FR2657785A2 - Gene recombinant pour une expression dans les cellules animales d'une proteine telle que l'urate oxydage. - Google Patents
Gene recombinant pour une expression dans les cellules animales d'une proteine telle que l'urate oxydage. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention a pour objet un nouveau gène recombinant codant pour l'urate oxydase. Ce gène peut avoir la séquence ci-après: (CF DESSIN DANS BOPI) Application: obtention d'urate oxydase.
Description
Gène recombinant pour une expression dans les cellules anima les d'une protéine telle que L'urate oxydase.
Le présent certificat d'addition se rattache à la demande de brevet n 89 17 466 qui concerne un nouveau gène recombinant pour une expression dans les cellules eucaryotes, caractérisé en ce qu'vil comporte une séquence d'ADN qui s'hybride avec une sonde de formule :
1 2 3 A 4 T A D5 TG dans laquelle les symboles D1, D2, D3, D4 et D5 représentent respectivement CA, G ou T7, CT ou C], [G ou A], EG ou A7 et EG ou A7 ainsi qu'avec une sonde de formule ::
A E1 E2 AAE3 C C C C A E4 AAE5 TG dans laquelle les symboles E1, E2, E3, E4 et E5 représentent respectivement EG ou A], [G ou A], {A, G, C ou T7, CG ou A7 et
ET ou C3 et code pour une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 33 kDa, qui catalyse la dégradation d'un métabolite.
1 2 3 A 4 T A D5 TG dans laquelle les symboles D1, D2, D3, D4 et D5 représentent respectivement CA, G ou T7, CT ou C], [G ou A], EG ou A7 et EG ou A7 ainsi qu'avec une sonde de formule ::
A E1 E2 AAE3 C C C C A E4 AAE5 TG dans laquelle les symboles E1, E2, E3, E4 et E5 représentent respectivement EG ou A], [G ou A], {A, G, C ou T7, CG ou A7 et
ET ou C3 et code pour une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 33 kDa, qui catalyse la dégradation d'un métabolite.
Ce gène recombinant comporte de préférence une séquence d'ADN, codant pour une protéine, appelée par la suite urate oxydase, de séquence ci-après, déduite de la séquence de l'ADNc de L'urate oxydase d'A. flavus.
MetSerAlaValLysAlaAlaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis LysAspGluLysThrGlyValGlnThrVal TyrGluMetThrValCysValLeuLeuGlu GlyGluIleGluThrSerTyrThrLysAla AspAsnSerValIleValAlaThrAspSer IleLysAsnThrIleTyrIleThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPhe
GlySerIleLeuGlyThrHisPheIleGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal
AsnIleValCysHisArgTrpThrArgMet AsplleAspGlyLysProHisProHisSer PheIleArgAspSerGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly
IleAspIleLysserserLeuserGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhe TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrThr LeuLysGluThrTrpAspArgIleLeuSer
ThrAspValAspAlaThrTrpGlnTrpLys AsnPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLysThrphe
AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnIleLeu AlaArgGlnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu
IleAspleuSerX1HisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla ProGlnSerAspProAsnGlyLeuIleLys CysThrValGlyArgSerSerLeuLysSer
LysLeu dans laquelle X1 représente Trp ou Gly, Trp étant particulièrement apprécié. L'enseignement de cette demande de brevet est incorporé dans la présente demande à titre de référence.
GlySerIleLeuGlyThrHisPheIleGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal
AsnIleValCysHisArgTrpThrArgMet AsplleAspGlyLysProHisProHisSer PheIleArgAspSerGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly
IleAspIleLysserserLeuserGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhe TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrThr LeuLysGluThrTrpAspArgIleLeuSer
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AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnIleLeu AlaArgGlnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu
IleAspleuSerX1HisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla ProGlnSerAspProAsnGlyLeuIleLys CysThrValGlyArgSerSerLeuLysSer
LysLeu dans laquelle X1 représente Trp ou Gly, Trp étant particulièrement apprécié. L'enseignement de cette demande de brevet est incorporé dans la présente demande à titre de référence.
Celle-ci exemplifie L'expression d'un gène codant pour
L'urate oxydase dans la levure et mentionne la possibilité de produire cette protéine dans les cellules animales.
L'urate oxydase dans la levure et mentionne la possibilité de produire cette protéine dans les cellules animales.
Les cellules COS sont des cellules de reins de singe exprimant l'antigène T du virus SV40 (Gluzman, Y. Cell 23, 1981, 175-182). Ces cellules, qui permettent la réplication de vecteurs contenant l'origine de réplication de L'ADN du virus SV40, constituent des hôtes de choix pour L'étude de L'expression de gènes dans les cellules animales.
La Demanderesse a maintenant construit un nouveau gène recombinant codant pour L'urate oxydase, qui permet une expression dans les cellules animales, introduit celui-ci dans un vecteur d'expression pour les ceLLuLes animales contenant L'origine de réplication de L'ADN du virus SV40, transfecté des cellules COS à l'aide de ce vecteur, cultivé ces dernières et constaté qu'elles exprimaient ce gène.
La présente invention concerne donc un gène recombinant codant pour L'urate oxydase, caractérisé en ce qu'il permet une expression dans les cellules animales. Ce gène recombinant peut par exemple comporter la séquence ci-après
5'-ATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA
CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA
CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC
TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA
GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC
TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC
CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT
TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC
GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG
TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG
CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC
TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC
CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC
TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC
AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG
ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA
CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT
TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCGG
TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G précédée d'une séquence 5' non traduite favorable à L'expression dans Les cellules animales. Une telle séquence 5' non traduite préférée est celle qui comprend La séquence : AGCTTGCCGCCACT, située immédiatement en amont de la séquence explicitée ci-dessus.
5'-ATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA
CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA
CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC
TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA
GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC
TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC
CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT
TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC
GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG
TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG
CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC
TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC
CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC
TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC
AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG
ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA
CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT
TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCGG
TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G précédée d'une séquence 5' non traduite favorable à L'expression dans Les cellules animales. Une telle séquence 5' non traduite préférée est celle qui comprend La séquence : AGCTTGCCGCCACT, située immédiatement en amont de la séquence explicitée ci-dessus.
L'invention concerne également un vecteur d'expression pour les cellules animales, qui porte le gène recombinant défini ci-dessus, avec les moyens nécessaires à son expression.
L'invention a également trait aux cellules anima les contenant, avec les moyens nécessaires à son expression, ce gène recombinant. Ce dernier peut, par exemple, avoir été introduit dans les cellules par transfection par le vecteur d'expression ci-dessus, par infection au moyen d'un virus ou d'un rétro-virus le portant, ou par microinjection.
L'invention sera mieux comprise à L'aide des exemples ci-après
Exemple 1 : Construction d'un vecteur d'expression de l'ADNc de
L'urate oxydase dans Les cellules animales, le plasmide PSV860.
Exemple 1 : Construction d'un vecteur d'expression de l'ADNc de
L'urate oxydase dans Les cellules animales, le plasmide PSV860.
Ce vecteur a été obtenu par - ligation du petit fragment AccI-SnaBI contenant une séquence codant pour L'urate oxydase à l'exception des 16 premiers acides aminés, issu du plasmide p466 : vecteur d'expression de L'urate oxydase d'A. flavus dans E. coli disponible au laboratoire et décrit ci-après, à un fragment synthétique HindIII-AccI, ce qui a permis d'obtenir un fragment HindIII-SnaBI contenant une séquence complète codant pour L'urate oxydase d'A. flavus et une séquence 5' non traduite favorable à L'expression dans les cellules animales.
- Insertion du fragment HindIII-SnaBI entre les sites HindIII et
SnaBI du polysite de clonage (également appelé polylinker) du vecteur d'expression pour les cellules animales, le plasmide pSE1.
SnaBI du polysite de clonage (également appelé polylinker) du vecteur d'expression pour les cellules animales, le plasmide pSE1.
L'exposé ci-après présentera successivement la construction du plasmide p466, celle du plasmide pSE1 et l'assemblage du plasmide pSV860.
1) Construction du plasmide p466
On a préparé le plasmide p466, vecteur d'expression de l'ADNc de L'urate oxydase dans E. coli. Ce dernier comprend un fragment de pBR327 incluant l'origine de réplication et le gène de résistance à l'ampicilline, il comprend également un promoteur synthétique d'E. coli (R. RODRIGUEZ et M.CHAMBERLIN "Promoters
Structure and function (1982) Preager), une séquence de Shine
Dalgarno, suivie d'un polylinker présentant les sites uniques NdeI et KpnI, un terminateur de transcription (dérivé du phage fd) et le gène Lac i.
On a préparé le plasmide p466, vecteur d'expression de l'ADNc de L'urate oxydase dans E. coli. Ce dernier comprend un fragment de pBR327 incluant l'origine de réplication et le gène de résistance à l'ampicilline, il comprend également un promoteur synthétique d'E. coli (R. RODRIGUEZ et M.CHAMBERLIN "Promoters
Structure and function (1982) Preager), une séquence de Shine
Dalgarno, suivie d'un polylinker présentant les sites uniques NdeI et KpnI, un terminateur de transcription (dérivé du phage fd) et le gène Lac i.
Ce plasmide a été construit à partir d'un plasmide d'expression de l'hGH dans E. coli (p462) par substitution d'un fragment portant le gène de l'hGH par l'ADNc de L'urate oxydase.
La construction du plasmide p466 va maintenant être décrite plus en détail dans L'exposé ci-après dans lequel il sera fait référence aux figures 1, 2, 3, 4 et 5.
La figure 1 représente une carte de restriction du plasmide p163,1. Les différents segments de restriction sont marqués de manière arbitraire selon la Légende ci-dessous
= Segment d'ADN issu du plasmide pBR322 = Localisation de l'origine de réplication (ORI) = Segment d'ADN contenant la séquence codant pour un
précurseur naturel de l'hGH = Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur
de transcription = Segment d'ADN contenant un promoteur-opérateur
hydride tryptophane-lactose UV5 = Segment d'ADN codant pour la p-lactamase (AmpR ::
résistance à l'ampicilline)
La figure 2 réprésente la carte de restriction du plasmide p160 dont les fragments PvuI-XhoI-BamHI(1) et PvuI-ORI
BamHI(2) proviennent respectivement des plasmides p163,1 et pBR327 et dont le petit fragment BamHI(2)-BamHI(1) est le fragment 3 décrit ci-après.
= Segment d'ADN issu du plasmide pBR322 = Localisation de l'origine de réplication (ORI) = Segment d'ADN contenant la séquence codant pour un
précurseur naturel de l'hGH = Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur
de transcription = Segment d'ADN contenant un promoteur-opérateur
hydride tryptophane-lactose UV5 = Segment d'ADN codant pour la p-lactamase (AmpR ::
résistance à l'ampicilline)
La figure 2 réprésente la carte de restriction du plasmide p160 dont les fragments PvuI-XhoI-BamHI(1) et PvuI-ORI
BamHI(2) proviennent respectivement des plasmides p163,1 et pBR327 et dont le petit fragment BamHI(2)-BamHI(1) est le fragment 3 décrit ci-après.
La figure 3 représente la carte de restriction commune du plasmide p373,2. Les différents segments de restriction sont marqués de manière arbitraire selon la Légende ci-dessous
= Séquence PvuI-BamHI (2) issue du plasmide pBR327
= Sequence PvuI-XhoI issue du plasmide p163,1 = Séquence XhoI-HincII issue du plasmide p163,1
= Séquence PvuI-BamHI (2) issue du plasmide pBR327
= Sequence PvuI-XhoI issue du plasmide p163,1 = Séquence XhoI-HincII issue du plasmide p163,1
Fragment 4 décrit ci-après
= Fragment 3 décrit ci-après = Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur
de transcription
La figure 4 représente la carte de restriction du plasmide p462, le fragment synthetique BglII-HindIII défini ci-après étant représenté par
= Fragment 3 décrit ci-après = Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur
de transcription
La figure 4 représente la carte de restriction du plasmide p462, le fragment synthetique BglII-HindIII défini ci-après étant représenté par
La figure 5 représente la carte de restriction du plasmide p466, le fragment NdeI-KpnI comprenant le gène codant pour
L'urate oxydase étant représenté par
a) Construction du plasmide p373,2
La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T. MANIATIS EF. FRITSCH et J.
L'urate oxydase étant représenté par
a) Construction du plasmide p373,2
La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T. MANIATIS EF. FRITSCH et J.
SAMBROOK, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). La synthèse des oligonucléotides est réalisée à L'aide d'un synthétiseur d'ADN
Biosearch 4 600.
Biosearch 4 600.
On a soumis Le plasmide p163,1 (figure 1), décrit dans la demande de brevet EP-A-0245138 et déposée à la CNCM sous la référence I-530 le 17 février 1986, à une digestion par les enzymes PvuI et BamHI. Ce plasmide contient Le gène codant pour l'hGH. Le fragment PvuI-BamHI - ci-après fragment 1 - contenant le site d'action de l'enzyme de restriction XhoI, représenté sur la figure 5, a été purifié.
De même, on a soumis le plasmide pBR327, bien connu de
L'homme de l'art, (cf. SOBERON, X et al., Gene, 9 (1980) 287-305) à une digestion par les enzymes PvuI et BamHI. Le fragment PvuI-BamHI - ci-après fragment 2 -, contenant l'origine de réplication, a été purifié.
L'homme de l'art, (cf. SOBERON, X et al., Gene, 9 (1980) 287-305) à une digestion par les enzymes PvuI et BamHI. Le fragment PvuI-BamHI - ci-après fragment 2 -, contenant l'origine de réplication, a été purifié.
Puis on a préparé le fragment 3, qui est un fragment synthétique BamHI(1)-BamHI(2) contenant le gène lac i et son promoteur dont la séquence est la suivante sur laquelle les deux extrémités du brin sont repérées par les nombres 1 et 2 pour préciser l'orientation du fragment dans les plasmides décrits aux figures 2 et 3.
FRAGMENT 3 BamHI(1) 5'
GATCC GCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT
GAGCTAACTT ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG
GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA
GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CCAGGGTGGT TTTTCTTTTC ACCAGTGAGA
CGGGCAACAG CTGATTGCCC TTCACCGCCT GGCCCTGAGA GAGTTGCAGC
AAGCGGTCCA CGCTGGTTTG CCCCACCACC CGAAAATCCT GTTTGATGGT
GGTTAACGGC GGGATATAAC ATGAGCTGTC TTCGGTATCG TCGTATCCCA
CTACCGAGAT ATCCGCACCA ACGCGCAGCC CGGACTCGGT AATGGCGCGC
ATTGCGCCCA GCGCCATCTG ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CAGTGGGAAC
GATGCCCTCA TTCAGCATTT GCATGGTTTG TTGAAAACCG GACATGGCAC
TCCAGTCGCC TTCCCGTTCC GCTATCGGCT GAATTTGATT GCGAGTGAGA
TATTTATGCC AGCCAGCCAG ACGCAGACGC GCCGAGACAG AACTTAATGG
GCCCGCTAAC AGCGCGATTT GCTGGTGACC CAATGCGACC AGATGCTCCA
CGCCCAGTCG CGTACCGTCT TCATGGGAGA AAATAATACT GTTGATGGGT
GTCTGGTCAG AGACATCAAG AAATAACGCC GGAACATTAG TGCAGGCAGC
TTCCACAGCA ATGGCATCCT GGTCATCCAG CGGATAGTTA ATGATCAGCC
CACTGACGCG TTGCGCGAGA AGATTGTGCA CCGCCGCTTT ACAGGCTTCG
ACGCCGCTTC GTTCTACCAT CGACACCACC ACGCTGGCAC CCAGTTGATC
GGCGCGAGAT TTAATCGCCG CGACAATTTG CGACGGCGCG TGCAGGGCCA
GACTGGAGGT GGCAACGCCA ATCAGCAACG ACTGTTTGCC CGCCAGTTGT
TGTGCCACGC GGTTGGGAAT GTAATTCAGC TCCGCCATCG CCGCTTCCAC
TTTTTCCCGC GTTTTCGCAG AAACGTGGCT GGCCTGGTTC ACCACGCGGG
AAACGGTCTG ATAACAGACA CCGGCATACT CTGCGACATC GTATAACGTT
ACTGGTTTCA CATTCACCAC CCTGAATTGA CTCTCTTCCG GGCGCTATCA
TGCCATACCG CGAAAGGTTT TGCGCCATTC GATGGTGTCC G 3'
BamHI(2)
Les fragments 1, 2 et 3 ont été alors ligués de manière à obtenir le plasmide p160 représenté sur la figure 2.
GATCC GCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT
GAGCTAACTT ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG
GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA
GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CCAGGGTGGT TTTTCTTTTC ACCAGTGAGA
CGGGCAACAG CTGATTGCCC TTCACCGCCT GGCCCTGAGA GAGTTGCAGC
AAGCGGTCCA CGCTGGTTTG CCCCACCACC CGAAAATCCT GTTTGATGGT
GGTTAACGGC GGGATATAAC ATGAGCTGTC TTCGGTATCG TCGTATCCCA
CTACCGAGAT ATCCGCACCA ACGCGCAGCC CGGACTCGGT AATGGCGCGC
ATTGCGCCCA GCGCCATCTG ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CAGTGGGAAC
GATGCCCTCA TTCAGCATTT GCATGGTTTG TTGAAAACCG GACATGGCAC
TCCAGTCGCC TTCCCGTTCC GCTATCGGCT GAATTTGATT GCGAGTGAGA
TATTTATGCC AGCCAGCCAG ACGCAGACGC GCCGAGACAG AACTTAATGG
GCCCGCTAAC AGCGCGATTT GCTGGTGACC CAATGCGACC AGATGCTCCA
CGCCCAGTCG CGTACCGTCT TCATGGGAGA AAATAATACT GTTGATGGGT
GTCTGGTCAG AGACATCAAG AAATAACGCC GGAACATTAG TGCAGGCAGC
TTCCACAGCA ATGGCATCCT GGTCATCCAG CGGATAGTTA ATGATCAGCC
CACTGACGCG TTGCGCGAGA AGATTGTGCA CCGCCGCTTT ACAGGCTTCG
ACGCCGCTTC GTTCTACCAT CGACACCACC ACGCTGGCAC CCAGTTGATC
GGCGCGAGAT TTAATCGCCG CGACAATTTG CGACGGCGCG TGCAGGGCCA
GACTGGAGGT GGCAACGCCA ATCAGCAACG ACTGTTTGCC CGCCAGTTGT
TGTGCCACGC GGTTGGGAAT GTAATTCAGC TCCGCCATCG CCGCTTCCAC
TTTTTCCCGC GTTTTCGCAG AAACGTGGCT GGCCTGGTTC ACCACGCGGG
AAACGGTCTG ATAACAGACA CCGGCATACT CTGCGACATC GTATAACGTT
ACTGGTTTCA CATTCACCAC CCTGAATTGA CTCTCTTCCG GGCGCTATCA
TGCCATACCG CGAAAGGTTT TGCGCCATTC GATGGTGTCC G 3'
BamHI(2)
Les fragments 1, 2 et 3 ont été alors ligués de manière à obtenir le plasmide p160 représenté sur la figure 2.
Ce plasmide a été soumis à une digestion partielle par
Les enzymes de restriction HincII et PstI. Le grand fragment
HincII-PstI, contenant L'origine de réplication et représenté sur la figure 6, a été ensuite ligué au fragment 4, représenté ci-après, qui est un fragment synthétique d'ADN portant une séquence codant pour les 44 premiers acides aminés d'un précurseur naturel de lthGH et en amont de cette séquence des signaux de régulation.
Les enzymes de restriction HincII et PstI. Le grand fragment
HincII-PstI, contenant L'origine de réplication et représenté sur la figure 6, a été ensuite ligué au fragment 4, représenté ci-après, qui est un fragment synthétique d'ADN portant une séquence codant pour les 44 premiers acides aminés d'un précurseur naturel de lthGH et en amont de cette séquence des signaux de régulation.
FRAGMENT 4
ClaI v
5' TCGAGCTGACTGACCTGTTGCTTATATTACATCGA
AGCTCGACTGACTGGACAACGAATATAATGTAGCT
NdeI
TAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGATAACAATTTCACACAGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT
ATCGATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTA
ATG GCT ACC GGA TCC CGG ACT AGT CTG CTC CTG GCT m GGC CTG CTC TGC CTG
TAC CGA TGG CCT AGG GCC TGA TCA GAC GAG GAC CGA AM CCG GAC GAC ACG GAC
M A T G S R T S L L LA F G L L CL -26
XbaI
CCC TGG CTT CM GAG GGC AGT GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCT AGA CTT TTT
GGG ACC GM GTT CTC CCG TCA CGG MG GGT TGG TM GGG AAT AGA TCT GM MA
P WL Q E G SA F P T I P L S R L F
-1 1
GAC MC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC
CTG TTG CGA TAC GAG GCG CGG GTA GCA GAC GTG GTC GAC CGG AAA CTG TGG ATC
D N A ML R A H R L H Q LA F LT Y
PstI
CAG GAG m GM GAA GCC TAT ATC CCA AAG GM CAG MG TAT TCA TTC CTG CA
GTC CTC MA CTT CTT CGG ATA TAG GGT TTC CTT GTC TTC ATA AGT AAG G
Q E F E E A Y I P K E Q K Y SF
44
Dans ce fragment, les acides amines sont designes par des lettres selon le code suivant
A = Alanine M = Methionine
C = Cysteine N = Asparagine
D = Acide aspartique P = Proline
E = Acide glutamique Q = Glutamine
F = Phenylalanine R = Arginine
G = Glycine S = Serine
H = Histidine T = Threonine
I = Isoleucine V = Valine
K = Lysine W = Tryptophane
L = Leucine Y = Tyrosine
Sont successivement soulignees dans ce fragment les sequences -35 (TTGCTT) et -10 (TATAAT) de La sequence promotrice, et la sequence de Shine et Dalgarno bien connue de L'homme de L'art
Le plasmide p380,1 a ete ainsi obtenu.
ClaI v
5' TCGAGCTGACTGACCTGTTGCTTATATTACATCGA
AGCTCGACTGACTGGACAACGAATATAATGTAGCT
NdeI
TAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGATAACAATTTCACACAGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT
ATCGATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTA
ATG GCT ACC GGA TCC CGG ACT AGT CTG CTC CTG GCT m GGC CTG CTC TGC CTG
TAC CGA TGG CCT AGG GCC TGA TCA GAC GAG GAC CGA AM CCG GAC GAC ACG GAC
M A T G S R T S L L LA F G L L CL -26
XbaI
CCC TGG CTT CM GAG GGC AGT GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCT AGA CTT TTT
GGG ACC GM GTT CTC CCG TCA CGG MG GGT TGG TM GGG AAT AGA TCT GM MA
P WL Q E G SA F P T I P L S R L F
-1 1
GAC MC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC
CTG TTG CGA TAC GAG GCG CGG GTA GCA GAC GTG GTC GAC CGG AAA CTG TGG ATC
D N A ML R A H R L H Q LA F LT Y
PstI
CAG GAG m GM GAA GCC TAT ATC CCA AAG GM CAG MG TAT TCA TTC CTG CA
GTC CTC MA CTT CTT CGG ATA TAG GGT TTC CTT GTC TTC ATA AGT AAG G
Q E F E E A Y I P K E Q K Y SF
44
Dans ce fragment, les acides amines sont designes par des lettres selon le code suivant
A = Alanine M = Methionine
C = Cysteine N = Asparagine
D = Acide aspartique P = Proline
E = Acide glutamique Q = Glutamine
F = Phenylalanine R = Arginine
G = Glycine S = Serine
H = Histidine T = Threonine
I = Isoleucine V = Valine
K = Lysine W = Tryptophane
L = Leucine Y = Tyrosine
Sont successivement soulignees dans ce fragment les sequences -35 (TTGCTT) et -10 (TATAAT) de La sequence promotrice, et la sequence de Shine et Dalgarno bien connue de L'homme de L'art
Le plasmide p380,1 a ete ainsi obtenu.
Le plasmide p380,1 a ete ensuite soumis à une digestion par les enzymes de restriction CLaI et NdeI de maniere à en eliminer le petit fragment ClaI-NdeI du fragment 4 ci-dessus et à lui substituer le fragment CLaI-NdeI ci-après
ClaI
5' CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA
TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT
NdeI
ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGGAGATATACA
TAAAGTGTGTCAAAAAGCGCTTCTTCCTCTATATGTAT 5'
Le plasmide resultant est le plasmide p373,2 (figure 3) b) Construction du plasmide p466
Le plasmide p373,2 a été soumis à une double digestion par les enzymes BglII et HindIII. Le grand fragment issu de cette digestion a été purifie et ligué avec un fragment d'ADN synthétique, dont La sequence donnee ci-apres est destinee à reconstituer la fin du gene de l'hGH suivie en 3' des sites de clonage KpnI et SnaBI.
ClaI
5' CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA
TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT
NdeI
ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGGAGATATACA
TAAAGTGTGTCAAAAAGCGCTTCTTCCTCTATATGTAT 5'
Le plasmide resultant est le plasmide p373,2 (figure 3) b) Construction du plasmide p466
Le plasmide p373,2 a été soumis à une double digestion par les enzymes BglII et HindIII. Le grand fragment issu de cette digestion a été purifie et ligué avec un fragment d'ADN synthétique, dont La sequence donnee ci-apres est destinee à reconstituer la fin du gene de l'hGH suivie en 3' des sites de clonage KpnI et SnaBI.
B
9
I
GATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT
----f---------±--------±--------±----
AAGTTCGTCTGGATGTCGTTCAAGCTGTGTTTGAGTGTGTTGCTA
GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTC ---------±--------±--------f---------+ + + + + + +
CTGCGTGATGAGTTCTTGATGCCCGACGAGATGACGAAGTCCTTCCTGTACCTGTTCCAG
F
s
p
I
GAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGTAA ---------f---------±--------±--------+ + + + + + +
CTCTGTAAGGACGCGTAGCACGTCACGGCGAGACACCTCCCGTCGACACCGAAGATCATT
H
S n
K n d
p a I
n B I
I I I
GGTACCCTGCCCTACGTACCA
+ +
CCATGGGACGGGATGCATGGTTCGA
Ce fragment comprend les extrémites cohésives BglII et HindIII. Le nouveau plasmide ainsi forme p462 (cf. fig. 4) comprend ainsi un site KpnI et un site NdeI qui vont servir au clonage du fragment portant l'ADNc de L'urate oxydase dans le vecteur d'expression.
9
I
GATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT
----f---------±--------±--------±----
AAGTTCGTCTGGATGTCGTTCAAGCTGTGTTTGAGTGTGTTGCTA
GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTC ---------±--------±--------f---------+ + + + + + +
CTGCGTGATGAGTTCTTGATGCCCGACGAGATGACGAAGTCCTTCCTGTACCTGTTCCAG
F
s
p
I
GAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGTAA ---------f---------±--------±--------+ + + + + + +
CTCTGTAAGGACGCGTAGCACGTCACGGCGAGACACCTCCCGTCGACACCGAAGATCATT
H
S n
K n d
p a I
n B I
I I I
GGTACCCTGCCCTACGTACCA
+ +
CCATGGGACGGGATGCATGGTTCGA
Ce fragment comprend les extrémites cohésives BglII et HindIII. Le nouveau plasmide ainsi forme p462 (cf. fig. 4) comprend ainsi un site KpnI et un site NdeI qui vont servir au clonage du fragment portant l'ADNc de L'urate oxydase dans le vecteur d'expression.
Le plasmide hybride dérivé de pTZ19R portant l'ADNc d'environ 1,2 Kb (clone 9C), de L'urate oxydase d'A. flavus (cf.
exemple 6 de la demande de brevet principale) comprend un site KpnI unique. Ce site est localisé quelques paires de bases en aval du site de clonage de L'ADNc. D'autre part, l'ADNc de L'urate oxydase contient un site AccI situé à proximité de L'extrémité 5'.
On a donc isole et purifié le fragment AccI-KpnI comprenant la plus grande partie de cet ADNc. D'autre part on a synthétise deux olîgonucléotides complémentaires dont la séquence donnee ci-après 5' -TATGTCTGCGGTAAAAGCAGCGCGCTACGGCAAGGACAATGTTCGCGT
ACAGACGCCATTTTCGTCGCGCGATGCCGTTCCTGTTACAAGCGCAGA-5' est destinée à reconstituer l'extrémité 5' de l'ADNc. Ce fragment synthétique ainsi obtenu possède une extremité NdeI et une autre AccII. Le fragment et la séquence synthétique ont éte ligués avec le vecteur d'expression coupe par KpnI et par NdeI. Cette ligation à trois fragments permet d'obtenir le vecteur d'expression nomme p466, de L'urate oxydase pour E. coli (cf. figure 5).Ce plasmide a ete soumis à une serie d'hydrolyses enzymatiques par des enzymes de restriction, qui a permis de verifier la presence des sites de restriction attendus, en particulier ceux portes par le gène codant pour L'urate oxydase.
ACAGACGCCATTTTCGTCGCGCGATGCCGTTCCTGTTACAAGCGCAGA-5' est destinée à reconstituer l'extrémité 5' de l'ADNc. Ce fragment synthétique ainsi obtenu possède une extremité NdeI et une autre AccII. Le fragment et la séquence synthétique ont éte ligués avec le vecteur d'expression coupe par KpnI et par NdeI. Cette ligation à trois fragments permet d'obtenir le vecteur d'expression nomme p466, de L'urate oxydase pour E. coli (cf. figure 5).Ce plasmide a ete soumis à une serie d'hydrolyses enzymatiques par des enzymes de restriction, qui a permis de verifier la presence des sites de restriction attendus, en particulier ceux portes par le gène codant pour L'urate oxydase.
Le plasmide p466 contient donc par construction un gène codant pour L'urate oxydase de sequence ci-apres
ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA
CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA
CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC
GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT
CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC
TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC
AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA
CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG
ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG
ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA
GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG
ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG
CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT
GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA
AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG
TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA
GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG
ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT
AAATTG (Les nucléotides différents des nucléotides de l'ADNc isolé d'A.
ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA
CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA
CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC
GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT
CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC
TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC
AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA
CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG
ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG
ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA
GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG
ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG
CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT
GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA
AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG
TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA
GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG
ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT
AAATTG (Les nucléotides différents des nucléotides de l'ADNc isolé d'A.
flavus sont sou lignés dans la séquence ci-dessus. Ces differences ont été introduites sur le fragment synthétique AccI-KpnI de façon à avoir en aval de L'ATG une séquence nucléotidique plus conforme à celles habituellement rencontrées dans un gène procaryote).
2) Construction d'un vecteur d'expression pour les cellules animales, le plasmide pSE1
La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées. Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T. MANIATIS, EF. FRITSCH et J. SAMBROOK dans "Molecular Cloning, a laboratory manual" (Cold
Spring Harbor Laboratory, 1984). La synthèse des oligonucléotides est réalisee à L'aide d'un synthetiseur d'ADN Biosearch 4 600.
La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées. Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T. MANIATIS, EF. FRITSCH et J. SAMBROOK dans "Molecular Cloning, a laboratory manual" (Cold
Spring Harbor Laboratory, 1984). La synthèse des oligonucléotides est réalisee à L'aide d'un synthetiseur d'ADN Biosearch 4 600.
La description ci-après sera mieux comprise en réference à la figure 6, qui represente une carte d'assemblage du plasmide pSE1, les sites ayant disparu par ligation étant notes entre parenthèses. Les symboles utilisés dans cette figure seront précisés dans L'exposé ci-après.
Ce plasmide a été construit par Ligotions successives des éléments ci-après 1) - un fragment PvuII-PvuII - symbolisé par ++++++ sur la figure 6 - de 2525 pb, obtenu par digestion complète du plasmide pTZ18R (Pharmacia) à L'aide de l'enzyme de restriction PvuII. Ce fragment contient L'origine de réplication du phage F1 (notee ORI F1 sur la figure 6), un gène (note Amp sur La figure 6) portant la résistance à l'ampicilline et l'origine de replication (notee
ORI pBR322 sur la figure 6) permettant la réplication de ce plasmide dans E. coli. Le premier site franc PvuII disparaît par ligation avec le site franc EcoRV (qui disparait également) du fragment decrit en 7).
ORI pBR322 sur la figure 6) permettant la réplication de ce plasmide dans E. coli. Le premier site franc PvuII disparaît par ligation avec le site franc EcoRV (qui disparait également) du fragment decrit en 7).
2) - Un fragment PvuII-HpaI - symbolisé par
sur La figure 6 - de 1060 pb de L'ADN d'adenovirus type 5 entre les positions 11299 (site de restriction PvuII) et 10239 (site de restriction
HpaI) (DEKKER & VAN ORMONDT, Gene 27, 1984, 115-120) contenant l'information pour les ARN VA-I et VA-II. Le site franc HpaI disparaît par ligation avec le site franc PvuII (qui disparait également) du fragment décrit en 3).
sur La figure 6 - de 1060 pb de L'ADN d'adenovirus type 5 entre les positions 11299 (site de restriction PvuII) et 10239 (site de restriction
HpaI) (DEKKER & VAN ORMONDT, Gene 27, 1984, 115-120) contenant l'information pour les ARN VA-I et VA-II. Le site franc HpaI disparaît par ligation avec le site franc PvuII (qui disparait également) du fragment décrit en 3).
3) - Un fragment PvuII-HindIII - symbolisé par
sur la figure 6 - de 344 pb, issu de L'ADN du virus SV40 obtenu par digestion complète à L'aide des enzymes de restriction PvuII et Hindis. Ce fragment comporte l'origine de réplication et Le promoteur précoce de L'ADN du virus SV40 (réf. B.J. BYRNE et al.
sur la figure 6 - de 344 pb, issu de L'ADN du virus SV40 obtenu par digestion complète à L'aide des enzymes de restriction PvuII et Hindis. Ce fragment comporte l'origine de réplication et Le promoteur précoce de L'ADN du virus SV40 (réf. B.J. BYRNE et al.
PNAS-USA (1983), 80, 721-725).
Le site HindIII di spa rait par ligation avec le site liant à HindIII du fragment decrit en 4).
4) - Un fragment synthétique "site liant à HindIII"-HindIII - symbolisé par ~~~~~~~~ sur la figure 6 - de 419 pb dont la séquence donnée ci-après est proche de la séquence 5' non traduite du virus HTLV1 (ref. WEISS et al, "Molecular Biology of Tumor
Viruses - part 2-2 ed - 1985 - Cold Spring Harbor Laboratory p. 1057).
Viruses - part 2-2 ed - 1985 - Cold Spring Harbor Laboratory p. 1057).
site liant à HindIII
1 60
CCGAGCGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCGGCGGGATGGACTCCGGCGGTAGGTGCGG
GGTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTA
61
CCACTCAGCGCAAGACGGCGGAGGGCGGACACCACGGAGGACTTGACGCAGGCGGCAGAT
GGTAGGCTCCAAGGGAGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTCTAAACTTACCTA 121 + + + + + +180
CCATCCGAGGTTCCCTCGGCCTGTTTCCGGGCCAGAGCTGGACTCGAGATTTGAATGGAT
GACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTT 181
CTGAGTCGGCCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGACGAACGAGTTGAGATGCAGAAACAAA
CGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAACTTCAAGGTATGCGCTGGGACCTGGCAGGCGGCAT 241
CTGGGACCCCTAGGAAGGGCTTGGGGGTCCTCGTGCCCAAGGCAGGGAACATAGTGGTCC 301 + + + + + +360
GACCCTGGGGATCCTTCCCGAACCCCCAGGAGCACGGGTTCCGTCCCTTGTATCACCAGG
CAGGAAGGGGAGCAGAGGCATCAGGGTGTCCACTTTGTCTCCGCAGCTCCTGAGCCTGCA 361
GTCCTTCCCCTCGTCTCCGTAGTCCCACAGGTGAAACAGAGGCGTCGAGGACTCGGACGT
GA
CTTCGA HindIII 5) - Un fragment synthétique HindIII "site liant à BamHI" - symbolisé par
sur la figure 6 - contenant le promoteur de l'ARN-polymerase du phage T7 ainsi qu'un polylinker contenant le site de clonage SmaI.
1 60
CCGAGCGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCGGCGGGATGGACTCCGGCGGTAGGTGCGG
GGTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTA
61
CCACTCAGCGCAAGACGGCGGAGGGCGGACACCACGGAGGACTTGACGCAGGCGGCAGAT
GGTAGGCTCCAAGGGAGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTCTAAACTTACCTA 121 + + + + + +180
CCATCCGAGGTTCCCTCGGCCTGTTTCCGGGCCAGAGCTGGACTCGAGATTTGAATGGAT
GACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTT 181
CTGAGTCGGCCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGACGAACGAGTTGAGATGCAGAAACAAA
CGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAACTTCAAGGTATGCGCTGGGACCTGGCAGGCGGCAT 241
CTGGGACCCCTAGGAAGGGCTTGGGGGTCCTCGTGCCCAAGGCAGGGAACATAGTGGTCC 301 + + + + + +360
GACCCTGGGGATCCTTCCCGAACCCCCAGGAGCACGGGTTCCGTCCCTTGTATCACCAGG
CAGGAAGGGGAGCAGAGGCATCAGGGTGTCCACTTTGTCTCCGCAGCTCCTGAGCCTGCA 361
GTCCTTCCCCTCGTCTCCGTAGTCCCACAGGTGAAACAGAGGCGTCGAGGACTCGGACGT
GA
CTTCGA HindIII 5) - Un fragment synthétique HindIII "site liant à BamHI" - symbolisé par
sur la figure 6 - contenant le promoteur de l'ARN-polymerase du phage T7 ainsi qu'un polylinker contenant le site de clonage SmaI.
AGCTTGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGCGGCCGCGGGCCCCTGCAGGAATTC
ACAGCTGATTATGCTGAGTGATATCCCGCCGGCGCCCGGGGACGTCCTTAAG #
HindIII
SmaI site liant à BamHI
v v
GGATCCCCCGGGTGACTGACT
CCTAGGGGGCCCACTGACTGACTAG 6) - Un fragment BamHI-BcII de 240 pb - représenté par
sur la figure 6 -, petit fragment obtenu par digestion complète à L'aide des enzymes BcII et BamHI du virus SV40 qui contient le site de polyadénylation tardif de ce dernier. (M. FITZGERALD et al. Cell, 24, 1981, 251-260). Les sites BamHI et BcII disparaissent par ligations avec respectivement le site liant à BamHI du fragment décrit en 5) et le site BamHI (qui disparaît egalement du fragment décrit en 7).
ACAGCTGATTATGCTGAGTGATATCCCGCCGGCGCCCGGGGACGTCCTTAAG #
HindIII
SmaI site liant à BamHI
v v
GGATCCCCCGGGTGACTGACT
CCTAGGGGGCCCACTGACTGACTAG 6) - Un fragment BamHI-BcII de 240 pb - représenté par
sur la figure 6 -, petit fragment obtenu par digestion complète à L'aide des enzymes BcII et BamHI du virus SV40 qui contient le site de polyadénylation tardif de ce dernier. (M. FITZGERALD et al. Cell, 24, 1981, 251-260). Les sites BamHI et BcII disparaissent par ligations avec respectivement le site liant à BamHI du fragment décrit en 5) et le site BamHI (qui disparaît egalement du fragment décrit en 7).
7) - Un fragment BamHI-EcoRV - symbolisé par
sur la figure 6 - de 190 pb, petit fragment issu du plasmide pBR322 après digestion complète à L'aide des enzymes EcoRV et BamHI.
sur la figure 6 - de 190 pb, petit fragment issu du plasmide pBR322 après digestion complète à L'aide des enzymes EcoRV et BamHI.
3) Construction du plasmide pSV860
Le plasmide p466 (cf. figure 5) a été soumis à une digestion complète à L'aide des enzymes AccI et SnaBI. Le petit fragment AccI-SnaBI, qui contient une séquence d'ADN codant pour
L'urate oxydase à l'exception des 16 premiers acides aminoterminaux, a été purifié et ligué au fragment synthétique HindIII-
AccI de séquence suivante :: HindIII AccI v v
AGCTTGCCGCCACTATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACGGCAAGGACAATGTCCGCGT + + + + + +
ACGGCGGTGATACAGGCGTCATTTTCGTCGGGCGATGCCGTTCCTGTTACAGGCGCAGA
Cette ligation permet d'obtenir le fragment
HindIII-SnaBI, qui contient une séquence codant pour L'urate oxydase identique à celle du clone 9C et une séquence 5' non traduite favorable à L'expression dans les cellules anima les (KOZAK, M., Nucl. Acids Res., 12, 2, 1984, 857-872).
Le plasmide p466 (cf. figure 5) a été soumis à une digestion complète à L'aide des enzymes AccI et SnaBI. Le petit fragment AccI-SnaBI, qui contient une séquence d'ADN codant pour
L'urate oxydase à l'exception des 16 premiers acides aminoterminaux, a été purifié et ligué au fragment synthétique HindIII-
AccI de séquence suivante :: HindIII AccI v v
AGCTTGCCGCCACTATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACGGCAAGGACAATGTCCGCGT + + + + + +
ACGGCGGTGATACAGGCGTCATTTTCGTCGGGCGATGCCGTTCCTGTTACAGGCGCAGA
Cette ligation permet d'obtenir le fragment
HindIII-SnaBI, qui contient une séquence codant pour L'urate oxydase identique à celle du clone 9C et une séquence 5' non traduite favorable à L'expression dans les cellules anima les (KOZAK, M., Nucl. Acids Res., 12, 2, 1984, 857-872).
Le fragment HindIII-SnaBI contient la séquence 5' -AGCTTGCCG CCACTATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA
CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA
CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC
TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA
GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC
TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC
CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT
TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC
GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG
TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG
CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC
TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC
CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC
TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC
AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG
ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA
CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT
TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCGG
TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G
Le fragment HindIII-SnaBI a ensuite été inséré dans le vecteur pSE1 préalablement incubé avec les enzymes HindIII et SmaI.
CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA
CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC
TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA
GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC
TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC
CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT
TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC
GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG
TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG
CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC
TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC
CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC
TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC
AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG
ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA
CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT
TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCGG
TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G
Le fragment HindIII-SnaBI a ensuite été inséré dans le vecteur pSE1 préalablement incubé avec les enzymes HindIII et SmaI.
On a ainsi obtenu le plasmide pSV860, représenté sur la figure 7, dans laquelle Les symboles ont la même signification que dans la figure 6, le nouveau fragment HindIII-SnaBI étant symbolise par
(Les sites SnaBI et SmaI ont disparu par ligation).
(Les sites SnaBI et SmaI ont disparu par ligation).
Exemple 2 : Expression transitoire de l'ADNc de L'urate oxydase dans les cellules COS. Dosage de L'activité urate oxydase dans le lysat cellulaire.
Les cellules COS sont des cellules de reins de singe exprimant l'antigène T du virus SV40 (GLuzman, Y. Cell 23, 1981, 175-182). Ces cellules, qui permettent La réplication des vecteurs contenant l'origine de réplication de L'ADN du virus SV40, constituent des hôtes de choix pour L'étude de L'expression de gènes dans les cellules animales.
1) Transfection des cellules COS et expression transitoire de l'ADNc de L'urate oxydase.
5 cellules COS sont étalées dans une boîte de Pétri de 6 cm de diamètre (Corning) dans 5 ml de mi lieu modifié d'Eagle selon Dulbecco ci-après appelé DMEM (le Dulbecco's modified Eagles medium de Gibco), lequel contient 0,6 g/l glutamine, 3,7 g/l NaHC03 et est complementé avec du sérum de veau foetal (GIBCO) à raison de 5%. Après environ 16 h de culture à 370C dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone, le mi lieu de culture est enlevé par aspiration et les cellules sont lavées avec 3 ml de tampon PBS (le Phosphate Buffer Saline de GIBCO).On y ajoute alors le mélange suivant : 1 000 pl de (DMEM + 10% sérum de veau foetal (GIBCO)), 110 ,ul de diéthylaminoéthyl-dextrane de poids moléculaire moyen 500 000, à une concentration de 2 mg/ml (Pharmacia), 1,1 ,ul de chloroquine 100mM (Sigma) et 3 jjg d'ADN soit du plasmide pSV860, soit du plasmide pSE1 (pour le témoin). Après 5 h d'incubation à 37 C dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone, le mélange est retiré des cellules. On y ajoute alors 2 ml de tampon
PBS contenant 10% de diméthyl sulfoxyde (qualité Spectroscopie,
Merck). Après 1 min d'incubation à la température ambiante, le mélange est retiré et les cellules sont lavées deux fois avec du tampon PBS.On y ajoute 5 ml de DMEM complémenté avec du sérum de veau foetal à raison de 2%. L'incubation est poursuivie pendant 4 jours à 370C sous atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone.
PBS contenant 10% de diméthyl sulfoxyde (qualité Spectroscopie,
Merck). Après 1 min d'incubation à la température ambiante, le mélange est retiré et les cellules sont lavées deux fois avec du tampon PBS.On y ajoute 5 ml de DMEM complémenté avec du sérum de veau foetal à raison de 2%. L'incubation est poursuivie pendant 4 jours à 370C sous atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone.
2) Préparation des échantillons.
Le milieu de culture est aspiré et les cellules COS sont rincées deux fois avec 3 ml de tampon PBS. Les cellules sont alors recueillies par grattage avec une spatule en caoutchouc (un "Policeman") dans 1 ml de tampon PBS. Après grattage, la boite est rincée avec 1 ml de tampon PBS. Les deux suspensions cellulaires sont combinées et centrifugées pendant 10 min à 1 000 tr/min. Le surnageant est enlevé et le culot cellulaire est remis en suspension dans 1 ml de tampon de triéthylammonium (TEA) 0,05 M de pH 8,9/EDTA.
Les cellules sont lysées par sonication (sur de la glace) par des pulsations de 10 s avec un sonicateur (le Vibra Cell de
Sonics and Materials Inc. USA) réglé à une puissance de 12 W. Le lysat cellulaire est centrifugé pendant 10 min à 10 000 tr/min et le surnageant est récupéré pour Le dosage de L'urate oxydase.
Sonics and Materials Inc. USA) réglé à une puissance de 12 W. Le lysat cellulaire est centrifugé pendant 10 min à 10 000 tr/min et le surnageant est récupéré pour Le dosage de L'urate oxydase.
3) Dosage de L'activité urate oxydase.
Le dosage de L'activiste urate oxydase a été effectué comme décrit dans la demande principale, exemple 9.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau ci-après :
<tb> <SEP> Cellules <SEP> COS <SEP> Activité <SEP> urate <SEP> oxydase
<tb> transfectées <SEP> par <SEP> U/ml
<tb> <SEP> pSV860 <SEP> 0,105
<tb> <SEP> pSE1 <SEP> < 0,01
<tb>
On constate que les cellules COS transfectées par le plasmide pSV860, porteur de L'ADNc de L'urate oxydase, expriment un niveau appréciable d'activité urate oxydase, alors qu'aucune activité urate oxydase n'est détectable sur le témoin. Il y a donc expression de l'ADNc de L'urate oxydase.
<tb> transfectées <SEP> par <SEP> U/ml
<tb> <SEP> pSV860 <SEP> 0,105
<tb> <SEP> pSE1 <SEP> < 0,01
<tb>
On constate que les cellules COS transfectées par le plasmide pSV860, porteur de L'ADNc de L'urate oxydase, expriment un niveau appréciable d'activité urate oxydase, alors qu'aucune activité urate oxydase n'est détectable sur le témoin. Il y a donc expression de l'ADNc de L'urate oxydase.
Claims (6)
1. Gène recombinant selon L'une des revendications 3 et 4 de la demande de brevet principal, caractérisé en ce qu'il permet une expression dans les cellules animales.
2. Gène recombinant selon la revendication 4 de la demande de brevet principal, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence ci-après
5'-ATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA
CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA
CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC
TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA
GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC
TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC
CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT
TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC
GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG
TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG
CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC
TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC
CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC
TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC
AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG
ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA
CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT
TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCGG
TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G précédée d'une séquence 5' non traduite favorable à L'expression dans les cellules animales.
3. Gène recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence 5' non traduite favorable à L'expression dans les cellules anima les comprend la séquence : AGCTTGCCGCCACT située immédiatement en amont de la séquence explicitée dans la revendication 2.
4. Vecteur d'expression pour Les cellules animales, caractérisé en ce qu'il porte, avec les moyens nécessaires à son expression, un gène recombinant selon L'une des revendications 1 à 3.
5. Cellules anima Les, caractérisées en ce qu'elles contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, un gène recombinant selon L'une des revendications 1 à 3.
6. Cellules animales, caractérisées en ce qu'elles contiennent un vecteur d'expression selon la revendication 4.
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| IL95057A IL95057A (en) | 1989-07-13 | 1990-07-12 | Recombinant gene coding for a protein possessing urate oxidase activity |
| PT94680A PT94680B (pt) | 1989-07-13 | 1990-07-12 | Processo para a obtencao de uma proteina tendo actividade de urato oxidase gene recombinante que a codifica vector de expressao portador deste gene microorganismos procariotas e celulas eucariotas transformados por este vector de expressao |
| ES90402023T ES2095243T3 (es) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | Proteina de actividad urato oxidasa; gen recombinante codante para esta, vector de expresion, micro-organismos y celulas transformadas. |
| BR909006855A BR9006855A (pt) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | Proteina de atividade urato oxidase,gene recombinante que a codifica,vetor de expressao,microorganismos e celulas transformadas |
| EP90402023A EP0408461B1 (fr) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | Protéine à activité urate oxydase, gène recombinant codant pour celle-ci, vecteur d'expression, micro-organismes et cellules transformées |
| HU906046A HU215948B (hu) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | Eljárás urát-oxidáz aktivitással rendelkező protein, azt kódoló gén, expressziós vektor és mikroorganizmusok előállítására |
| KR1019910700276A KR0159107B1 (ko) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포 |
| JP2510514A JP2664804B2 (ja) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | 尿酸オキシダーゼ活性蛋白質、それをコードした組換え遺伝子、発現ベクター、微生物および形質転換細胞 |
| US07/920,519 US5382518A (en) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | Urate oxidase activity protein, recombinant gene coding therefor, expression vector, micro-organisms and transformed cells |
| DE69028884T DE69028884T2 (de) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | Protein mit Urate-Oxidase-Aktivität, dafür kodierendes rekombinantes Gen, Expressionsvektor, Mikroorganismen und Transformanten |
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| CA002035900A CA2035900C (fr) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | Proteine a activite urate oxydase, gene recombinant codant pour celle-ci, vecteur d'expression, micro-organismes et cellules transformees |
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| DK90402023.7T DK0408461T3 (da) | 1989-07-13 | 1990-07-13 | Protein med uratoxidase-aktivitet, rekombinant gen, der koder for proteinet, samt ekspressionsvektor, mikroorganismer og transformerede celler |
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| NO910982A NO308139B1 (no) | 1989-07-13 | 1991-03-12 | FremgangsmÕte for fremstilling av rekombinant protein som har spesifikk uratoksydaseaktivitet, rekombinant gen som koder for proteinet, ekspresjonsvektor samt vertsceller som inneholder de rekombinante gen |
| FI911212A FI105047B (fi) | 1989-07-13 | 1991-03-12 | Menetelmä uraattioksidaasiaktiivisuutta, omaavan yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi, tätä proteiinia koodittava yhdistelmägeeni, ja tämän sisältävät ekspressiovektorit, mikro-organismit ja transformoidut solut |
| US08/314,586 US5541098A (en) | 1989-07-13 | 1994-09-28 | Urate oxidase activity protein, recombinant gene coding therefor, expression vector, micro-organisms and transformed cells |
| GR960403531T GR3022085T3 (en) | 1989-07-13 | 1996-12-18 | Protein with urate oxidase activity, recombinant gene coding therefor, expression vector, micro-organisms and transformed cells |
| HK97101519A HK1000099A1 (en) | 1989-07-13 | 1997-07-08 | Protein with urate oxidase activity recombinant gene coding therefor expression vector micro-organisms and transformed cells |
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| LU90781C LU90781I2 (fr) | 1989-07-13 | 2001-05-23 | Fasturtec -rasburicase |
| NL300046C NL300046I2 (nl) | 1989-07-13 | 2001-06-12 | Eiwit met uraat oxidase activiteit, recombinant gen dat hiervoor codeert, expressievector, micro-organismen en getransformeerde cellen. |
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| WO1988008450A1 (fr) * | 1987-05-01 | 1988-11-03 | Birdwell Finlayson | Therapie genetique pour troubles du metabolisme |
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1997
- 1997-05-02 BR BR1100404-5A patent/BR1100404A/pt active IP Right Grant
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