LV12000B - Olbaltumviela ar urātoksidāzes aktivitāti un tās iegūšana - Google Patents

Description

1 LV 12000

Proteine a activite urate oxydase, gene recombinant codant pour celle-ci, vecteur d'expression, micro-organismes et celLules trans-formees. L'invention concerne une nouvetle proteine a activite 05 urate oxydase/ un medicament contenant celle-ci et les outils de genie genetique pour produire cette proteine et notamment un gene recombinant, un vecteur d'expression portant ce gene, les micro-organismes procaryotes et les cellules eucaryotes transformees par ce vecteur d'expression. 10 L'urate oxydase (EC 1.7.3.3.), egalement denommee uri- case, est une enzyme de la voie de degradation des purines. Cette enzyme n'existe pas chez les primates (comme l'Homme), les oiseaux, quelques reptiles ni chez la plupart des insectes. Certains chiens (comme le dalmatien) en sont egalement depourvus. 15 Chez l'homme, les bases puriques, adenine et guanine, sont converties en xanthine. La xanthine est oxydee par la xanthine oxyda$e pour former l'acide urique selon la rēaction : xanthine + V^O + 0^ -> acide urique + 0^ · 20

Le radical (>£ , substrat de la superoxyde dismutase, est transformē par cette derniere en peroxyde d*hydrogene. L'acide urique, metabolite present dans le sang, se trouve normalement essentiellement sous formē de sel monosodique 25 soluble. Toutefois, il peut arriver que, chez certaines personnes, l'acide urique precipite et formē des calculs. L'hyperuricemie, augmentation de la quantite d'acide urique en circulation dans le sang, cause le depot d'acide urique dans les tissus cartilagineux, ce qui entraine la goutte. L'hyperuricemie peut egalement avoir des 30 consequences sur les reins : un exces d'acide urique dans l'urine et dans les reins peut conduire a une nephrolithiase a acide urique, c'est-ā-dire ā l'accumulation de calculs renaux qui sont tres douloureux et peuvent endommager te rein. Ces calculs sont composes d'acide urique eventuellement associe avec des sels phos-35 phates et oxalates. 2

La surproduction d'acide urique peut avoir des origines diverses : defauts metaboliques congenitaux, syndrome de

Lesch-Nyhan, l'ingestion en exces de purine oii de protēines, traitements avec des drogues uricosuriques, traitement des 05 hemopathies, notamment cancereuses ā L'aide des cytolytiques (chimiotherapie) ou par radiotherapie, etc. (Gutman, AB et YU, T.F. (1968) Am. J. Med. 45 - 756-779). L'urate oxydase, enzyme qui catalyse La degradation de l'acide urique en alLantoine (compose beaucoup plus soluble que 10 L'acide urique, ne cristaLLisant pas aux concentrations atteintes dans Les liquides bioLogiques), presente donc un interēt therapeu-tique. Utilisee en injection, eLLe presente un grand nombre d'avan-tages dans Le traitement de L'hyperuricēmie et des nephroLi-thiases : rapidite de L'effet hypo-uricemiant (diminution de 15 L'ordre de 50 % de L'hyperuricemie en moins de 24 h), meiLLeure protection du rein contre Les Lithiases par rapport a d'autres drogues comme L'aLLopurinoL (inhibiteur de La xanthine oxydase)/ etc. Cette enzyme est actueLLement principalement utiLis4e comme adjuvant des cytoLytiques en chimiotherapie. 20 L'urate oxydase utilisee actueLLement comme medicament est obtenue seLon un procede comprenant La cuLture d'un mycelium d'AspergiLLus fLavus et l'isoLement de L'urate oxydase par extrac-tion du miLieu de cuLture ainsi que pLusieurs etapes de purifica- tion partieLLe de cette proteine. Ce procede, qui permet L'obten- 25 tion d'urate oxydase d'activite specifique urate oxydase voisine de 8 U/mg, depourvue de contaminants toxiques, presente toutefois des inconvenients. En effet, La physiologie et surtout La genetique d'A. fLavus ne sont pas aisement travaillables (UOLOSHUK et ai, (1989) Applied environ. microbioL. voL. 55, p. 86-90). IL n'est 30 donc pas possible d'obtenir des souches qui produisent cette enzyme en quantites importantes. D'autre part, A. fLavus est susceptiblfe de produire des afLatoxines, LesqueLLes sont parfois difficiles ā separer. IL convient donc de verifier que Le produit purifie est exempt de ces toxines. 3 LV 12000 II existe donc un besoin pour une urate oxydase d'A. flavus plus pure ainsi que des outils et des techniques de genie genetique permettant de s'affranchir de ces inconvenients.

La demanderesse a purifiē l'urate oxydase extraite d'A. flavus, appelee ci-apres urate oxydase extractive, a un degre de purete tres superieur ā celui deja connu de cette proteine, determinē la sequence partielle de celle-la et construit deux pools de sondes marquees susceptibles de s'hybrider avec Ies nucleotides codant pour deux portions de cette proteine. Elle a ensuite construit un vecteur d'expression comprenant cet ADNc, transformē une souche d'E. coli K12 avec ce dernier, cultive celle-ci et verifie que le lysat des cellules contenait une proteine recombinante de la masse moleculaire attendue, qui possede une activite urate oxydase (capacite de degrader l'acide urique en allantoine).

La demanderesse a egalement construit plusieurs vecteurs d'expression dans Ies cellules eucaryotes comprenant un gene recom-binant codant pour l'urate oxydase dont la sequence comporte des variations par rapport a l'ADNc isole, introduites dans le but de mettre en place des codons usuels dans Ies cellules eucaryotes/. transformē differentes cellules eucaryotes ā l'aide de ces vecteurs, cultive celles-ci en faible volume ainsi qu'en volume plus important Cfermenteur) et constate que Ies lysats des cellules contenaient un taux important de proteine recombinante de la masse moleculaire attendue possedant une activite urate oxydase.

Elle a purifiē cette proteine recombinante et caracterise partiellement celle-ci, de fagon comparative vis-ā-vis de l'urate oxydase extractive. L'invention concerne donc une nouvelle proteine caracte-risee en ce qu'elle presente une activite urate oxydase specifique d’au moins 16 U/mg, en ce qu'elle a la sequence ci-apres :

Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr 6ly Lys Asp Asn Vai Arg Vai Tyr Lys Vai His Lys Asp Glu Lys Thr 6ly Vai Gln Thr Vai Tyr Glu Met Thr Vai Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala 4

Lys Gln Asn Pro Vai Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Vai Asn Ile Vai Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Vai Gln Vai Asp Vai Vai Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gln Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser Vai Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu, precedēe ēventue illement d'une mēthionine, ou en ce qu'el Lle presente un degre d'homologie substantiel avec cette sequence.

De preference, cette proteine a une activite urate oxy-dase specifique d'environ 30 U/mg.

Une proteine de ce type appreciee est celle qui, par ana-20 lyse sur un geL bidimensionnel presente un spot de masse molecu-laire d'environ 33,5 kDa et de point isoelectrique voisin de 8,0 representant au moins 90 % de La masse proteique.

De preference Le taux de purete de cette proteine determinē par chromatographie liquide sur une colonne de silice 25 greffee C8 est superieur a 80 %.

Une proteine interessante de ce type est celle qui a un point isoēlectrique voisin de 8,0. On apprecie que la serine amino-terminale porte un groupement bloquant, de preference de masse voi-sine de 43 unites de masse atomique, tel que par exemple le groupe 30 acetyle. L'invention a egalement trait au medicament qui contient, dans un vehicule pharmaceutiquement acceptable, la protēine definie precedemment. Celle-ci peut remplacer avantageusement, dans ses differentes indications, l'urate oxydase extractive d'activite 35 urate oxydase specifique voisine de 8 U/mg vendue en preparation injectable sous la marque Uricozyme (Vidai 1990). 5 LV 12000 L’ 'invention concerne aussi un gene recombinant i caracte- rise en ce qu' 1 il comporte une sequence d'ADN < :odant pour la pro- teine de sequence c- i-apres Met Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai Tyr Lys Vai Hi s Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai Gln Thr Vai Tyr Glu Met Thr Vai Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Vai Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Vai Asn Ile Vai Cys His Arg T rp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Vai Gln Vai Asp Vai Vai Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe T rp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr T rp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gln Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser Vai Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp Hi s Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu A cause de la degēnerescence du code genetique, i l ex- i ste un grand nombre de sequences d'ADN codant pour une proteine dont la 25 sequence repond a la formulē donnee ci-dessus. Parmi celles-ci une sequence preferee particuli^rement adaptee pour une expression dans Ies micro-organismes procaryotes est la suivante :

ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA 30 CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 35 AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG 6

ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGSCCTG

ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA

GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG

ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG

05 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAA6ACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA

AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCT6ATCGA GACTGTCGAG

TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA

GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 10 ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AAATTG.

Une autre sequence d'ADN preferee qui convient notamment pour l1expression dans Ies cellules eucaryotes, telles que la 15 levure, est la suivante :

ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGAGTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA 20 CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA 25 CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCT6 ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 30 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 35 ACCCCAACGG AAATTG. TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 7 LV 12000

Une autre sequence d'ADN preferee qui convient notamment pour une expression dans Ies cellules animaLes est.La suivante :

05 5'-ATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC 10 TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG 15 CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG 20 ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCGG TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G 25 precedee d'une sequence 5' non traduite favorabLe ā l'expression dans Ies ceLLules animaLes. Une teLLe sēquence 5' non traduite pre-fēree est ceLLe qui comprend La sequence : AGCTTGCCGCCACT, situee immediatement en amont de La sequence expLicitee ci-dessus.

On notera que La proteine codee par Les sequences d'ADNc 3Q donnees ci-dessus peut subir une maturation par La methionyL-amino-peptidase, qui La cLive de son residu methionine amino-terminaL. L'invention concerne egaLement un vecteur d'expression qui porte, avec les moyens necessaires ā son βχρΓβεείοη, Le gene recombinant defini precedemment. δ

Pour une expression dans Ies micro-organismes proca-ryotes, en particulier dans Escherichia coLi, La sequence codante doit ētre inseree dans un vecteur d'expression comportant notamment un promoteur efficace, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gene ā exprimer, ainsi qu'une sequence d'arrēt de trans-cription efficace en aval du gēne ā exprimer. Ce plasmide doit egaleraent comporter une origine de replication et un marqueur de selection. Toutes ces sequences doivent ētre choisies en fonction de La ceLLuLe hēte.

Pour une expression dans Les ceLLuLes eucaryotes, Le vecteur d’expression seLon L'invention porte Le gene recombinant defini precedemment avec Les moyens necessaires ā son expression, a sa replication dans Les ceLLuLes eucaryotes et a La seLection des ceLLuLes transformēes. De preference, ce vecteur porte un marqueur de seLection, choisi par exempLe pour compLementer une mutation des ceLLuLes eucaryotes receptrices/ qui pertnet La selection des ceLLuLes qui ont integrē Le gene recombinant en un nombre de copies ēleve soit dans Leur gēnome, soit dans un vecteur multicopie.

Pour une expression dans Les ceLLuLes animaLes, notamment dans Les ceLLuLes d'ovaires de hamster chinois CHO, La sequence codante est inseree dans un plasmide (par exempLe derive du pBR 322) comportant deux unites d'expression/ une premiere unite dans LaqueLLe est insērē Le gene recombinant devant un promoteur efficace (par exemple Le promoteur precoce de SV40). La sequence autour de L'ATG d'initiation est de preference choisie en fonction de La sequence consensus decrite par KOZAK CM. KOZAK (1978) CeLL-7 15/ 1109-1123). Une sequence intronique/ par exemple L'intron de L'a-globine de souris/ peut ētre inseree en amont du gēne recombinant ainsi qu'une sequence comportant un site de polyadēnylation/ par exemple une sequence de poLyadenyLation du SV40/ en avaL du gene recombinant. La deuxieme unite d'expression comporte un marqueur de selection (par exemple une sequence d'ADN) codant pour La dihydro-folate reductase (enzyme ci-apres abrēgēe DHFR). Le pLasmide est transfecte dans Les ceLLuLes animaLes, par exemple Les ceLLuLes CH0 DHFR (incapables d'exprimer La DHFR). Une lignee est selectionnee pour sa resistance au methotrexate : elLe a integrē dans son genome 9 LV 12000 un nombre ēlevē de copies du gēne recombinant et exprime ce dernier ā un niveau suffisant.

Pour une expression dans Ies cellules eucaryotes telles que la levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae, il convient d'insērer la ' sēquence codante entre, d'une part, des sēquences reconnues comme promoteur efficace, d'autre part, un terminateur de transcription. L'ensemble promoteur-sēquence codante-terminateur, appelē cassette d'expression, est clonē soit dans un vecteur plas-midique (monocopie ou polycopie pour la levure, soit integrē en multicopie dans le gēnome de la levure. L'invention a ēgalement trait aux cellules eucaryotes transformēes par le vecteur d’expression prēcēdent. Parmi celles-ci, on apprēcie Ies souches de l'espece Saccharomyces cerevisiae, en particulier celles qui comportent une mutation sur l'un des gēnes responsables de la synthese de la leucine ou de l'uracile, par exemple le gene LEU2 ou le gēne URA3. L'invention a ēgalement trait aux cellules animales contenant, avec Ies moyens nēcessaires a son expression, ce gēne recombinant. Ce dernier peut, par exemple, avoir ētē introduit dans Ies cellules par transfection par le vecteur d1expression ci-dessus, par infection au moyen d'un virus ou d'un rētro-virus le portant, ou par microinjection. L'invention a ēgalement pour objet un procēdē d'obtention d'urate oxydase recombinante qui comprend Ies ētapes de : 1) mise en culture d'une souche telle que dēfinie ci- dessus : 2) lyse de cellules ; 3) isolement et purification de l'urate oxydase recombinante contenue dans le lysat. L'invention sera mieux comprise a l'aide des exemples ci- aprēs : une grande partie de l'ensemble des techniques ci-aprēs, bien connues de l'homme de l'art, est exposēe en dētail dans l'ouvrage de Maniatis et al : "Molecular cloning : a laboratory manual” publiē en 1984 par Ies ēditions Cold Spring Harbor Press ā Neu York. 10 EXEMPLE 1 : Isolement des ARN messagers d1Aspergillus flavus

La souche d'A. flavus productrice d'urate oxydase a ete cultivee dans des conditions de production d'urate oxydase, c'est-a-dire dans un milieu contenant de l'acide urique de composition suivante : glucose 15 g/l, MgS0.,7H~0 1 g/l, ΚΗ-,ΡΟ. 0,75 g/l, CaC0_ ** L L k 3 1,2 g/l, acide urique 1,2 g/l, K0H 0,5 g/l, huile de soja 0,66 ml/1, FeS0^,7H->0 10 mg/l, CuS04,5H20 1 mg/l, ZnS04,7H20 3 mg/l, MnS04,H2Q 1 mg/L.

Le milieu est ajuste ā pH 7 avec H-SO. 1M et est steri- O t k lise a 120 C pendant 80 min.

Dans un erlenmeyer de 5 l on ensemence 1,5 l de milieu avec environ 1 ā 3-10^ spores.

La culture est incubee pendant environ 40 h ā 30°C sous agitation (120 tr/min). Le mycelium est recuperē par filtration sur gāze, lave avec de l'eau et congele dans l'azote liquide. 15 g de mycelium (poids humide) sont decongeles et resus-pendus dans 45 ml de tampon de lyse puis repris dans un mēme volume de billes (0,45 pm de diametre). Le tampon de lyse est constitue de thiocyanate de guanidine 4 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,6, E0TA 10 mM, β-mercaptoethanol 50 ml/l. La suspension mycelienne est broyee au broyeur Zellmūhle (vibrogene) pendant 5 min.

Le broyat est recupere et Ies billes decantees. Le surna-geant est preleve (environ 45 ml) et ramene ā 3 H final en chlorure de lithium et conserve ā 0°C.

Apres deux jours, on le centrifuge pendant 60 min ā 10 000 tr/min. Le surnageant est ecarte et le culot est repris dans 40 ml de LiCl 3M et recentrifuge a 10 000 tr/min pendant 1 h 30.

On ajoute la proteinase K (SIGMA), 40 pg/ml du SOS (0,1 7. P/V) et de l'EDTA ā 20 mM. On incube ā 37°C pendant 3 h. On prēcipite avec 2 volumes d'ethanol, puis on effectue un lavage a l'etbanol 70 %. On reprend le culot dans 0,5 ml de tampon TE (tris HCl 10 mM EDTA, 1 mM pH 7,5), on extrait 2 fois au chloroforme, on precipite ā l'ethanol. Les ARN sont conserves ā -8Q°C dans l'alcool. 11 LV 12000

EXEMPLE 2 : Purification de la fraction poly A* des ARN

Environ 1 mg d'ARN est precipite 20 min ā’4°C (15 000 tr/ min) puis lave avec de l'ethanol 70 % puis seche.

Le culot est repris dans 1 ml de tampon TE et resuspendu par agitation au vortex. L'oligo dT-cellulose type 3 (commer-cialise par Collaborative Research Inc, Biomedicals Product Division) est prepare suivant Ies recommandations du fabricant. L'ARN est depose sur l'oligo dT, agite doucement pour remettre en suspension Ies billes, puis chauffe pendant 1 min a 65°C.

La suspension est ajustee ā 0,5 M NaCl puis mise ā agiter doucement pendant 10 min. La suspension est alors centrifugee pendant 1 min ā 1 000 tr/min, le surnageant est elimine, le culot est lave 2 fois avec 1 ml de tampon TE contenant 0,5 M NaCl. Les surnageants sont elimines. L'elution de la fraction polyadenylee des ARN (constituee des ARN messagers) est obtenue par suspension des billes dans 1 ml de tampon TE, puis chauffage de cette suspension a 60°C pendant 1 min, suivi d'une agitation pendant 10 min sur plaque basculante. On centrifuge ensuite 1 min a 1 000 tr/min, ce qui permet de recuperer d'une part le surnageant contenant des ARNm libres en solution et d'autre part le culot de billes de cellulose. L'ensemble des operations ci-dessus (ā partir de l'elution) est repete. Les surnageants ainsi obtenus sont rassem-bles, on elimine l'exces de billes par centrifugation et on preci-pite le surnageant ā l'ethanol contenant du NaCl suivant les techniques habituelles. (Haniatis : op. prec.). EXEMPLE 3 : Constitution de la bangue des ADNc A partir des ARN messagers isoles comme decrit dans l'exemple precedent, on a realise une banque d'AONc dans le vecteur pTZ19R (commercialise par PHARMACIA). Ce vecteur est un plasmide comprenant un polylinker contenant des sites uniques de restric-tion.

La technique de clonage utilisee est celle dēcrite par Caput et al, (technique de l'amorce-adapteur (Primer-adapter) : (Caput et al, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) (1986) 83, 1670— 1674)). 12

Elle consiste d'une part ā digerer le vecteur par Pst1/ ajouter une queue de polydC sur l’extrēmitē 3' protubērante, puis a digerer Ies plasmides ainsi obtenus par BamHI. Le fragment corres-pondant au vecteur est purifiē sur colonne de Sēpharose CL4B (Pharmacia). II comprend donc une queue polydC ā une exlrēmitē/ l'autre extrēmite etant cohesive, du type BamHI. D'autre part/ Ies ARN messagers sont soumis ā la transcription inverse ā partir d'une amorce dont la sequence est la suivante 5'<GATCCGGGCCCT^2) Ainsi/ Ies ADNc prēsentent-iIs a leur extremite 5' la sēquence GATCC complēmentaire de l'extrēmitē cohēsive BamHI.

Les hybrides ARN-ADN obtenus par action de la transcriptase inverse sont soumis ā une hydrolyse alcaline qui permet de se debarrasser de l'ARN. Les ADNc simple brin sont alors purifies par 2 cycles sur colonne de Sepharose CL4B et soumis ā un traitement a la termiņai transfērase de fa?on ā ajouter des polydG en 3'. Les ADNc sont inseres sous formē simple brin dans le vecteur preparē comme decrit plus haut. Un second oligonucleotide "l'adapter" complementaire de l'amorce est necessaire pour generer un site BamHI "ouvert" a l'extremitē 5' des ADNc. Apres hybri-dation du vecteur/ de l’ADNc et de l,Madapter"/ les molecules recombinantes sont circularisees par l'action de la ligase du phage T4. Les reģions simple brin sont alors reparees grāce a l'ADN polymerase du phage T4. Le pool de plasmides ainsi obtenu sert ā transformer la souche MC 1061 pour la resištance ā l'ampicilline (Casabadan Chou et Cohen J. Bact. (1980) 143 pages 971-980). EXEMPLE 4 : Purification de l'urate oxydase extractive d'A. flavus et caractērisation de celle-ci 1) Purification de l'urate oxydase extractive d'A. flavus.

Une preparation d'urate oxydase extractive d'A. flavus (uricozyme - Laboratoires Clin Midy) presentant une activitd urate oxydase specifique de 8 U/ml (l'activitē spēcifique urate oxydase est le rapport entre l'activitē urate oxydase mesurēe selon le tēst dēcrit a l'exemple 9 et la masse de proteines totales mesurēe par la mēthode de Bradford : Anal. Biochem./ 72/ 248-254) a ētē repu- 13 LV 12000 rifiee par chromatographie sur une colonne d'agarose greffe Red" agarose 120 (SIGMA), concentration par ultrafiltration et filtra-tion sur un gel polyacryLamide-agarose ULtrogeL ACA 44 (IBF), selon Le protocole ci-aprēs : 05

Etape 1 : Chromatographie d'affinitē sur agarose greffe

Temperature : 4 C

Colonne : PHARMACIA K50/30 - diametre = 50 mm 10 - longueur = 33 cm

Resine : Red 120 Agarose (3 000 CL/R-0503 SIGMA) (volume de gel = 410 ml, hauteur de gel = 20 cm)

Tampon d'equilibrage : glycine/Na0H 20 mM pH 8,3

Tampon d'elution : glycine/Na0H 20 mM, NaCl 2M pH 8,3 15 Debit de mise en conditionnement : 250 ml.h ^ -1

Debit de fonctionnement : 160 ml.h

Debit d'elution : 60 ml.h ^ 1) Deposer en tēte de colonne, ā l'aide d'une pompe a debit cons- 20 tant la solution d'Uricozyme 2) Apres adsorption, laver la colonne par 2 fois son volume en tampon d'equilibrage 3) Eluer par un gradient de force ionique ayant la composition sui-vante :

25 glycine, NaOH, 20 mM pH 8,3/glycine, NaOH, 20 mM + NaCl 2M pH 8,3

Le volume total du gradient est egal a 10 fois le volume de la colonne, reparti pour moitie dans chacun des constituants. L'enregistrement chromatographique est operē ā λ = 280 nm ; le 30 pool urate oxydase est collecte apres regroupement des fractions presentant une activite urate oxydase specifique superieure ou egale ā 16 U/mg.

Etape 2 : Concentration du pool urate oxydase par ultrafiltration ā 35 l'aide d'un systēme Biopass comportant une membrane d'ultra-filtration de 10 kDa. 14

Etape 3 :

Temperature : 4°C

Colonne : PHARMACIA K 50/100 - diamētre = 50 mm - longueur = 100 cm

Resine : Polyacrylamide agarose avec groupements amine et hydroxyle : l'UltrogeL ACA 44 CIBF)

- volume de gel = 1,6 L - hauteur de gel = 80 cm

Tampon d'equilibrage : glycine/Na0H 20 mM pH 8,3 -1

Debit de mise en conditionnement : 40 ml.h Debit de fonctionnement : 24 ml.h 1) Deposer en tēte de colonne, ā l'aide d'une pompe ā debit cons-tant, le pool urate oxydase concentre. 2) Aprēs depot de l'echantillon, continuer d'alimenter la colonne avec du tampon glycine/Na0H 20 mM pH 8,3. 3) Apres chromatographie, laver avec du NaCl 2M jusqu'ā une valeur d'absorbance U.V. (λ = 280 nm) < 0,05.

Stocker sous NaCl 2 M ā 4°C. L'enregistrement chromatographique est opere ā λ = 280 nm ; le pool urate oxydase est collecte apres regroupement des frac-tions presentant conjointement : - une activite urate oxydase specifique superieure ou egale a 20 u/mg. - 2 bandes seulement en electrophorēse dans des conditions denaturantes (presence de S.D.S) et revelation au nitrate d'argent (kit de coloration Biorad), avec : . une bande majeure de 33-34 kDa . une bande mineure de 70-71 kDa 2) Caracterisation de l'urate oxydase extractive d'A. flavus purifiee : a) sequen?age partiel

Afin d'obtenir des informations sur la sequence des acides amines de l'urate oxydase extractive purifiee, permettant la 15 LV 12000 synthese des sondes necessaires au clonage de l'ADNc, un sequen?age amino-terminal direct de la proteine a ete tente. Ce dernier n'a pas abouti, ā cause d'un blocage amino-terminal de la proteine (Cf. f) ci-dessous).

La strategie ci-apres a donc ete developpee pour l'obten-tion de la sequence partielle de l'urate oxydase : - coupure de la proteine par des enzymes proteolytiques Cā l'aide des enzymes trypsine et protease V8 de Staphylococcus aureus) - separation des polypeptides obtenus par HPLC phase inverse - sequenpage des peptides purifies. a) Hydrolyse de L'urate oxydase par la trypsine, purification et seguenpage des peptides : l'urate oxydase a 9 mg/ml dans un tampon de carbonate d'ammonium 100 mH pH 8/9 a ete digeree par la trypsine (Northington, TPCK) avec un rapport urate oxydase/trypsine de 30/1 en poids a 30°C pendant 24 h. Apres l'hydrolyse tryptique/ 60 pg d'urate oxydase digeree ont ete directement injectes sur une colonne HPLC phase inverse de silice greffee Brounlee 618 (colonne 10 x 0,2 cm), equilibree en acetonitrile 1 7. (v/v), acide trifluoro-acetique 0,1 % (v/v) dans l'eau. Les peptides ont ete ensuite elues par un gradient lineaire d1acetonitrile dans une solution d'acide trifluoroacetique (0,1 % v/v) dans l'eau variant de 1 % ā 60 % d'acetonitrile en 60 min, avec un debit de 150 μΐ/min. Les peptides a la sortie de la colonne ont ete detectes par mesure de la densite optique a 218 nm.

Le profil d'elution est presente dans la figurē 1, dans laquelle les numeros suivant la lettre T (Trypsine) correspondent aux pics identifies.

Chaque pie a ete collecte et conserve ā -20°C jusqu'au moment de l'analyse sur un sequenceur de proteines (le modele 470 A d'Applied Biosystems), equipe d'un chromatographe (modele 430 A d'Applied Biosystems) qui analyse en continu les dērivēs phenyl-thiohydantoiques formēs, apres chaque cycle de degradation.

Le tableau (1) ci-apres presente les sequences peptidiques des 9 pics identifies. 16 β) Hydrolyse de l*urate oxydase par la protease V8, purification et seguencage des peptides. L'urate oxydase, a une concentration de 2 mg/ml dans un tampon acetate d'ammonium 100 mM pH 6,8, a ete digerēe par la pro-05 tease V8 de Staphylococcus aureus (Boehringer-Mannheim) avec un rapport urate oxydase/protease V8 de 60/1 ā 30°C pendant 72 h. 160 pg d'urate oxydase digeree ont ensuite ete injectes sur une colonne HPLC phase inverse de silice greffee Brounlee G18 (colonne 10 x 0,2 cm) ; particules (7 x 0,03 pm) equilibree en acetonitrile 10 1 %, acide trifluoroacetique 0,1 % (v/v) dans l'eau. Les peptides ont ensuite ete elues par un gradient lineaire d'acetonitrile dans une solution d'acide trifluoroacetique dans l'eau (0,1 % (v/v)) variant de 1 % ā 60 % d'acetonitrile en 60 min, avec un debit de 150 pl/ml. Les peptides ā la sortie de la colonne ont ete detectes 15 par mesure de la densite optique ā 218 nm.

Le profil d'elution est presente dans la figurē 2, dans laquelle les numeros suivant la lettre V (protease V8) corres-pondent aux pics identifies.

Chaque pie a ete collecte et conserve ā -20°C jusqu'au 20 moment de l'analyse sur le sequenceur de proteines dejā mentionne.

Le tableau (1) ci-aprās presente les sequences pepti-diques des 5 pics identifies. 17LV 12000 TABLEAU (1)

18 b) Activitē specifique : L'urate oxydase extractive purifiee prēsente une activitē specifique d'environ 30 U/mg. 05 c) Electrophorese en conditions denaturantes L'electrophorese de L'urate oxydase extractive purifiee sur geL de poLyacryLamide en presence de SDS (sodium dodecyl-10 sulfate), suivie d'une revelation ā l'argent, permet de voir une bande de forte intensite d'environ 33-34 kDa et une bande de tres faible intensite d'environ 70-71 kDa. d) Determination du point isoelectrique : 15 mode operatoire : - Utilisation des gels prets a L'empLoi, Les LKB AmphoLines Gel PLates de Pharmacia de gammes de pH : (3,5-9/5) et (5-8). 20 - Depot de 10 pL de protčines de temoins LKB (gamme des points iso- electriques des proteines tēmoins : 3,5-9,5) et d’urate oxydase purifiee 4 pg et 8 pg (sur deux pistes differentes). - Run 1 h 30, 12V, 6°C. - Puis coloration au bleu de Commassie (0,1 %) dans (25 % EthanoL, 25 8 % Acide Acetique) de fa?on ā colorer les proteines, suivie d'une decoloration a L'aide d'une soLution contenant 25 % Ethanol et 8 % Acide Acetique (pour eliminer Le bruit de fond). - Resultats : Observation sur chacune de deux pistes de deux bandes rapprochees (doublet) de points isoelectriques 8,1 et 7,9. 30 e) Analyse en gel bidimensionnel L'analyse en gel bidimensionnel permet de separer les proteines dans un premier temps d'apres leurs points isoelectriques et dans un deuxieme temps d'apres leurs masses moleculaires. 35 19 LV 12000

Protocole

Echantillon : solution d'urate oxydase extractive purifiee dans un tampon glycine 20 mM de pH 8,3.

Preparātiem de l'echantiLlon - Deux echantilLons de 5 pg et 10 pg d'urate oxydase ; - Sechage par centrifugation sous vide, reprise dans 5 pl du tampon de lyse de composition suivante : uree 2,5 M, / 3-(3-cholamidopropyl) dimethylammonio) 1-propane sul-fonate CHAPS (Sigma) / 2 % (v/v), / Amphoteres Ampholines (LKB) de gamme de pH 5-8 et 3,5-9,5 / 0,4 % et β mercaptoethanol 5 %.

Gel d'isoelectrofocalisation - Preparation d'une solution contenant : uree 9,5 M, CHAPS 5 %,

Ampholines LKB CpH (3,5-9,5) 1 7, ; pH (5-8) 1 %), Acrylamide/ bisacrylamide (28,4 %/1,7 %) 3,5 Z final, H2O- - Solution filtree et degazee puis addition de 0,075 Z de tetra-m4thylethylēne diamine Temed (Pharmacia) et de 0,015 Z persulfate d'ammonium. - Solution coulee dans des tubes (16 x 0,12 cm) - polymerisation une nuit a 20°C. - Solution cathodique : NaOH 0,1 M degazee.

Solution anodique : H^PO^ 25 mM. - Pre run 45 min 4 mA (voltage 300 V -> 1 000 V). - Depot des echantilLons au niveau de la cathode. - Run 19 h h 1 000 V ā 20°C. - Gels demoules et equilibres 10 min ā 20°C dans un tampon (Tris 0,375 M pH 8,8 ; SDS 3 Z, Dithiothreitol DTT 50 mM).

Gel denaturant PAGE/SDS - Preparation d'une solution contenant : Acrylamide/bisacrylamide (30 Z/0,8 Z) 15 Z final, tris-HCl (pH 8,8) 0,375 M, HgO. 20 - Solution filtree et degazee puis addition de SDS (0/1 %), de per- sulfate d'ammonium 0,05 % et de Temed 0,05 %. - Polymerisation une nuit ā 4°C (gel 16 x 20 x 0,15 cm). - Le gel d'isoēlectrofocalisation apres equilibration est depose ā 05 la surface du gel PAGE/SDS qui scelle par de l'agarose. - Tampon d'ēlectrophorese : (Tris-HCl 25 mM pH 8,3, glycine 0,192 M, SDS 0,1 X). - Run 100 mA - 6 h a 6°C. - Gel fixe dans 50 % de methanol, 10 % acide acetique puis colore 10 au nitrate d'argent (Mēthode de Blum. H., Electrophoresis 1987, 8 p. 93-99). - Gel scanne sur un analyseur d'image visage 2000/Kodak pour determiner la densite optique et la surface de chaque spot, donc permettre de calculer le rapport quantitatif entre Ies spots. 15 - La masse molaire de la proteine est determinee en ršalisant un gel bidimensionnel en presence de proteines temoins Amersham.

Resultat : 20 25 30

On observe deux spots de masse moleculaire voisine de 33,5 kDa, l'un majoritaire de point isoelectrique voisin de 8,0 d’intensite 5,2 (representant environ 93 % de la masse proteique), l'autre minoritaire de point isoelectrique voisin de 7,4 d'inten-site 0,41 (representant environ 7 % de La masse proteique). f) Determination de la sequence amino-terminale et de la masse du groupement amino-terminal bloquant : a) mise en evidence du caractere bloque de la sequence amino-terminale :

La sequence amino-terminale a ete analysee a l*aide d'un sēquenceur Applied Biosystem modele 470 A, couple ā un analyseur de derives phenylthiohydantoīques Applied Biosystem modele 120A. L'urate oxydase purifiee (200 pmoles contrSlēes par analyse d'acides amines) a ete deposee sur le sequenceur en presence de 20 pmoles de β-lactoglobuline, proteine temoin. 35 21 LV 12000

Aucune sequence amino-terminale correspondant a une sequence de l'urate oxydase n'a ete dštectee (par contre la sequence amino-terminale de la proteine temoin a ete detectee, donc le sequenceur fonctionne). L'urate oxydase d'A. flavus a donc l'extremite amino-terminale bloquee. β) dētermination de la sequence d'un peptide amino-terminal de 32 acides amines et de la masse du groupement amino-terminal bloquant :

Methode : Digestion par le bromure de cyanogene L'urate oxydase extractive purifiee est soumise ā un gel filtration sur un gel obtenu par reticulation du dextran avec de l1epichlorhydrine/ le Sephadex 625 (PD10 - Pharmacia), equilibre avec une solution contenant 7 % d'acide formique, ce qui permet d'eliminer Ies sels et de changer le tampon. - Par centrifugation sous vide, la concentration en acide formique est augmentee a 70 %. On ajoute alors dubromure de cyanogene ā 0,2 M final et on laisse reagir 20 h sous argon, en absence de lumiere, et ā temperature ambiante. - Separation par chromatographie d'echanges d'ions des peptides issus de la digestion au bromure de cyanogene de la proteine

Les peptides ont ete separes sur une colonne d'echanges d'ions ā base de resine hydrophyle mono S (Pharmacia).

Tampon A : Acetate d’ammonium 10 mM pH 6,2 Tampon B : Acetate d'ammonium 1 M pH 6,2

Debit : 0,6 ml/min, detection des pics par mesure de la densite optique a 278 nm

Gradients : a 0 % de B a 100 % B en 30 min - collecte de fractions de 1 ml. 22

Les fractions issues de L'etape d'echanges d'ions ont έΐέ anaLysees par geL PAGE/SDS suivant La methode decrite par Schagger et Von Jagou <1987) Anal. Biochem 166 - p. 368-379. 05 “ Purification du peptide amino-terminal par HPLC phase inverse et analyse par spectrometrie de masse de ce dernier

Le peptide issu de L'etape d'echanges d'ions et ayant une masse molaire voisine de 4 OOO Da (sur gel PAGE/SDS) a ete purifie sur 10 une coLonne d'HPLC phase inverse ā base de silice greffee C18/ La coLonne Beckman ALtex C18 <250 x 2,1 mm) Dēbit : 0,3 ml/min, detection des pics par mesure de La densite optique a 218 nm

Tampon A : ^0/0,1 7. TFA <acide trifLuoroacetique)

15 Tampon B : AcetonitriLe/0,1 % TFA

Gradient de 1 ā 50 % de B en 60 min.

Le peptide coLLecte apres une premiere etape d'HPLC phase inverse a ete repurifie sur La mēme coLonne d'HPLC phase inverse mais avec un 20 gradient different.

Gradient de 1 ā 50 % de B en 10 min.

Le pie coLLecte a ete soumis ā une anaLyse par spectrometrie de masse a bombardement par atomes rapides (FAB/MS) avec une matrice gLycēroL + thiogLyceroL. 25 - Digestion par La chymotrypsine du peptide amino-terminaL et ana-lyse des acides amines des peptides chymotryptiques separes par HPLC phase inverse 30 Afin d'etablir La sequence du peptide purifie par HPLC phase inverse, ceLui-ci a ete digere par La chymotrypsine. Les peptides chymotryptiques ont ete separes par HPLC phase inverse sur coLonne Beckman ALtex C18 <250 x 2,1 mm). D6bit 0,3 mL/min, detection des pics par mesure de La densite optique a 218 nm, 35 23 LV 12000

Tampon A Η^Ο/Ο,Ι1 % TFA Tampon B Acetonitrile/0,08 % TFA

Gradient de 1 7. de B ā 50 % B en 60 min - collecte des pics.

Les peptides chymotryptiques ont ete identifies par analyse d'acides amines sur AnaLyseur Applied Biosystem (modele 420-130A).

Resultats :

Les resultats presentes ci-apres, etablis postērieurement ā la determination de la sēquence de l'ADNc de l'urate oxydase d'A. flavus et de la sequence d'acides amines deduite (Cf. exemple 6), ne peuvent ētre compris qu'a la lumiere de ceux-ci. - Analyse par spectrometrie de masse du peptide amino- terminal.

On observe une difference d'environ 42 unites de masse atomique entre les deux masses moleculaires determinēes par spectrometrie de masse, 3684 et 3666, et les masses moleculaires theo-riques determinees a partir de la sēquence suivante. (sequence d'acides amines deduite de l'ADNc de l'urate oxydase d'A. flavus avec clivage du groupe methionine amino-terminal et coupure pepti-dique par le bromure de cyanogene apres le premier residu methionine) :

Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai Tyr Lys Vai His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai Gln Thr Vai Tyr Gly (1) avec un residu methionine carboxyterminal modifie par action du bromure de cyanogēne soit en homoserine, 3642, soit en homoserine lactone, 3624. II y a donc un groupement bloquant sur la serine amino-terminale qui confere une masse supplementaire d'environ 42 unites 24 de masse atomique, correspondant probablement ā une acetylation de ce dernier (masse de CH^CO-masse H = 42 unitēs de masse atomique). - Analyse des acides amines des peptides chymotryptiques:

Cette analyse a permis de montrer dans ambiguite que la sequence du peptide amino-terminal obtenu par digestion au bromure de cyanogēne comprend la sequence (1), explicitee ci-dessus.

La sequence complete d'acides amines de l'urate oxydase est indiquee ci-apres :

Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Ty r Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai Tyr Lys Vai His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai Gln Thr Vai Tyr Glu Met Thr Vai Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Vai Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Vai Asn Ile Vai Cys His Arg T rp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Vai Gln Vai Asp Vai Vai Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe T rp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr T rp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gln Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr T rp Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser Vai Gln Ala Thr Met Ty r Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 25 25LV 12000 EXEMPLE 5 : Criblage des bacteries 1) Preparation des sondes marquees

Deux pools de sondes deduites de sequences en aminoacides de la proteine ont ete synthetises ā l'aide d'un synthetiseur d'AON Biosearch 4600. Le premier pool correspond a la sequence de residus His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp (partie de la sequence de T 27), soit de 5' vērs 3' :

A T G G G

TCGAT TC AA TA TG T C A A A 4

Ce pool est en fait constitue de 2 x 3 = 48 oligonucleotides differents representant toutes Ies combinaisons possibles.

Le deuxieme pool correspond a la sequence en residus aminoacides Gln-Phe-Trp-Gly-Phe-Leu (partie de la sequence de V5), soit de 5' vērs 3' :

GG A G T

A AAGCCCCA AA TG AA C A C

T , 4

Ce pool est constitue de 2 x 4 = 64 combinaisons.

Les sondes sont marquees ā la termināle desoxynucleotide trans-ferase (TdT) (commercialise par IBI, Inc).

La reaction s'effectue sur 100 ng d'un melange d'oligo-nucleotides en solution (100 mg/ml) dans du tampon de reaction "Cobalt" (fourni 10 fois concentree par IBI inc. : 1/4 M de coco-dylate de potassium-pH 7,2, 300 mM de dithiothreitol/ 1 pl d'enzyme desoxynucleotidyl-terminal-transferase (IBI inc) et 50 pCi de desoxycytidyItriphosphate dCTP marque au P32.

La reaction se fait a 37°C pendant 10 min puis est arrētee en ajoutant 1 μΐ d'EDTA 0/5 M.

On extrait au phenol et on dialyse sur colonne de polyacrylamide Biogel P 10 (Biorad : 150~1050). 26 2) Hybridation et detection des colonies contenant L'ADNc de L'urate oxydase :

Environ 40 000 colonies sont criblees par'la technique d'hybridation in situ mise au point par Grunstein et Hogness (1975/ Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.)/ 72 3961). Environ 6 000 bacteries sont etalees sur boites de Pētri de fa?on ā obtenir des colonies isolees. Apres incubation pendant 24 h a 37°C/ chaque boite est repliquēe sur 2 filtrēs/ chaque filtrē etant destine a ētre traite avec un des 2 pools de sondes, de fagon que toutes Ies colonies obtenues soient testees avec Ies 2 pools de sondes en parallēle.

Les filtrēs sont mis έ hybrider avec un des 2 pools de sondes dans un tampon contenant 6 x SSC/ 10 x Denhardt's et 100 pg/ ml d'ADN de sperme de saumon sonique et denature (SIGMA). La tempe- rature d'hybridation est de 42°C et la duree de 16 h. La solution 6 x SSC s'obtient par dilution d'une solution 20 x SSC. La prepara- tion du tampon 20 x SSC est decrite dans Maniatis, Fritsch et Sambrook (op. citē). En rēsume, ce tampon contient 175,3 g/l de NaCl ; 88,2 g/l de citrate de sodium et est ajuste ā pH 7 par quelques gouttes de NaOH 10N. La solution 10 x Denhardt's contient 1 g de Ficoll, 1 g de polyvinylpyrrolidone/ 1 g de serum-albumine humaine pour 500 ml de volume final.

Apres lavage dans la solution 6 x SSC a 42°C (3 h avec 5 changements de bain), les filtrēs sont essuyes au papier Joseph et mis en autoradiographie. Les filtrēs sont revēlēs apres 16 h. II est apparu qu'une fraction d'environ 0,5 % des colonies hybridait avec les 2 pools de sondes. 5 colonies parmi celle-ci ont ete reprises et purifiees. On a preparē l'ADN plasmidique de chacune de ces colonies, et l'on a analyse cet ADN par digestion avec soit BamHI, soit HindIII, soit a la fois BamHI et HindIII.

Apres analyse sur gel d'agarose, il est apparu que les 5 plasmides obtenus sont linearises par BamHI et par HindIII. Les doubles digestions permettent de liberer un fragment correspondant a l'intēgralite de L'ADNc clonē. La taille de ce fragment est d'environ 1,2 Kb dans 3 cas, d'environ 0,9 Kb dans les 2 autres cas. Pour la determination ci-apres on a selectionnē un des 27 27LV 12000 fragments de 0,9 Kb et un des fragments de 1,2 Kb qui ont ete reclonēs (voir exemple 6 ci-apres). ΕΧΕΜΡΙΕ 6 : Determination de La sēguence de L'ADNc -de l'urate oxydase 05 On a reclone un des fragments de 0,9 Kb d'une part (clone 9A) et un des fragments de 1,2 Kb (clone 90 d'autre part, dans l'ADN de la formē replicative de phage simple-brin M13. L'ADN des clones M13 contenant d'une part le fragment de 0,9 Kb et d'autre part le fragment de 1,2 Kb a ete soumis a une digestion exonu-10 cleasique de maniere ā generer une serie de clones M13 chevauchants (procedure "Cyclone I Biosystem" de IBI). Ces derniers ont ete sequences par la methode des dideoxyribonucleotides (Sanger et al, PNAS-U.S.A.-1977, 14, 5463-5467).

La sequence nucleotidique du clone 9C est representee sur 15 la figurē 3 laquelle indique egalement par une fleche le debut du clone 9A et par un symbole nucleotidique muni d'un asterisque * Ies nucleotides sequences du clone 9A non identiques a ceux du clone 9C (quand on fait correspondre Ies deux sequences et Ies sites de res-triction Accl et BamHI utilises dans Ies constructions ulterieures 20 (Cf. exemple 10).

On constate que : - la sequence nucleotidique du fragment le plus long (clone 90 recouvre celle du fragment le plus court (clone 9A), ā deux differences pres (v figurē 3). Une des differences est silen-25 cieuse, l'autre correspond a un changement d'un residu tryptophane en residu glycine. Ces differences peuvent ētre dues, soit a des differences dans Ies ARN messagers isoles, (Cf. exemple 2 ci-dessus), soit a des erreurs de la transcriptase inverse utilisee lors de la constitution de la banque des ADNc (Cf. exemple 3 ci-30 dessus). Le sequen?age de l'ADN genomique, de l'urate oxydase d'A. flavus a permis de Iever cette ambiguitē : il s'agit d'un residu tryptophane (et donc probablement d'une erreur de la transcriptase inverse).

Dans le cas du fragment le plus long, un codon ATG (en position 109 sur la figurē 3) ouvre une phase ouverte correspondant ā un polypeptide de 302 aminoacides, de masse moleculaire voisine 35 28 de 34240 Da, dont la sequence correspond a la sequence partielle de l'urate oxydase d'A. flavus purifiee (Cf. exemple 4).

On a represente sur la figurē 4 la sequence d'ADN ouverte par le codon ATG et le polypeptide code, ainsi que par des fleches en vis-ā-vis avec le polypeptide code Ies peptides sequences CCf-exemple 4) obtenus par hydrolyse de l'urate oxydase d'A. flavus a l'aide de la trypsine et de la protease V8.

On constate que la sequence du polypeptide se termine par le triplet Ser-Lys-Leu, typique des enzymes a localisation peroxi-somale (Gould S.J. et al, J. Celi, Biology 108 (1989) 1657-1664). EXEMPLE 7 : Construction d'un vecteur d'expression de l'ADNc de l'urate oxydase

On a prepare le plasmide p466, vecteur d'expression dans E. coli. Ce dernier comprend un fragment de pBR327 incluant l'origine de replication et le gene de rēsistance ā l'ampicilline, il comprend egalement un promoteur synthetique d'E. coli (R. R0DRIGUEZ et M. CHAMBERLIN "Promoters-Structure and function (1982) Preager), une sequence de Shine-Dalgarno, suivie d'un polylinker presentant Ies sites uniques NdeI et KpnI, un terminateur de trans-cription (derive du phage fd) et le gene lac i.

Ce plasmide a ete construit ā partir d'un plasmide d'expression de l'hGH dans E. coli (p462) par substitution d'un fragment portant le gene de l'hGH par l'ADNc de l'urate oxydase.

La construction du plasmide p466 va maintenant etre decrite plus en dētail dans l'expose ci-apres dans Lequel il sera fait reference aux figurēs 5, 6, 7, 8, 9.

La figurē 5 represente une carte de restriction du plasmide p163,1. Les differents segments de restriction sont margues de maniere arbitraire selon la lēgende ci-dessous : = Segment d'ADN issu du plasmide pBR322

= Localisation de l'origine de replication (ORI) 29 LV 12000

= Segment d'ADN contenant La sequence codant pour un precurseur naturel de L'hGH

Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur de transcription

Segment d'ADN contenant un promoteur-operateur h/bride tryptophane-Lactose l)V5

Segment d'ADN codant pour la β-lactamase (ApR : resistance ā l'ampicilline).

La figurē 6 represente La carte de restriction d'un plasmide p160 dont Les fragments PvuI-XhoI-BamHI(1) et

Pvul-ORI-BamHI(2) proviennent respectivement des pLasmides p163,1 et pBR327 et dont Le petit fragment BamHI(2)-BamHI(1) est Le fragment 3 decrit ci- apres.

La figurē 7 represente La carte de restriction du pLasmide p373,2. Les differents segments de restriction sont margues de maniere arbitraire seLon La Legende ci-dessous : -ļ---ļ---J- = Sequence Pvul-BamHI issue du plasmide pBR327 = Sequence PvuI-XhoI issue du plasmide p163,1 issue du plasmide p163/1

//ļ// ////, ~ Sequence XhoI-HincII 30

XX X X X X ~ Fra9roent 3 decrit ci-apres = Segment d'AON du phage fd contenant un terminateur de transcription du ci-

La figurē 8 represente une carte de restriction plasmide p462, le fragment synthetique BgLII-HindIII defini aprēs etant represente par : Zf/f//

Aili AlU

La figurē 9 represente une carte de restriction du plasmide p466, le fragment Ndel-KpnI comprenant le gene codant pour l'urate oxydase etant represente par 1) Construction du plasmide p373,2

La strategie mise en oeuvre fait appel a des fragments obtenus ā partir de plasmides preexistants accessibles au public et ā des fragments preparēs par voie de synthese selon Ies techniques maintenant couramment utilisees. Les techniques de clonage employees sont celles decrites par T. MANIATIS EF, FRITSCH et J. SAMBR00K, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). La synthese des oligonucleotides est realisee a l'aide d'un synthetiseur d'ADN Biosearch 4 600.

On a soumis le plasmide p163,1 (figurē 5), decrit dans la demande de brevet EP-A-0245138 et deposee ā la CNCM sous la refe-rence 1—530 le 17 fēvrier 1986, a une digestion par les enzymes Pvul et BamHI. Ce plasmide contient le gene codant pour l’hGH. Le fragment Pvul-BamHI - ci-apres fragment 1 - contenant le site 31 LV 12000 d'action de l'enzyme de restriction XhoI, represente sur La figurē 5/ a ete purifie.

De mēme, on a soumis Le pLasmide pBR327, bien connu de l'honme de l'art, (cf. SOBĒRON, X et al., Gene, 9 (1980) 287-305) a 05 une digestion par Les enzymes Pvul et BamHI. Le fragment Pvul-BamHI - ci-apres fragment 2 contenant l'origine de rēplication, a ete purifie.

Puis on a preparē le fragment 3/ qui est un fragment synthetique BamHI(1)-BamHI(2) contenant Le gene Lac i et son promo-10 teur dont La sēquence est La suivante sur laquelle Les deux extre-mites du brin sont reperees par Les nombres 1 et 2 pour preciser L'orientation du fragment dans Les plasmides dēcrits aux figurēs 6 et 7. 15 FRAGMENT 3

BamHI(1)

5' GATCC GCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT 20 GAGCTAACTT ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CCAGGGTGGT TTTTCTTTTC ACCAGTGAGA CGGGCAACAG CTGATTGCCC TTCACCGCCT GGCCCTGAGA GAGTTGCAGC AAGCGGTCCA CGCTGGTTTG CCCCACGACC CGAAAATCCT GTTTGATGGT 25 GGTTAACGGC GGGATATAAC ATGAGCTGTC TTCGGTATCG TCGTATCCCA CTACCGAGAT ATCCGCACCA ACGCGCAGCC CGGACTCGGT AATGGCGCGC ATTGCGCCCA GCGCCATCTG ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CAGTGGGAAC GATGCCCTCA TTCAGCATTT GCATGGTTTG TTGAAAACCG GACATGGCAC TCCAGTCGCC TTCCCGTTCC GCTATCGGCT GAATTTGATT GCGAGTGAGA 30 TATTTATGCC AGCCAGCCAG ACGCAGACGC GCCGAGACAG AACTTAATGG GCCCGCTAAC AGCGCGATTT GCTGGTGACC CAATGCGACC AGATGCTCCA CGCCCAGTCG CGTACCGTCT TCATGGGAGA AAATAATACT GTTGATGGGT GTCTGGTCAG AGACATCAAG AAATAACGCC GGAACATTAG TGCAGGCAGC TTCCACAGCA ATGGCATCCT GGTCATCCAG CGGATAGTTA ATGATCAGCC 35 CACTGACGCG TTGCGCGAGA AGATTGTGCA CCGCCGCTTT ACAGGCTTCG ACGCCGCTTC GTTCTACCAT CGACACCACC ACGCTGGCAC CCAGTTGATC 32

GGCGCGAGAT TTAATCGCCG CGACAATTTG CGACGGCGCG TGCAGGGCCA

GACTGGAGGT GGCAACGCCA ATCAGCAACG ACTGTTTGCC CGCCAGTTGT

TGTGCCACGC GGTTGGGAAT GTAATTCAGC TCCGCCATCG CCGCTTCCAC

TTTTTCCCGC GTTTTCGCAG AAACGTGGCT GGCCTGGTTC ACCACGCGGG

05 AAACGGTCTG ATAACAGACA CCGGCATACT CTGCGACATC GTATAACGTT

ACTGGTTTCA CATTCACCAC CCTGAATTGA CTCTCTTCCG GGCGCTATCA TGCCATACCG CGAAAGGTTT TGCGCCATTC GATGGTGTCC G 3'

BamHI(2) 10 Les fragments 1, 2 et 3 ont ete alors Ligues de maniere ā obtenir le plasmide p160 represente sur La figurē 6.

Ce plasmide a ete soumis a une digestion partielle par Les enzymes de restriction HincII et Pstl. Le grand fragment HincII-PstI, contenant L'origine de replication et represente sur 15 La figurē 6, a ete ensuite ligue au fragment 4, represente ci-apres, qui est un fragment synthetique d'ADN portant une sequence codant pour Les 44 premiers acides amines d'un precurseur naturel de L'hGH et en amont de cette sequence des signaux de reguLation. 20 FRAGMENT 4

C^aI

5' TCGAGCTGACTGACCTGTTGCTTATATTACATCGA 25 30 35

AGCTCGACTGACTGGACAACGAATATAATGTAGJT

Nd^I

TAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGATAACAATTTCACACAGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT

ATCGATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTA ATG GCT ACC GGA TCC CGG ACT AGT CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG TAC CGA TGG CCT AGG GCC TGA TCA GAC GAG GAC CGA AAA CCG GAC GAC ACG GAC ^MATGSRTSLLLAFGLLCL -26 33 05 10 15 LV 12000

^al CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCT AGA CTT TTT

GGG ACC GAA GTT CTC CCG TCA CGG AAG GGT TGG TAA GGG AAT AGA TCT GAA AAA PWLQEGSAFPTIPLSf^“l_F -1 1 GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC

CTG TTG CGA TAC GAG GCG CGG GTA GCA GAC GTG GTC GAC CGG AAA CTG TGG ATC DNAMLRAHRLHQLAFLTY PstI CAG GAG ITT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CA GTC CTC AAA CTT CTT CGG ATA TAG GGT TTC CTT GTC TTC ATA AGT AAG G QEFEEAYIPKEQKY$F 44

Dans ce fragment, Les acides amines sont designes par des 20 Lettres selon le code suivant : 25 30 A = Alanine C - Cysteine D = Acide aspartique E = Acide glutamique F = PhenyLalanine G = Glycine H = Histidine I = Isoleucine K = Lysine L = Leucine M = Methionine N = Asparagine P = Proline Q = Glutamine R = Arginine S = Serine T = Threonine V = Valine W = Tryptophane Y = Tyrosine

Sont successivement soulignees dans ce fragment Les sequences -35 (TTGCTT) et -10 (TATAAT) de La sequence promotrice, 35 et la sequence de Shine et Dalgarno bien connue de l'homme de L'art. 34

Le plasmide p380,1 a ete ainsi obtenu.

Le plasmide p380,1 a ete ensuite soumis a une digestion par Ies enzymes de restriction Clal et NdeI de maniere a en eliminer le petit fragment Clal-Ndel du fragment 4 ci-dessus et a lui substituer le fragment Clal-Ndel ci-apres :

Clal

5' CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA

TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT

NdeI ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGSAGATATACA TAAAGTGTGTCAAAAAGCGCTTCTTCCTCTATATGTAT 5 ·

Le plasmide resultant est le plasmide p373,2 (figurē 7). 2) Construction du plasmide p466 :

Le plasmide p373,2 a ete soumis a une double digestion par Ies enzymes BgtII et HindIII. Le grand fragment issu de cette digestion a ete purifie et ligue avec un fragment d'AON synthe-tique, dont la sequence donnee ci-apres est destinee a reconstituer la fin du gēne de l'hGH suivie en 3' des sites de clonage KpnI et SnaBI.

B g l

I

I

GATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT ----+---------+---------+---------+---------+

AAGTTCGTCTGGATGTCGTTCAAGCTGTGTTTGAGTGTGTTGCTA

GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTC ---------+---------+---------+---------+-------—+---------+

CTGCGTGATGAGTTCTTGATGCCCGACGAGATGACGAAGTCCTTCCTGTACCTGTTCCAG 35 LV 12000

F s

P

I 05

GAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGTAA ---------+---------+---------+---------+---------+--------+

CTCTGTAAGGACGCGTAGCACGTCACGGCGAGACACCTCCCGTCGACACCGAAGATCATT 10 15

K P n I

S n a B I

H i n d I I I

GGTACCCTGCCCTACGTACCA ---------+---------+-----

CCATGGGAČGGGATGCATGGTTCGA 20 Ce fragment comprend Ies extremites cohesives Bglll et

HindIII. Le nouveau plasmide ainsi formē p462 (Cf. Fig. 8) comprend ainsi un site KpnI et un site NdeI qui vont servir au clonage du fragment portant l'ADNc de l'urate oxydase dans le vecteur d'expression. 25 Le plasmide hybride derive de pTZ19R portant l'ADNc d'environ 1,2 Kb (clone 90, de l'urate oxydase (voir exemple 3) comprend un site KpnI unique. Ce site est localise quelques paires de bases en aval du site de clonage de l'ADNc. D'autre part l'ADNc de l'urate oxydase contient un site Accl situe ā proximite de 30 l'extremite 5'.

On a donc isole et purifie le fragment Accl-Kpnl compre-nant la plus grande partie de cet ADNc. D'autre part on a synthe-tise deux oligonucleotides complementaires dont la sequence donnee ci-apres : 36

5'-TATGTCTGCGGTAAAAGCAGCGCGCTACGGCAAGGACAATGTTCGCGT ACAGACGCCATTTTCGTCGCGCGATGCCGTTCCTGTT ACAAGCGCAGA-5' est destinee ā reconstituer L'extremite 5' de L'ADNc. Ce fragment 05 synthetique ainsi obtenu possede une extremite NdeI et une autre AccII. Le fragment et La sequence synthetique ont ete Ligues avec Le vecteur d'expression coupe par KpnI et par NdeI. Cette Ligation ā trois fragments permet d'obtenir Le vecteur d'expression nomme p466/ de L'urate oxydase pour E. coLi (Cf. figurē 9). Ce pLasmide a 10 ete soumis a une serie d'hydroLyses enzymatiques par des enzymes de restriction, qui a permis de verifier La presence des sites de restriction attendus, en particuLier ceux portes par Le gene codant pour L'urate oxydase.

Le pLasmide p466 contient donc par construction un gene 15 codant pour L'urate oxydase de sequence ci-apres :

ATGTCTGCĢG TAAAAGCAGC Ģ_CGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA

CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA

CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC

20 GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT

CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC

TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC

AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA

CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG

25 ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG

ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA

GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG

ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG

CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT

30 GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA

AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG

TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA

GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG

ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 35 AAATTG. 37 LV 12000 (Les nucleotides differents des nucleotides de l'ADNc isole d'A. flavus sont soulignes dans la sequence ci-dessus. Ces differences ont ete introduites sur le fragment synthetique Accī-Kpnl de fa?on ā avoir en aval de l'ATG une sequence nucleotidique plus conforme ā celles habituellement rencontrees dans un gēne procaryote). EXEMPLE 8 : Expression de l'ADNc de l'urate oxydase

La souche E. coli K12 RR1 CBethesda research lab. Inc.) a ete transformee pour la resistance ā l'ampicilline avec le plasmide p466 et avec un plasmide temoin .negatif pBR322.

Des colonies resistantes ā l'ampicilline ont ete obtenues dans les 2 cas. 1 colonie de chaque type a ete mise en culture dans du milieu (LB + ampicilline 100 pg/ml). Apres une nuit a 37°C sous agitation, les deux cultures ont ete diluees 100 fois dans du milieu (LB + ampicilline 100 pg/ml). Apres 1 h de culture on y ajoute de l'IPTG (Isopropyl β-DThiogalactoside) 1 mM pendant 3 h.

Immunodētection de l'urate oxydase par Uestern blot : 1) Mode operatoire :

On preleve du milieu de culture obtenu apres 3 h d'induc-tion a l'IPTG une fraction aliquote correspondant a 0,2 ml ā D0 = 1. On centrifuge cette derniere et on elimine le surnageant. On soumet ensuite le culot a un Western blot, technique bien connue de l'homme de l'art, qui comprend les etapes suivantes : - Solubilisation du culot par ebullition pendant 10 min dans un tampon denomme tampon de charge constitue de Tris HCl 0,125 M pH 6,8 SDS 4 bleu de bromophenol 0,002 %, glycerol 20 Z, β-mercaptoethanol 10 % (selon le protocole decrit par LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685)), - separation electrophoretique des diffērentes proteines contenues dans le solubilisat selon le protocole decrit par LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685), - transfert desdites proteines contenues dans le gel sur un filtrē de nitrocellulose (selon la technique de H. T0WBIN et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354), 38

Immunodetection, realisee selon La technique de BURNETTE (VI.W. BURNETTE Ana. Biochem. 112 (1981) 195-20?·), elle implique successi-vement : . Le rin^age du filtrē de nitrocellulose pendant 10 min avec un tampon A (Tris-HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KCl 1 mM). . La mise en contact du filtrē de nitrocellulose pendant 30 min a 37°C avec un tampon B (tampon A additionne de serum-albumine bovine ā raison de 3 g pour 100 ml). . La mise en contact du filtrē de nitrocellulose pendant 1 h a 37°C avec un immunserum (des anticorps polyclonaux reconnais-sant l'urate oxydase d'A. flavus). . Le rinĢage du filtrē de nitrocellulose avec le tampon B. . La mise en contact du filtrē de nitrocellulose pendant 1 h ā 37°C avec une solution de proteine 6 marquee a l'iode 125 ā 0,1 microcurie/ml. . Le rin^age du filtrē avec le tampon A. . Le sechage du filtrē entre deux feuilles absorbantes. . La mise en contact d'un film radiographiqu'e. . La revelation du film. 2) Resultats :

On constate que la souche transformee par le plasmide p466 surproduit une proteine de poids moleculaire apparent d'environ 33 KDa qui est reconnue par Ies anticorps diriģēs contre l'urate oxydase d'A. flavus et qui est absente dans la souche temoin. EXEMPLE 9 : Dosage de l'activite urate oxydase

On preleve du milieu de culture obtenu apres 3 h d'induc-tion a l'IPTG dans Ies conditions de culture decrites ā l'exemple precedent une fraction aliquote correspondant ā l'equivalent de 0,5 ml ā DO = 1. On centrifuge cette derniere et on elimine le surnageant. On reprend Ies čūlots dans 1 ml de tampon TEA (Trietha-nolamine) 0,05 M pH 8,9. La suspension cellulaire est soniquee 2 fois pendant 30 s dans la glace avec un sonicateur ultrasonic W10 (regle a puissance 8 et intensite 4). Les extraits sont centrifuges a 10 000 g pendant 10 min, les surnageants sont utilises pour le dosage. 39 39LV 12000 0n effectue Les operations ci-dessus pour quatre colonies prises au hasard d'E. coli K12 transformē par Le plasmide p466 (colonies B.j, et D^) et une colonie transformee par le plasmide pBR322). 1) Principe

On suit la transformation de l'acide urique en allantoine par la diminution de l'absorbance a 292 nm. La reaction est la suivante :

h2o + o2 h2o + co2

Acide urigue AIlantoine (absorbant ā 292 nm) 2) Rēactifs

a) Tampon TEA 0,05 M pH 8,9/EDTA - dissoudre 7,5 g de TEA (rēactif pour analyse-ProLabo ref. 287.46.266) dans 400 ml d'eau distillee, - dissoudre 0,372 g de Complexon III (Merck-rēf. 8418) dans 50 m(_ d'eau distillēe, - reunir les deux Solutions et completer ā 500 ml (solution 1), - ajuster le pH de cette solution ā 8,9 par HCl 0,2N, - completer ā 1 000 ml avec de l'eau distillee (solution 2). b) Acide urique Solution stock - dissoudre 100 mg d'acide urique (Carbiochem ref. 6671) dans 50 mļ_ de la solution 1, - ajuster par HCl 0,2N ā pH 8,9, - completer a 100 ml par de l'eau distillee.

La solution obtenue peut se conserver une semaine a 4°r c) Acide urique Solution Substrat - prelever 1,5 ml de solution stock d'acide urigue (carbiochem rģf 40 6671) et diluer a 100 ml avec du tampon TEA/reactif pour analyse-Prolabo ref. 287.46.Z66).

Cette sotution doit ētre utilisee dans La journee. 3) Mode operatoire 05 0n introduit dans La cuve de quartz d'un spectrophoto- metre regle ā 292 nm et thermostate a 30°C Les volumes suivants : - 600 μΐ d'acide urique solution substrat (prechauffes a 30°C), - 100 μΐ des surnageants ci-dessus auxquels ont ete ajoutes 200 μΐ de TEA pH 8,9 (prechauffes ā 30°C). 10 On melange et on Lit le changement de densite optique toutes Les 30 s pendant 5 min. On en deduit ΔΕ, variation de La densite optique par minūte. 4) ResuLtats : L'activitē A enzymatique urate oxydase exprimee en U/mL 15 D0 1 est caLcuLee a partir de La mesure de ΔΕ ā L'aide de La formuLe : . _ ΔΕ x Vr x d A = -

I x V

PE 20 dans LaquelLe Les symboles Vr, d, I et Vp^ representent respecti-vement le voLume reactionneL (0,9 ml), Le taux de dilution (2), Le coefficient d'extinction de L'acide urique a 292 nm (12,5) et Le voLume de La prise d’essai (0,3 ml).

Les resuLtats obtenus sont rassembles dans Le tableau (II) ci-apres : 25 41 LV 12000 05 TABLEAU (II) 10 Souche d'E. coli K12 transformee par Activite urate oxydase (U/ml D0 1) PBR322 < 0,001 colonie A^ 0,086 p466 colonie B^ 0,119 colonie Cļ 0,135 colonie 0,118 II apparait clairement sur Le tableau ci-dessus que Ies cellules d'E. coli transformees par te plasmide p466 sont capables 20 en presence d'IPTG de produire une activite urate oxydase. EXEHPLE 10 : Construction de trois vecteurs d'expression de l*ADNc de l'urate oxydase dans la levure, Ies plasmides PEMR469, pEMR473 et pEMR515

La strategie mise en oeuvre fait appel ā des fragments 25 obtenus ā partir de plasmides preexistants accessibles au public et a des fragments preparēs par voie de synthese selon Ies techniques maintenant couramment utilisees. Les techniques de clonage employees sont celles decrites par T. MANIATIS, EF. FRITSCH et J. SAMBR00K dans "Molecular Cloning, a laboratory manual" (Cold Spring 30 Harbor Laboratory, 1984). La synthēse des oligonucleotides est realisee a l'aide d'un synthetiseur d'ADN Biosearch 4 600.

La description ci-apres sera mieux comprise a la lecture des figurēs 10, 11 et 12 qui representent respectivement des cartes de restriction du plasmide pEMR414, et des plasmides 35 pEMR469 ainsi que pEMR473. Les symboles utilises sur ces figurēs seront precises dans l'expose ci-apres. Dans le cas ou un site a 42 ete rendu franc par La polymerase de Kleenou, iL lui est affecte l'indice M°" ; lorsque Ies sites ont ete supprimes par ligation, i Ls sont indiques entre parentheses. 1) Construction du plasmide pEMR469 : 05 Ce plasmide a ete construit a partir du vecteur navette E- coli-levure pEMR414, construit par ligations successives des elements ci-aprēs : - le fragment Pstl-HindIII0 - symbolise par ++++ sur la figurē 10 - du plasmide pJDB207 (BEGGS, 1978 : Gene cloning in 10 yeast-p. 175-203 dans : Genetic Engineering vol 2 - MILLIAMSON -Academic Press - London UK) comprenant la partie amont du gene de

D resistance a l'ampicilline Amp de pBR322 (Sutcliffe 1979 Cold Spring Symp. Quart. Biol. 43, 779) et un fragment de 2 μ endogene formē B portant le gene LEU2 de S. cerevisiae partiellement delete 15 de son promoteur (appele LEU2d), le ločus STB (REP3) et l'origine de replication du 2 μ (HARTLEY et DONELSON, 1980, Nature, 286, 860-865). L,extremite HindIII de ce fragment a.ete rendue franche par action de la polymerase de Kleenow. Elle est notee HindIII0 sur la figurē 10. 20 - le fragment HindIII-Smal - represente par ΠΖ sur la figurē 10 - du chromosome V de levure contenant le gene URA3 avec son promoteur (R0SE et al., 1984, Gene, 29, p. 113-124). Ce fragment HindIII-Smal provient du plasmide pFLl (CHEVALLIER et al., 1980, Gene 11, 11-19)). L'extremite HindIII de ce plasmide a 25 ete rendue franche par l’action de la polymerase de Kleenow. - un fragment Saml-Bamhl - symbolise par "~~~sur la figurē 10 - contenant une version synthetique du promoteur du gene ADH2 ne differant de la version naturelle decrite par RUSSEL et SMITH (RUSSEL et al., 1983). J. Biol. Chem. 258, 2674-2682) que par 30 quelques paires de bases destinees a introduire des sites de restriction. (La sequence naturelle pourrait etre utilisee avec des resultats peu differents). La sequence de ce fragment est donnee ci-apres : 4305 10 15 20 25 30 35 LV 12000 S M m L a u I I 7 ^GGGACGCGTCTCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAAGTTGGAG ------+---------+---------+---------+---------+------ CCCTGCGCAGAGGAGACGGCCTTGTGGCCCGTAGAGGTTGAATATTCAACCTC AAATAAGAGAATTTCAGATTGAGAGAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCAGAGGAGA ---+---------+---------+---------+---------+--------+------ TTTATTCTCTTAAAGTCTAACTCTCTTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGTCTCCTCT S P h I GCATAGAAATGGGGTTCACTTTTTGGTAAAGCTATAGCATGCCTATCACATATAAATAGA ---+---------+---------+---------+---------+---------+------ CGTATCTTTACCCCAAGTGAAAAACCATTTCGATATCGTACGGAT AGTGTATATTTATCT GTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCGAGATACTCTT ACTACTGCTCTCTTGTTGTTTT ---+---------+---------+---------+---------+----------+------ CACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAGCTCTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAA TATCACTTCTTGTTTCTTCTTGGTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAA ---+---------+---------+---------+---------+---------+------ ATAGTGAAGAACAAAGAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTT B C a I m a H I I V CTATCAACTATTAACTATATCGATACCATATGGATCCGTCGACTCTAGAGGATCGTC ---+---------+---------+---------+---------+---------+---

GATAGTTGATAATTGATATAGCTATGGTATACCTAGGCAGCTGAGATCTCCTAGCAG 44 Β a m Η GACTCTAGAG^

CTGAGATCTCCTAG “ le fragment BglII-HindIII - syrobolis^ par^ĒtBĒ sur La figurē 10 - portant L'extremitē 3' du gene PGK de Levure. Ce fragment provient de la digestion compLete ģ L'aide de BglII du fragment HirtdIII de L'ADN chromosomique de Levure, portant Le gēne PGK dēcrit par HITZEMAN et ai. (1982 NucLeic Acids Res., 10, 7791-7808) LequeL ne presente qu'un site Bgln. Cette digestion permet d'obtenir deux fragments HindII I-Bgin, dont Le pLus petit d'environ 0,4 Kb, qui porte L'extremite 3' du gene PGK de levure est retenu. La sequence de ce dernier fragment est decrite par HITZEMANN et aL. (reference citee ci-dessus). Le site BglII est cLone dans Le site BamHI du fragment precedent (Les sites BamHI et BglII disparaissent donc) et Le site HindIIl, rendu franc par action de La polymerase de Kleenou, est cLone dans Le site PvuII du fragment PvuII-Pstl de pBR322 decrit ci-apres. - Le fragment PvuII~PstI - symboLise par xxx sur La figurē 10 - de pBR322 contenant L'origine de repLication et La partie avaL du gene de resistance a L'ampiciLLine Amp .

Le pLasmide pEMR414 ainsi constitue comporte donc Les elements suivants : - une origine de repLication et un gene de resistance ā β L'ampiciLLine Amp permettant La repLication et La seLection du pLasmide dans Les ceLLuLes E. coLi. Ces eLements permettent La transformation dans Les ceLLuLes de E. coli. - une origine de repLication pour La Levure (ARS), Le Ločus STB et Le gene LEU2 de S. cerevisiae sāns promoteur et Le gene URA3 avec son promoteur de S. cerevisiae. Ces eLements permettent La repLication et La seLection du pLasmide dans Les ceLLuLes de 45 LV 12000 S. cerevisiae ainsi qu'une efficacite de partition suffisante dans Ies cellules contenant le plasmide 2μ endogene. 05

Le plasmide pEMR414 a ete soumis ā une diģestion complete par Ies enzymes de restriction NheI et Ctal. Le petit fragment Nhel-Clal contenant le gene URA3, appele ci-apres fragment A, a ete purifie. 10

Le plasmide pEMR414 a ete soumis ā une diģestion complete par Ies enzymes NheI et BamHI. Le grand fragment Nhel-BamHI contenant notamment le gene LEU2d et l'origine de replication du plasmide pBR322, appele ci-apres fragment B, a ete purifie. 15

On a prepare d'autre part le fragment synthetique Clal-Accl contenant le debut d'un gene codant pour la proteine deduite de la sequence de l'ADNc de l'urate oxydase (clone 90. Ce fragment comporte des modifications par rapport au clone 9C, introduites dans le but de mettre en place des codons usuels dans la levure (Cf. SHARP et ai-, 1986, Nucl. Ac. Res. Vol. 14, 13, pp. 5125-5143) sāns changement des acides amines codes. La sequence de ce fragment, denomme ci-apres fragment C, est la suivante (Ies nucleotides soulignes sont ceux modifies par rapport au clone 90. 20 C l A c

c I a

I 25 f

CGATATACACAATGTCUCTGnAAĢGC^GCTAGATACGGUAGGACAACGTTAGAGT ---+---------+---------+---------+---------+---------+----

TATATGTGTTACAGACGACAATTCCGACGATCTATGCCATTCCTGTTGCAATCTCAGA 30 On a soumis le plasmide du clone 9C (Cf. figurē 3) a une diģestion par Ies enzymes Accl et BamHI. Le fragment AccI-BamHI qui contient la fin de l'ADNc de l'urate oxydase, ci-apres appele fragment D, a ete purifie. Ce fragment a la sequence suivante : 4ό

Accl

Ύ CΤACAAGGTTCACAAGGACCAGAAC

(TGTTCCAAGTGTTCCTGCTCTTC ACCGG7G7CCAGACGG7G7ACCAGA7CACC GTCTGTGTGCTTCTGGAGGGTGAGATTGAG ---------+---------+---------+

TGGCCACAGGTCTGCCACATGCTCTACTGG CAGACACACGAAGACCTCCCACTCTAACTC

ACCTCTTACAC.CAAGGCCGACAACAGCGTC ATTGTCGCAACCCACTCCATTAAGAACACC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

TGGAGAATGTGGTTCCGGCTGTTGTCGCAG TAACAGCGTTGGCTGAGGTAATTCTTGTGG

ATTTACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTT ACTCCTCCCGAGCTGTTCGGCTCCATCCTG ---------+--------- + ---------+ --------+---------+---------+

TAAATGTAGTGGCGGTTCGTCTTGGGGCAA TGAGGAGGGCTCGACAAGCCGAGGTAGGAC

GGCACACACTTCATTGAGAAGTACAACCAC ATCCATGCCGCTCACGTCAACATTGTCTGC ---------+---------+---------+--------- +---------+---------+

CCG7G7G7GAAC7AAC7C77CA7G77GG7G TAGGTACGGCGAGTGCAGTTGTAACAGACG

CACCGC7GGACCCGGATGGACATTGACGGC AAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCGCGAC ---------+---------+---------+---— ----+---------+---------+

GTGGCGACCTGGGCCTACCTGTAACTGCCG TTCCCTGTGGCAGTGAGGAAGTAGGCGCTG

AGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGAC GTGGTCGAGGGCAAGGGCATCGATATCAAG ---------+---------+---------+ ---------+ - — ----------------+

7CGC7CC7C77CGCC77ACACG7CCACC7G CACCAGCTCCCG7TCCCGTACCTATACTTC TCG7C7C7G7CCGGCC7GACCG7GC7GAAG AGCACCAAC7CGCAG77C7GGGGC77CC7G — + — - — ---- - — --+---------+ - - — — - · — +

AGCAGAGACAGGCCGGAC7GGCACGAC77C 7CG7GG77CAGCG7CAAGACCCCGAAGGAC CG7GACGAG7ACACCACAC77AAGGAGACC 7GGGACCG7A7CC7GAGCACCGACG7CGA7 ---------+---------+---------+ --------- +---------+---------+

GCAC7GC7CA7G7GG7G7GAA77CC7C7GG ACCC7GGCA7AGGAC7CG7GGC7GCAGC7A

GCCACT7GGCAG7GGAAGAA777CAG7GGA C7CCAGGAGG7CCGC7CGCACG7GCC7AAG

CGG7GAACCG7CACC77C77AAAG7CACC7 GAGG7CC7CCAGGCGAGCG7GCACGGA77C

77CGA7GC7ACC7GGGCCAC7GC7CGCGAG G7CACTC7GAAGAC7T77GČ7GAAGA7AAC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

AAGCTACGATGGACCCGG7GACGAGCGC7C CAGTGAGACT7CTGAAAACGAC77C7A7TG

AG7GCCAGCG7GCAGGCCAC7A7G7ACAAG A7GGCAGAGCAAA7CC7GGCGCGCCAGCAG ---------+---------+---------+---------+---------+--------- +

TCACGG7CGCACG7CCGG7GA7ACA7G7TC TACCG7C7CG777AGGACCGCGCGG7CG7C

C7GA7CGAGAC7G7CGAG7AC7CGTTGCCT AACAAGCAC7ATTTCGAAA7CGACC7GAGC ---------+--------- +---------+---------+---------+--------- +

GAC7AGC7C7GACAGC7CA7GAGCAACGGA T7GT7CG7GA7AAAGC777AGC7GGAC7CG

TGGCACAAGGGCC7CCAAAACACCGGCAAG AACCCCGAGG7C77CGC7CC7CAG7CGGAC ---------+-------------------+---------+---------+---------+

ACCG7G77CCCGGAGG777TG7GGCCGTTC TTGCGGC7CCAGAAGCGAGGAG7CAGCC7G

CCCAACGG7CTGA7CAAG7G7ACCG7CGGC CGGTCC7C7C7GAAG7C7AAA77G7AAACC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

GGG77GCCAGAC7AG77CACA7GGCAGCCG GCCAGGAGAGAC77CAGA777AACA777GG

AACA7GA77C7CACG77CCGGAG777CCAA GGCAAAC7G7A7A7AG7C7GGGA7AGGG7A ---------+---------+--------- +---------+---------+--------- +

T7G7AC7AAGAG7GCAAGGCCTCAAAGGTT CCG777GACATATATCAGACCCTA7CCCAT 7AGCA77CA77CAC77G777777AC77CCA · ΑΑΑΑΛΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ATCGTAAGTAAGTGAACAAAAAATGAAGGT χχχχχχττχτχττΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCCCG· eamHI ---------4------------------

TTTTTTTTTTTTTTT7TTTTTCCCGGGCCT AG 47 LV 12000

Les fragments A, B, C et D ont ete ligues de maniere a obtenir Le plasmide pEMR469 represente sur la figurē 11, dans laquelle les symboles ont la meme signification que sur la figurē 10, les nouveaux fragments Clal-Accl et AccI-BamHI etant symbolises 05 par

2) Construction du plasmide pEMR473 : 10

Le plasmide pEMR469 a ete soumis ā une digestion complete par les enzymes Mlul et Sphl. Le grand fragment Mlul-Sphl contenant le gene de l'urate oxydase a ensuite ete ligue au fragment synthe-tique, de sequence donnee ci-aprēs, correspondant a une partie (200 pb) de la sequence en amont de l'element TATA du promoteur GAL 7 de S. cerevisiae, laquelle comprend les sequences d'activa-tion amont (upstream activation sequences : UAS). 15 Μ Ι u

I

CGCGTCTATACTTCGGflGCftCTGTTGAGCGAAGGCTCATTAGATATPTTTTCTGTCftT

AGATATGAAGCCTCGTGACAACTCGCTTCCGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA 20

TTTCCTTAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACAACTGrTGACCGT

AAACGAATTGGGTTTTTATTCCCTCTCCCAGGTTTTTCGCGAGCCTGTTGACAACTGGCA

GATCCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATAGCCAAGCTGAAAATAATGTGTAGC ----♦------- — ----— --------------------

CTAGGCTTCCTGACCGATATGTCACAAGTGT TTTATCGGTTCGACTTTTAT TACACATCG 25 s

P h

I CTTTAGCTATGTTCAGTTAGTTTCGCATG. - - — >-·--- — *-·-- — * -· — gaaatcgatacaagtcaatcaaacci 30

Le plasmide pEMR473 ainsi obtenu est represente sur la figurē 12, dans laquelle les symboles ont la mēme signification que dans la figurē 11, le nouveau fragment Mlul-Sphl introduit etant symbolise par 35 48 3) Construction du plasmide pEMR515 :

Le plasmide pEMR473 a ete soumis a une digestion partielle par l'enzyme Xbal et a une digestion totale par l'enzyme Mlul. Le1 grand fragment Xbal-Mlul a ete purifie. Ce fragment 05 contient notamment Ies sequences de l'origine de replication et le ločus STB du 2μ, le gene LEU2d, le gene de resistance a l'ampicil- p line Amp , l'origine de replication du pBR322 et la cassette d'expression de l'urate oxydase. II ne contient en revanche ni le gene URA3, ni la partie du 2μ comprise entre Ies sites Xbal et 10 Nhel.

Le grand fragment Xbal-Mlul a ete recircularise via L'adaptateur de sequence suivant comportant des extremites cohe-sives Xbal modifie et Mlul : 15 Xbal modifie

^CTAGGCTAGCGGGCCCGCATGCA CGATCGCCCGGGCGTACGTGCGC^

Mlul 20 Le plasmide pEMR515 ainsi obtenu ne possede qu'un seul des trois elements du site FRT cible de la recombinase codee par le gene FLP du 2μ.

Les plasmides pEMR 469/ pEMR473 et pEMR513 possedent le gene codant pour l'urate oxydate de sequence ci-apres : 25

ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGAGTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT 30 CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG 35 ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG 49 LV 12000

ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG

CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT

GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA

AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG

05 TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA

GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG

ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AAATTG. 10 EXEMPLE 11 : Transformation de la souche de Levure ΕΜΥ761, par Les plasmides pEMR469, pEMR473 et pEMR515 - Transfor- mation des souches de Levures ΕΜΥ500 et GRF18 par Le pLasmide PEMR515 - Transformation avec seLection soit pour La prototrophie de l'uraciLe, soit pour La 15 prototrophie de Leucine

On a utilise comme souches receptrices trois souches de Saccharomyces cerevisiae non isogeniques : - La souche ΕΜΥ761 (Mata, leu2, ura3, his3, gal) - La souche ΕΜΥ500 (Mata, Leu2, ura3, pep4) 20 - La souche GRF18 (Mata, Leu2, his3);

La souche GRF18 est bien connue de l'homme de L'art (Gerry FINK, MIT, USA). Les souches ΕΜΥ761 et ΕΜΥ500 sont appa- rentees a La souche GRF18. ELLes ont ete obtenues par croisements successifs de la souche GRF18 avec une souche ura3 derivee de La 25 souche FL100 (deposee a l'ATCC sous Le n° 28 383) et avec La souche 20B12 (Mata, tsp1, pep4) dēcrite par E.W. JONES (E.W. JONES et aL. (1977) Genetics, 85, 23).

On peut obtenir La souche GRF18 par curage du pLasmide pEMR515 de La souche GRF18 pEMR515 (Leu+) deposee ā La CNCM sous La 30 reference n° 1-920, Le 28 decembre 1989 et La souche ΕΜΥ500 par curage du pLasmide pEMR515 de La souche ΕΜΥ500 pEMR515 (leu+) deposee a La CNCM sous La reference n° 1-919, le 28 decembre 1989.

Ces souches contiennent des mutations (Leu2 et ura3), susceptibLes d'ētre complementees par Le marqueur de seLection 35 dēfectif LEU2d et Le marqueur de seLection URA3, presents dans chacun des pLasmides pEMR469 et pEMR473. 50 1) Transformation avec sēlection pour la prototrophie de L 'uraci le :

Une colonie de la souche ΕΜΥ761 a servi ā ensemencer 100 ml d'un milieu appelē milieu YPG liquide (Cf. tableau III 05 ci-aprēs). Lors de l'obtention d'une densitē cellulaire de 107 cellules par ml. Ies cellules ont ete traitēes a l'acētate de lithium 0,2 M pour la transformation selon une technique bien connue de l'homme de l’art, dēcrite par ITO et al. (ITO et al., 1983, J. Bacteriology 153, 163-168). 10 Les cellules ΕΜΥ761 ont ete transformēes en parallele avec environ 1 pg de chacun des plasmides pEMR469 et pEMR473. Les cellules transformees sont selectionnees pour le caractere d'auxo-trophie d'uracile (ura+) sur un milieu appelē milieu solide sāns uracile, (Cf. tableau III ci-apres). 0n a ainsi retenu un trans-15 formē ΕΜΥ761 pEMR469 (ura+) et un transformē ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+). 2) Transformation avec selection pour la prototrophie de leucine :

La technique de transformation utilisee est une variante de celle dēcrite par Beggs et al. (Beggs et al. (1978), Nature 275, 104-Ί09). Elle consiste a soumettre les levures a un traitement de 20 protoplastisation en prēsence d'un stabilisant osmotique, le sorbitol en concentration 1 M.

Le protocole prēcis de transformation est prēcise ci-apres : a) 200 ml du milieu YPG liquide (Cf. tableau III) sont ino-25 cules avec environ 5 x 10^ cellules d'une culture en phase station- naire et la culture ainsi inoculēe est placēe une nuit sous agita-tion ā 30°C. b) Lorsque la culture atteint environ 107 cellules par ml, les cellules sont centrifugēes a 4 000 tr/min pendant 5 min et le 30 culot est lavē avec du sorbitol 1 M. c) Les cellules sont suspendues dans 5 ml de solution de sorbitol 1 M contenant 25 mM EDTA et 50 mM de dithiothrēitol et incubēes pendant 10 min ā 30°C. d) Les cellules sont lavēes une fois avec 10 ml de sorbitol

35 1 M et suspendues dans 20 ml de sorbitol. De la zymolyase-100T (prēparation obtenue par purification partielle sur colonne 51 LV 12000 d’affinite du surnageant de culture d'Arthobacter luteus et contenant de La β-1,3-glucane-Laminaripentahydrolase, commercia-Lisee par SEYKAGAKU Κ06Υ0 Co. Ltd) est ajoutee ā une concentration finale de 20 jjg/ml et on incube La suspension ā temperature ambiante pendant environ 15 min. e) Les ceLLuLes sont resuspendues dans 20 mL d'un miLieu contenant du sorbitoL appele miLieu YPG sorbitoL (Cf. tabLeau III ci-apres) et incubees pendant 20 min ā 30°C sous agitation douce. f) On centrifuge pendant 3 min ā 2 500 tr/min. g) On resuspend dans 9 mL de tampon de transformation (sorbitoL 1 M, tris-HCl de pH 7,5 10 mH et CaCL^ 10 mM).

h) On ajoute 0,1 mL de ceLLuLes et 5 μΐ de solution d'ADN (environ 5 pg) et on Laisse La suspension obtenue pendant 10 a 15 min a temperature ambiante. i) On ajoute 1 mL de La soLution : polyēthyLene gLycoL PEG 4000 20 %, tris-HCL de pH 7,5 10 mM et CaCl2 10 mM. j) On verse 0,1 ml de La suspension obtenue en i) dans un tube contenant du miLieu soLide de regeneration sāns leucine (Cf. tabLeau III ci-apres) preaLablement fondu et maintenu Liquide a environ 45°C. On verse La suspension sur une boite de Petri contenant une couche soLidifiee de 15 ml de miLieu de regeneration soLide sāns Leucine. k) On repete l'etape j) avec le reste de La suspension ceLLu-laire obtenue en i).

Les transformēs commencent ā apparaitre au bout de trois jours.

On a ainsi retenu Les transformēs ΕΜΥ761 pEMR469 (Leu+), ΕΜΥ761 pEMR473 (Leu+), ΕΜΥ761 pEMR515 (Leu+), GRF18 pEMR515 (Leu+) et ΕΜΥ500 pEMR515 (leu+). 52

TABLEAU III

Principaux milieux utilises dans Ies exenipl.es 11, 12, 13 et 14 - milieu solide sāns uracile 6,7 g de base azotee de Levure sāns acides amines (Yeast nitrogen base uithout Amino Acids de DIFCO) 5,0 g d'hydrotysat de caseine (Casamino acids de DIFCO) 10 g de glucose 20 g d'agar melanger tous Ies ingredients dans de L'eau distillee, completer Le volume final ā 1 l avec de L'eau distillee. AutocLaver 15 min a 120°C. - milieu Liguide sāns uracile

Utiliser la formulē du milieu solide sāns uracile en omettant l'agar - AutocLaver 15 min a 120°C. - milieu solide sāns leucine 6,7 g de base azotee de levure sāns acides amines (Yeast nitrogen base without Amino Acids de DIFCO) 20 mg d'adenine 20 mg d'uracile 20 mg de l-tryptophane 20 mg de l-histidine 20 mg de l-arginine 20 mg de l-methionine 30 mg de l-tyrosine 30 mg de l-isoleucine 30 mg de l-lysine 50 mg de l-phenylalanine 100 mg de l-acide glutamique 150 mg de l-valine 400 mg de l-leucine 53 LV 12000 20 g de glucose 20 g d'agar melanger tous Ies ingredients dans l'eau distillee. Completer le volume final š 1 l avec de l'eau distillee - Autoclaver 15 min a 05 120°C. Apres autoclavage, ajouter 200 mg de l-threonine et 100 mg d'acide l-aspartique. - milieu solide de regeneration sāns leucine 10 utiliser la formulē du milieu solide sāns leucine en melangeant 30 g d'agar au lieu de 20 et en ajoutant au melange 182 g de sorbi tol. 15 - milieu Liguide sāns leucine utiliser la formulē du milieu solide sāns leucine en omettant l'agar - Autoclaver 15 min a 120°C. Apres autoclavage, ajouter 200 mg de l-threonine et 100 mg d'acide l-aspartique. 20 - milieu YP Liguide 10 g d'extrait de levure (Bacto-yeast extract de DIFC0) 20 g de peptone (Bacto-peptone de DIFC0) melanger Ies ingredients dans de l'eau distillee. Completer le 25 volume final a 1 l avec de l'eau distillee - Autoclaver 15 min a 120°C. 30 - milieu YPG Liguide utiliser la formulē du milieu YP liquide auquel on ajoute, apres autoclavage, du glucose a une concentration de 20 g/l. 54 mi Lieu YPG sorbitol uti User La formulē du milieu YPG liquide auquel on ajoute, apres autoclavage, du sorbitol a une concentration de 1 M. 05 - milieu YP ethanol-glycerol utiliser la formulē du milieu YP liquide. Apres autoclavage, ajouter 10 ml d'ēthanol 100 % (1 % final) et 30 g de glycerol. 10 - milieu YP ēthanol-glycērol-galactose utiliser La formulē du milieu YP liquide. Apres autoclavage, ajouter 10 ml d'ēthanol 100 %, 30 g de glycerol et 30 g de galac-tose. 20 EXEMPLE 12 : Expression en erlenmeyer de l'ADNc de l'urate oxydase par les souches ΕΗΥ761 pEMR469 (ura+) , ΕΜΥ761 PEMR473 (ura+), ΕΜΥ761 PEMR469 (leu+) et ΕΗΥ761 PEMR473 (leu+) - Immunodetection par Western Blot, dosage de l'activitē urate oxydase et des proteines solubles 1) Expression de l'ADNc de l'urate oxydase : a) Souches selectionnees sur milieu sāns uracile 25 30

Une colonie de chacune des souches ΕΜΥ761 pEMR469 (ura+) et ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+) a ete mise en culture dans 20 ml de milieu liquide sāns uracile (Cf. tableau III, exemple 11). Apres une nuit a 30°C sous agitation, Ies deux cultures ont ete centrifugees pendant 10 min a 7 000 tr/min. Les čūlots ont ete repris dans 10 ml d'eau distillee sterile et de nouveaux centrifuges pendant 10 min a 7 000 tr/min. L'expression de l'urate oxydase a ete induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP ēthanol-glycerol (Cf. tableau III, exemple 11) pour la souche ΕΜΥ761 pEMR469 (ura+) et 20 ml de milieu YP ethanol-glycerol-galactose (Cf. tableau III, exemple 11) pour la souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura ). Les cultures ont ete replacees a 30°C sous agitation pendant 22 h. 35 55 55LV 12000 b) Souches selectionnees sur milieu sāns leucine

Dans un premier temps, une colonie de chacu'ne des souches ΕΜΥ761 pEMR469 (leu+) et ΕΜΥ761 pEMR473 <Leu+) a ete mise en culture dans 20 ml de milieu liquide sāns leucine (Cf. tableau III, exemple 11). Ceci a permis d’obtenir et de maintenir un nombre de copies de plasmides eteve en pratiquant la selection pour la complementation de la mutation Leu2 par le gene LEU2d porte par Ies plasmides pEMR469 et pEMR473.

Apres une nuit ā 30°C sous agitation, Ies deux cultures ont ete centrifugees pendant 10 min ā 7 000 tr/min. Les čūlots ont ete repris dans 10 ml d’eau distillee sterile et de nouveau centri-fuges pendant 10 min a 7 000 tr/min. L’expression de l'urate oxydase a ete induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP ethanol-glycerol pour la souche ΕΜΥ761 pEMR469 (leu+) et 20 ml de milieu YP ēthanol-glycerol-galactose (Cf. tableau III, exemple 11) pour la souche ΕΜΥ761 pEMR473 (leu+). Les cultures ont ete replacees a 30°C sous agitation pendant 22 h. c) Souche temoin

La souche ΕΜΥ761 non transformee, c'est-a-dire sāns plasmide, a ete cultivee comme ci-dessus. Elle a subi d'une part l'induction dans 10 ml de milieu liquide YP ethanol-glycerol et, d'autre part, l'induction dans 10 ml de milieu YP ethanol-glycerol-galactose. 2) Preparation des echantillons : a) Les cellules cultivees en 1a), 1b) et 1c) ont ete centrifugees et le surnageant a ete elimine. Les čūlots ont ete repris dans 10 ml d'eau distillee et centrifuges pendant 10 min ā 7 000 tr/min. Les čūlots ainsi laves ont ete repris dans environ 1 ml de tampon de triethanolamine TEA de pH 8,9. Environ 300 pl de cellules ainsi reprises ont ete lisees en presence de billes de verre (de 400 a 500 pm de diametre) representant environ la moitie du volume final. Ce melange a ete vortexe vigoureusement pendant 1 min, 4 fois, les echantillons etant places pendant 30 s dans la glace entre chaque broyage. Le liquide a ete retire des tubes avec une pipette pasteur et transfere dans un microtube. Les billes de verre ont ete lavees 1 fois avec environ 200 pl de tampon TEA de 56 ρΗ 8,9. Les billes ont ete vortexees pendant 1 min, 1 fois, et Le liquide a ete reti re a La pipette pasteur pour ētre ajoute au lysat precedent. Le lysat a ete ensuite centrifuge dans un microtube pendant 5 min ā 7 000 tr/min. Le surnageant a ete precautionneuse-05 ment reti re et conserve a -20°C pour Le Western BLot, Le dosage de L'activite urate oxydase et Le dosage des proteines. Le cuLot des ceLLuLes Lysees a ete conserve separement ā -20°C pour Le Uestern Blot (Cf. 3) ci-dessous). D'autre part, des preLevements des cuLtures rēalisees en 10 1a) et 1b) ont ete realises comme suit avant L'induction : 2 mL de cuLture ont ete centrifuges pendant 10 min ā 7 000 tr/min. Les cuLots ont ete repris dans 500 pL d'eau distillee et de nouveau centrifuges pendant 5 min a 7 000 tr/min. Les cuLots ont ete repris dans environ 200 pl de tampon TEA de pH 8,9 et Lyses comme 15 ci-dessus en presence de bi LLes de verre. Les surnageants et Les cuLots des ceLLuLes Lysees ont ete conserves ā -20°C separement. 3) Imrounodetection de L’urate oxydase par Mestern BLot : a) Mode operatoire

Les cuLots et Les surnageants des differents echantiLlons 20 ont etē soumis a un Western BLot, technique bien connue de L'homme de L'art, qui comprend Les etapes suivantes : - soLubiLisation du cuLot par ebullition pendant 10 min dans un tampon denommē tampon de charge constitue de tris-HCL 0,125 M pH 6,8 SDS 4 %, bLeu de bromophenoL 0,002 Z, gLyceroL 20 Z,

25 β-mercaptoethanoL 10 Z (seLon Le protocole decrit par LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685)), (etape mise en oeuvre uniquement pour Les cuLots), - sēparation eLectrophoretique des differentes proteines contenues dans Le soLubiLisat seLon Le protocoLe decrit par LAEMMLI (U.K. 30 LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685), - transfert desdites proteines contenues dans Le geL sur un fiLtre de nitroceLLuLose (seLon la technique de H. T0WBIN et aL. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354), L'immunodetection, realisee seLon La technique de 35 BURNETTE (W.W. BURNETTE Ana. Biochem. 1_12 (1981) 195-203), implique successivement : 57 LV 12000 . Le rincage du filtrē de nitrocellulose pendant 10 min avec un tampon A (tris-HCl 10 mM/ NaCl 170 mM, Kl 1 mM). . La mise en contact du filtrē de nitrocellulose pendant 30 min a 37°C avec un tampon B (tampon A additionne de 05 serum-albumine bovine a raison de 3 g pour 100 ml). . La mise en contact du filtrē de nitrocellulose pendant 1 h a 37°C avec un immunserum (des anticorps polyclonaux reconnaissant l'urate oxydase d'A. flavus). . Le ringage du filtrē de nitrocellulose avec le tampon B. 10 . La mise en contact du filtrē de nitrocellulose pendant 1 h ā 37°C avec une solution de proteine G marquee a l'iode 125 a 0/1 microcurie/ml. . Le rinfage du filtrē avec le tampon A. . Le sechage du filtrē entre deux feuilles absorbantes. 15 . La mise en contact d'un film radiographique. . La revelation du film. b) Resultats

On constate que Ies souches ΕΜΥ761 pEMR469 (ura )/ ΕΜΥ761 PEMR473 (ura+), ΕΜΥ761 pEMR469 (leu+) et ΕΜΥ761 pEMR473 (leu+) 20 produisent une proteine de poids moleculaire apparent d'environ 33 KDa qui est reconnue par Ies anticorps diriģēs contre l'urate oxydase d'A. flavus et qui est absente de la souche temoin.

On constate egalement que Ies souches non induites ne produisent pas ou tres peu de la proteine decrite ci-dessus. 25 La comparaison entre Ies quantites de cette proteine pour

Ies čūlots et Ies surnageants permet de deduire qu*environ 80 % de celle-ci est sous formē soluble dans le lysat. 4) Dosage de l'activite urate oxydase : L’activite urate oxydase a ete mesuree sur Ies surna-30 geants des cellules lysees selon le mode operatoire decrit ā l'exemple 9 ci-dessus.

Les resultats obtenus sont rassembles dans le tableau (IV) ci-apres. Celui-ci precise pour chaque souche induite au glycerol-ethanol, induite au glycerol-ethanol-galactose ou non induite/ l'activite urate oxydase en U/ml. 35 58

TABLEAU IV

Souche / Inducteur Activite urate oxydase CU/mt) ΕΜΥ761/ΥΡ ethanol-glycerol-galactose < 0,1 ΕΜΥ761/ΥΡ ethanol-glycerol < 0,1 ΕΜΥ761 pEMR469 (ura+)/(non induit) 0,4 ΕΜΥ761 pEMR469 (ura+)/YP ethanot-glycerol 12 ΕΜΥ761 pEMR469 (leu+)/(non induit) 0,17 ΕΜΥ761 pEMR469 (leu+)/YP ethanol-glycerol 36 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+)/(non induit) < 0,1 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+)/YP ethanol-glycerol-galactose 12,5 ΕΜΥ761 pEMR473 (leu+)/(non induit) < 0,1 ΕΜΥ761 pEMR473 (leu+)/YP ēthanol-glycerol-galactose 15,3 II apparait clairement sur le tableau ci-dessus que Les cellules Levure transformees par ces plasmides pEMR469 et pEMR473 sont capables apres induction de produire une activite urate oxydase. 5) Dosage des proteines totales solubles dans Les lysats :

Le kit protein assay de BIORAD a ete utilise pour doser Les proteines totales prēsentes dans le surnageant des cellules lysees. II est base sur l'observation que l'absorbance maximum pour une solution acide de bleu brillant de Coomassie g-250 passe de 465 nm ā 595 nm lorsque des proteines viennent s'y fixer (Cf. Reisner et al., Anal Biochem, 64, 509-(1975)). a) Mode operatoire

On introduit dans la cuve d'un spectrophotometre regle a 595 nm les volumes suivants : - 10 pl d'ēchantillon auxquels ont ete rajoutes 790 μΐ d'eau di st ilLee - 200 μΐ de "Dye reaģent" concentre (Biorad). 59 LV 12000 0n melange et on lit La densite optique ā 595 nm. Une gamme etalon avec des concentrations croissantes de BSA (Bovine Serum Albumine) a ete realisēe ainsi. On lit La concentration inconnue des proteines totaLes des lysats sur La courbe etalon obtenue. b) Resultats

Les principaux resultats obtenus sont rassembles dans Le tableau V ci-apres. CeLui-ci precise pour chaque souche induite au glyceroL-ethanol, induite au glycerol-ethanol-galactose ou non induite, La quantite (en mg/ml) de proteines totaLes solubLes ainsi que Le pourcentage d'urate oxydase dans Les proteines totaLes soLubLes (on admet ici que l'activite specifique de La proteine recombinante est identique ā celle de l'urate oxydase obtenue ā partir d'A. flavus : 30 U/mg).

TABLEAU V

Souche / Inducteur Proteines totaLes solubLes mg/ml % d'urate oxydase dans Les proteines totaLes soLūbles ΕΜΥ761/g Lyce ro L-et hano L 5,3 < 0,05 ΕΜΥ761/g Lycē ro L-ēt hanol-ga Lactose 5,8 < 0,05 ΕΜΥ761 pEMR469 (ura+)/non induit 8,5 0,25 ΕΜΥ761 pEHR469 (ura+)/gLycēroL-ethanoL 5,3 4,7 ΕΜΥ761 pEMR469 (Leu+)/non induit 1,7 0,3 ΕΜΥ761 pEMR409 (Leu+)/gLyceroL-ēthanoL 5,9 20 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+)/non induit 10,3 < 0,05 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+)/gLyceroL-ethanoL-gaLactose 6,5 6,4 ΕΜΥ761 pEMR473 (Leu+)/non induit 0,5 < 0,05 ΕΜΥ761 pEMR473 (leu+)/glycerol-ethanol-galactose 3,9 13

On constate que le taux de production de L'urate oxydase variē de 5 a 20 % selon les transformants et le mode de selection des transformēs (leu+). 60 EXEMPLE 13 : Expression en fermenteur de 2,5 L de L'ADNc de L*urate oxydase pour La souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+) 1) ProtocoLe de fermentation : a) Mi li eux Milieu inoculum

Une colonie de la souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+) a ete mise en culture dans 200 ml de milieu liquide sāns uracile (Cf. tableau III, exemple 11). La culture est poursuivie pendant une nuit sous agitation jusqu'a une D0 d’environ 3.

Milieu de culture A pour 1 l d'eau purifiee sur un appareil de type Mi11i —q glucose 30 g glycerol 30 g hydrolysat de caseine (Casamino-acids de DIFC0) 30 g base azotee de levure (Yeast Nitrogen Base de DIFC0) 15 g extrait de levure (Yeast extract de DIFC0) 2,5 g k2hpo4 3 g MgS04,7H20 0,5 g

Milieu additionnel B pour 100 ml d 'eau purifiee sur un appareil < de type Mi11i —Q glycerol 30 g hydrolysat de peptone (le Primatone de G. Sheffield) 30 g base azotee de levure (Yeast Nitrogen Base de DIFC0) 15 g extrait de levure (Yeast extract de DIFC0) 5 g 61 LV 12000 K2HP04 3 g

MgS04,7H20 0,5 g b) Parametres de fermentation 05 Bioreacteur de 2,5 l de volume total equipe de deux turbines temperature = 30°C pH = 5 pression partieLLe en oxygene = 30 mmHg dēbit d'air = 1 l/min. 10 Le bioreacteur est rempli avec 1,5 L du milieu A et est ensemencē avec 150 ml de l'inoculum.

Une fois que Le glucose est epuise ā D0 2,5 vērs D0 17, L'induction a lieu par addition d'un volume de 150 mL de galactose ā 20 X poids/volume. La croissance est poursuivie, puis Le raiLieu 15 additionnel B est ajoute aux environs de DO 30.

La croissance se proLonge une quinzaine d'heures et La recolte a ete effectuēe ā une D0 104. 2) Preparation et anaLyse des echantiLLons :

Les echantiLLons ont ete preparēs comme decrit dans 20 l'exempLe 9 2) a) a partir de La cuLture en fermenteur. Deux preLe-vements ont ete reaLises : Le premier apres 7 h d'induction, Le second apres 22 h d'induction.

Sur ces deux Lysats obtenus apres Lyse des celluLes, Les tests suivants decrits dans L'exempLe 9 ont ete reaLises : 25 - immunodetection par Western BLot - dosage de L'activite bioLogique - dosage des proteines totaLes.

Les resuLtats obtenus sont Les suivants. a) Imniunodetection par Mestern BLot 30 On constate que La souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+) cultivee en fermenteur de 2 L produit une proteine de poids molecuLaire apparent de 33 KDa qui est reconnue par les anticorps diriģēs contre L'urate oxydase d'A. fLavus : (preparēs chez Le lapiņ seLon des techniques bien connues de l'homme de L'art : Cf. VAITUKAITIS 35 et aL. (1981) "Methods in EnzymoLogy" Academic Press, New York, voL. 73, p. 46) et qui est absente dans La souche temoin. •62 b) Dosage de l'activite biologigue

Les resultats obtenus sont rassembles dans Le tableau VI ci-apres : 05

TABLEAU VI

Souche / Temps d'induction U/ml ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+)/7 h ΕΜΥ761 pEMR473 <ura+)/22 h 9 12,5

On constate que La souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+), cultivee en -fermenteur, est capable, aprēs induction, de produire une activite urate oxydase. c) Dosage des proteines totales solubles

Les resultats sont rassembles dans le tableau VII ci- apres :

TABLEAU VII

Proteines % d'urate oxydase Souche / Temps d'induction totales dans les proteines solubles totales solubles mg/ml ΕΜΥ761 pE«R473 (ura+)/7 h 5,2 5,7 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura+)/21 h 6,2 6,6

Ces resultats indiquent que le taux de synthese en urate oxydase de la souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura ) cultivee en fermenteur est d'env'iron 5 X de proteines totales de la cellule apres 7 h et 21 h d'induction. 63 63LV 12000 EXEMPLE 14 : Expression en erLenmeyer de l'ADNc de L'urate oxydase par Ies souches ΕΜΥ761 pEMR515 (leu*), ΕΜΥ500 pEMR515 (leu*) et GRF18 pEMR515 (leu*)

Une colonie de chacune des trois souches ci-dessus a ete mise en culture dans 20 ml de milieu liquide sāns leucine.

Apres une nuit a 30°C sous agitation, Les trois cuLtures ont ete centrifugees pendant 10 min a 7 .000 tr/min. Les čūlots cellulaires ont ete repris dans 10 ml d'eau distillee sterile et de nouveau centrifuges pendant 10 min. L'expression de l'urate oxydase a ete induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP ethanol-glycerol-galactose (Cf. tableau I, exemple 8). Les cultures ont ete replacees ā 30°C sous agitation pendant environ 20 h. En temoin, une culture de chaque souche hote, non transformee, a ete effectuee.

Les cellules de chacune des six cultures sont reculotees par centrifugation et le surnageant est elimine. Les čūlots ont ete repris dans 10 ml d'eau distillee et centrifuges pendant 10 min ā 7 000 tr/min. Les čūlots ainsi laves ont ete repris dans environ 1 ml de tampon TEA de pH 8,9 et le broyage ainsi que l'e.limination des particules par centrifugation ont ete realises comme decrit dans l'exemple 9, 2). Le surnageant de chaque culture sert comme precedemment a un dosage de l'urate oxydase et des proteines totales. Les principaux resultats obtenus sont rassembles dans le tableau VIII ci-apres : 64

TABLEAU VIII

Souche/Conditions de culture Activite urate oxydase (U/mū Proteines totales solubles (mg/ml) % d'urate oxydase dans Ies proteines solubles GRF18 pEMR515 (leu+)/a) < 0,1 2,2 < 0,05 ΕΜΥ500 pEHR515 (leu+)/a) < 0,1 0,9 <0,05 ΕΜΥ761 pEMR515 Cleu+)/a) < 0,1 1,8 < 0,05 GRF18 pEMR515 (leu+)/b) 38 5,4 23 % ΕΜΥ500 pEMR515 (leu+)/b) 20 2,5 26 % ΕΜΥ761 pEMR515 (leu+)/b) 33 4,2 26 % a) : Ies souches sont cultivēes en presence de glucose (conditions de non-induction) b) : Ies souches sont cultivees en absence de glucose et en presence de galactose (induction).

Ces resultats montrent que l'on peut obtenir un haut niveau d'expression d'urate oxydase avec trois souches receptrices non isogēniques transformees par le vecteur d'expression selon 1'invention. ΕΧΕΜΡ1-Ε 15 : Express1on en fermenteur de 2/5 l de l'ADNc de l'urate oxydase pour la souche ΕΜΥ500 pEWR515. Purification et caracterisation partielle de L'urate oxydase recom-binante 1) Culture en -fermenteur de 2,5 l de la souche ΕΜΥ500 pEMR515 :

La culture de la souche ΕΜΥ500 pEMR515 se fait en fermenteur et se deroule de la maniere suivante : a) Phase de preculture en erlenmeyer A partir de 1 ml de solution dans un milieu contenant 20 % de glycerol de la souche ΕΜΥ500 pEMR515 avec un nombre de cellules correspondant a une D0 de 2,35, on ensemence un erlenmeyer de 500 ml contenant 90 ml de milieu de croissance phase autoclave MCPA complemente par 1,28 g de MES (2/N-morpholino/-ethanesulfonic 65 LV 12000 acid : Sigma n° M 8250) et 10 ml de milieu de croissance phase filtrče. MCPF. Les compositions des milieux MCPA et MCPF sont pre-cisees ci-aprčs. Apres 24 heures d'incubation, sous agitation a 30°C, la densitč optique de la culture est d'environ 7. b) Phases de culture en fermenteur

La culture ci-dessus est utilisče pour ensemencer un fer-menteur 2/5 1/ contenant le milieu de culture de composition sui-vante :

900 ml de MCPA + 200 ml de MCPF

Le pH de la culture est regule par le fermenteur a la valeur de consigne qui est 5/5. Apres 6 a 7 h de culture a 30°C, on ajoute de maniere linčai re et pendant 9 h, 72 ml d'une solution de glucose ā 500 g/l soit en tout 36 g de glucose. c) Phase d'expression

Au melange precčdemment decrit/ on ajoute 100 ml de milieu d'expression phase autoclavable ΜΕΡΑ et 150 ml de milieu d'expression phase filtree MEPF (dont les compositions sont pre-cisees ci-apres). La culture est alors continuee pendant 5 h. Puis, on ajoute de fa?on linčai re, pendant 20 h, 150 ml d'une solution contenant 30 g de galactose, 15 g de glycčrol et 36 g d'čthanol. On obtient alors une D.O. voisine de 160.

COMPOSITION CHIMIGtUE DES MILIEUX DE CROISSANCE ET D'EXPRESSION - Milieu de croissance phase autoclavable MCPA pour 900 ml final NTA (acide nitrilotriacčtique) extrait de levure (DIFCO) 1/2 g 6 g 1/2 g 0/6 g 1/2 g

NaCl

MgS04/ 7H20 66

CaCl2, 2H20 840 mg FeClj 108 mg acide glutamique 4,44 g HYCASE SF (Sheffield Products) 30 g leucine 2,16 g hi stidine 600 mg methionine 1/2 9 oligoelements I (Cf. ci-apres) 5 ml uraci le 1/2 g 10

Liste des oligoelements I pour 1 l d'eau ultrapurifiee

CuSO^, 5H20 O 00 mg HjBOj 5 9 ZuSO^, 7H20 3 9 KI . 1 9 MnS04, 2H20 3,5 9 Na?M0A, r 2H20 2 9 FeCU, 6H-.0 4,8 9

Ajouter a la solution 100 ml d'acide chlorhydrique concentre. Completer a 1 000 ml.

25 - Milieu de croissance phase filtree MCPF pour 200 ml final d'eau ultrapurifiee KH2P04 4,8 g 30 tryptophane 420 mg vitamine I (Cf. ci-aprēs) 5 ml glucose_ 36 g

Chauffer pour dissoudre, temperer, ajouter Ies vitamines I et filtrer a 0,2 μ. 35 67 LV 12000

Liste des vitamines I pour 100 ml final d'eau ultrapurifiee biotine 1,2 mg acide folique 1 mg niacine 144 mg (acide nicotinique pyridoxine. HCl 60 mg thiamine. HCl 240 mg pantothenate de calcium 1,2 g mesoinosi tol 2,4 g

Completer ā 100 ml apres dissolution.

Filtrer ā froid sterilement ā 0,2 μ. - Milieu d'expression phase autoclavable ΜΕΡΑ pour 100 ml d'eau ultrapurifiee 20 NTA 1,2 g K2S°4 2,08 g acide glutamique 6 g HīCASE SF (Sheffield Products) 24 g leucine 2,16 g 25 histidine 600 mg methionine 1,2 g MgS04, 7H20 720 g CaCl2, 2H20 840 mg FeCl3, 6H20 108 mg 30 oligoelements liste 1 5 ml uracile 1,2 g

Ajuster le pH ā 5,5 avec ^SO^ concentre ou K0H concentre. Autoclav/er 20 min a 120°C. 35 68 - Milieu d'expression phase filtree MEPF pour 150 ml final d'eau ultrapurifiee kh2po4 2,4 g tryptophane 420 mg vitamines I 5 ml glycerol 36 g galactose 45 g 10

Chauffer pour dissoudre, temperer, ajouter Ies vitamines et fi Ltrer. 2) Broyage des cellules 15 Apres 20 heures d'induction, la densite optique, mesurāe ā 600 nm, de la culture est de 98. 800 g de moūt fermentation sont centrifūgās 5 min a 10 000 g et le culot cellulaire est repris dans 80 ml de tampon de lyse (glycine 20 mM pH 8,5). Les cellules sont alors broyees ā 4°C, 2 fois pendant 2,5 min dans un broyeur 20 (Vibrogen Zellmuhle V14) en presence d’un volume de billes de 0,5 mm de diametre, egal au volume de la solution de cellules ā lyser. Apres broyage, le surnageant est repris et les billes sont lavees deux fois par 80 ml de tampon de lyse. On recupere 210 ml de lysat possedant un taux de proteines totales d'environ 3 mg/ml et 25 une activite urate oxydase d'environ 7,7 ll/ml (soit un pourcentage d'urate oxydase par rapport aux proteines totales d'environ 8,5 X en supposant une activite specifique de cette derniere de 30 U/mg). 3) Purification de l'urate oxydase recombinante 30 a) Protocole de purification

On soumet le lysat precedent au protocole de purification a deux etapes decrit ci-apres. 35 69 LV 12000 ETAPE 1 :

Chromatographie anionique :

Support : DEAE (diethylaminosulfate) sepharose fast flou (Pharmacia ref. 17.07.09.91).

Le gel une fois tasse occupe un volume de 70 ml.

La separation est effectuee ā temperature ambiante, Ies fractions recoltees, conservees ā 0°C.

Conditions de separation :

On utilise un gradient de force ionique de chlorure entre un tampon 1 (borate de sodium 10 mM, pH 9,2) et un tampon 2 (borate de sodium 10 mM, chlorure de sodium 1 M). Les tampons sont prealable-ment degazes et lors de l'elution sont conserves a 0°C. Dans chaque tampon il a ete ajoute l'equivalent de 0,02 % d'azide. L'extrait brut est depose (10 ml) et elue avec le tampon 1 jusqu'a la collecte complete de l'urate oxydase (par fractions de 10 ml), qui n'est pas retenue sur la colonne.

Les pigments et les proteines contaminantes sont ensuite elimines en eluant avec le tampon 2.

La purification est suivie par mesure de la densitē optique de l'eluat a 214 nm. ETAPE 2 :

Chromatographie Liquide haute pression sur phase inverse :

Support :

Colonne a base de silice greffee C8, l'Aquapore 0D-300 (100 x 2,1 mm) (Brounlee-Applied Biosystems) 70

Conditions operatoires :

Eluant 1 : Eau ultrapurifiee (passee a travers un systfeme Milli-pore) avec 0,1 X d’acide trifLuoroacetique.

Eluant 2 : Acetonitrile Cde qualite spectrophotometrique ou equi-valent) avec 0,08 X d'acide trifluoroacetique.

Debit : 0,3 ml/min.

Le gradient est de 35 X acetonitrile/TFA ā 70 % acetonitrile/TFA en 20 min, on maintient ā 70 X pendant 5 min. La quantite injectee est de 1 ml par run.

Collecte des fractions :

Le deroulement de la separation est suivi par mesure de la densite optique a 218 nm. L'acetonitrile est evapore lors de la centrifuga-tion sous vide. b) Resultats : L'echantillon avant et apres la premiere etape de purifi-cation a ete analyse par chromatographie liquide sur une colonne de silice greffee C8, l'Aquapore 0D-300 decrite precedemment avec le meme gradient, avec une quantite injectee de 50 μΐ. On utilise comme temoin externe l'urate oxydase d'A. flavus purifiee.

Dans le lysat de depart, l'urate oxydase represente 63 X des proteines totales. Apres la premiere etape de purification l'urate oxydase represente 84 % des proteines totales.

La totalite de l'echantillon obtenu h l'issue de la seconde etape, lequel contient certainement plus de 84 % d'urate oxydase, a ete utilisee pour la caracterisation partielle decrite ci-apres. 4) Caracterisation partielle de l'urate oxydase recombinante. a) Analyse d'acides aminēs 71 LV 12000 L'anatyse des acides amines de l'hydrolysat acide de l'urate oxydase recombinante purifiee a ete effectu.ee sur un analy-seur d'Applied Biosystems modele 420-130A. La repartition des acides amines quantifies est compatible (pas de difference signifi-cative) avec la sequence supposee. Le mēme resultat a ete observē pour l'urate oxydate d'A. ftavus extractive purifiee (obtenue ā l'exemple 4). b) Carte peptidique tryptique

Une carte peptidique tryptique a ete etablie pour l’urate oxydase recombinante purifiee et pour l'urate oxydase extractive purifiee (obtenue a l'exemple 4) dans Ies conditions suivantes :

On prepare une solution d'urage oxydase ā une concentra-tion d'environ 1 mg/ml et extemporanement une solution de trypsine ā une concentration de 1 mg/ml.

Les deux Solutions sont mises en presence dans une pro-portion enzyme/substrat de 1/30 pendant 8 heures a tempērature ambiante. L'hydrolysat tryptique est ensuite soumis ā une chromato-graphie en phase liquide sur une colonne a base de silice greffee C18,5 pm, lichrosorb (250 x 4^6 mm) (Hichrom-ref.RP 18-5-250A), equipe d'un detecteur UV a 218 couple ā un enregistreur. Le gradient applique est de 1 % acetonitrile/TFA ā 60 % acžtonitrile/ TFA en 120 min, puis on maintient ā 60 X pendant 5 min.

Les cartes peptidiques obtenues ont un profil tres proche. 3) Mise en evidence du caractere bloque de la sequence amino-terminale :

La sequence amino-terminale a ete analysee ā l'aide d'un sequenceur Applied Biosystem modele 470A, couple ā un analyseur de derives phenylthioidantoīques Applied Biosystem modele 120A. L'urate oxydase recombinante purifiee (200 pmoles contrčlees par 72 analyse d'acides amines) a ete deposee sur le sēquenceur en prē-sence de 20 pmol.es de β-lactoglobuline, protēine tēmoin.

Aucune sēquence amino-terminale correspondant a une sēquence de l'urate oxydase n'a ētē dētectēe (par contre la sequence amino-terminale de la proteine temoin a ete detectee). L'urate oxydase recombinante a donc, comme l'urate oxydase extractive, l'extremite amino-terminale bloquēe.

Exemple 16 : Construction d'un vecteur d'expression de l'ADNc de l'urate oxydase dans Ies cellules animales, le plasmide PSV860.

Ce vecteur a ete obtenu par : - ligation du petit fragment AccI-SnaBI contenant une sequence codant pour l’urate oxydase ā l'exception des 16 premiers acides amines, issu du plasmide p466 : vecteur d‘expression de l'urate oxydase d'A. flavus dans E. coli disponible au laboratoire et dēcrit ci-apres, ā un fragment synthetique HindIII-AccI, ce qui a permis d'obtenir un fragment HindIII-SnaBI contenant une sequence complete codant pour l'urate oxydase d'A. flavus et une sequence 5' non traduite favorable ā l'expression dans Ies cellules animales. - Insertion du fragment HindIII-SnaBI entre Ies sites HindIII et SnaBI du polysite de clonage (egalement appelē polylinker) du vecteur d*expression pour Ies cellules animales, te plasmide pSE^. L'expose ci-apres presentera successivement la construction du plasmide p466, celle du plasmide pSE^ et l'assemblage du plasmide pSV860. 1) Construction du plasmide p466

On a preparē le plasmide p466, vecteur d'expression de l'ADNc de l'urate oxydase dans E. coli. Ce dernier comprend un fragment de pBR327 incluant l'origine de rēplication et le gene de 73 73LV 12000 rēsistance ā l'ampicilline, il comprend ēgalement un promoteur synthētique d*E. coli (R. RODRIGUEZ et M.CHAMBERLĪN "Promoters-Structure and function (1982) Preager), une sequence de Shine-Dalgarno, suivie d'un polyLinker prēsentant Ies sites uniques NdeI et KpnI, un terminateur de transcription (dērivē du phage fd) et le gēne Lac i.

Ce plasmide a ete construit ā partir d'un plasmide d'expression de l'hGH dans E. coli Cp462) par substitution d'un fragment portant le gene de l'hGH par l'ADNc de l'urate oxydase.

La construction du plasmide p466 a ete decrite en detail dans l'exemple 7 ci-dessus. 2) Construction d'un vecteur d'expression pour Ies cellules animales, le plasmide pSE^

La strategie mise en oeuvre fait appel ā des fragments obtenus ā partir de plasmides preexistants accessibles au public et ā des fragments preparēs par voie de synthese selon Ies techniques maintenant couramment utilisees. Les techniques de clonage employees sont celles decrites par T. MANIATIS, EF. FRITSCH et J. SAMBR00K dans "Molecular Cloning, a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984). La synthese des oligonucleotides est realisee ā l'aide d'un synthetiseur d'ADN Biosearch 4 600.

La description ci-apres sera mieux comprise en reference ā la figurē 13, qui represente une carte d'assemblage du plasmide pSE^, les sites ayant disparu par ligation etant notēs entre parentheses. Les symboles utilisēs dans cette figurē seront prēcisēs dans l'exposē ci-apres. 74

Ce plasmide a ete construit par ligations successives des elements ci-aprēs : 1) - un fragment PvuII-PvuII - symbolise par ++++++ sur la figurē 13 - de 2525 pb, obtenu par digestion complete du plasmide pTZ18R (Pharmacia) ā l'aide de l'enzyme de restriction PvuII. Ce fragment contient l'origine de replication du phage F1 (notee ORI F1 sur la figurē 13), un gene (note Amp sur la figurē 13) portant la resistance ā l'ampicilline et l'origine de replication (notee ORI pBR322 sur la figurē 13) permettant la replication de ce plasmide dans E. coli. Le premier site franc PvuII disparait par ligation avec le site franc EcoRV (qui disparait egalement) du fragment decrit en 7). 2) - Un fragment PvuII-Hpal - symbolise par flHf sur la figurē 13 - de 1060 pb de l'ADN d'adenovirus type 5 entre Ies positions 11299 (site de restriction PvuII) et 10239 (site de restriction HpaI) (DEKKER * VAN 0RM0NDT, Gene _27, 1984, 115-120) contenant

l'information pour Ies ARN VA-I et VA-II. Le site franc HpaI disparait par ligation avec le site franc PvuII (qui disparait egalement) du fragment decrit en 3). 3) - Un fragment Pvull-HindIII - symbolise par T7TT, sur la figurē 13 - de 344 pb, issu de l'ADN du virus SV40 obtenu par digestion complete a l'aide des enzymes de restriction PvuII et HindIII. Ce fragment comporte l'origine de replication et le promoteur precoce de l'ADN du virus SV40 (ref. B.J. BYRNE et al. PNAS-USA (1983), 80, 721-725).

Le site HindIII disparait par ligation avec le site liant a HindIII du fragment decrit en 4).

4) - Un fragment synthetique "site liant a HindIII"-HindIII - symbolise par _ sur la figurē 13 - de 419 pb dont la sequence donnee ci-apres est proche de la sequence 5' non traduite du virus HTLV1 (ref. WEISS et al, "Molecular Biology of Tumor

Viruses - part 2~2e ed - 1985 - Cold Spring Harbor Laboratory -p. 1057). 75 LV 12000

site liant a HindIII Ψ

w AGCTGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCC 1 ---------+---------+--------+---------+---------+—-------+ 60

CCGAGCGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCGGCGGGATGGACTCCGGCGGTAGGTGCGG

GGTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTA 61 ---------+---------+---------+---------+---------+--------+120

CCACTCAGCGCAAGACGGCGGAGGGCGGACACCACGGAGGACTTGACGCAGGCGGCAGAT

GGTAGGCTCCAAGGGAGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTCTAAACTTACCTA 121 ---------+---------+---------+--------+---------+--------+180

CCATCCGAGGTTCCCTCGGCCTGTTTCCGGGCCAGAGCTGGACTCGAGATTTGAATGGAT

GACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTT 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+240

CTGAGTCGGCCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGACGAACGAGTTGAGATGCAGAAACAAA

CGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAACTTCAAGGTATGCGCTGGGACCTGGCAGGCGGCAT 241 ---------+---------+---------+---------+---------+:---------+300

GCAAAAGACAAGACGCGGCAATGTTGAAGTTCCATACGCGACCCTGGACCGTCCGCCGTA

CTGGGACCCCTAGGAAGGGCTTGGGGGTCCTCGTGCCCAAGGCAGGGAACATAGTGGTCC 301 ——---—h———h----------i----------+360

GACCCTGGGGATCCTTCCCGAACCCCCAGGAGCACGGGTTCCGTCCCTTGTATCACCAGG

CAGGAAGGGGAGCAGAGGCATCAGGGTGTCCACTTTGTCTCCGCAGCTCCTGAGCCTGCA 361 --------+---------+---------+---------+---------+--------+420

GTCCTTCCCCTCGTCTCCGTAGTCCCACAGGTGAAACAGAGGCGTCGAGGACTCGGACGT

GA CTTCGA^

HindIII 76 5) - Un fragment synthetique HindIII "site liant a BarnHI*' - symbolise par yW \ sur la figurē 13 - contenant le promoteur de l'ARN-polymerase du phage T7 ainsi qu'un polylinker contenant le site de clonage Smal. 05

AGCTTGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGCGGCCGCGGGCCCCTGCAGGAATTC

ACAGCTGATTATGCTGAGTGATATCCCGCCGGCGCCCGGGGACGTCCTTAAG

A

HindIII

Smal site liant ā BamHI 10 GGATCCCCCGGGTGACTGACT^

CCTAGGGGGCCCACTGACTGACTAG 6) - Un fragment BamHI-BcII de 240 pb - represente parJJJJsur la 15 figurē 13 -, petit fragment obtenu par digestion complete a l'aide des enzymes Bell et BamHI du virus SV40 qui contient le site de polyadenylation tardif de ce dernier. (M. FITZGERALD et ai. Celi, 24, 1981, 251-260). Les sites BamHI et Bell disparaissent par ligations avec respectivement le site liant a BamHI du fragment 20 decrit en 5) et le site BamHI (qui disparait egalement du fragment decrit en 7). 7) - Un fragment BamHI-EcoRV - symbolise par Ο Ο Ο O sur la figurē 13 - de 190 pb, petit fragment issu du plasmide pBR322 apres 25 digestion complete ā l'aide des enzymes EcoRV et BamHI. 3) Construction du plasmide pSV860

Le plasmide p466 (cf. figurē 9) a ete soumis a une digestion complete a l'aide des enzymes Accl et SnaBI. Le petit 30 fragment AccI-SnaBI, qui contient une sequence d'ADN codant pour l'urate oxydase ā l'exception des 16 premiers acides aminoter-minaux, a ete purifie et ligue au fragment synthetique HindlII-Accl de sequence suivante : 77 LV 12000

HindIII Accl τ y

AGCTTGCCGCCACTATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACGGCAAGGACAATGTCCGCGT ---------+---------+---------+---------+-------'—+-------+

ACGGCGGTGATACAGGCGTCATTTTCGTCGGGCGATGCCGTTCCTGTTACAGGCGCAGA

Cette ligation permet d'obtenir le fragment HindIII-SnaBI, qui contient une sequence codant pour L'urate oxydase identique ā celle du clone 9C et une sequence 5' non traduite favorable a l'expression dans Les cellules animales (K0ZAK, M., Nuct. Acids Res., 12, 2, 1984, 857-872).

Le fragment HindIII-SnaBI contient La sequence :

5' -AGCTTGCCG CCACTATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCGG TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G

Le fragment HindIII-SnaBI a ensuite ete insere dans Le vecteur pSE^ prealablement incube avec les enzymes HindIII et Smal. On a ainsi obtenu le plasmide pSV860, represente sur La figurē 14, 78 dans laquelle Ies symbol.es ont La mēme signification que dans la figurē 13, Le nouveau fragment HindIII-SnaBI .etant symbolise par^ (Les sites SnaBI et Smal ont disparu par Ligation).

ExempLe 17 : Expression transitoire de L'ADNc de l'urate oxydase dans les cellules COS. Dosage de l'activite urate oxydase-dans le lysat cellulaire.

Les cellules COS sont des cellules de reins de singe exprimant l'antigēne T du virus SV40 (Gluzman, Y. Celi 23, 1981, 175-182). Ces cellules, qui permettent la replication des vecteurs contenant l'origine de replication de l'ADN du virus SV40, constituent des hotes de choix pour l'etude de l'expression de genes dans les cellules animales. 1) Transfection des cellules COS et expression transitoire de l'ADNc de l'urate oxydase. 4.10^ cellules COS sont etalees dans une boite de Petri de 6 cm de diametre (Corning) dans 5 ml de milieu modifie d'Eagle selon Dulbecco ci-apres appele DMEM (le Dulbecco's modified Eagles medium de Gibco), lequel contient 0,6 g/l glutamine, 3,7 g/l NaHCO^ et est complemente avec du serum de veau foetal (GIBCO) a raison de 5%. Aprēs environ 16 h de culture ā 37°C dans une atmosphere contenant 5Z de dioxyde de carbone, le milieu de culture est enleve par aspiration et les cellules sont lavees avec 3 ml de tampon PBS (le Phosphate Buffer Saline de GIBCO). On y ajoute alors le melange suivant : 1 000 μΐ de (DMEM + 10% serum de veau foetal (GIBCO)), 110 μΐ de diethylaminoethyl-dextrane de poids moleculaire moyen 500 000, h une concentration de 2 mg/ml (Pharmacia), 1,1 μΐ de chloroquine 100mM (Sigma) et 3 pg d'ADN soit du plasmide pSV860, soit du plasmide pSE^ (pour le temoin). Apres 5 h d'incubation a 37°C dans une atmosphere contenant 5% de dioxyde de carbone, le melange est reti re des cellules. On y ajoute alors 2 ml de tampon PBS contenant 10% de dimethyl sulfoxyde (qualite Spectroscopie, Merck). Apres 1 min d'incubation a la temperature ambiante, le melange est reti re et les cellules sont lavees deux fois avec du tampon PBS. On y ajoute 5 ml de DMEM complemente avec du serum de 79 LV 12000 veau foetal a raison de 2%. L'incubation est poursuivie pendant 4 jours a 37°C sous atmosphere contenant 5% de dioxyde de carbone. 2) Preparation des echanti llons. 05 Le milieu de culture est aspire et Les celluLes COS sont rincees deux fois avec 3 ml de tampon PBS. Les celluLes sont alors recueillies par grattage avec une spatule en caoutchouc (un "Policeman”) dans 1 ml de tampon PBS. Apres grattage, la boite est rincee avec 1 ml de tampon PBS. Les deux suspensions cellulaires 10 sont combinees et centrifugees pendant 10 min a 1 000 tr/min. Le surnageant est enleve et le culot cellulaire est remis en suspension dans 1 ml de tampon de triēthanolamine (TEA) 0,05 M de pH 8,9/EDTA.

Les cellules sont lysees par sonication (sur de la glace) 15 par des pulsations de 10 s avec un sonicateur (le Vibra Celi de Sonics and Materials Inc. USA) regle a une puissance de 12 W. Le lysat cellulaire est centrifuge pendant 10 min a 10 000 tr/min et le surnageant est recupere pour le dosage de l'urate oxydase. 20 3) Dosage de l'activite urate oxydase.

Le dosage de l'activite urate oxydase a ete effectue comme decrit a l'exemple 9. 25 Les resultats sont rassembles dans le tableau ci-apres :

Cellules COS transfectees par Activite urate oxydase U/ml pSV860 0,105 pSE1 <0,01 δο Οη constate que Les ceLLuLes COS transfectees par le plasmide pSV860, porteur de L'ADNc de L'urate oxydase, expriment un niveau appreciable d'activite urate oxydase, alors qu'aucune activite urate oxydase n'est detectable sur Le temoin. IL y a donc 05 expression de L'ADNc de L'urate oxydase.

Revendications LV 12000 1. Prolēine recombinante, caractērisee en ce qu'elle prēsente une activitē urate oxydase spēcifique d'au moins 16 U/mg et en ce qu'elle a la sēquence ci-apres :

Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai Tyr 1 5 10 15 Lys Vai His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai Gln Thr Vai Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Vai Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Vai Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Vai Asn Ile Vai Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg U5 120 125 Asn Vai Gln Vai Asp Vai Vai Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 I50 155 160 Gly Phe Leu Ar g Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205

Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Vai Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 25O 255 Tyr Phe Glu 11 e Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 27O Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 prēcēdēe ēventuellement d'une mēthionine. 2. Protēine recombinante selon la revendication 1, caractērisēe en ce qu'elle prēsente une activitē urate oxydase spēcifique d'environ 30 U/mg. 3. Proteine recombinante selon l'une des revendications 1 et 2, caractērisēe en ce que, par analyse sur gel bidimen-sionnel, elle prēsente un spot de masse molēculaire d'environ 33,5 kDa, reprēsentant au moins 90 % de la masse protēique. 4. Proteine recombinante selon l‘une quelconque des revendications 1 ā 3, caractērisēe en ce qu‘elle a un taux de puretē, dēterminē par chromatographie liquide sur une coionne de silice greflee C8, supērieur ā 80 %. 5. Proteine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 ā 4, caractērisēe en ce qu'elle a un point isoēlectrique voisin de 5.0. 6. Protēine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 ā 4, caractērisēe en ce qu'elle porte un grou-pement bloquant, de prēfērence de masse molēculaire voisine de 43 unitēs de masse atomique, sur la sērine amino-terminale. 7. Mēdicament, caractērisē en ce qu'il contient la protēine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 ā 6. 8. Gēne recombinant, caractērisē en ce qu'i! comporte une sēquence d'ADN codant pour la protēine de sēquence ci-aprēs:

Met 1 Ser Ala Vai Lys 5 Ala Ala Arg Tyr Gly 10 Lys Asp Asn Vai Arg 15 Vai Tyr Lys Vai His 20 Lys Asp Glu Lys Thr 25 Gly Vai Gln Thr Vai 30 Tyr Glu Met Thr Vai 35 Cys Vai Leu Leu Glu Gly 40 Glu Ile Glu Thr 45 Ser Tyr Thr Lys Ala 50 Asp Asn Ser Vai Ile 55 Vai Ala Thr Asp Ser 60 Ile Lys Asn Thr LV 12000

Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Vai Thr Pro Pro Glu Leu Phe 65 70 75 80

Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His 85 90 95

Ala Ala His Vai Asn Ile Vai Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile 100 105 110

Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys 115 120 125

Arg Asn Vai Gln Vai Asp Vai Vai Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys 130 135 i4o

Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe 145 150 155 160

Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp 165 170 175

Arg Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe 180 185 190

Ser Gly Leu Gln Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr 195 200 205

Trp Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn 210 215 220

Ser Ala Ser Vai Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu 225 230 235 240

Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys 245 250 255

His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr 260 265 270

Cly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu 275 280 285

Ile Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 29O 295 300 9. Gēne recombinant selon la revendication 8, caractērise en ce qu'il permet une expression dans Ies micro-orga-nismes procaryotes. 10. Gēne recombinant selon la revendication 9, caractērise en ce que ladite sēquence d'ADN contient la sēquence ci-aprēs: ATGTCTGCGG TAAAAGCACC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA CAAGGTTCAC 60 AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG 120 GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC l80 ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC 240 GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC 36O TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC 420 ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC 480 TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGACC 540 ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 600 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT 660 GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG 720 GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA 780 ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT 840 CCTCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900 AAATTG 906 11. Gēne recombinant selon la revendication 8, caractērisē en ce qu'il permet une expression dans Ies cellules euca-ryotes. 12. Gēne recombinant selon la revendication 11. caractērisē en ce que ladite sēquence d'ADN contient la sēquence ci-aprēs: ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGAGTCTA CAAGGTTCAC 60 AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG 120 GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC 180 ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC 240 GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC 360 TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC 420 ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC 480 TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTAGACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC 540 ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 600 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT 660 GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG 720 GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA 780 ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT 840 CCTCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900 AAATTG 906 13. Gēne recombinant selon la revendication 8. caractērisē en ce qu'il permet une expression dans Ies cellules ani-males. 14. Gēne recombinant selon la revendication 13. caractērisē en ce que ladite sēquence d'ADN comprend la sēquence ci-aprēs : ATGTCCGCAG TAAAAGCAGC CCGCTACGGC AAGGACAATG TCCGCGTCTA CAAGGTTCAC 60 AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG 120 GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC l80 ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC 240 LV 12000

GGCTCCATCC TGGGCACACA AACATTGTCT GCCACCGCTG TTCATCCGCG ACAGCGAGGA ATCGATATCA AGTCGTCTCT TGGGGCTTCC TGCGTGACGA ACCGACGTCG ATGCCACTTG CACGTGCCTA AGTTCGATGC GCTGAAGATA ACAGTGCCAG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA ATCGACCTGA GCTGGCACAA CCTCAGTCGG ACCCCAACGG AAATTG

CTTCATTGAG AAGTACAACC GACCCGGATG GACATTGACG GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA GTACACCACA CTTAAGGAGA GCAGTGGAAG AATTTCAGTG TACCTGGGCC ACTGCTCGCG CGTGCAGGCC ACTATGTACA GACTGTCGAG TACTCGTTGC GGGCCTCCAA AACACCGGCA TCTGATCAAG TGTACCGTCG

ACATCCATGC CGCTCACGTC GCAAGCCACA CCCTCACTCC ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC AGAGCACCAA CTCGCAGTTC CCTGGGACCG TATCCTGAGC GACTCCAGGA GGTCCGCTCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT AGATGGCAGA GCAAATCCTG CTAACAAGCA CTATTTCGAA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 906 prēcēdēe d'une sēquence 5' non traduite favorable ā l’expression dans Ies cellules animales. 15. Gēne recombinant selon la revendication 14, caractērisē en ce que la sēquence 5' non traduite favorable ā l'ex-pression dans Ies cellules animales comprend la sequence: AGCTTGCCGCCACT situēe immēdiatement en amont de la sēquence explicitee dans la revendication 14. 16. Vecteur d'expression, caractērise en ce qu'il porte, avec Ies moyens nēcessaires ā son expression, un gēne recombinant selon l'une quelconque des revendications 8 ā 15. 17. Vecteur d'expression selon la revendication 16, caractērise en ce qu'il porte au moins un marqueurde sēlection. 18. Vecteur d'expression seion la revendication 17, caractērisē en ce qu'il a Ies caractēristiques de l'un des plasmides pEMR469, pEMR473 dēcrits dans Ies figurēs 11 et 12 ou de pEMR515 dērivē de pEMR473 pardēlētion du gēne URA3 et du fragment Xbal-Nhel du 2 micron. 19. Micro-organismes procaryotes, caractērisēs en ce qu'ils sont transformēs par un vecteur d'expression selon la revendication 16, portant un gēne recombinant selon la revendication 9. 20. Cellules eucaryotes, caractērisēes en ce qu'elles sont transformēes par l’un des vecteurs d'expression selon 1‘une quelconque des revendications 16 ā 18 portant le gēne recombinant selon la revendication 11. 21. Souche de Saccharomvces cerevisiae. caractērisāe en ce qu'elle est transformēe par l'un des vecteurs d'expres-sion selon l'une quelconque des revendications 16 ā 18. 22. Souche selon la revendication 21, caractērisēe en ce qu'elle porte une mutation sur au moins l'un des gēnes responsables de la synthēse de la leucine ou de l'uracile. 23. Souche selon la revendication 22, caractērisēe en ce qu‘elle porte une mutation sur au moins l'un des gēnes LEU2 et URA3. 24. Procēdē pour obtenir l'urate oxydase recombinante selon la revendication 1, caractērisē en ce qu'il comprend Ies ētapes ci-aprēs: 1/ mise en culture d'une souche selon l'une quelconque des revendications 21 ā 23: 21 lyse de cellules : 3/ isolement et purification de l'urate oxydase recombinante contenue dans le lysat. 25. Cellules animales, caractērisēes en ce qu'elles contiennent. avec Ies moyens nēcessaires ā son excression. un gēne recombinant selon la revendication 13. 26. Cellules animales, caractēnsēes en ce qu‘elles contiennent un vecteur d'expression selon la revendication 16. portant un gēne recombinant selon la revendication 14. LV 12000

FIG.1

Profil d'ēlution par mesure de la densitē optique a 218 nm du produit de la digestion tryptique de l'urat oxydase LV 12000

FIG.2

Profil d'elution par mesure de la densitē optique ā 218 nm du produit de la digestiori per la protease V8 de l'urate oxydase LV 12000

1 AAACCCTCAC7GCC7C7C7CA77CC77CCG G7GCCCCCGA7CC7CAA7CCAAC77G7ACA 61 7AC77C7CCCAAC7C7C7GC7A7A7CC7TC ATA77CCCATAC7ACAAGA7G7CCGCAG7A 121 AAAGCAGCCCGCTACGGCAAGGACAA7G7C CGCG7C7ACAAGGT7CACAAGGACGAGAAG 181 accggtgtccagacggtgtacgagatgacc G7C7G7G7GC77C7GGAGGG7GAGAT7GAG 241 ACC7C77ACACCAAGGCCGACAACAGCG7C A77G7CGCAACCGAC7CCA7TAAGAACACC 301 ATTTACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTT ACTCCTCCCGAGCTGTTCGGCTCCATCCTG 361 GGCACACAC77 CAT TGAGAAGTACAACCAC ATCCATGCCGCTCACGTCAACATTGTCTGC 421 CACCGCTGGACCCGGATGGACATTGACGGC AAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCGCGAC 481 AGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGAC GTGGTCGAGGGCAAGGGCATCGATATCAAG 541 TCGTCTCTGTCCGGCCTGACCGTGCTGAAG AGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGC77CC7G 601 CGTGACGAGTACACCACAC7TAAGGAGACC 7GGGACCG7A7CC7GAGCACCGACGTCGAT 661 GCCAC77GGCAG7GGAAGAA777CAG7GGA CTCCAGGAGGTCCGCTCGCACGTGCCTAAG 721 TTCGATGCTACCTGGGCCACTGCTCGCGAG G7CAC7C7GAAGAC7777GC7GAAGA7AAC 7 81 AGTGCCAGCGTGCAGGCCAC7ATG7ACAAG A7GGCAGAGCAAATCC7GGCGCGCCAGCAG 841 C7GA7CGAGAC7G7CGAGTAC7CG77GCC7 AACAAGCAC7A777CGAAA7CGACC7GAGC 901 TGGCACAAGGGCC7CCAAAACACCGGCAAG AACGCCGAGG7C77CGC7CC7CAG7CGGAC 961 CCCAACGG7C7GA7CAAG7G7ACCG7CGGC CGG7CC7C7C7GAAG7C7AAA77G7AAACC 1021 AACATGATTCTCACG77CCGGAG777CCAA GGCAAAC7G7A7A7AG7C7GGGATAGGG7A 1081 7AGCAT7CA77CAC77G777777AC77CCA AAAAAAAAAAA. . . 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080

Sēquence nuclēotidique du clone 9C et d'une partie du clone 9A

: dēbut du clone 9A LV 12000 10 5 ATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCCACGGC 1 MetSerAlaVaH.yaAlAAlaArgTyrCIy 169 AAGGACGAGAAGACCGGTGTCCAGACGGTG 21 LyaA3pGluLyaTiirGlyValGlnThrVal 229 GGTGAGATTGAGACCTCTTACACCAAGGCC 41 GlyGluIleGluTiirSarTyrTī:r-y3Ala 2 a 9 ATTAAGAACACCATTTACATCACCGCCAAG $1 HeLysAanTiirIleTyrIleTī'.rAlaLys 3-49 GGCTCCATCCTGGGCACACAC?TCA77GAG 81 GlySarIleLeuGly7hrHi3PhaIleGlu -409 AACATTGTCTGCCACCGCTGGACCCGGATG 101 A3nIleValCy8HieArgTgp71igArgMet 4 6 9 TTCATCCCCCACAGCGACGAGAAGCCCAA7 121 PheIleArgAapSerGluGluI.yoAxgAan 529 A7CGA7A7CAAC7CG7C7C7CTCCGGCC7G 141 IleAapIleLyaSerSerLeuSerGlyLeu " 1 2” vj/7( n 58 9 7GGGGC77CCTGCC7GACGAG7ACACCACA 161 TrpGlvPhaLauArgAapG1u ?y r7hr7hr 64 9 ACCGACG7CGA7GCCACT7GGCAG7GGAAG 181 ThrA-apValAapAlaThgTrpGlnTrpLya TJ4 ‘ 2 709 CACGTGCC7AAGT7CGA7GCTACC7GGGCC 201 8iaValProLyaPheAapAlaThrTrpAla 2 T1J ” 7 6 9 GCTGAAGATAACAGTGCCAGCGTGCAGGCC 221 AlaGluAapAanSerAlaSerValGlnAla • vi —r 82 9 GCGCGCCAGCAGCTGA7CGAGAC7GTCGAG 241 AlaArgGlnGlnLeuIleGluīfcgValGlu 8 8 9 ATCGACCTGAGCTGGCACAAGGGCCTCCAA 261 ļ.^).XleA3pLeuSerTrpHiaLyaGlyL6uGln 94 9 CC7CAG7CGGACCCCAACGG7C7GA7CAAG 281 ProGlnSezAapProAanGlyLeuXleLya 1009 AAATTG7AA 301 LysLeu£nd AAGGACAA7G7CCGCG7C7ACAf\ovjT7CAC 165 LyaAapAanValArgVal7yrLyaValHia 20 7ACGAGA7GACCG7C7G7G7GC77C7GSAG 220 7yrGluMet71irValCy3ValLauLeuGlu 40 GACAACAGCGTCATTGTCGCAACCGACTCC 288 AapAaaSerValIleValAlaTlirAspSer 60 CAGAACCCCG7TACTCCTCCCGAGC7GTTC 348 GlnAsnProValThrProProGluLauPha 80 .4

FIG Sēquence d'ADN ouverte par l'ATG en position 109 sur la figurē 3 et polypeptide codē.

Les peptides sēquencēs obtenus par hydrolyse de l'urate oxydase d'A. flavus a l’aide de la trypsine et de la protease V8 sont representēs par des flēches en vis-ā-vis du polypeptide codē selon -► : peptide tryptique ------► : peptide obtenu par hydrolyse ā l'aide de la protease V8. 1 " Til/TJ» AAG7ACAACCACATCCATGCCGCTCACG7C 408 Lya7yrA3nHiaIleHieAlaAlaHiaVal 100 GACA77GACGGCAAGCCACACCCTCACTCC 463 A3pIleAapGlyI.y3ProHiaProHiaSer 120 C7GCACG7GGACC7GCTCGAGGGCAACGGC 528 ValGlnValAa pValVa lGluGlyI.yaGly 140 τι» --- ACCG7GC7GAAGAGCACCAACTCGCAGT7C 588 7hrValLeuI<ya5er7hrA3nSerGlnPhe 160 C77AAGGAGACCTGGGACCG7A7CC7GAGC 64 8 LeuLyaGlu7iir7rpAapArgIleLeuSer 180 AA777CAG7GGAC7CCAGGAGG7CCGC7CG 708 A3nPheSerGlyLeuGlnGluValAxgSer 200 2 rīē ” ACTGCTCGCGAGGTCACTCTGAAGACTTTT 768 7iirAlaArgGluVal71irLeuLy3ThrPiie 220 AC7A7G7ACAAGATGGCAGAGCAAA7CCTG 828 7hrMetTyrLyaMetAlaGluGlnIleLeu 240 7AC7CG77GCC7AACAAGCAC7A777CGAA 888 7ygSegLauggoAanLyaHia?ygPheGlu 260 AACACCGGCAAGAACGCCGAGGTC77CGCT 94 8 Aar.7AgGlyLyaAanAlaGluValliheAla 230 TG7ACCG7CGGCCGG7CCTCTC7GAAGTC7 1008 Cy3ĪligValGlyAjrgSerSerLeuLysSer 300

LV 12000 Hinc H

FIG.5

Plasmide p 163,1 LV 12000

Hmc E

FIG.6

Plasmida p 160 LV 12000 (Hinc II)

FIG.7

Plasmīde p 373,2 LV 12000 (Hinc H)

FIG.8

Plasmide p A62 LV 12000 (Hīnc II)

FIG.9

Plasmide p 465

LV 12000 NheI

FIG.10

Plasrr.ids pEMR414

LV 12000 NheI

FIG.11

Plasmide pEMR 469 LV 12000

NheI

FIG.12

Plasmide pEMR A73 LV 12000

FIG.13

Plssmidg PS£ 1 LV 12000

FIG.14

Plasm\de. p 5V860

Claims (26)

1 LV 12000 Izgudrojuma formula 1. Olbaltumviela, kas atšķiras ar to, ka tai piemīt urātoksidāzes aktivitāte vismaz 16 vienības/mg un kuru raksturo šāda secība: Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai 1 5 10 15 Tyr Lys Vai His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai Gln Thr Vai Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Vai Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser Ile 50 55 60 Lys Asn Thr Īle Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Vai Thr Pro 65 70 75 Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys 80 85 90 Tyr Asn His Īle His Ala Ala His Vai Asn Ile Vai Cys His Arg 95 100 105 Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe 110 115 120 Īle Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Vai Gln Vai Asp Vai Vai 125 130 135 Glu Gly Lys Gly Ile Asp ILe Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr 140 145 150 Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp 155 160 165 Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr 170 175 180 Asp Vai Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gln 185 190 195 Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala Thr 200 205 210 Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala 215 220 225 Ser Vai Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala - 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys 245 250 255 His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn 260 265 270 2 Thr Gly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys 290 295 300 Leu, kuru neobligāti ievada papildus metionina palieka.

2. Olbaltumviela pēc 1. punkta, kas atšķiras ar to, ka tai piemīt urātoksidāzes aktivitāte apmēram 30 vienibas/mg.

3. Olbaltumviela pēc 1. vai 2. punkta, kas atšķiras ar to, ka vismaz 90 % no šīs olbaltumvielas masas divdimensionālā gēlelektroforēzes analīzē veido plankumu, kuram atbilst molekulmasa apmēram 33,5 kDa.

4. Olbaltumviela pēc jebkura no 1.- 3. punktam, kas atšķiras ar to, ka tās tīrība, nosakot ar šķidruma hromatogrāfiju uz modificēta silikagēla C8 kolonas, pārsniedz 80%.

5. Olbaltumviela pēc jebkura no 1.- 4. punktam, kas atšķiras ar to, ka tās izoelektriskais punkts ir aptuveni 8,0.

6. Olbaltumviela pēc jebkura no 1.- 4. punktam, kas atšķiras ar to, ka tās aminogrupas gala serīns aizsargāts ar grupu, kuras masa ir aptuveni 43 masas vienības.

7. Ārstniecības līdzeklis, kas atšķiras ar to, ka tas satur olbaltumvielu pēc jebkura no iepriekšējiem punktiem.

8. Rekombinantais gēns, kas atšķiras ar to, ka tas satur DNS secību, kura kodē olbaltumvielu ar šādu secību: Met Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg 1 5 10 15 Vai Tyr Lys Vai His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai Gln Thr Vai 20 25 30 Tyr Glu Met Thr Vai Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr 35 40 45 Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser 50 55 60 Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Vai Thr 65 70 75 Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu 80 85 90 Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Vai Asn Ile Vai Cys His 95 100 105 Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser 110 115 120 3 LV 12000 Phe Īle Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Vai Gln Vai Asp Vai 125 130 135 Vai Glu Gly Lys Gly Ile Asp ILe Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu 140 145 150 Thr Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp Gly Phe Leu Arg 155 160 165 Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser 170 175 180 Thr Asp Vai Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu 185 190 195 Gln Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala 200 205 210 Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 215 220 225 Ala Ser Vai Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu 230 235 240 Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn 245 250 255 Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln 260 265 270 Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro 275 280 285 Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser 290 295 300 Lys Leu

9. Rekombinantais gēns pēc 8. punkta, kas atšķiras ar to, ka to iespējams ekspresēt prokariotos mikroorganismos.

10. Rekombinantais gēns pēc 9. punkta, kas atšķiras ar to, ka tā DNS ietver šādu secību: ATGTCTGCGG CAAGGTTCAC CCGTCTGTGT GACAACAGCG CACCGCCAAG TGGGCACACA AACATTGTCT CCCTCACTCC ACGTGGTCGA ACCGTGCTGA GTACACCACA ATGCCACTTG CACGTGCCTA GAAGACTTTT AGATGGCAGA TACTCGTTGC GGGCCTCCAA ACCCCAACGG AAATTG TAAAAGCAGC AAGGACGAGA GCTTCTGGAG TCATTGTCGC CAGAACCCCG CTTCATTGAG GCCACCGCTG TTCATCCGCG GGGCAAGGGC AGAGCACCAA CTTAAGGAGA GCAGTGGAAG AGTTCGATGC GCTGAAGATA GCAAATCCTG CTAACAAGCA AACACCGGCA TCTGATCAAG GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA 50 AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA 100 GTTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC 150 AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT 200 TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC 250 AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA 350 ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG 400 ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG 450 CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA 500 CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG 550 AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 600 TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT 650 ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA 700 GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG 750 CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA 800 AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 850 TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900 906 4

11. Rekombinantais gēns pēc 8. punkta, kas atšķiras ar to, ka to iespējams ekspresēt eikariotu šūnās.

12. Rekombinantais gēns pēc 11. punkta, kas atšķiras ar to, ka tā DNS ietver šādu secību: GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA 50 AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA 100 GTTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC 150 AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT 200 TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC 250 AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA 350 ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG 400 ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG 450 CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA 500 CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG 550 AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 600 TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT 650 ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA 700 GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG 750 CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA 800 AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 850 TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900 906 ATGTCTGCGG CAAGGTTCAC CCGTCTGTGT GACAACAGCG CACCGCCAAG TGGGCACACA AACATTGTCT CCCTCACTCC ACGTGGTCGA ACCGTGCTGA GTACACCACA ATGCCACTTG CACGTGCCTA GAAGACTTTT AGATGGCAGA TACTCGTTGC GGGCCTCCAA ACCCCAACGG AAATTG TAAAAGCAGC AAGGACGAGA GCTTCTGGAG TCATTGTCGC CAGAACCCCG CTTCATTGAG GCCACCGCTG TTCATCCGCG GGGCAAGGGC AGAGCACCAA CTTAAGGAGA GCAGTGGAAG AGTTCGATGC GCTGAAGATA GCAAATCCTG CTAACAAGCA AACACCGGCA TCTGATCAAG

13. Rekombinantais gēns pēc 8. punkta, kas atšķiras ar to, ka to iespējams ekspresēt dzīvnieku šūnās.

14.Rekombinantais gēns pēc 13. punkta, kas atšķiras ar to, ka tā DNS ietver šādu secību: ATGTCCGCAG TAAAAGCAGC CCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA 50 CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA 100 CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GTTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC 150 GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT 200 CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC 250 TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTAAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA 350 CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG 400 ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG 450 ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA 500 GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG 550 ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCGAGGA GGTCCGCTCG 600 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT 650 GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA 700 AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG 750 TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA 800 GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 850 ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900 AAATTG 906, kuru ievada neekspresējama 5' gala secība, kas veicina ekspresiju dzīvnieku šūnās. 5 LV 12000

15. Rekombinantais gēns pēc 14. punkta, kas atšķiras ar to, ka neekspresējamā 5' gala secība, kas veicina ekspresiju dzīvnieku šūnās satur secību: AGCTTGCCGCCACT, kura novietota tieši pirms 14. punktā dotās secības.

16. Ekspresijas vektors, kas atšķiras ar to, ka tas satur rekombinanto gēnu pēc jebkura no 8. - 15. punktam un līdzekļus, kas nepieciešami tā ekspresijai.

17. Ekspresijas vektors pēc 16. punkta, kas atšķiras ar to, ka tas satur vismaz vienu selekcijas posmu.

18. Ekspresijas vektors pēc 17. punkta, kas atšķiras ar to, ka tas raksturojas kā viena no plazmīdām pEMR469 vai pEMR473, kas attēlotas Fig. 12 vai 13, vai pEMR515, kas iegūta no pEMR473, aizvācot gēnu URA3 un 2. mikrona fragmentu Xbal-Nhel.

19. Prokariotie mikroorganismi, kas atšķiras ar to, ka tie ir transformēti ar ekspresijas vektoru pēc 16. punkta, kurš satur rekombinanto gēnu pēc 9. punkta.

20. Eikariotu šūnas, kas atšķiras ar to, ka tās ir transformētas ar ekspresijas vektoru pēc jebkura no 16. -18. punktam, kurš satur rekombinanto gēnu pēc 11. punkta.

21. Saccharomyces cerevisiae celms,kas atšķiras ar to, ka tas ir transformēts ar ekspresijas vektoru pēc jebkura no 16. - 18. punktam.

22. Celms pēc 21. punkta, kas atšķiras ar to, ka tas satur mutāciju vismaz vienā no gēniem, kas atbild par leicīna vai uracila sintēzi.

23. Celms pēc 22. punkta, kas atšķiras ar to, ka tas satur mutāciju vismaz vienā no gēniem LEU2 un URA3.

24. Paņēmiens rekombinantas urātoksidāzes pēc 1. punkta iegūšanai, kas ietver šādus posmus: 1) celma pēc jebkura no 21. - 23. punktam kultivēšanu; 2) šūnu lizēšanu; 3) lizātā esošās rekombinantās urātoksidāzes izdalīšanu un attīrīšanu.

25. Dzīvnieku šūnas, kas atšķiras ar to, ka tās satur rekombinanto gēnu pēc 13. punkta, kopā ar tā ekspresijai nepieciešamiem līdzekļiem.

26. Dzīvnieku šūnas, kas atšķiras ar to, ka tās satur ekspresijas vektoru pēc 16. punkta, kurš ietver rekombinanto gēnu pēc 14. punkta.