GTC C1C fM\ CTT CTT CGG ΛΙΛ TAG GGT FFC Cl I C,1C FTC Α1Λ Λ5Τ AAG G Π E F U E A '( 1 1’ ·< C FI ·< Y 5 F
AA
Ebben a fragmensben az aminosavakat betűk jelölik, az alábbi kód szerint:
A=alanin M=metionin
C=cisztein N=aszparagin
D=aszparaginsav P=prolin
E=glutaminsav Q=glutamin
F=fenil-alanin R=arginin
G=glicin S=szerin
H=hisztidin T=treonin
1=izoleucin V=valin
K=lizin W=triptofán
L=leucin Y=tirozin
Clal
A promoter szekvenciának a szakember számára jól ismert -35-ös (TTGCTT) és -10-es (TATAAT) szekvenciáit, valamint a Shine-Dalgamo-szekvenciát a fragmensen aláhúzzuk.
Ily módon kapjuk a p38O,l plazmidot.
A p380,l plazmidot ezután a Clal és Ndel restrikciós enzimekkel emésztjük abból a célból, hogy eltávolítsuk belőle a fenti 4-es fragmensből származó kis Clal-Ndel fragmenst, és helyettesítsük az alábbi
Clal-NDEI fragmenssel:
3' CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA
TATCGCATATTACACACCTTAACACACGCCTATTGT
Ndel
ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGGAGATATACA
TAAAGTGTGTCAAAAAGCGCTTCTTCCTCTATATGTAT 5' így kapjuk a p373,2 plazmidot (7. ábra).
2. A p466 plazmid előállítása A p373,2 plazmidot kettős emésztésnek vetjük alá
BglII és Hindlll enzimekkel. Az ebből az emésztésből származó nagy fragmenst megtisztítjuk és egy szinteti50 kus DNS-fragmenssel ligáljuk, amelynek a szekvenciáját az alábbiakban mutatjuk be. A ligálás célja, hogy a hGH gén végét helyreállítsuk, és a 3’ véget kövesse egy Kpnl és SnaBI klónozóhely.
HU 215 948 Β
Β l
I
I
GA'TCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT
----+---------+----.-----+---------+---------+ aagttcgtctggatgtcgttcaagctgtgtttgagtgtgttgcta
GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTC
CTGCGTGATGAGTTCTTGATGCCCGACGAGATGACGAAGTCCTTCCTGTACCTGTTCCAG
F s
15
I
GAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGTAA ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
CICTGTAAGGACGCGTAGCACGTCACGGCGAGACACCTCCCGTCGACACCGAAGATCATT
K
P n
I
H i
S n n d a I
Β I
I _I_
GGTACCCTGCCCTACGTACCA
---------+---------+----30 CCATGGGACGGGATGCATGGTTCGA
Ez a fragmens tartalmazza a BG1II és HindlII tapadós végeket. Az ily módon keletkezett új plazmid, a p462 (lásd 8. ábra) tartalmaz tehát egy KpnI és egy Ndel hasítási helyet, amelyet az expressziós vektorban az urát-oxidáz cDNS fragmens klónozására használunk.
A pTZ19R-ből származó hibrid plazmid, amely a körülbelül 1,2 kb méretű urát-oxidáz cDNS-t tartalmazza (9C klón, lásd a 3. példát), egy egyedülálló Kpnlhellyel rendelkezik. Ez a hasítási hely néhány bázispárral a cDNS-klónozó hely után helyezkedik el. Az urát-oxidáz cDNS emellett tartalmaz az 5’ vég közelé50 ben egy AccI hasítási helyet.
Az AccI-KpnI fragmenst, amely ennek a cDNS-nek a legnagyobb részét tartalmazza, ezután izoláljuk és tisztítjuk. Két komplementerszekvenciát is szintetizálunk, amelyeknek a szekvenciáját az alábbiakban adjuk meg:
S'-TATGTCTGCGGTAAAAGCAGCGCGCTACGGCAAGGACAATGTTCGCGT
ACAGACGCCATTTTCGTCGCGCGATGCCGTTCCTGTTACAAGCGCAGA-5'
HU 215 948 Β
Ezekkel helyreállítjuk a cDNS 5’ szekvenciáját. Az így előállított szintetikus fragmens egy Ndel és egy másik AccII hasítási hellyel rendelkezik. A fragmenst és a szintetikus szekvenciát KpnI és Ndel restrukciós enzimekkel hasított expressziós vektorba ligáljuk. Ez a háromfragmenses ligálás teszi lehetővé a p466 expressziós vektor előállítását, urát-oxidáz E. coliban való előállítására (lásd 9. ábra). Ezt a plazmidot több enzimatikus emésztésnek vetjük alá restikciós enzimekkel, ami lehetővé teszi a várt restrikciós hasítási helyek jelenlétének igazolását, főleg azokét, amelyeket az urát-oxidázt kódo5 ló gén hordoz.
Ennélfogva a p466 plazmid tartalmaz egy alábbi szekvenciával leírható, urát-oxidázt kódoló gént:
ATGTCTGCGG T AAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAAT3 TTCGCGTCTA
CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA
CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG < GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGGC
GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT
CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC
TGG3CACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC
AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGAC3 GCAAGCCACA
CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTG3
ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG
ACCGTGCTgA AuAGc ACu AA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA
gTágACgAg A CTTAAGGAGA CCTGGGACC3 TATCCTGA3C ACCGACGTCG
ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTTCAGGA GGTAAGCTCG
CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT
GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA
AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG
TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA
GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG
ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT
AAATTG.
(A fenti szekvenciában azokat a nukleotidokat húzzuk alá, amelyek eltérnek az Aspergillus flavusból izo- 50 Iáit cDNS szekvenciájától. Ezeket a különbségeket a szintetikus AccI-KpnI szekvenciával vittük be, azért, hogy az ATG után egy olyan nukleotidszekvenciát kapjunk, amely jobban megfelel a prokarióta génekben általában előforduló szekvenciáknak.)
8. példa
Az urát-oxidáz cDNS expresszálása
Az E. coli K12 RR1 törzset (Bethesda Research
Láb. Inc.) a p466 plazmiddal, valamint negatív kont- 60 rollként a pBR322 plazmiddal ampicillinrezisztenssé transzformáljuk. Mindkét esetben kapunk ampicillinrezisztens telepeket. Mindegyik típusból egy ampicillinrezisztens telepet folyékony táptalajban tenyésztünk (LB + 100 μg/ml ampicillin). Miután egy éjszakán át 37 °C-on kevertettük, a két tenyészetet 100-szorosra hí55 gítjuk a táptalajban (LB+100 μg/ml ampicillin). Miután egy órán át tenyésztettük, 1 mmol/1 IPTG-t adunk hozzá 3 órára.
Az urát-oxidáz detektálása immunológiai módszerekkel (Western biot):
HU 215 948 Β
1. Az eljárás
A tenyészléből a háromórás IPTG-s indukciót követően kiveszünk egy alikvot részt, amely megfelel 0,2 ml OD= 1-nek. Ezt az alikvot részt lecentrifugáljuk, majd a felülúszót eltávolítjuk. A maradékot azután alávetjük a Western biot eljárásnak - ez egy jól ismert technika a szakterületen jártas szakemberek számára -, amely a következő lépésekből áll:
- a maradékot szolubilizáljuk, 10 percig forralva egy pufferben, ennek neve felvivőpuffer, összetétele: 0,125 mol/1 TRIS-HC1 pH = 6,8, 4% SDS, 0,002% bróm-fenolkék, 20% glicerin, 10% β-merkapto-etanol, a Laemmli által ismertetett kísérleti eljárás szerint [U. K. Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1980)], és
- a gélben levő említett fehérjéket nitro-cellulózszűrőre visszük át, a H. Towbin és munkatársai által leírt technikával [Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok, 76, 4350-4354 (1979)].
Az immunológiai kimutatás, Bumette technikája alapján [W. W. Burnette, Anal. Biochem., 112, 195-203 (1981)], a következő lépésekből áll:
- a nitro-cellulóz-szűrőt 10 percig mossuk A pufferrel (TRIS-HC110 mmol/1, NaCl 170 mmol/1, KC11 mmol/1);
- a nitro-cellulóz-szűrőt 37 °C-on három órára érintkezésbe hozzuk a B pufferrel (A puffer, 3 g/100 ml mennyiségben kiegészítve szarvasmarha-szérumalbuminnal).
- a nitro-cellulóz-szűrőt 37 °C-on egy órára érintkezésbe hozzuk egy immunszérummal (az Aspergillus flavus urát-oxidázt felismerő poliklonális antitestek);
- a nitro-cellulóz-szűrőt 37 °C-on egy órára érintkezésbe hozzuk protein G oldattal, amely 125I-vel van jelezve 0,1 mikrocurie/ml arányban;
- a szűrőt A pufferrel mossuk;
- a szűrőt két folyadékfelszívó papírlap között szárítjuk;
- a szűrőt röntgenfilmre fektetjük; és
- előhívjuk a filmet.
2. Eredmények
Az találtuk, hogy a p466 plazmiddal transzformált törzs nagy mennyiségben termel egy fehéijét, melynek látszólagos molekulatömege körülbelül 33 kDa, az Aspergillus flavus urát-oxidáz elleni antitestek felismerik, és hiányzik a kontrol ltörzsből.
9. példa
Az urát-oxidáz-aktivitás vizsgálata
Az előző példában ismertetett tenyésztési körülmények között IPTG-vel indukált tenyészléből 0,5 ml OD= 1-nek megfelelő alikvot részt veszünk ki. Ezt az alikvot részt lecentrifugáljuk, és a felülúszót eltávolítjuk. A maradékot 1 ml TEA (trietanol-amin) pufferben vesszük fel (0,05 mol/1, pH = 8,9). A sejtszuszpenziót kétszer 30 másodpercig ultrahanggal besugározzuk jég között, W10 ultrahangos besugárzóval (8-as erősség, 4es intenzitás). A sejtkivonatokat ezután lOOOOxg-vel centrifugáljuk 10 percig, majd a felülúszókat használjuk a vizsgálatban.
A fenti műveleteket p466 plazmiddal transzformált E. coli K12 telepek közül véletlenszerűen kiválasztott telepekkel végezzük (Ab Bb C, és Di), valamint egy pBR322-vel transzformált teleppel.
1. Elmélet
A húgysav allantoinná való konverzióját a 292 nmen mért abszorbancia csökkenése követi. A reakciót az I-es reakcióegyenlet írja le.
2. Reagensek
a) TEA 0,05 mol/1 pH=8,9/EDTA puffer
- 7,5 g TEA-t (analitikai reagens, Prolabo, ref. 287.46.266) oldunk 400 ml desztillált vízben;
- 0,372 g Komplexon ΠΙ-at (Merch, ref. 8418) oldunk 50 ml desztillált vízben;
- a két oldatot egyesítjük, és 500 ml-re töltjük fel (1-es oldat);
- az elkészült oldat pH-ját 8,9-re állítjuk, 0,2 normál sósavval;
- az oldatot desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel (2-es oldat).
b) Húgysav törzsoldat
- 1000 mg húgysavat (Calbiochem. ref. 6671) oldunk 50 ml 1-es oldatban;
- az oldat pH-ját 0,2 normál sósavval 8,9-re állítjuk; és
- az elkészült oldat térfogatát desztillált vízzel 100 ml-re töltjük fel.
A kapott oldatot egy hétig tárolhatjuk 4 °C-on.
c) Uronsav szubsztrátoldat
- 1,5 ml uronsav törzsoldatot (Calbiochem, ref. 6671) 100 ml-re hígítunk TEA pufferrel (analitikai reagens, Prolabo ref. 287.46.266).
Az oldatot a készítés napján el kell használni.
3. Az eljárás
A következő térfogatú oldatokat juttatjuk bele egy 292 nm-re állított és 30 °C-on inkubált spektrofotométer kvarcküvettájába:
- 600 μΐ uronsav szubsztrátoldat (előmelegítve 30 °C-ra) és
- 100 μΐ a fenti felülúszókból, amelyekhez 200 μ] TEA puffért (pH=8,9) adtunk (előmelegítve 30 °C-ra).
Összekeverés után az optikai sűrűség változását 5 percig 30 másodpercenként leolvassuk. Ezekből a leolvasásokból számítjuk ki E-t, az optikai sűrűség percenkénti változását.
4. Eredmények
Az urát-oxidáz enzimaktivitást (A, U/ml OD 1 egységben kifejezve) az E mérésekből számítjuk ki, a következő képlet segítségével :
/\E x Vr x d
A:31 X VpE ahol Vr, d, I és VPE szimbólumok jelentése a reakciótérfogat (0,9 ml), a hígítás! faktor (2), az uronsav extinkciós koefficiense 292 nm-en (12,5), valamint a vizsgált minta térfogata (0,1 ml).
A kapott eredményeket a ΙΙ-es táblázatban foglaljuk össze:
HU 215 948 Β
II. táblázat
Plazmiddal transzformált E. coli KI2 törzs (Jrát-oxidáz-aktivitás (U/ml Δ 1)
pBR322 <0,001
p466 A, telep 0,086
B| telep 0,119
C| telep 0,135
D, telep 0,118
A fenti táblázat világosan mutatja, hogy a p466 plazmiddal transzformált E. coli sejtek képesek urát-oxidázaktivitást termelni IPTG jelenlétében.
10. példa
Három expressziós vektor készítése az urát-oxidáz cDNS-hez élesztőben: a pEMR469, pEMR473 és pEMR515 plazmidok
Az alkalmazott stratégia széles körben elérhető, létező plazmidokból nyert ffagmenseket alkalmaz, valamint szintetikus fragmenseket, amelyeket általánosan használt technikákkal állítunk elő. A klónozó technikák a T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook által leírtak [Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Az oligonukleotidokat egy Biosearch 4600 DNS-szintetizátorral állítjuk elő.
Az alábbi leírás világosabban érthető a 10., 11., és 12. ábrák alapján, amelyek a pEMR414, pEMR469, illetve a pEMR473 plazmidok restrikciós térképeit mutatják. Az ezeken az ábrákon alkalmazott jelölések jelentését az alábbi leírásban adjuk meg. Abban az esetben, amikor egy hasítási helyet Klenow-polimeráz I segítségével tettünk tompa végűvé, ez a indexet viseli; ahol a restrikciós hasítási helyeket ligálással elimináltuk, ezeket zárójel mutatja.
1. A pEMR469 plazmid előállítása
Ezt a plazmidot a pEMR414 E. coli élesztő ingázó vektorból állítjuk elő, a következő komponensek egymás után történő ligálásával :
- a pJDB plazmid [Beggs, Genetic Engineering, 2, Gene cloning in yeast, 175-203, Williamson-Academic Press-London UK (1978)] Pstl-HindlII’ fragmense, jelzése ±±±±± a 10. ábrán, amely a pBR322 AmpR ampicillinrezisztencia gén 5’ végét tartalmazza [Sutcliffe, Cold Spring Symp. Quant. Bioi., 43, 779 (1979)], valamint egy endogén 1 μ-os fragmenst (B forma), amely a
S. cerevisiae LEU2 génjét tartalmazza, olyképpen módosítva, hogy a promotere ki van vágva belőle (neve Leud2d), az STB-lókuszt (REP3), valamint a 2 μ-os fragmens replikációs origóját [Hartley and Donelson, Natúré, 286, 860-865 (1980)]. Ennek a fragmensnek a Hindlll végét Klenow-polimerázzal tompa végre alakítjuk. Ennek jele Hindlll’ a 10. ábrán;
- az élesztő V-ös kromoszómája HindlII-Smal fragmense, jele /////. a 10. ábrán, amely tartalmazza az URA3 gént a promoterével együtt [Rose et al., Gene, 29, 113-124 (1984)]. Ez a Hindlll-Smal fragmens a pFLl plazmidból származik [Chevallier et al., Gene, 77, 11-19 (1980)]. Ennek a plazmidnak a Hindlll végét Klenow-polimerázzal tesszük tompavégűvé;
- egy Saml-BamHI fragmens - jele ΕΣΣΣΣΕ a 10. ábrán, amely az ADH2 gént promoterének szintetikus verzióját tartalmazza, ez csak néhány bázisban tér el a természetes verziótól, amelyet Russel és Smith írt le [Russel et al., J. Bioi. Chem., 258, 2674-2682 (1983)]. A módosítás célja restrikciós helyek kialakítása volt. (A természetes verzió alkalmazása enyhén eltérő eredményeket ad.) Ennek a fragmensnek a szekvenciáját az alábbiakban adjuk meg:
HU 215 948 Β
S Μ m 1 a u
I 1 TGGGACGCG7C7 CC7C7GCCGGAACACCGGGCATC7CCAAC7 7A7AAG77 GGAG
-------*---------*---------4------------------------·_ CCC7GCGCAGAGGAGACGGCC7 7G7GGCCCG7AGAGGT 7G.AATA7 7 CAACCTC ppg TAAGAGAA7 T 7CAGA7 7GAGAGAA7 GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGC AGAGGAGA ________________________________·-------------------------10 777A77C7CT7AAAG7C7AACTC7C77ACT7777777777777777777CCG7C7CCTCT
S
P
h.
i
GC AT AGAAATGGGG7 TCAC 7 Τ 7 Τ 7 GG7 AAAGCT AT AGC AT GCCT AT C AGAT ΑΤΑΑΑΤ AGA -------------4---------♦---------»---------♦---------»-----15 CG7A7C7 7 TACCCGAAG7 GAAAAACCA7 Τ TCGA7 A.TCG'T ACGGAT AGTGT AT AT 7 7 ATC Τ
G7GCCAGTAGCGACT777 7TCACAC7CGA3ATACTCT7ACTAC7GC7C7C7TG7 7G7TTT ___4---------*------------------------------*---------------CACGG7CATCGC7GAAAAAAG7G7GAGC7C7 A7GAGAA7 GAT GACGAGAGAACAACAAAA 7A7CAC7 TCT Τ GT 7 7 C7 7 C 7 7GG7 AAA7 AGAAT ATC AAGCT ACAAAAAGC AT AC AA7 C AA _______________________4____________________________________
AT AGT GAAGAACAAAGAAGAACC AT 7 T A C 7 T AT AG7 7 CG AT GT 1 7 7 7 CG T AT GT T AGT T 3
C a m
a H
I 1 25 CTA7CAACTATTAACTATA7CGA7ACCATA7 GGATCCGT CGAC TC Τ AGAi/gaTCGTC ___*---------4---------4-------------------4---------4--G AT AG7 7GAT AAT TGAT AT AGC7 A TGGT AT ACC T AGGCAGC TGAGA TC T CC 7 AGCzIG
Π
H
I
GACTCTAGAGt ctgac-atctcctag
- a BglII-HindlII fragmens - jelzése a
10. ábrán, amely az élesztő PKG gén 3’ végét tartalmazza. Ez a fragmens az élesztő kromoszomális DNS PGK gént hordozó HindlII fragmense [Hitzeman et al., Nucleic Acids Rés., 10, 7791-7808 (1982)] BglII restrikciós enzimmel való teljes emésztéséből származik, amelynek csak egy BglII hasítási helye van. Ezzel az emésztéssel válik lehetővé két HindlII-BglII fragmens előállítása, amelyek közül a kisebbet, mérete körülbelül 0,4 kb, és az élesztő PGK génjét hordozza, izoláljuk. Ennek a fragmensnek a szekvenciáját Hitzemaim és munkatársai közlik (i. m.). A BglII helyet az előző fragmens BamHI helyére klónozzuk (ezért a BamHI és BG1II helyek eltűnnek), majd a HindlII helyet, Klenowpolimerázzal tompavégűvé alakítása után az alábbiakban ismertetett pBR322 Pvul-PstI fragmens Pvul he55 lyére klónozzuk.
- A pBR322 plazmid PvuII-Pstl fragmense (a 10. ábrán XXXX jelöli), amely tartalmazza a replikációs origót és az AmpR ampicillinrezisztencia gén 3’ végét.
Az így előállított pEMR414 plazmid a következő 60 komponenseket tartalmazza :
HU 215 948 Β
- egy replikációs origót és egy AmpR ampicillinrezisztenciát, ami lehetővé teszi a plazmid replikációját és szelekcióját E. coli sejtekben. Ezek a komponensek lehetővé teszik az E. coli sejtek transzformációját,
- egy élesztő replikációs origót (ARS), az STBlókuszt, a S. cerevisiae promoter nélküli LEU2 génjét, valamint a S, cerevisiae promoterrel rendelkező URA3 génjét. Ezek a komponensek lehetővé teszik a plazmid replikációját és szelekcióját S. cerevisiae sejtekben, valamint az endogén 2 μ plazmidot tartalmazó sejtekben az elegendő megoszlási hatékonyságot.
A pEMR414 plazmidot teljesen megemésztjük Nhel és Clal restrikciós enzimekkel. Az URA3 gént tartalmazó kis Nhel-Clal fragmens, a továbbiakban A fragmens a jelölése, megtisztítjuk.
A pEMR414 plazmidot teljesen megemésztjük Nhel és BamHI restrikciós enzimekkel. A nagy
Clal
Nhel-BamHI fragmenst, amely főleg a LEU2d gént és a pBR322 plazmid replikációs origóját tartalmazza, a továbbiakban B fragmens a jelölése, megtisztítjuk.
Előállítjuk a szintetikus Clal-AccI fragmenst is, amely az urát-oxidáz cDNS-szekvenciájáról (9C klón) meghatározott fehérjét kódoló gén startpontját tartalmazza. Ez a fragmens a 9C kiónhoz viszonyítva módosításokat tartalmaz, amelyeket azzal a céllal tettünk, hogy az élesztő számára jobban elfogadható kodonokat építsünk be [Sharp et al., Nucl. Acid. Rés., 14 (13), 5125-5143 (1986)], anélkül, hogy megváltoztatnánk az aminosavak összetételét. Ennek a ífagmensnek a szekvenciáját (a továbbiakban C fragmensnek nevezzük) az alábbiakban adjuk meg (az aláhúzott nukleotidok a 9C kiónhoz viszonyított változásokat jelzik):
ACCl
CGATATACACAATGTCTGCTGTTAAGGCTGCTAGATACGGTAAGGACAACGTTAGAGT
TATATGTGTTACAGACGACAATTCCGACGATCTATGCCATTCCTGTTGCAATCTCAGA
A 9C klón plazmidját (lásd 3. ábra), Acél és BamHI 25 gét (a továbbiakban D fragmensként említjük), megtiszrestrikciós enzimekkel emésztjük. Az AccI-BamHI títjuk. Ennek a fragmensnek a szekvenciája a követkefragmenst, amely tartalmazza az urát-oxidáz cDNS-vé- ző:
Acc I Ύ CTACAAGGT7CACz\AGGz\CGAGAAG -----------------------+ [TGTTCCAACzGTTCCTGCzCTTC ZiCCGGTGTCCAGACGGTGTACGAGATGACC GTCTGTGTGCTTCTGGAGGGTGAGATTGAG
---------4---------+---------4---------+---------4---------4
TGGCCACAGGTCTGCCACA7GC7C7ACTGG Cz\GACACACGAAGACC7CCCAC7C7/\ACTC 05
ACCTCTTACACCAAGGCCGACAACAGCGTC ATTGTCCCAACCGACTCCATTAAGAACACC
---------4----------4----- - — - + ------ - — 4---------+---------4
TGGAG/w^TGTGGTTCCGGCTGzTGzCGCAG TAACAGCGTTGGCTGAGGTAATTCTTGTGG
ATTTzACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTT ACTCCTCCCGAGCTCT7CGCCTCCATCC7G
----------4 - — - -- -- - - 4---------4------- ---4---------4---------4
TAAATGTAGTGGCGGTTCGTCTTGGGGCAA TGztGGAGGGC TCG ACZvAGCCG AGG TAGG AC
GGCAC ACACT TCATTGAGAAGT ACAACCAC ATCC AT GCCGCTCACGTCAACATTGTCTGC
---------4---------4---------4. ---------4---------4---------4
CCG7G7GTG AAGT AAC T CT z CATG χ TGGTG TAGGT ACGGCG/\GTGCAGTTGT AAC AG ACG
CACCGCTGGACCCGGATGGACATTGACGGC AAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCCCCAC
---------4---------+---------4---------4---------+---------4
G7GGCGACC7GGGCCTACCTGTAAC7GCCG TTCGGTG7CGGAG7GAGGAAG7AGGCGC7G
AGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGAC GTGG7CGAGGGCAAGGGCATCGATz\TCz\AG
---------4----------4---------4 ---------4---------4---------4
TCGCTCCTCTTCGCCTTACACGTCCACCTG Cz\CCAGC7CCCG7TCCCGTAGCTz\Tz\G77C
TCGTC7CTGTCCGGCCTGACCG7GC7Gz\AG AGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGCTTCCTG
---------4---------4---------4---------4---------4---------+
AGCAGAGACAGGCCGGACTGGCACGACTTC TCGTGGTTGAGCCTCz\AGACCCCGz\AGGAC
CGTGACG AGT AC ACCAG ACT 7 AAGG AG ACC TG GGA CCG * ATCCTGAGC ACCGACG z CGzzT
---------4---------4---------4 ---------4---------4---------+
GCACTGCTCATGTGGTGTGAATTCCTCTGG ACCCTGvzCzz-AGGACTCGTGGCTGCz.GCzzv
HU 215 948 Β
GCCAC77GGCAG7GGAAGAA777CAG7GGA C7CCAGGAGG7CCGC7CGCACG7GCC7AAG
---------+---------+---------4---------4---------4---------+
CGG7GAACCG7CACC77CTTAAAG7CACC7 GAGG7CC7CCAGGCGAGCGTGCACGGA77C
TTCGA7GCTACCTGGGCCAC7GC7CGCGAG GTCACTCTGí\AGACT7TTGC7GAAGA7AAC
---------+---------+---------+---------<---------+---------+
AAGCTACGATGGACCCGG7GACGAGCGC7C CAG7GAGAC77CTGAAAACGAC7TC7A7TG
AG7GCCAGCG7GCAGGCCAC7z\ x G χ z\CAmG A7GGCAGAGCAAA7CC7GGCGCGCCAGCAG
---------+---------+---------+---------4---------+----------+
TCACGG7CGCACGTCCGG7GA7ACA7G77C TACCG7CTCG777AGGACCGCGCGG7CG7C
C7GA7CGAGAC7G7CGAGTACTCG77GCC7 AACAACCAC7AT7TCGAAA7CGACC7GAGC
---------+ ----------h---------+ ---------4---------+---------+
GAC7AGCTC7GACxxGC χ Gzi * Gz^GCzvACGGzv 77G77CG x GA7AAAGC777AGC7GGAC7CG TGGCACAAGGGCC7CCAAAACACCGGCAAG AACGCCGAGG7C77CGC7CCTCAG7CGGAC
----------k---------+----------(--------- +---------4---------+
ACCGTGTTCCCGGAGGTTTTGTGGCCGTTC TTGCGGCTCCAGAAGCGAGGAGTCAGCCTG
CCCAACGG7C7GA7CAAG7G7ACCG7CCGC CGGTCC7C7C7CAAGTC7AAA77G7/\AACC
---------4---------4---------+---------4---------+---------+
GGG77GCCAGAC7AG77CACA7GGCAGCCG GCCAGGAGAGAC77CAGA777AACA777GG
AACA7GA77CTCACG77CCGGAG7T7CCAA GGCAAAC7GTA7A7AG7C7GCGATAGGGTA
---------4---------4---------+---------4---------+---------+
TTGTACTAAGAGTGCAAGGCCTCAAAGGTT CCGTTTGACATA7ATCAGACCCTATCCCAT
7AGCA77Cz%77Cz\C77G χ 777 x 7AC77CCA ΑΑΛΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΛΑΑΑΛΑΑΛΑΑΑΛΑΛΑΑΑ
---------4---------4---------4---------4---------4---------+
A7CGTAAGTAAG7GAACAAAAAA7GAACCT 777777777777777777777777777T7T Z\AAAAAAAAA-AAAAAAAAAAz\GGGCCCG‘ ·Η I
---------4---------4-------777777777777777777777CCCCGGCC7 AG I
Az A, B, C és D fragmenseket összeligálva kapjuk fragmenst, amely az urát-oxidáz gént tartalmazza, a szina 11. ábrán látható pEMR469 plazmidot, amelyben tetikus fragmenssel ligáljuk, amelynek a szekvenciáját a szimbólumok jelentése ugyanaz, mint a 10. ábrán, 35 az alábbiakban adjuk meg, ennek a szekvenciája megfeaz új Clal-AccI és AccI-BamHI fragmenst lel a S. cerevisiae GAL7 promotere TATA komponense jelöli. előtti szekvencia egy részének (200 bp), ez az említett
2. A pEMR473 plazmid előállítása rész tartalmazza az úgynevezett „upstream activating
A pEMR469 plazmidot teljesen megemésztjük az sequences” (UAS)-t.
Miül és Sphl restrikciós enzimekkel. A nagy Mlul-Sphl 40
HIÚI
CGCGTCTATACTTCGGAGCACTGTTGAGCGAAGGCTCATTAGATATATTTTCTGTCAT
AGATATGAAGCCTCGTGACAACTCGCTTCCGAGTCCTCTATATAAAAGACAGTA
TTTCCTTAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACAACTGTTGACCGT
AAAGGAATTGGGTTTTTATTCCCTCTCCCAGGTTTTTCGCGAGCCTGTTGACAACTGGCA
HU 215 948 Β
GATCCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATAGCCAAGCTGAAAATAATGTGTAGC ctaggcttcctgaccgatatgtcacaagtgttttatcggttcgacttttattacacatcg
Sphl
CTTTAGCTATGTTCAGTTAGTTTGGCATG
GAAATCGATACAAGTCAATCAAACC
Az így előállított pEMR473 plazmid látható a 12. ábrán, amelyen a szimbólumok jelentése ugyanaz, mint all. ábrán, a beépített új Mlul-Sphll fragmenst a következőképpen jelöljük: I a a I
3. A pEMR515 plazmid előállítása
A pEMR473 plazmidot részlegesen megemésztjük Xbal enzimmel, majd teljesen megemésztjük az Miül restrikciós enzimmel. A nagy Xbal-Mlul fragmenst izoláljuk. Ez a fragmens főleg a 2g-os fragmens replikációs origóját és STB-lókuszát tartalmazza, a LEU2d gént, az AmpR ampicillinrezisztencia gént, a pBR322 replikációs origóját és az urát-oxidáz expressziós kazettáját. Másrészről nem tartalmazza sem az URA3 gént, sem a 2p-os ffagmensnek az Xbal és Nhel hasítási helyei közötti részét.
A nagy Xbal-Mlul fragmenst a következő adapterszekvencia segítségével recirkularizáljuk, amely Miül és módosított Xbal tapadós végeket tartalmaz:
módosított Xbal
CTAGGCTAGCGGGCCCGCATGCA
CGATCGCCCGGGCGTACGTGCGC
HIÚI
Az így előállított pEMR515 plazmid csak egyet tar- 30 A pEMR469, pEMR473 és pEMR515 plazmidok talmaz a 2μ-οβ fragmens FLP génje által kódolt rekom- tartalmazzák az urát-oxidázt kódoló gént, amelynek a bináz cél FRT hely három komponenséből. szekvenciája az alábbi:
ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA
CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA
CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGGC
GACAACAGCG TCATTGTC3C AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT
CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC
TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC
AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA
CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG
ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG
ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA
GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG
ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTTCAGGA GGTAAGCTCG
CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT
HU 215 948 Β
GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG
TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AAATTG.
Az EMY761 élesztőtörzs transzformálása a pEMR469, pEMR473 éspEMR515plazmidokkal - Az EMY500 és GRF18 élesztötörzsek transzformálása a pEMR515 plazmiddal — Transzformálás vagy uracil prototrófia vagy leucin prototrófia alapján szelektálva
A Saccharomyces cerevisiae három nem izogén törzsét használjuk befogadó törzsként:
- az EMY761 törzset (Mata, leu2, ura3, his3, gal)
- az EMY500 törzset (Mata, leu2, ura3, pep4)
- a GRF18 törzset (Mata, leu2, his3)
A GRF18 törzs jól ismert a szakterületen jártas szakemberek számára (Gerry Fink, MIT, Amerikai Egyesült Államok). Az EMY761 és EMY500 törzsek rokonságban vannak a GRF18 törzzsel. Úgy állították elő őket, hogy egymás után keresztezték a GRF18 törzset egy, az FL100 törzsből (letétbe helyezve: 1975. január 2-án az ATCC-nél 28383 letéti szám alatt) származó ura3 törzzsel, valamint az E. W. Jones által leírt 20B12 törzzsel (Mata, tspl, pep4) [E. W. Jones et al., Genetics, 85, 223 (1977)].
A GRF18 törzset úgy állíthatjuk elő, hogy a GRF18 pEMR515 (leu+) törzsből (letétbe helyezve a CNCM-nél 1-920 letéti szám alatt 1989. december 28án) töröljük a pEMR515 plazmidot, az EMY500 törzset pedig úgy állíthatjuk elő, hogy az EMY500 pEMSR515 (leu+) törzsből (letétbe helyezve a CNCMnél 1-919 letéti szám alatt 1989. december 28-án) töröljük a pEMSR515 plazmidot.
Az EMY761 jelű törzset pedig úgy állítjuk elő, hogy a GRF18 jelű törzset egy, az FL100 jelű (1975. január 2-án ATCC 28383 számon letétbe helyezett) törzs ura3 származékával keresztezzük. Az FL100 törzsbe az ura3 mutáció vagy szokásos mutagenezissel (azaz a mutánsok 0,8 g/1 fluoronsavat és 100 mg/1 uracilt tartalmazó tápközegen történő szelekciójával), vagy közvetlen mutagenezissel vihető be. Ezek a módszerek szakemberek számára jól ismertek például a következő szakirodalmi helyről: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology Methods of Enzymology, No. 194, és különösen:
- a 18. fejezetből, amely klasszikus mutagenezismódszereket ismertet,
- a 19. fejezetből, amely a célzást, elroncsolást, helyettesítést és az allélmentést ismerteti, továbbá
- a 20. fejezetből, amely az in vitro mutagenezist és plazmidbevitelt: klónozott génről a mutáns élesztőbe való átvitelt ismerteti.
Ezek a törzsek olyan mutációkat tartalmaznak (leu2 és ura3), amelyek a pEMR469 és pEMR473 plaz15 midokban jelen levő LEU2d-hiányos szelekciós markerrel, illetve az URA3 szelekciós markerrel komplementálhatók.
1. Transzformálás az uracilprototrófiára való szelekció alapján
Az EMY761 törzs egy telepével 100 ml YPG táptalajt oltunk be (lásd a III. táblázatot). Amikor a sejtsűrűség elérte a 107per ml értéket, a sejteket 0,2 mól lítiumacetáttal kezeljük, egy olyan transzformálási technika végrehajtása céljából, amely jól ismert a szakterületen jártas szakemberek számára [Ito et al., J. Bacteriology, 153, 163-168(1983)].
Az EMY761 sejteket ezzel párhuzamosan 1-1 pg pEMR469 és pEMR473 plazmiddal transzformáljuk. A transzformált sejteket az uraciU karakter alapján sze30 lektáljuk uracilmentes táptalajon (lásd az alábbi III. táblázat). Egy EMY761 pEMR469 (ura+) transzformált törzset és egy EMY761 pEMR473 (ura+) transzformált törzset kapunk ily módon.
2. Transzformálás a leucin prototrófiára való szelekció alapján
Az alkalmazott transzformációs technika egy variánsa a Beggs által leírtnak [Beggs et al., Natúré, 275, 104-109 (1978)]. Ez abból áll, hogy élesztősejteket protoplaszttá alakítunk ozmotikus stabilizátor, neveze40 tesen 1 mólos szorbitol jelenlétében.
A transzformációs kísérlet pontos leírása az alábbi:
a) 200 ml folyékony YPG táptalajt (lásd III. táblázat) körülbelül 5xl06 stacioner fázisban levő sejttel inokulálunk, majd az így beoltott tenyészetet egy éjsza45 kán át 30 °C-on kevertetjük.
b) Amikor a tenyészet sűrűsége körülbelül 107 sejt per ml értéket elér, akkor a sejteket lecentrifúgáljuk (4000/perc, 5 perc), majd a maradékot 1 mólos szorbitollal mossuk.
c) A sejteket 5 ml 1 mólos szorbitololdatban szuszpendáljuk, amely 25 mmol/1 EDTA-t és 50 mmol/1 ditiotreitolt tartalmaz, majd 10 percig 30 °C-on inkubáljuk.
d) A sejteket egyszer mossuk 10 ml 1 mólos szorbitollal, majd szuszpendáljuk 20 ml szorbittal. 20 pg/ml végkoncentrációban hozzáadunk Zymolase-lOOT-t (egy olyan preparátum, amelyet Arthrobacter luteus-tenyészet felülúszójának affinitásoszlopon való tisztításával kapunk, P-l,3-glükán-laminari-pentahidrolázt tartalmaz, árulja a SEYKAGAKU KOGYO Co. Ltd.), majd a
HU 215 948 Β szuszpenziót szobahőmérsékleten körülbelül 15 percig inkubáljuk.
e) A sejteket 20 ml szorbitolt tartalmazó táptalajban szuszpendáljuk (YPG, lásd az alábbi III. táblázatot), majd 20 percig 30 °C-on inkubáljuk enyhe kevertetés közben.
f) A sejteket 3 percig 2500/perc fordulatszámmal centrifugáljuk.
g) A sejteket 9 ml transzformációs pufferben szuszpendáljuk (1 mólos szorbitol, TRIS-HC1 10 mmol/1 pH=7,5 és CaCl2 10 mmol/1).
h) 0,1 ml sejtet és 5 μΐ (körülbelül 5 μg) DNS-oldatot elegyítünk, majd a kapott szuszpenziót 10 percig szobahőmérsékleten hagyjuk állni.
i) 1 ml-t adunk hozzá a következő összetételű oldatból: PEG 200020%, TRIS-HC1 10 mmol/1 pH=7,5 és CaCl2 10 mmol/1).
j) Az i) lépésben kapott szuszpenzióból 0,1 ml-et egy olyan csőbe öntünk, amely leucinmentes regeneráló táptalajt tartalmaz (lásd alább a III. táblázatot), és előzőleg felolvasztottunk és 45 °C-on folyékony állapotban tartunk. A szuszpenziót egy olyan Petri-csészébe Öntjük, amely 15 ml leucinmentes szilárd regeneráló táptalajt tartalmaz.
k) A j) lépést megismételjük a h) lépésben kapott sejtszuszpenzió maradékával.
A transzformált sejtek 3 nap elteltével kezdenek megjelenni.
Az EMY761 pEMR469 (leu+), EMY761 pEMR473 (leu+), EMY761 pEMR515 (leu+, GRF18 pEMR515 (leu+) és EMY500 pEMR515 (leu+) transzformált törzseket állítjuk elő ily módon.
III. táblázat
A 11., 12., 13. és 14. példákban használt fő táptalajok
- uracilmentes szilárd táptalaj
6,7 g élesztő nitrogénalap, aminosavak nélkül (DIFCO)
5,0 g kazein-hidrolizátum (kazaminosavak a DIFCO-tól)
10 g glükóz
20 g agar Az összes komponens desztillált vízben kell oldani, majd 1 1 végtérfogatra feltölteni desztillált vízzel. Autoklávozás 15 perc, 120 °C
- uracilmentes folyadék táptalaj
Az uracilmentes szilárd táptalaj összetételét alkalmazzuk agar nélkül. Autoklávozás 15 perc 120 °C.
- leucinmentes szilárd táptalaj
6,7 g élesztő nitrogénalap, aminosavak nélkül (DIFCO)
20 mg adenin
20 mg uracil
20 mg L-triptofán
20 mg L-hisztidin
20 mg L-arginin
20 mg L-metionin
30 mg L-tirozin
30 mg L-izoleucin
30 mg L-lizin
50 mg L-fenil-alanin
100 mg L-glutaminsav
150 mg L-valin
400 mg L-leucin
20 g glükóz
20 g agar Az összes komponenst desztillált vízben oldjuk. A végtérfogatot 1 literre állítjuk desztillált vízzel. 15 percig 120 °C-on autoklávozzuk. Autoklávozás után 200 mg ltreonint és 100 mg L-aszparaginsavat adunk hozzá.
- leucinmentes szilárd regeneráló táptalaj
A leucinmentes szilárd táptalaj összetételét alkalmazzuk, agar nélkül, majd 20 mg helyett 30 g agart keverünk bele, és 182 g szorbitolt adunk az elegyhez.
- leucinmentes folyadék táptalaj
A leucinmentes szilárd táptalaj összetételét alkalmazzuk agar nélkül. 15 percig 120 °C-on autoklávozzuk. Autoklávozás után hozzáadunk 200 mg L-treonint és 100 mg laszparaginsavat.
-folyékony YP táptalaj
10 g élesztőkivonat (Bacto-yeast extract, DIFCO)
20 g pepton (Bacto-peptone, DIFCO) A komponenseket desztillált vízben oldjuk. A végtérfogatot 1 literre állítjuk desztillált vízzel. 15 percig 120°C-on autoklávozzuk.
-folyékony YPG táptalaj
A folyékony YP táptalaj összetételét alkalmazzuk, autoklávozás után glükózt adunk hozzá 20 g/1 koncentrációban.
- szorbitol YPG táptalaj
A folyékony YPG táptalaj összetételét alkalmazzuk, majd autoklávozás után szorbitolt adunk hozzá 1 mól koncentrációban.
- etanol-glicerin YP táptalaj
A folyékony YP táptalaj összetételét alkalmazzuk. Autoklávozás után hozzáadunk 10 ml 100%-os etanolt (1% végkoncentráció) és 30 g glicerint.
- etanol-glicerin-galaktóz YP táptalaj
A folyékony YP táptalaj összetételét alkalmazzuk. Autoklávozás után hozzáadunk 10 ml 100%-os etanolt, 30 g glicerint és 30 g galaktózt.
12. példa
Az urát-oxidáz cDNS expresszálása Erlenmeyer-lombikban az EMY761 pEMR469 (ura+), EMY761 pEMR473 (ura+), EMY761 pEMR469 (leu+) és az EMY761 pEMR473 (leu+) törzsekkel - Immunológiai kimutatás Western blottal - Az urát-oxidáz-aktivitás és az oldható fehérjék vizsgálata
1. Az urát-oxidáz cDNS expressziója
a) Uracilmentes táptalajon szelektált törzsek Mind az EMY761 pEMR469 (ura+), mind az
EMY761 pEMR473 (ura+) törzsből egy-egy telepet el28
HU 215 948 Β szaporítunk 20 ml uracilmentes folyadék táptalajban (lásd III. táblázat, 11. példa). Miután egy éjszakán át 30 °C-on rázattuk, a két tenyészetet 10 percig 7000/perc fordulatszámmal lecentrifugáljuk. A maradékot 10 ml steril desztillált vízben felvesszük, majd ismét centrifugáljuk 10 percig 7000/perc fordulatszámmal. Az urátoxidáz expresszióját úgy indukáljuk, hogy az EMY761 pEMR469 (ura+) törzs sejtjeit 20 ml etanol-glicerin YP táptalajban vesszük fel (lásd III. táblázat, 11. példa), illetve az EMY761 pEMR473 (ura+) törzs sejtjeit 20 ml etanol-glicerin-galaktóz YP táptalajban (lásd III. táblázat, 11. példa). A tenyészeteket 30 °C-on inkubáljuk 22 órán át, kevertetés közben.
b) Leucinmentes táptalajon szelektált törzsek
Az első lépésben mind az EMY761 pEMR469 (leu+), mind az EMY761 pEMR473 (leu+) törzsek egy-egy telepét 20 ml leucinmentes folyadék táptalajban (lásd ΠΙ. táblázat, 11. példa) tenyésztjük. Ez teszi lehetővé, hogy a plazmidok magas kópiaszámban legyenek jelen, és ezt meg is tartsák, a szelekciót a pEMR469 és pEMR473 plazmidok által hordozott LEU2d gén és a leu2 mutáció közötti komplementációval hajtja végre.
Miután egy éjszakán át 30 °C-on inkubáltuk, a két tenyészetet 10 percig 7000/perc fordulatszámmal lecentrifugáljuk. A maradékokat 10 ml steril desztillált vízben felvesszük, majd ismét 10 percig centrifugáljuk 7000/perc fordulatszámmal. Az urát-oxidáz expreszszióját azzal indukáljuk, hogy a sejteket 20 ml etanolglicerines YP táptalajban vesszük fel az EMY761 pEMR469 (leu+) törzs esetében és 20 ml etanol-glicerin-galaktóz YP táptalajban az EMY761 pEMR473 (leu+) törzs esetében (III. táblázat, 11. példa). A tenyészeteket ezután tovább inkubáljuk 22 órán át 30 °C-on kevertetve.
c) Kontrolitörzs
A nem transzformált EMY761 törzset, azaz a plazmid nélküli EMY761 törzset a fentiek szerint tenyésztjük. Egyrészről 10 ml etanol-glicerin YP táptalajban indukáljuk, másrészről 10 ml etanol-glicerin-galaktóz YP táptalajban.
2. A minták elkészítése
a) Az la), lb) és le) pontok szerint növesztett tenyészeteket lecentrifugáljuk, majd a felülúszókat eltávolítjuk. A maradékokat 10 ml desztillált vízben vesszük fel, majd 10 percig 7000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. Az ily módon mosott maradékokat körülbelül 1 ml trietilén-amin pufferben (TEA, pH = 8,9) felvesszük. Az említett pufferben felvett sejtekből körülbelül 300 μΐ-t feltárunk üveggyöngyök jelenlétében (400-500 pm átmérőjű), amelyek a végső térfogat felét teszik ki. Ezt az elegyet négyszer 1 percig erősen kevertetjük Vortexszel, a mintákat a feltáró műveletek között 30 másodpercre jég közé helyezzük. A folyadékot Pasteur-pipettával leszívjuk a csövekről, majd egy mikrokémcsőbe tesszük át. Az üveggyöngyöket egyszer mossuk körülbelül 200 μΐ TEA pufferrel (pH=8,9). A gyöngyöket egyszer 1 percig vortexeljük, majd a folyadékot Pasteur-pipettával leszívjuk, és a fenti lizátumhoz adjuk. A lizátumot ezután mikrocsőben 5 percig 7000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A felülúszót óvatosan leszívjuk és -20 °C-on tartjuk Western biot készítéséhez, az urátoxidáz-aktivitás meghatározásához és a fehérjék méréséhez. A feltárt sejtek maradékát külön tároljuk -20 °C-on Western blotkészítés céljából (lásd az alábbi 3-as pontot).
Emellett az la) és lb) pontok szerint előállított mintákat a következőképpen vesszük fel indukáció előtt: 2 ml tenyészetet 10 percig 7000/perc fordulatszámmal centrifugálunk. A maradékot 500 μΐ desztillált vízben vesszük fel, majd ismét centrifugáljuk 5 percig 7000/perc fordulatszámmal. A maradékokat 200 μΐ TEA pufferben vesszük fel (pH=8,9), majd a fentiek szerint üveggyöngyökkel feltárjuk. A felülúszókat és a lizált sejtek maradékait külön tároljuk -20 °C-on.
3. Az urát-oxidáz immunológiai kimutatása Western blottal
a) Az eljárás
A különböző minták maradékait és felülúszóit Western blotnak vetjük alá- ez egy jól ismert technika a szakterületen jártas szakember számára -, ami a következő lépésekből áll:
- a maradékot szolubilizáljuk oly módon, hogy 10 percig egy pufferben, az úgynevezett felvivő pufferben forraljuk, amelynek összetétele a következő: TRIS-HC1 0,125 mol/1 pH=6,8, SDS 4%, bróm-fenolkék 0,002%, glicerin 20%, β-merkapto-etanol 10% [a Laemmli és munkatársai által közölt kísérleti leírás szerint, Natúré, 227, 680-685 (1970)];
- az oldatban levő különböző fehérjéket elektroforetikusan elválasztjuk, a Laemmli és munkatársai által közölt kísérleti leírás szerint [U. K. Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970)];
- az említett, a gélben levő fehérjéket egy nitro-cellulóz-szűrőre visszük át [H. Towbin és munkatársai által leírt technika, Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok, 76, 4350-4354 (1979)].
Az immunológiai kimutatás, Bumette technikájával végrehajtva [W. W. Bumette, Anal. Biochem., 112, 195-203 (1981)], a következő lépésekből áll:
- a nitro-cellulóz-szűrőt 10 percig mossuk A pufferrel (TRIS-HC1 10 mmol/1, NaCl 170 mmol/1, KC1 1 mmol/1);
- a nitro-cellulóz-szűrőt 37 °C-on három órára érintkezésbe hozzuk a B pufferrel (A puffer, 3 g/100 ml mennyiségben kiegészítve szarvasmarha-szérumalbuminnal);
- a nitro-cellulóz-szűrőt 37 °C-on egy órára érintkezésbe hozzuk egy immunszérummal (az Aspergillus flavus urát-oxidázt felismerő poliklonális antitestek);
- a nitro-cellulóz-szűrőt B pufferrel mossuk;
- a nitro-cellulóz-szűrőt 37 °C-on egy órára érintkezésbe hozzuk protein G-oldattal, amely 125I-vel van jelezve 0,1 mikrocurie/ml arányban;
- a szűrőt A pufferrel mossuk;
- a szűrőt két folyadékfelszívó papírlap között szárítjuk;
HU 215 948 Β
- a szűrőt röntgenfilmre fektetjük; és
- előhívjuk a filmet, b) Eredmények
Azt találtuk, hogy az EMY761 pEMR469 (ura+), EMY761 pEMR473 (ura+) és az EMY761 pEMR469 (leu+) és az EMY761 pEMR (leu+) plazmiddal transzformáit törzsek nagy mennyiségben termelnek egy fehérjét, melynek látszólagos molekulatömege körülbelül 33 kDa, az Aspergillus flavus urát-oxidáz elleni antitestek felismerik, és hiányzik a kontrolltörzsből.
Azt is felismertük, hogy a nem indukált törzsek nem vagy nagyon kis mennyiséget termelnek az említett fehérjékből.
Ennek a fehérjének a maradékokban és a felülúszókban mért mennyiségének az Összehasonlítása lehetővé teszi annak megbecslését, hogy az említett fehéijék körülbelül 40%-a lizátumban van.
4. Az urát-oxidáz-aktivitás vizsgálata
Az urát-oxidáz-aktivitást a feltárt sejtek felülúszóin mérjük, a 9. példában leírt kísérleti leírás szerint.
A kapott eredményeket az alábbi, IV. táblázatban gyűjtöttük össze, az összes glicerin-etanollal, glicerinetanol-galaktózzal indukált törzs és az összes nem indukált törzs esetében az urát-oxidáz-aktivitást U/ml-ben adjuk meg.
IV. táblázat
Törzs/Indukálószer Urát-oxidáz-aktivitás (U/tnt)
EMY761/YP etanol-glicerin-galaktóz <0,1
EMY761/YP etanol-glicerin <0,1
EMY761 pEMR469 (ura ' )/(nem indukált) 0,4
EMY761 pEMR469 (ura')/YP etanolglicerin 12
EMY761 pEMR469 (leu+)/(nem indukált) 0,17
EMY761 pEMR469 (leu j/YP etanolglicerin 36
EMY761 pEMR473 (ura*)/(nem indukált) <0,1
EMY761 pEMR473 (ura')/YP etanolglicerin-galaktóz 12,5
EMY761 pEMR473 (leu+)/(nem indukált) <0,1
EMY761 pEMR473 (leu*j/YP etanolglicerin-galaktóz 15,3
A fenti eredmények tisztán mutatják, hogy a pEMR469 és pEMR473 plazmidokkal transzformált élesztősejtek képesek indukció után urát-oxidáz-aktivitást termelni.
5. A teljes oldható fehérje vizsgálata a lizátumokban
A BIORAD által árult fehérjemérő kitet használjuk a lizált sejtek felülúszóiban levő összfehérje mérésére. Ez azon a megfigyelésen alapul, hogy a Coomassie brillant blue g-250 savas oldatának maximális abszorpciója 465 nm-ről 595 nm-re változik, ha fehéijék kötődnek hozzá [Reisner et al., Anal. Biochem., 64, 509 (1975)].
a) Az eljárás
A következő térfogatú oldatokat juttatjuk egy 595 nm-re állított spektrofotométer cellájába:
- 10 μΐ minta, amelyhez 790 μΐ desztillált vizet adtunk,
- 200 μΐ koncentrált Dye-reagens (Biorad)
A komponenseket összekeverjük, majd 595 nm-en leolvassuk az optikai sűrűséget. Ily módon növekvő koncentrációjú szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) kalibrációs görbét készítünk. A lizátumokban levő összfehérje ismeretlen koncentrációját a kapott kalibrációs görbe alapján olvassuk le.
b) Eredmények
A kapott fontosabb eredményeket az V. táblázatban gyűjtjük össze, amelyben meghatározzuk (mg/ml egységben) az összes oldható fehéije mennyiségét, valamint az urát-oxidáz százalékát az oldható összfehérjében, mindegyik glicerin-etanollal, glicerin-etanolgalaktózzal indukált törzs esetében, valamint mindegyik nem indukált törzs esetében (az a feltételezés, hogy a rekombináns fehérje specifikus aktivitása ugyanannyi, mint az Aspergillus flavusból kapott fehérje esetében: 30 U/mg).
V. táblázat
Törzs/Indukálószer Teljes oldható fehérje mg/ml Az urát-oxidáz % a teljes oldható fehérjében
EM Y 7 61 /etanol-gliceringalaktóz 5,8 <0,05
EMY761 /etanol-glicerin 5,3 <0,05
EMY761 pEMR469 (ura-)/ (nem indukált) 8,5 0,25
EMY761 pEMR469 (ura)/ etanol-glicerin 5,3 4,7
EMY761 pEMR469 (leu+)/ (nem indukált) 1,7 0,3
EMY761 pEMR469 (leu+)/ etanol-glicerin 5,9 20
EMY761 pEMR473 (ura ^)/ (nem indukált) 10,3 <0,05
EMY761 pEMR473 (ura-)/ YP etanol-gliceringalaktóz 6,5 6,4
EMY761 pEMR473 (leu )/ (nem indukált) 0,5 <0,05
EMY761 pEMR473 (leu+)/ YP etanol-gliceringalaktóz 3,9 13
Azt találtuk, hogy a termelt urát-oxidáz mennyisége
5-20% között változik, a transzformánsoktól és a transzformált törzsek szelekciójától függően (leu+).
HU 215 948 Β
13. példa
Az urát-oxidáz cDNS expresszálása az EMY761 pEMR473 (ura fi törzzsel 2,5 literes fermentorban 1. A fermentáció kísérleti leírása
a) Táptalajok Oltóanyag táptalaj
Az. EMY761 pEMR(ura+) törzs egy telepét 200 ml uracilmentes táptalajban növesztjük (lásd III. táblázat,
Miután a glükóz elfogyott OD 2,5 és OD 17 között, a tenyészetet 150 ml, 20 v%-os galaktóz hozzáadásával indukáljuk. A növekedés folytatódik, majd B táptalajt adunk hozzá körülbelül OD 30-nál.
A növekedés további tizenöt órán át folytatódik, majd a terméket begyűjtjük OD 104 értéknél.
2. A minták elkészítése és analízise
A mintákat a 9. példa 2a) pontjában leírtak szerint
11. példa). A tenyésztést egy éjszakán át végezzük ke- készítjük el a fermentorban levő tenyészetből. Két min-
vertetés közben, amíg az OD értéke körülbelül 3 nem 10 tát veszünk: az elsőt az indukálás után 7 órával, majd a
lesz. „ A ” tenyésztő táptalaj 1 liter Milli-Q típusú berendezésen tisztított vízre 15 másodikat az indukálás után 22 órával. A sejtek feltárása után kapott két lizátumon az aláb- bi, a 9. példában leírt vizsgálatokat végezzük el: - immunológiai kimutatás Western blottal, - a biológiai aktivitás vizsgálata,
Glükóz 30 g - az összfehérje vizsgálata,
Glicerin 30 g A következő eredményeket kaptuk:
Kazein-hidrolizátum (kazaminosavak, DIFCO) 30 g a) Immunológiai kimutatás Western blottal Úgy találtuk, hogy az EMR473 (ura+) törzs, 2 literes
Élesztő nitrogénalap (DIFCO) 15 g 20 fermentorban tenyésztve egy körülbelül 33 kDa látszóla-
Élesztőkivonat (DIFCO) 2,5 g gos molekulatömegű fehérjét termel, amelyet az
K2HPO4 3 g Aspergillus flavus urát-oxidáz elleni antitestek felismer-
MgSO4.7H2O 0,5 g nek [az említett antitesteket nyulakban állítjuk elő, a
Addicionális „B” táptalaj 1 liter Milli-Q típusú 25 szakterületen jártas szakemberek számára jól ismert technikával, lásd Vaitukaitis et al, Methods in Enzy-
Glicerin berendezésen tisztított vízre 30 g mology, 73, 46 (1981), Academic Press, New York], és amely nem található meg a kontrolitörzsekben. b) A biológiai aktivitás vizsgálata
Pepton-hidrolizátum (Primatone, G. Sheffíeld) 30 g 30 A kapott eredményeket a VI. táblázatban foglaljuk össze:
Élesztő nitrogénalap (DIFCO) Élesztőkivonat (DIFCO) 15 g 2,5 g VI. táblázat
K2HPO4 3 g
MgSO4.7H2O 0,5 g
b) Fermentációs paraméterek 2,5 literes bioreaktor, két turbinával Hőmérséklet=30 °C pH=5
Oxigén parciális nyomása=4 kPa
Levegő mennyisége=l 1/perc
A bioreaktort 1 liter A táptalajjal töltjük, majd 150 ml oltóanyaggal oltjuk be.
Törzs/Indukció ideje U/ml
EMY761 pEMR473 (ura+)/7 óra 9
EMY761 pEMR473 (uraQ/22 óra 12,5
Azt találtuk, hogy az EMY761 pEMR473 (ura+) törzs, fermentorban tenyésztve indukálás után képes urát-oxi40 dázt termelni.
c) Az összoldható fehérje vizsgálata Az eredményeket az alábbi VII. táblázatban foglaljuk össze:
VII. táblázat
Törzs/Indukció ideje Oldható összfehérje mg/ml Urát-oxidáz % az oldható összfehérjében
EMY761 pEMR473 (ura*)/7 óra 5,2 5,7
EMY761 pEMR473 (ura')/22 óra 6,2 6,6
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a fermentorban tenyésztett EMY761 pEMR473 (ura+) törzs által termelt urát-oxidáz mennyisége kb. 5%-a a sejt összfehérjéjének, az indukció után 7, illetve 22 órával.
14. példa
Az urát-oxidáz cDNS expresszálása az EMY761 pEMR515 (leufi, az EMY500pEMR515 (leu fi és a GRF18pEMR515 (leufi törzzsel Erlenmeyer-lombikban
Mindhárom fenti törzsből egy-egy telepet elszapori55 tünk 20 ml leucinmentes folyadék táptalajban.
Miután egy éjszakán át 30 °C-on rázattuk, a három tenyészetet 10 percig 7000/perc fordulatszámmal lecentrifugáljuk. A maradékot 10 ml steril desztillált vízben felvesszük, majd ismét centrifugáljuk 10 percig
7000/perc fordulatszámmal. Az urát-oxidáz expresz31
HU 215 948 Β szióját úgy indukáljuk, hogy a sejteket 20 ml etanol-glicerin-galaktóz YP táptalajban vesszük fel (lásd I. táblázat, 8. példa). A tenyészeteket 30 °C-on inkubáljuk 22 órán át, kevertetés közben. A nem transzformált gazdasejteket kontrollként tenyésztjük.
Mindhárom törzs sejtjeit ismét lecentrifugáljuk, majd a felülúszókat eltávolítjuk. A maradékokat 10 ml desztillált vízben vesszük fel, majd 10 percig 7000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. Az ily módon mosott maradékokat körülbelül 1 ml trietilén-amin pufferben (TEA, pH=8,9) felvesszük, majd a feltárást és a részecskék centrifugálással való eltávolítását a 9. példa 2. pontjában leírtak szerint végezzük. Mindegyik tenyészet felülúszóját használjuk, mint az előzőekben, az urát-oxidáz és az összfehéijék vizsgálatára. A kapott fontosabb eredmények az alábbi, VIII. táblázatban találhatók:
Vili. táblázat
Törzs/tenyésztcsi feltételek Urát-oxidáz-aktivitás (U/ml) Oldható összfehérje (mg/ml) Urát-oxidáz % az oldható összfehérjében
GRF18 pEMR515 (leu+)/a) <0,1 2,2 <0,05
EMY500 pEMR505 (leu Q/a) <0,1 0,9 <0,05
EMY761 pEMR515 (leu1 )/a) <0,1 1,8 <0,05
GRF18 pEMR515 (leu+)/b) 38 5,4 23
EMY500 pEMR515 (leu*)/b) 20 2,5 26
EMY761 pEMR515 (leu+)/b 33 4,2 26
a) : A sejteket glükóz jelenlétében tenyésztjük (nem indukáló körülmények)
b) : A sejteket glükóz nélkül inkubáljuk, galaktóz jelenlétében (indukció).
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti expressziós vektorral transzformált három nem izogén gazdatörzsben az urát-oxidáz magas szintű expresszióját lehet elérni.
15. példa
Az urát-oxidáz cDNS expressziója
EMY500pEMR515 törzzsel 2,5 literes fermentorban.
A rekombináns urát-oxidáz tisztítása és részleges jellemzése
1. Az EMY500 pEMR515 törzs tenyésztése 2,5 literes fermentorban
Az EMY500 pEMR515 törzs tenyésztését a következőképpen végezzük:
a) Előtenyésztés Erlenmeyer-lombikban
500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 90 ml MCPA táptalajt (autokláwal sterilezve), amely 1,28 g MES-sel (2-(/V-morfolino)-ctánszulfonsav, Sigma M8250) és 10 ml MCPF növesztő táptalajjal (ultraszűréssel sterilezve) van kiegészítve, 1 ml EMY500 pEMR515 sejtszuszpenzióval oltunk be, amely 20% glicerint tartalmazó táptalajban van, a sejtek száma megfelel OD 2,35-nek. Az MCPA és MCPF táptalajok összetételét a későbbiekben adjuk meg. 24 órát rázatjuk 30 °C-on, az optikai sűrűség értéke körülbelül 7.
b) Tenyésztési fázis fermentorban
A fenti tenyészetet használjuk 2,5 literes fermentor beoltására, amely a következő összetételű táptalajt tartalmazza:
900 ml MCPA +200 ml MCPF
A tenyészet pH-ját a fermentor automatikája szabályozza, 5,5-es értékre. Miután 6-7 órát tenyésztettünk 30 °C-on, 72 ml 500 g/1 koncentrációjú glükózoldatot adunk a tenyészethez 9 óra alatt egyenletesen becsepegtetve (azaz összesen 36 g glükózt).
c) Expressziós fázis
Az előzőekben ismertetett elegyhez 100 ml ΜΕΡΑ expressziós táptalajt adunk (autoklávban sterilezve), majd 150 ml MEPF expressziós táptalajt (ultraszűréssel sterilezve), amelynek az összetételét az alábbiakban is30 mertetjük. Ezután 20 óra alatt egyenletesen csepegtetve 150 ml, következő összetételű oldatot adunk hozzá; 30 g galaktóz, 15 g glicerin és 36 g etanol. így körülbelül 160-as OD-t lehet elérni.
A növesztő táptalajok összetétele
- MCPA növesztő táptalaj (autoklávban sterilezve)
900 ml összterfogatra
NTA (nitrilo-ecetsav) 1,2 g
élesztőkivonat 6g
K2SO4 1,2 g
NaCl 0,6 g
MgSO4-7H2O 1,2 g
CaCl2-2H2O 840 mg
FeClj 108 mg
glutaminsav 4,44 g
HYCASE SF (Sheffield Products) 30 g
leucin 2,16 g
hisztidin 600 mg
metionin 1,2 g
I-es oligoelemek (lásd az alábbiakban) 5 ml
uracil 1,2 g
HU 215 948 Β
Az 1-es oligoelemek listája
1 1 ultratiszta vízhez
CuSO4.5H2O 780 mg
H3BO3 5 g
ZnSO4.7H2O 3g
KI 1 g
MnSO4.2H2O 3,5 g
Na2MO4.2H2O 2g
FeCl3.6H2O 4,8 g
A pH-t tömény kénsavval vagy tömény KOH-val 5,5-re állítjuk.
Autoklávozás 20 percig 120 °C-on
- MEPF expressziós táptalaj (ultraszűréssel sterilezve)
150 ml ultratiszta vízre
KH2PO4 2,4 g
triptofán 420 mg
I-es vitaminok 5 ml
glicerin 36 g
galaktóz 45 g
Az oldathoz 100 ml tömény sósavat adunk, majd a térfogatát 1000 ml-re állítjuk.
- Az MCPF növesztő táptalaj (ultraszűréssel sterilezve)
200 ml ultratiszta vízhez
KH2PO4 4,8 g
Triptofán 420 mg
Vitamin I-es oldat 5 ml
Glükóz 36 g
A feloldáshoz felmelegítjük, majd szobahőmérsékletre visszahűtjük, hozzáadjuk az I-es vitaminoldatot, és 0,2 pm-es pórusátmérőjű szűrőn átszűrjük.
Az I-es vitaminok listája
100 ml ultratiszta vízhez
biotin 1,2 mg
fólsav 1 mg
niacin (nikotinsav) 144 mg
piridoxin-HCl 60 mg
tiamin-HCl 240 mg
kalcium-pantotenát 1,2 g
mezo-inozitol 2,4 g
A feloldódás után 100 ml-re feltölteni.
Hidegben sterilezve szűrjük, 0,2 μ-os szűrővel.
- ΜΕΡΑ expressziós táptalaj (autoklávban sterilezve)
NTA 1,2 g
K2SO4 2,08 g
glutaminsav 6g
HYCASE SF (Sheffield Products) 24 g
leucin 2,16 g
hisztidin 600 mg
metionin 1,2 g
MgSO4.7H2O 720 mg
CaCl2.2H2O 840 mg
FeCl3.6H2O 108 mg
I-es oligoelemek 5 ml
uracil 1,2 g
Feloldáshoz felmelegítjük, szobahőmérsékletre visszahűtjük, hozzáadjuk a vitaminokat és megszűrjük.
2. A sejtek feltárása órás indukálás után, a tenyészet OD-ja 600 nmen mérve 98. A fermentléből 800 g-ot lecentrifugálunk (5 perc, 10000 g), majd a leülepedett sejteket 80 ml lízis pufferben vesszük fel (20 mmol-os glicin, pH=8,5). A sejteket ezután 2,5 percig feltárjuk 4 °Con, a lizálandó sejteket tartalmazó oldattal azonos térfogatú gyöngyök jelenlétében (0,50 mm átmérőjű), egy megfelelő őrlőberendezésben (Vibrogenic Zellmühle mill VI 4). A feltárás után a felülúszót felvesszük, és a gyöngyöket 80 ml lízis pufferrel mossuk. 210 ml lizátumot nyerünk ki; az említett lizátum összfehéije-tartalma körülbelül 3 mg/ml, urát-oxidáz-aktivitása körülbelül 7,7 U/ml (azaz az összfehérjére számítva az urát-oxidáz mennyisége körülbelül 8,5%, ha feltételezzük, hogy ennek a fehérjének a specifikus aktivitása 30 U/mg).
3. A rekombináns urát-oxidáz tisztítása
a) Tisztítási eljárás
A fenti lizátumot kétlépéses tisztítási eljárásnak vetjük alá, amelyet az alábbiakban ismertetünk.
1. lépés
Anionos kromatográfia
Hordozó:
DEAE (dietil-amino-szulfát)-sepharose (fást flow, Pharmacia, 17.07.09.91).
A tömörített gél térfogata 70 ml.
Az elválasztást szobahőmérsékleten végezzük, az elválasztott frakciókat 0 °C-on tartjuk.
Elválasztási körülmények:
Az 1-es puffer (nátrium-borát 10 mmol/1, pH=9,2) és a 2-es puffer (nátrium-borát 10 mmol/1, nátrium-klorid 1 mol/1) közötti kloridion-erősség-különbséget használjuk ki gradiens formájában. A puffereket előzőleg gázmentesítjük, majd az eluálás során 0 °C-on tartjuk. Mindegyik pufferhez 0,02% azidot adunk.
A nyers kivonatot felvisszük az oszlopra (10 ml), majd az 1-es pufferei addig eluáljuk, amíg az urátoxidázt teljesen vissza nem nyeljük (10 ml-es frakciókban), amely nem marad az oszlopon.
A pigmenteket és a szennyező fehérjéket ezután a 2-es pufferrel eluáljuk.
A tisztítást az eluátum optikai sűrűségének 214 nmen való mérésével követjük.
HU 215 948 Β
2. lépés
Nagynyomású, fordított fázisú folyadékkromatográfia Hordozó:
Ojtott C8 szilikátoszlop, Aquapore OD-300 (100x2,1 mm) (Brownlee-Applied Biosystem). Működési körülmények:
Az 1-es eluálószer: ultratiszta víz (Millipore rendszerben átszűrve), amely 0,1%, trifluor-ecetsavat tartalmaz.
A 2-es eluálószer: Acetonitril (spektrofotometriás, vagy hasonló tisztaságú), amely 0,08% trifluor-ecetsavat tartalmaz.
Áramlási sebesség: 0,3 ml/perc.
A gradiens: 35% acetonitril/TFA —» 70% acetonitril/TFA 20 perc alatt, majd 5 percig tartjuk 70%-on. A beinjektált mennyiség futásonként 1 ml.
a) A frakciók kinyerése:
Az elválasztást az optikai sűrűség 218 nm-en való mérésével követjük. Az acetonitril a vákuum alatt végzett centrifugálás során elpárolog.
b) Eredmények:
A mintát a tisztítás első lépése előtt és után is megvizsgáljuk folyadékkromatográfiával, ojtott C8 szilikátoszlopon, az előzőekben ismertetett Aquapore OD-300-as tölteten, az előzőkben ismertetett gradienssel, 50 μΐ beinjektált mennyiséggel. Az Aspergillus flavusból származó tisztított urát-oxidázt használjuk külső kontrollként.
A kiindulási lizátumban az urát-oxidáz az összfehérje 63%-át teszi ki. Az első tisztítási lépés után az urát-oxidáz az összfehéije 84%-át teszi ki.
A 2. lépés után kapott minta teljes mennyiségét használjuk a következő, részleges jellemzésre. Az említett minta az urát-oxidázból biztosan többet tartalmaz 84%-nál.
4. A rekombináns urát-oxidáz részleges tisztítása
a) Aminosavanalízis
A tisztított rekombináns urát-oxidáz savas hidrolizátumának aminosav-analízisét egy Applied Biosystems 420-130A modell analizátorral végezzük. A tisztított aminosavak megoszlása kompatíbilis (nincs lényeges különbség) a feltételezett szekvenciával. Ugyanez az eredmény figyelhető meg az Aspergillus flavusból kivont tisztított urát-oxidáz esetében is (4. példa szerint előállítva).
b) Triptikus peptidtérkép
Meghatározzuk a tisztított rekombináns urát-oxidáz és a 4. példában kapott tisztított urát-oxidáz-kivonat triptikus peptidtérképét, az alábbi körülmények között:
Egy 1 mg/ml koncentrációjú urát-oxidáz-oldatot készítünk. Hevenyészve elkészítünk egy 1 mg/ml koncentrációjú tripszinoldatot.
A két oldatot 1/30 enzim/szubsztrát arányban összekeverjük, majd 8 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A triptikus hidrolizátumot ezután kromatografáljuk (folyadékfázisú kromatográfia) Cl8 ojtott szilikátoszlopon (5 pm; lichrosorb 250 χ 4,6 mm Hichromref. RP 18-5-250A), amelyet egy rekorderhez kapcsolt UV-detektorral látunk el. Az alkalmazott gradiens
1% acetonitril/TFA—» 60% acetonitril/TFA 120 percre, majd a gradienst 5 percig 60%-nál tartjuk.
A peptidtérkép nagyon szűk profilú.
5. Az aminoterminális szekvencia blokkolt jellegének meghatározása
Az aminoterminális szekvenciát Applied Biosystems 470A modellszekvenálóval határozzuk meg, amely a fenil-tiohidantoin-származékok analizálására alkalmas detektorhoz van kapcsolva (Applied Biosystems 120A modell). A tisztított rekombináns urát-oxidázt (200 pmol, az aminosavanalízis alapján) a szekvenálóba helyezzük 20 pmol β-laktoglobulin (kontrollfehérje) jelenlétében.
Az urát-oxidáz szekvenciájának megfelelő aminoterminális szekvencia nem detektálható, jóllehet a kontroll fehérje aminoterminális szekvenciája kimutatható.
Tehát mind a találmány szerinti rekombináns urátoxidáz, mind az urát-oxidáz-kivonat blokkolt aminoterminálissal rendelkezik.
16. példa
Expressziós vektor készítése az urát-oxidáz cDNS állati sejtekben való expresszálása céljából: a pSV860plazmid
Ezt a vektort úgy állítjuk elő, hogy
- a kis Acc-SnaBI fragmenst, amely tartalmazza az első 16 aminosav kivételével az urát-oxidázt kódoló szekvenciát, és a p466 plazmidból származik (ez egy expressziós vektor az Aspergillus urát-oxidáz E. coliban való expresszálására, laboratóriumunkban hozzáférhető, leírása az alábbiakban következik), ligáljuk egy szintetikus Hindlll-Acél fragmenssel, ami lehetővé teszi egy olyan Hindlll-SnaBI fragmens előállítását, amely az Aspergillus flavus urát-oxidáz teljes szekvenciáját tartalmazza, egy 5’, állati sejtekben való expresszálódást elősegítő nem transzlálódó régióval együtt;és
- a Hindlll-SnaBI fragmenst állati sejtekben való expresszálásra alkalmas expressziós vektor, nevezetesen a pSE! plazmid többszörös klónozóhelye (nevezik ezt még polilinkemek is) Hindlll és SnaBI hasítási helyei közé klónozzuk.
Az alábbiakban egymást követően leírjuk a p466, pSE| és pSV860 plazmidok előállítását.
1. A p466plazmid előállítása
A p466 plazmidot, amely urát-oxidáz E. coliban való expresszálására alkalmas vektor, az alábbiak szerint állítjuk elő. Tartalmaz egy pBR327 fragmenst (replikációs origó és ampicillinrezisztencia gén); tartalmaz egy szintetikus E. coli promotert [R. Rodriguez and M. Chamberlain, „Promoters-Structure and function”, Preager, (1982)], egy Shine-Dalgamo-szekvenciát, majd ezt követően egy polilinkert, benne az egyedülálló Ndel és Kpnl hasítási helyekkel, egy transzkripciós terminátort (az fd fágból származik) és a lac i gént.
Ezt a plazmidot a hGH E. coliban való expreszszálására készített expressziós plazmidból (p462) állítjuk elő, a hGH gént hordozó fragmenst az urát-oxidáz cDNS-sel helyettesítve.
HU 215 948 Β
A p466 plazmid előállítását az előzőekben a 7. példában részletesen ismertettük.
2. Expressziós vektor készítése állati sejtekhez: pSEj plazmid
Az alkalmazott stratégia széles körben elérhető, létező plazmidokból nyert fragmenseket alkalmaz, valamint szintetikus fragmenseket, amelyeket általánosan használt technikákkal állítunk elő. A klónozó technikák a T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook által leírtak [Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Az oligonukleotidokat egy Biosearch 4600 DNS-szintetizátorral állítjuk elő.
Az alábbi leírást jobban meg lehet érteni a 13. ábra alapján, amely a pSE, plazmid restrikciós térképét mutatja, azokat a helyeket, amelyek a ligálás következtében eltűntek, zárójelbe téve. Az ábrán alkalmazott szimbólumokat az alábbi leírásban ismertetjük.
A plazmidot az alábbi komponensek egymást követő ligálásával állítjuk elő:
1. - egy PvuII-PvuII fragmens, amelyet ±±±±±± szimbolizál a 13. ábrán - mérete 2525 bp, és a pTZ18R plazmid (Pharmacia) PvuII enzimmel való teljes emésztésével kapunk. Ez a fragmens tartalmazza az FI fág replikációs origóját (ezt a 13. ábrán ŐRI FI jelzi), egy ampicillinrezisztenciát hordozó gént (AmpR jelzi a 13. ábrán), valamint ennek a plazmidnak E. coliban való replikációját lehetővé tevő replikációs origót (ŐRI pBR322 jelzi a 13. ábrán). Az első PvuII tompa vég eltűnik a 7. pontban leírt fragmens EcoRV tompa végével való ligálás következtében (ez is eltűnik).
2. - egy PvuII-Hpal fragmens -, amelyet Íféfeagfo szimbolizál a 13. ábrán - mérete 1060 bp, az 5-ös típusú adenovírus DNS az 11299-es pozíció (PvuII restrikciós hely) és a 10239-es pozíció (Hpal restrikciós hely) közötti szakasz [Dekker&Van Ormondt, Gene, 27, 115-120 (1984)], amely a VA-I és VA-II RNS-ek információját tartalmazza. A Hpal tompa vég eltűnik a 3.
pontban leírt fragmens PvuII tompa végével való ligálás következtében (amely szintén eltűnik).
3. - egy PvuII-HindlII fragment, melyet //// szimbolizál a 13. ábrán - 344 bp méretű, az SV40 vírus DNS PvuII és Hindlll restrikciós enzimekkel végzett teljes emésztésével kapjuk. Ez a fragmens tartalmazza az SV40 vírus DNS-replikációs origóját és a korai promoterét [J. Byme et al., Proc. Natl. Acad. Amerikai Egyesült Államok, 80, 721-725 (1983)].
A Hindlll hasítási hely eltűnik a 4. pontban leírt fragmens Hindlll hasítási helyéhez kötődő helyhez való ligálás következtében.
4. - egy szintetikus „Hindlll hasítási helyhez kötődő hely” fragmens, a 13. ábrán . a szimbóluma,
419 bp méretű, amelynek az alábbiakban megadott szekvenciája hasonló a HTLV1 vírus 5’ nem transzlálódó szekvenciájához [Weiss et al., „Molecular Biology of Tumor Viruses” - 2. rész - 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, 1057. oldal (1985)].
Hindlll U . !.:4·’·1’· U<iy T AGCTGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGGGöCCÍKCAÍGCC
---------4----------4----------4---------i---------------------óO
CCGAGCGTAGAGAGGAAGTGCCCGGGCGGCGGGATGGACTCCGGCGGT nGGT C»C GG 05 ggigagicgcgttcigccgcctcccgcctgiggtgcctcctgaactgcgtccgccgtcta
---------4---------+---------4---------4---------4·----------->120 ccactcagcgcaagacggccgagggcggacaccacggaggactigacgcaggcggcagat
GGTAGGCTCCAAGÜGAGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCrCTAAACTTACCTA 121 ---------+---------4----------+---------+---------+---------*130
CCATCCGAGGTTCCCTCGGCCTGTTTCCGGGCCAGAGCTGGACTCGAGATTIGAATGGAT gactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgttt·
121 --------— 4---------4---------4----------4---------4-----J---4-2/.0 ctgagtcggccgagaggtgcoaaacggactgggacgaacgagttgagatgcagaaacaaa
HU 215 948 Β táblázat (folytatás)
CGTTTTCTGTICIGCGCCGTTACAACTTCüÁGGIftTGCGCIGGGACCTGGCAGGCGGCAT 2'(i _________+_________t---------+----------+---------+---------+ 3C0
GCAAAAGA.CAAGACGCGGCAATGTTGAAGTTCCATACGCGACCCTGGACCGTCCGCCGTA ctgggacccctaggaagggcttgggggtcctcgtgcccaaggcagggaacatagtggtcc
301 ---------+---------+---------+---------+---------+--------+360 gaccctggggatccttcccgaacccccaggagcacgggtíccgtcccttgtatcaccagg
CAGGAAGGGGAGCAGAGGCATCAGGGTGTCCACTTTGTCTCCGCAGCTCCTGAGCCTGCA 361 ---------+---------+---------+----------♦---------+----------+ A20 gtccttcccctcgtctccgtagtcccacaggtcaaacagaggcgtcgaggactcggacgt ga
CTTCGA
Hindlll
5. - egy szintetikus HindIII-„BamHI-hez kötődő hely” talmazza a T7 fág RNS-polimerázát, valamint a Smal fragmens, XXX szimbolizálja a 13. ábrán - amely tar- 30 klónozóhelyet tartalmazó polilinkert.
A3CTT3TCGACTAATACGACTCACTATAGGGCGSCCGCGGGCCCCTGCAGGAATTC
ACAGCTGATTATGCTGAGTGATATCCCGCCGGCCCCGGCGGACGTCCTTAAG
Hindlll
Smal BamHI-hez KötödC hely
GGATCCCCCGGGTGACTGACT
CCTAGGSGGCCCACTGACTGACTAG
6. - egy 240 bp méretű BamHI-BclII fragmens - a 13. ábrán TVT szimbolizálja -, amely egy kis fragmens, és úgy kapjuk, hogy az SV40 vírust Bell és BamHl restrikciós enzimekkel teljesen megemésztjük, és az említett vírus késői poliadenilációs helyét tartalmazza [M. Fitzgerald et al., Cell, 24, 251-260 (1981)]. A GamHI és Bell helyek eltűnnek az 5. pontban leírt fragmens BamHI-hez kötődő helyével, illetve a 7. pontban leírt fragmens BamHl helyével való ligálás következtében (amely szintén eltűnik).
7. - egy BamHI-EcoRV fragmens 'QQQ| szimbolizálja a 13. ábrán - mérete 190 bp, ez egy kis fragmens, a pBR322 plazmid EcoRV és BamHl enzimekkel végzett teljes emésztéséből származik.
3. A pSV860plazmid előállítása
A p466 plazmidot (lásd 9. ábra) teljesen megemésztjük az Acél és SnaBI restrikciós enzimekkel. A kis AccI-SnaBI fragmenst, amely az első 16 aminosav kivételével az urát-oxidázt kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza, megtisztítjuk, és az alábbi szekvenciával rendel55 kező szintetikus Hindlll-Acél fragmenssel ligáljuk:
HU 215 948 Β
HindlII agcttgccgccactatgtccgcagtaaaagcagcccgctacggcaaggacaatgtccgcg
ACGGCGGTGATACAGGCGTCATTTTCGTCGGGCGATGCCGTTCCTGTTACAGGCGC
T
AGA AccI
Ez a ligálás lehetővé teszi, hogy megkapjuk a HindlII-SnaBI fragmenst, amely egy, a 9C klónnal azonos urát-oxidázt kódoló szekvenciát tartalmaz, valamint az állati sejtekben való expressziót elősegítő 5’ szekvenciát [Kozák, M., Nucl. Acids Rés., 12 (2), 857-872 (1984)].
A Hindii-SnaBI fragmens az alábbi szekvenciákat 15 tartalmazza:
5’
AGCTTGCCG CCACTATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA
CAATGTTCGC GTCTACAAG3 ttcacaagga CGAGAAGACC GGTGTCCAGA
CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC
TCTTACACCA AGGGCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA
GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC
TGTTCG3CTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC
CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT
TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC
GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG
TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG
CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC
TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCÁGT GGAAGAATTT CAGTGGACTT
CAGGAGGTAA 3CTC3CACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACT3C
TCGCGAG3TC ACTlTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC
AGGCCAvTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG
ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA
CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT
TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCG3
TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G
HU 215 948 Β
A Hindlll-SnaBI fragmenst ezután beépítjük a pSEj vektorba, amelyet ezt megelőzően a Hindlll és Smal restrikciós enzimekkel emésztettünk. így kapjuk a
14. ábrán látható pSV860 plazmidot, amelyben a szimbólumok jelentése ugyanaz, mint a 13. ábrán, az új HindlII-SnaBI fragmenst 1¾¾¾¾ szimbolizálja. (A SnaBI-Smal restrikciós helyek a ligálás következtében eltűntek).
17. példa
Az urát-oxidáz cDNS ideiglenes expressziója COSsejtekben - Az urát-oxidáz-aktivitás vizsgálata a sejtlizátumban
A COS-sejtek majomvesesejtek, amelyek az SV40 vírus T-antigénjét expresszálják [Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182 (1981)]. Ezek a sejtek, amelyek lehetővé teszik az SV40 vírus DNS replikációs origóját tartalmazó vektorok replikációját, előnyös gazdaszervezetek a gének állati sejtekben való expresszálásának vizsgálatára.
1. A COS-sejtek transzfekciója és az urát-oxidáz cDNS átmeneti expressziója
4χ 105 COS-sejtet szélesztünk 6 cm átmérőjű Petricsészére (Corning) Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajban (Gibco), a továbbiakban DMEM néven nevezzük, amely 0,6 g/1 glutamint és 3,7 g/1 NaHCO3-ot tartalmaz, és 5% borjúmagzatszérummal (GIBCO) van kiegészítve. Miután körülbelül 16 órán tenyésztettük 37 °C-on 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában, a táptalajt leszívatjuk, és a sejteket 3 ml PBS-sel (foszfáttal puffereit sóoldat, GIBCO) mossuk. Ezután a következő elegyet adjuk hozzá: 100 μΐ (DMEM +10% borjúmagzatszérum, GIBCO), 110 μΐ 50000-es átlagos molekulatömegű dietil-amino-etil-dextrán 2 mg/ml koncentrációban (Pharmacia), 1,1 μΐ 100 mmol-os klorokin (Sigma), és 3 μg DNS-t akár a pSV860, akár a pSE! plazmidból (ez utóbbi a kontroll). Miután 5 órán át 37 °C-on inkubáltuk 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában, az elegyet leszívatjuk a sejtekről. 2 ml 10% dimetil-szulfoxidot (spektroszkópiai minőség, Merck) tartalmazó PBS-t adunk hozzá. Miután 1 percig szobahőmérsékleten tartottuk, az elegyet eltávolítjuk, és a sejteket kétszer mossuk PBS-sel, 5 ml, 2% boíjúmagzatszérummal kiegészített DMEM-et adunk hozzá. Az inkubálást 4 napig folytatjuk 37 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában.
2. A minták előállítása
A táptalajt leszívatjuk, majd a COS-sejteket kétszer öblítjük 3 ml PBS-sel. A sejteket ezután gumispatulával vakargatva összegyűjtjük 1 ml PBS-ben. A vakargatás után a lemezt 1 ml PBS-sel öblítjük. A két sejtszuszpenziót egyesítjük, majd 10 percig 1000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, majd a sejtek maradékát 1 ml 0,5 mól trietil-ammónium (TEA) (ph=8,9)/EDTA pufferben szuszpendáljuk.
A sejteket ezután ultrahanggal feltárjuk (jégen), 10 másodperces pulzusokkal (Vibra Cell, Sonics and Materials Ind., Amerikai Egyesült Államok), 12 W-ra állítva az energiát. A sejtlizátumot 10 percig 10 000/perc fordulatszámmal lecentrifugáljuk, majd a felülúszót eltávolítjuk az urát-oxidáz vizsgálata céljából.
3. Az urát-oxidáz-aktivitás vizsgálata
Az urát-oxidáz-aktivitást a 9. példában leírt módon vizsgáljuk.
Az eredmények az alábbi táblázatban találhatók:
Transzfektált COS sejtek Urát-oxidáz-aktivitás (U/ml)
pSV860 0,105
pSEl <0,01
Azt találtuk, hogy az urát-oxidáz cDNS-t tartalmazó pSV860 plazmiddal transzfektált COS-sejtek elfogadható szinten expresszálják az urát-oxidáz-aktivitást, míg a kontroliban nincs detektálható urát-oxidáz-aktivitás. Tehát az urát-oxidáz cDNS expresszálódik.
Az 1. ábra az urát-oxidáz triptikus emésztésével kapott termék elúciós profilját mutatja a 218 nm-nél mért optikai sűrűség alapján.
A 2. ábra az urát-oxidáz V8 proteázos emésztésével kapott termék elúciós profilját mutatja a 218 nm-nél mért optikai sűrűség alapján.
A 3. ábra a 9C klón és a 9A klón egy részének nukleotidszekvenciáját mutatja, ahol a 9A klón kezdetét jelzi.
A 4a) és 4b) ábra a 3. ábra 109 helyzeténél ATG-vel induló DNS-szekvenciát és a kódolt polipeptidet mutatja. Az A. flavus urát-oxidáz tripszines és V8 proteázos emésztésével kapott, szekventált peptideket a kódolt polipeptideknél nyilak jelzik, az alábbiak szerint: <-> triptikus peptid <-----> V8 proteázos emésztéssel kapott peptid.
Az 5. ábra a pl63,1 plazmidot, a 6. ábra a pl60 plazmidot, a 7. ábra a p373,2 plazmidot, a 8. ábra a p462 plazmidot, a 9. ábra a p466 plazmidot, a 10. ábra a pEMR414 plazmidot, all. ábra a pEMR469 plazmidot, a 12. ábra a pEMR473 plazmidot, a 13. ábra a pSE( plazmidot és a 14. ábra a pSV860 plazmidot ábrázolja.
HU 215 948 Β

Claims (12)

1. Eljárás legalább 16 egység/mg fajlagos urátoxidáz-aktivitással rendelkező rekombináns fehérje előállítására, amelynek szekvenciája a következő: 5
Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gin Thr Val Tyr Glu Met Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gin Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Val Gin Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Tnr Leu Lys. Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gin Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gin Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser Val Gin Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gin Ile Leu Ala Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gin Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gin Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu
amelyet kívánt esetben egy metionincsoport előz meg, azzal jellemezve, hogy (i) egy, a fenti fehérjét kódoló gént tartalmazó expressziós vektorral, és annak kifejeződéséhez szükséges elemekkel transzformált gazdasejtet tenyésztünk, (ii) a tenyésztett sejteket lizáljuk, és (iii) a lizátumból izoláljuk és tisztítjuk a rekombináns fehérjét. (Elsőbbsége: 1990.07. 13.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 30 egység/mg fajlagos urát-oxidáz-aktivitással rendelkező rekombináns fehérjét állítunk elő. (Elsőbbsége: 1990. 07. 13.)
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előállított fehéije legalább 90 tömeg%-át kitevő, kétdimenziós gélen vizsgálva mintegy 33,5 kDa molekulatömegű rekombináns fehérjét állítunk elő. (Elsőbbsége: 1990.07. 13.)
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ojtott C8 szilikagél oszlopon folyadékkromatográfiásán meghatározva legalább 80%os tisztaságú rekombináns fehérjét állítunk elő. (El35 sőbbsége: 1990. 07. 13.)
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 8,0 izoelektromos ponttal rendelkező rekombináns fehérjét állítunk elő. (Elsőbbsége: 1990.07. 13.)
40
6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminoterminális szerincsoporton egy blokkolócsoportot tartalmazó rekombináns fehérjét állítunk elő. (Elsőbbsége: 1990. 07. 13.)
7. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, az45 zal jellemezve, hogy valamely, az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított rekombináns fehérjét a gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyagokkal és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk. (Elsőbbsége: 1990.
50 07.13.)
8. Eljárás a következő szekvenciával rendelkező:
Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gin Thr Val Tyr Glu Met Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr
HU 215 948 Β
Ile Thr Alá Lys Gin Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile 6lu Lys Tyr Asn His Ile His Alá Alá His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn val Gin
Val Asp Val Va i Glu i Gly i Lys ' Gly Ile Asp Ile l Lys Ser Ser i Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp G lu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Alá Thr Trp Gin Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gin Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Alá Thr Trp Alá Thr Alá Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Alá Glu Asp Asn Ser Alá Ser Val Gin Alá Thr Met Tyr Lys Met Alá Glu Gin Ile Leu Alá Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Se r Trp His Lys Gly Leu Gin Asn Thr Gly Lys Asn Alá Glu Val Phe Alá Pro Gin Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu
fajlagos urát-oxidáz-aktivitást mutató proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns gén előállítására, azzal jellemezve, hogy
- ri.//avu.y-ból mRNS-t izolálunk,
- az mRNS poliA+-frakcióját tisztítjuk,
- a kapott frakció alapján cDNS-könyvtárat hozunk létre,
- a kapott cDNS-könyvtárat a fehérje aminosavszekvenciájából kikövetkeztetett szekvenciával rendelkező minták két csoportjával átvizsgáljuk,
- az urát-oxidáz-aktivitással rendelkező átvizsgált fragmensekből kiindulva meghatározzuk a cDNS-t. (El25 sőbbsége: 1989. 07. 13.)
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokarióta mikroorganizmusokban kifejeződő gént állítunk elő. (Elsőbbsége: 1989.07. 13.)
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 30 hogy a következő DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-t állítjuk elő:
ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT
GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AAATTG (Elsőbbsége: 1989. 07. 13.)
HU 215 948 Β
11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezhogy eukarióta mikroorganizmusokban kifejeződő gént ve, hogy a következő DNS-szekvenciát tartalmazó állítunk elő. (Elsőbbsége: 1989.
12. 29.) DNS-t állítjuk elő:
ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGACTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCT6GAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC
I
AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA
HU906046A 1989-07-13 1990-07-13 Eljárás urát-oxidáz aktivitással rendelkező protein, azt kódoló gén, expressziós vektor és mikroorganizmusok előállítására HU215948B (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8909550A FR2649720A1 (en) 1989-07-13 1989-07-13 Recombinant gene which encodes a protein such as urate oxidase
FR8917466A FR2656530B1 (fr) 1989-12-29 1989-12-29 Gene recombinant pour une expression dans les cellules eucaryotes d'une proteine telle que l'urate oxydase.
FR9001368A FR2657785A2 (fr) 1989-12-29 1990-02-06 Gene recombinant pour une expression dans les cellules animales d'une proteine telle que l'urate oxydage.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU906046D0 HU906046D0 (en) 1991-07-29
HUT56884A HUT56884A (en) 1991-10-28
HU215948B true HU215948B (hu) 1999-03-29

Family

ID=27251947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU906046A HU215948B (hu) 1989-07-13 1990-07-13 Eljárás urát-oxidáz aktivitással rendelkező protein, azt kódoló gén, expressziós vektor és mikroorganizmusok előállítására

Country Status (24)

Country Link
EP (1) EP0408461B1 (hu)
JP (1) JP2664804B2 (hu)
AT (1) ATE144282T1 (hu)
AU (1) AU636637B2 (hu)
BR (1) BR9006855A (hu)
CA (1) CA2035900C (hu)
DE (2) DE10199042I2 (hu)
DK (1) DK0408461T3 (hu)
ES (1) ES2095243T3 (hu)
FI (1) FI105047B (hu)
GR (1) GR3022085T3 (hu)
HK (1) HK1000099A1 (hu)
HU (1) HU215948B (hu)
IE (1) IE77158B1 (hu)
IL (1) IL95057A (hu)
LU (1) LU90781I2 (hu)
LV (1) LV12000B (hu)
MC (1) MC2145A1 (hu)
NL (1) NL300046I2 (hu)
NO (1) NO2001018I2 (hu)
NZ (1) NZ234453A (hu)
PT (1) PT94680B (hu)
RU (1) RU2105812C1 (hu)
WO (1) WO1991000909A1 (hu)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2971218B2 (ja) * 1991-12-04 1999-11-02 協和醗酵工業株式会社 ウリカーゼ遺伝子およびウリカーゼの製造法
US5691188A (en) 1994-02-14 1997-11-25 American Cyanamid Company Transformed yeast cells expressing heterologous G-protein coupled receptor
HU230275B1 (hu) * 1996-09-13 2015-11-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc Eljárás tisztított humán alfa-galaktozidáz-A készítmények előállítására, és a tisztított készítményeket tartalmazó gyógyászati készítmények, alfa-gal-A-deficienciából eredő rendellenességek kezelésében történő alkalmazásra
US6083725A (en) 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
ES2361190T3 (es) 1998-08-06 2011-06-14 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso.
US6783965B1 (en) * 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
CA2419453C (en) 2000-08-17 2010-03-09 Ajinomoto Co., Inc. Mutant transglutaminase from streptoverticillium having modified substrate specificity
AU2003228722B2 (en) 2002-04-25 2009-06-25 Takeda Pharmaceutical Company Limited Treatment of alpha-galactosidase A deficiency
WO2006110761A2 (en) 2005-04-11 2006-10-19 Savient Pharmaceuticals, Inc. A variant form of urate oxidase and use thereof
TWI418564B (zh) * 2005-04-11 2013-12-11 Savient Pharmaceuticals Inc 利用陽離子界面活性劑之蛋白質純化
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
CZ2007695A3 (cs) 2005-04-11 2008-02-27 Savient Pharmaceuticals, Inc. Variantní formy urátoxidázy a jejich použití
HU230758B1 (hu) * 2006-04-12 2018-03-28 Crealta Pharmaceuticals LLC 100% Fehérjék tisztítása kationos felületaktív anyaggal
RU2443426C2 (ru) * 2008-11-07 2012-02-27 Мунтэн Вью Фармасьютикэлз, Инк. Конъюгаты уратоксидазы, фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты и способ получения вышеупомянутых конъюгатов
SG176897A1 (en) 2009-06-25 2012-01-30 Savient Pharmaceuticals Inc Methods and kits for predicting infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricase therapy
CN109223707B (zh) * 2018-09-13 2020-12-08 中国药科大学 一种尿酸酶外用凝胶制剂、其制备方法及用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR6301M (hu) * 1967-03-29 1968-09-09
SU457723A1 (ru) * 1973-04-09 1977-08-05 Всесоюзный Научно-Исследовательский Витаминный Институт Штамм 313-152 - продуцент уратоксидазы
EP0423890A3 (en) * 1984-07-27 1991-07-03 Unilever Nv Use of oxidoreductases in bleaching and/or detergent compositions and their preparation by microorganisms engineered by recombinant dna technology
WO1988008450A1 (en) * 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
JPH0671428B2 (ja) * 1988-08-17 1994-09-14 サッポロビール株式会社 ウリカーゼのｄｎａ配列および製法

Also Published As

Publication number Publication date
HUT56884A (en) 1991-10-28
FI911212A0 (fi) 1991-03-12
HK1000099A1 (en) 1997-11-21
GR3022085T3 (en) 1997-03-31
NL300046I2 (nl) 2001-12-01
DE10199042I2 (de) 2003-10-23
IL95057A0 (en) 1991-06-10
EP0408461A1 (fr) 1991-01-16
DE10199042I1 (de) 2002-01-10
RU2105812C1 (ru) 1998-02-27
MC2145A1 (fr) 1992-02-18
EP0408461B1 (fr) 1996-10-16
DE69028884D1 (de) 1996-11-21
NZ234453A (en) 1993-01-27
DE69028884T2 (de) 1997-05-07
LV12000B (lv) 1998-06-20
NL300046I1 (nl) 2001-09-03
IE77158B1 (en) 1997-12-03
WO1991000909A1 (fr) 1991-01-24
JPH04501807A (ja) 1992-04-02
ATE144282T1 (de) 1996-11-15
CA2035900A1 (fr) 1991-01-14
NO2001018I2 (no) 2006-05-01
JP2664804B2 (ja) 1997-10-22
CA2035900C (fr) 2000-01-11
FI105047B (fi) 2000-05-31
PT94680B (pt) 1997-04-30
LV12000A (lv) 1998-03-20
LU90781I2 (fr) 2001-07-23
AU636637B2 (en) 1993-05-06
AU6052390A (en) 1991-02-06
ES2095243T3 (es) 1997-02-16
HU906046D0 (en) 1991-07-29
PT94680A (pt) 1991-04-18
DK0408461T3 (da) 1997-03-24
IL95057A (en) 1997-07-13
IE902559A1 (en) 1991-02-27
BR9006855A (pt) 1991-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1338642C (en) Bacterial methionine n-terminal peptidase
US5382518A (en) Urate oxidase activity protein, recombinant gene coding therefor, expression vector, micro-organisms and transformed cells
JP2592444B2 (ja) ポリペプチドの製造法
KR100566136B1 (ko) 효소적으로 활성인 재조합 카르복시펩티다제 b의 생산
HU215948B (hu) Eljárás urát-oxidáz aktivitással rendelkező protein, azt kódoló gén, expressziós vektor és mikroorganizmusok előállítására
JP3878207B2 (ja) ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド
Beck et al. Efficient production of active human manganese superoxide dismutase in Escherichia coli
US5013662A (en) Bacterial methionine n-terminal peptidase
JP2840441B2 (ja) 真正ｆｇｆの酵母における発現およびプロセシング
JP3004788B2 (ja) アルギニンデイミナーゼ発現ベクター、形質転換微生物およびアルギニンデイミナーゼの製造法
EP0404119A2 (en) Plasma-type glutathione peroxidase gene and application of the same
JPH08238087A (ja) サルコシンオキシダーゼおよびその製造法
JP3379133B2 (ja) オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子およびその利用
JPH09187280A (ja) ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａの用途
JPH02219570A (ja) ヒト５―リポキシゲナーゼの製造方法
JPH10117784A (ja) 新規プロテアーゼインヒビター及びそれをコードする遺伝子
JPH04325090A (ja) ブタ膵臓エラスターゼｉｉｉ

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SANOFI-SYNTHELABO, FR

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: RASBURICASE; REG. NO/DATE: EU/1/00/170/001 20010223

Spc suppl protection certif: S0400032

Filing date: 20041018

Expiry date: 20100713

Extension date: 20150713

Free format text: PRODUCT NAME: RASBURICASE; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/00/170/001 20010223

Spc suppl protection certif: S0400032

Filing date: 20041018

Expiry date: 20100713

Extension date: 20150713