KR0159107B1 - 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기의 서열을 포함하며 임의로 메티오닌이 선행되거나 이 서열과 상당한 정도의 동종성을 갖는 신규 우레이트 산화효소 활성 단백질에 관련된 것이다.

Description

우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 백터, 미생물 및 형질전환 세포

본 발명은 우레이트 산화효소 활성을 갖는 새로운 단백질에 관한 것이다; 본 발명은 또한 상기 단백질, 특히 상기 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 이 발현 벡터에 의해 형질전환된 진핵세포 혹은 원핵미생물을 제조하기 위한 유전공합 도구 뿐만 아니라 상기 단백질을 포함하는 의약품들에 관한 것이기도 하다.

우레이트 산화효소(EC 1. 7. 3. 3) [우리카아제라고도 함]는 푸린 분해대사 경로의 한 효소이다. 이 효소는 영장류(예, 사람), 조류, 몇 몇 파충류 또는 대부분의 곤충류에는 존재하지 않는다. 이것은 또한, 몇 몇 개들(예, 달마티아 개)에 있어서도 존재하지 않는다.

사람의 경우, 푸린 염기(아데닌과 구아닌)들은 크산틴(xanthine)으로 전환된다. 이 크산틴은 크산틴 산화효소에 의해 산화되어 다음 반응에 따라 요산을 형성한다.

O₂ ^-라디칼 (과산화물 디스뮤타아제의 기질임)은 과산화물 디스뮤타아제에 의해 과산화수소로 전환된다.

혈중에 존재하는 대사산물인 요산은 보통 용해성의 모노소듐염 형태이어야 한다. 그러나, 어떤 사람의 경우에 있어서는, 요산이 침전되어 결석이 형성되는 일이 있다. 과잉요산혈증(Hyperuricemia, 혈증을 순환하는 요산의 양의 증가 현상)은 요산을 연골조직에 침적시켜 통풍을 일으킨다. 과잉요산혈증은 신장에서도 나타날 수 있다 : 뇨 및 신장에서 광잉량의 요산은 요산 신장결석증(nephrolithiasis) 즉, 신장결석의 축적을 일으킬 수 있다(매우 고통스럽고, 신장손상을 야기할 수 있음). 이들 결석은 요산이 아마도 인산염 및 옥살산염과 결합된 상태로 구성되어 있다. 요산의 과잉생성 원인은 다음과 같이 다양하다 : 선천선 대상장애, 레쉬-니한 증후군, 푸린 또는 단백질의 과잉 섭취, 요산뇨증 약물에 의한 치료, 혈액병 특히 세포분해제(화학용법) 또는 방사선요법에 의한 암관련 혈액병의 치료(Gutman, A.B. and YU, T.F. (1968) Am. J. Med. 45-756-779).

요산을 알란토인(요산보다 매우 높은 용해성으로 생물학적 체액에 가까운 농도에서 결정화가 안됨)으로 분해하는 반응을 촉매하는 효소인 우레이트 산화효소는 따라서 치료적 가치가 있다. 이것을 주사제로 사용하면, 과잉요산혈증 및 신장결석증의 치료에서 다음과 같은 여러 장점을 가질 수 있다 : 신속한 저요산혈증 효과(24시간 미만에 50% 정도의 과잉요산혈증의 감소), 기타 약품 [예, 알로푸리놀(크산틴 산화효소 저해제)]에 비해 결석증에 대한 신장의 우수한 보호 등. 현재, 이 효소는 화학요법에 있어 세포분해제의 보조약(adjuvant)으로 주로 사용되고 있다.

현재 약으로 사용되고 있는 우레이트 산화효소는 이 단백질의 몇 가지 정제단계와 함께, 아스페리글루스 플라부스(Aspergillus flavus)의 균산의 배양 및 그 배양액으로부터 추출에 의한 우레이트 산화효소의 분리를 포함하는 방법을 통해 수득된 것이다. 이 방법은 우레이트 산화효소를 고순도로 수득할 수 있지만, 불리한 점을 내포하고 있다. 실제로, 아스페르길루스 플라부스의 생리 및 특히 유전학을 해명하기는 쉽지 않다(WOLOSHUK et al. (1989) Applied, environ. microbiol., Vol. 55. p.86-90). 따라서, 이 효소를 충분한 양으로 생성하는 균주를 얻는다는 것은 불가능하다. 더욱이, 아스페르길루스 플라부스는 때때로 분리제거가 곤란한 아플라톡신(aflatoxin)을 생성하기 쉽다. 결국, 정제산물을 점검하여 이들 톡신이 없음을 확인하여야 한다.

따라서, 이러한 문제점을 극복할 수 있는 유전공학 도구 및 기술은 물론, 보다 정제된 아스페르길루스 플라부스의 우레이트 산화효소에 대한 필요성이 요구되었다.

본 출원인은 아스페르길루스 플라부스(이후, 우레이트 산화효소 추출물이라 함)로부터 우레이트 산화효소를 이 단백질에 대해 지금까지 알려져 있는 것 보다 높은 순도로 정제하였다 : 또한, 본 출원인은 이 단백질에 대한 서열을 일부 결정하였으며, 이 단백질의 두 부분을 암호화하는 누클레오티드들과 하이브리드화할 수 있는(hybridize) 두 개의 표지 탐식자의 풀(pool)을 만들었다. 그 후, 이에 대한 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 제조하였고, 이것으로 대장균 K12(E. coli K12)규주를 형질전환시켰으며, 상기 균주를 배양한 결과,이 세포의 분해물은 예산 분자량의 재조합 단백질을 포함하며, 이것이 우레이트 산화효소 활성(요산을 알란토인으로 분해시킬 수 있는 능력)을 가짐을 확인하였다.

본 출원인은 또한, 분리된 cDNA에 대해 서열이 변형된 부분을 포함하며 우레이트 산화효소를 암호화하는 재조합 유전자로 구성된, 진핵세포 내에서의 발현을 위한 몇 개의 벡터를 제조하였고, 진핵세포에서 통상적인 코돈(codon)을 삽입목적으로 도입하였으며, 이들 벡터로 여러 가지 진핵세포들을 형질전환시켜 상기 세포를 소량 및 대량(발효조 용량) 배양한 결과, 상기 세포의 분해물이 예상 분자량과 우레이트 산화효소 활성을 갖는 상당한 분량의 재조합 단백질을 함유함을 확인하였다. 본 출원인은 이 재조합 단백질을 정제하고 우레이트 산화효소 추출물과 비교하여 부분적으로 이것의 특성을 구명하였다.

따라서, 본 발명은 적어도 16 U/mg의 우레이트 산화효소 비활성(specific activity)을 가지며, 다음의 서열 :

(임의로 메티오닌 이 선행됨)또는 이 서열과 상당한 정도의 유사성(homology)을 갖는 새로운 단백질에 관한 것이다.

바람직하게는 본 발명 단백질의 우레이트 산화효소 비활성은 약 30 U/mg이다.

바람직한 이러한 형태의 단백질은 2차원의 겔 분석상 분자량이 약 33.5kDa, 등전점이 약 8.0인 반점(spot)을 나타내며, 단백질 질량의 적어도 90%을 차지하는 단백질이다.

바람직한 본 발명 단백질의 순도는 (C8 접합 실리카 칼럼을 이용한 액체 크로마토그라피에 의해 결정) 80%를 넘는다.

이러한 형태의 중요한 단백질은 등전점이 8.0인 단백질이다. 바람직하게는 이 단백질의 아미노말단의 세린은 차단기(바람직하게는 원자질량 단위가 약 43인 분자량을 갖는), 예를 들면 아세틸기 등을 갖는다.

본 발명은 또한, 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된 본 발명 단백질을 함유하는 의약물에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 단백질은, 다른 용도로 , 우레이트 산화효소 비활성이 약 8U/mg인 우레이트 산화효소 추출물[우리 코자임 (Uricozyme) (Vidal 1990)이라는 상품명의 주사제로 시판]을 유리하게 대체할 수 있다.

본 발명은 또한, 다음의 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 서열로 구성된 재조합 유전자에 관한 것이기도 하다 :

유전 부호의 축퇴성(degeneracy) 때문에, 상기 식에 대응하는 서열의 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 여럿 존재한다. 하나의 바람직한 DNA 서열 특히, 원핵 미생물에서의발현에 적합한 DNA 서열은 다음과 같다 :

효모와 같은 진핵 세포 내에서의 발현에 특히 적합한, 또 하나의 바람직한 DNA 서열은 다음과 같다 :

동물세포에서의 발현에 특히 적합한, 또다른 DNA 서열은 다음과 같다 (동물세포에서 발현을 촉진하는 비번역 5' 서열이 선행 ) :

이러한 형태의 바람직한 비번역 5'서열은 상기 서열 바로 앞에 위치한 AGCTTGCCGCCACT 서열로 구성되는 서열이다.

상기 cDNA들이 암호화하는 단백질이 이 단백질의 아미노말단 메티오인 잔기로부터 이 단백질을 분해하는 메티오닐 아미노펩티디아제에 의해 가공처리(processing)될 수 있음은 주목할 만한 것이다.

본 발명은 더욱이 상기 정의된 재조합 유전자의 발현에 필요한 수단과 함께 상기 재조합 유전자를 함유하고 있는 발현 벡터에 관한 것이기도 하다.

원핵 미생물 특히, 대장균에서의 발현을 위하여, 코딩 서열은 특별히 효과적인 프로모터 [그 다음에 리보솜 결합부위가 발현될 유전자의 앞쪽(upstream)에 온다] 및 발현될 유전자의 뒤쪽(downstream)에 효과적인 전사 종결 서열을 포함하는 발현 벡터에 삽입되어야 한다. 이 플라즈미드는 또한 복제 개시점과 선택 표지(selection marker)도 포함하여야 한다. 상기 서열들은 모두 호스트세포(host cell)의 한 기능으로서 선택되어야 한다.

진핵세포에서의 발현을 위해, 본 발명에 따른 발현벡터는 상기 정의된 재조합 유전자의 발현, 진핵세포에서 재조합 유전자의 복제 및 형질전환 세포의 선택에 필요한 수단과 함께 상기 정의된 재조합 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 예를 들면 수용생물체 진핵세포의 돌연변이를 상보하기 위해 선택된 선택 표지[재조합 유전자의 수많은 복제물들이 게놈 혹은 다중복제(multicopy) 벡터에 삽입된 세포들의 선발을 가능하게 한다]를 갖는다.

동물세포 특히, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포에서의 발현을 위해, 코딩 서열은 두 개의 발현단위[효과적인 프로모터 (예를 들면, SV40 초기 프로모터)앞의 첫 번째 단위에 재조합 유전자가 삽입됨]를 포함하는 플라즈미드 (예를 들면, pBR322에서 유래된것)에 삽입된다. 개시 ATG 주변의 서열은 KOZAK [M. KOZAK (1978) Cell, 15. 1109-1123]에 의해 설명된 컨센서스 서열(consensus sequence)의 한 기능으로서 선택되는 것이 좋다. 인트론 서열, 예를들면, 마우스 α-글로빈의 인트론은 재조합 유전자의 앞쪽에 삽입될 수 있고, 폴리아데닐화 부위(polyadenylation site)를 포함한 서열, 예를 들면, SV40 폴리아델닐화 서열은 재조합 유전자의 뒤쪽에 삽입될 수 있다.

두 번째 발현단위에는 디히드로폴산 환원효소 [dihydrofolate reductase (이하 DHFR로 약칭되는 효소)]를 암호화하는 선택 표지(예를 들면, 어떤 DNA 서열)가 포함된다. 이 플라즈미드로 동물세포, 예를들면 DHFR^-CHO 세포(DHFR을 발현시킬 수 없음)를 형질전환시킨다. 메토트렉세이트(methotrexate)내성을 이용하여 세포주를 선별한다 : 이 세포주는 재조합 유전자의 수많은 복제물들을 자신의 게놈에 통합시켰으며, 상기 재조합 유전자를 충분한 정도로 발현시킨다.

효모와 같은 진핵세포, 예를 들면 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현을 위해서, 코딩 서열은 한편으로는 효과적인 프로모터로서, 또 다른 한편으로는 전사 종결인자(transcription terminator)로서 인식되는 서열들 사이에 삽입되어야 한다. 발현 카세트(expression cassette)라 불리우는 배열인 프로모터/코딩 서열/종결인자 배열은 효모의 플라즈미드 벡터(단일 복제 또는 다중 복제)에서 클론되거나, 또는 다중 복제물로서 효모의 게놈내로 통합된다.

더욱이 본 발명은 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 진핵세포에 관한 것이기도 하다. 이들 진핵세포 가운데서도, 사카로마이세스 세레비지애 속의 균주들 특히, 루신(leucine) 또는 우라실(uracil)의 합성과 관련된 유전자들 중의 하나, 예를들면 LEU2 유전자 또는 URA3 유전자에 돌연변이를 포함하고 있는 균주들이 중요하다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 유전자의 발현에 필요한 수단과 함께 재조합 유전자를 포함하는 동물세포에 관한 것이기도 하다. 상기 재조합 유전자라면, 예를 들어, 상기 발현 벡터에 의한 형질전환, 비루스 또는 상기 발현 벡터함유 레트로비루스에 의한 감염, 또는 미소주사(microinjection)을 의해 세포내로 도입될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 다음의 단계들로 구성되는 재조합 우레이트 산화효소의 제조 방법에 관한 것이기도 하다 :

1) 상기 정의된 형질전환 세포의 배양 :

2) 상기 세포의 분쇄 유도 :

3) 수득된 분쇄물(lyzate)에 포함되어 있는 우레이트 산화효소의 분리 및 정제.

본 발명의 내용은 아래의 실시예로 더욱 분명하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 분야에 익숙한 사람들에게는 잘 알려져 있는 다음의 여러 기술들은 Maniatis 등의 저서에 잘 설명되어 있다 : Maniatis et al : Molecular cloning: a laboratory manual (1984, Cold Spring Harbor Press, New York).

(아스페르길루스 플라부스로부터 mRNA의 분리)

우레이트 산화효소를 생산하는 아스페르길루스 플라부스 세포주를 우레이트 산화효소 생산에 적합한 조건 즉, 요산과 다음의 조성 : 글루코오스 15 g/1, MgSO₄, 7H₂O 1g/1, KH₂PO₄0.75 g/1, CaCO₃, 1.2 g/1, 요산 1.2 g/1, KOH 0.5 g/1, 콩기름 0.66 m1/1, FeSO₄·7H₂O 10mg/1, CuSO₄·5H₂O 1mg/1, ZnSO₄·7H₂O 3mg/1, MnSO₄·H₂O 1mg/1을 갖는 배지에서 배양한다. 본 배지를 1 M H₂SO₄로 pH=7 로 조정하고, 120℃에서 80분간 멸균한다.

5ℓ 에를렌마이어 플라스크에서, 1.5ℓ의 배지를 약 1 3.10⁷포자로 접종한다.

상기 배양액은 120 rpm 의 속도로 흔들어주면서, 30℃에서 약 40시간 배양한다. 균사를 거즈(gauze)위에서 여과 회수하여, 물로 세정한 후 액체 질소에서 냉동시킨다.

15g의 균사(습윤 중량)를 녹여, 45ml의 용균 완충액(lysis buffer)에 현탁시킨 후 동일 체적의 비이드(직경 0.45㎛)로 처리한다. 용균 완충액은 구아니딘 티오시아네이트 4M, Tris-HCI 10mM pH 7.6, EDTA 10mM, β-메르캅토에탄올 50ml/ℓ로 구성된다. 균사 현탁액을 젤뮬러(Zellmuhler)분쇄기(진동발생)에서 분쇄한다.

이 분쇄물을 회수하고 비이드를 따라낸다. 상등액을 제거하고 (약 45ml) 리튬 클로리드에 대해 최종 농도를 3M 로 하여 0℃에서 보관한다.

이틀 후, 이것을 10,000 rpm에서 60분 원심분리한다. 상등액을 버리고 잔류물을 40ml의 LiCl 3M 에 취하여 10,000 rpm에서 1시간 30분간 다시 원심분리를 행한다.

다음의 것을 첨가한다 : 프로테이나아제 K (시그마) 40㎍/ml, SDS(0.1% w/v) 및 EDTA 20mM. 이 혼합물을 37℃에서 3시간 방치한다. 2배의 에탄올로 침전시킨 후, 70% 에탄올로 세정한다. 잔류물을 0.5ml의 TE 완충액(Tris-HCI 10mM, EDTA mM pH7.5)으로 처리하고, 혼합물을 2회 클로로포름을 추출한 후 에탄올로 침전시킨다. RNA를 -80℃로 알콜에서 보관한다.

[실시예 2]

(RNA의 폴리 A⁺분획의 정제)

약 1mg의 RNA를 4℃(15,000rpm)에서 20분간 침전시키고 70% 에탄올로 세정한 후 건조시킨다. 잔류물을 1ml의 TE 완충액으로 처리하고 보르텍스(Vortex)에서 흔들어 줌으로써 재현탁시킨다. 올리고 dT-셀룰로오즈 제3형 (Collaborative Research Inc., Biomedicals Product Division 사 제품)을 제조회사의 추천방법에 따라 제조한다. RNA을 이 올리고 dT에 넣고 가볍게 흔들어서 비이드와 재현탁시키고, 65℃에서 1분간 가열한다.

이 현탁액을 0.5 M NaCl에 맞춘 후 가볍게 10분간 흔들어 준다. 이후 1분간 1000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 잔류물을 0.5M NaCl 함유 1ml의 TE 완충액으로 2회 세정한다. 상등액을 제거한다. RNA의 폴리아데닐화 분획(mRNA로 구성)은 1ml의 TE완충액에 비이드를 현탁시킨 후, 이 현탁액을 60℃에서 1분간 가열하고, 이어서 이것을 10분간 틸팅 플레이트(tilting plate)위에서 흔들어 줌으로써 용출시킨다. 이후, 이것을 1분간 1000rpm 으로 원심분리함으로써, 한편으로 용액 내에 자유 mRNA를 포함하는 상등액과 또 다른 한편으로는 셀룰로오즈 비이드의 잔류물을 회수하는 것이 가능하다. 상기 일련의 과정 (용출로부터 시작)을 반복한다. 이러한 방법으로 수득된 상등액을 모으고, 과잉량의 비이드를 원심분리로 제거한 후, 상등액을 일반적 방법(Maniatis : 앞에 인용한 책에 있는)에 따라 NaCl 함유 에탄올로 침전시킨다.

[실시예 3]

(cDNA 유전정보 도서관(library)의 구성)

상기 실시예에서 기술된 대로 분리한 mRNA를 이용하여 벡터 pTZ19R(PHARMACIA 사 제품)로 cDNA 유전정보 도서관을 제조한다. 이 벡터는 오직 한 종류의 제한부위를 갖는 폴리링커(ploylinker)로 구성된 플라즈미드이다.

사용한 클로닝 기술은 Caput등의 방법(primer-adapter techique : Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A)(1986) 86,1670 1674)이다.

이것은 먼저 벡터를 PstI으로 소화시키고 PolydC 꼬리를 3'의 돌출부 말단에 부가한 후, 그 결과로서 생성되는 플라즈미드를 BamHI으로 소화시킨다. 벡터에 해당하는 단편을 Sepharose CL4B(Pharmacia) 칼럼으로 정제한다. 따라서, 이것은 한 쪽 말단에 polydC 꼬리가 있고, 다른 말단은 BamHI형의 접착성 말단(sticky end)을 갖는 것으로 구성되어 있다. 둘째로, mRNA를 서열 5'GATCCGGGCCCT₍₁₂₎3'을 갖는 시발물질(primer)로부터 역전사시킨다. 따라서, 이 cDNA는 자신의 5' 말단에 BamHI 접착성 말단과 상보적인 서열 GATCC를 갖는다. 역전사효소의 작용에 의해 수득된 RNA-DAN 혼성체를 알칼리로 가수분해하여 RNA를 제거한다. 이 후, 단일가닥의 cDNA를 2회 Sepharos CL4B칼럽으로 정제하고 말단 전이효소(terminal transferse)로 처리하여 polydG를 3' 말단에 부가시킨다. 이 cDNA를 단일 가닥의 형태로 상기 제조된 벡터내로 삽입시킨다. 두 번째 올리고누클레오티드 즉, 시발물질에 상보적인 연결인자(adapter)가 이 cDNA의 5' 말단에서 오픈 (open) BamHI 부위를 만들어 내는데 필요하다. 백터의 하이브리드화 후, cDNA, 연결인자 및 재조합 유전자를 파아지 T₄연결효소(ligase)를 이용하여 원형화한다. 단일가닥 부분은 이후 T₄파아지의 DNA 폴리머라아제에 의해 복구된다. 이러한 방법으로 수득한 플라즈미드 폴(pool)을 사용하여 암피실린 내성의 MC1061 세포주를 형질전환시킨다 (Casabadan, Chou and Cohen. J. Bact. (1980) 143, 971 980).

[실시예 4]

(아스페르길루스 플라부스로부터 추출된 우레이트 산화효소의 정제 및 이의 특성구명)

1) 아스페르길루스 플라부스로부터 추출된 우레이트 산화효소의 정제.

우레이트 산화효소의 비활성 [비활성은 브래드포드 방법 (Anal. Biochem. 72,248 254)으로 측정한 총 단백질 양에 대한, 실시예 9에서 기술된 방법으로 측정된 우레이트 산화효소 활성의 비)이 8μ/ml인 아스페르길루스 플라부스로부터 추출된 우레이트 산화효소의 조합액(Uricozyme - Laboratiories Clin Midy)을, 다음의 프로토콜에 따라, 레드-아가로오즈 120을 접합시킨 아가로오즈(시그마) 칼럼을 이용한 크로마토그라피, 한외여과법에 의한 농축 및 Ultrogel Aca 44(IBF) [일종의 폴리아크릴아미드-아가로오즈 겔]를 통한 여과로 재정제한다 :

단계 1 : 접합 아가로오즈를 통한 친화크로마토그라피.

온도 : 4℃

칼럼 : PHARMACIA K50/30

- 직경 = 50mm

- 길이 = 33cm

수지 : 레드 120 아가로오즈(3,000 CL/R-0503 시그마)

(겔의 부피 = 410ml, 겔의 높이 = 20cm)

평형완충액 : 글리신/NaOH 20mM pH 8.3

용출완충액 : 글리신/NaOH 20mM NaCl 2 M pH 8.3

조건형성 유속 : 250ml.h^-1

운전유속 : 160ml.h^-1

용출유속 : 60ml.h^-1

1) Uricozyme액을 일정-유속 펌프를 이용하여 칼럼의 윗 부분에 주의깊게 부어 넣는다.

2) 흡착시킨 후, 이 칼럼을 칼럼 부피의 평형 완충액으로 2회 세정한다.

3) 다음의 조성을 갖는 이온 농도 구배로 용출 시킨다 :

글리신, NaOH, 20 mM pH 8.3/글리신, NaOH, 20mM + NaCl 2M pH 8.3 농도 구배의 총 용량은 칼럼 용량의 10배이며, 두 조성물 사이에서 균등하게 분할한다.

크로마토그라피 기록은 λ= 280nm에서 한다. 우레이트 산화효소의 풀은 우레이트 산화효소의 비활성이 16 U/mg 이상인 분획들을 합한 것이다.

단계 2 : 10kDa 한외여과막으로 구성되어 있는 Biopass system을 이용한 한외여과에 의한 우레이트 산화효소 풀의 농축

단계 3 :

온도 : 4℃

칼럼 : PHARMACIA K50/100

- 직경 = 50mm

- 길이 = 100cm

수지 : 아민기와 히드록실기를 가진 플리아크릴아미드-아가로오즈

: Ultrogel ACA 44 (IBF)

- 겔의 부피 = 1.61

- 겔의 높이 = 80cm

평형 완충액 : 글리신/NaOH 20mM pH 8.3

조건형성 유속 : 40 ml.h^-1

운전 유속 : 24 ml.h¹

1) 농축 우레이트 산화효소 풀을 일정-유속 펌프를 이용하여 칼럼의 윗 부분에 주의깊게 부어 넣는다.

2) 시료를 부어 넣은 후, 계속 칼럼에 글리신/NaOH 20mM pH 8.3의 완충액으로 공급한다.

3) 크로마토그라피 후, NaCl 2M로 UV 흡수치 (λ=280nm) 0.05 일 때까지 세정한다.

NaCl 2M하에서 4℃에서 보관한다.

크로마토그라프 기록은 λ=280nm에서 한다 : 우레이트 산화효소의 풀은 공통으로 다음의 성질을 갑는 분획들을 합하여 모은다 :

- 우레이트 산화효소 비활성이 20U/mg 이상이며 :

- 변성 조건(SDS의 존재)하, 질산은 전개(Biorad staining kit)시의 전기영동에서 2개의 밴드 즉 :

33 34 kDa 의 주 밴드

70 71 kDa 의 부 밴드.

2) 아스페르길루스 플라부스로부터 추출된 정제 우레이트 산화효소의 특성 구명.

a) 부분 서열 결정 (Partial sequencing)

정제 우레이트 산화효소 추출물의 아미노산 서열의 정보를 얻기 위해 이단백질의 아미노-말단 서열의 직접 결정(이것은 cDNA 클로닝에 필요한 탐식자의 합성을 가능하게 한다)을 시도하였다. 이 서열결정은 이 단백질의 아미노-말단의 저지현상 때문에 실패하였다 (하기 f) 참조).

따라서, 우레이트 산화효소의 부분 서열을 얻기 위해 다음의 전략을 개발하였다 :

- 이 단백질을 단백질 분해 효소 (스타필로코쿠스 아우레우스 , Staphylococcus aureus의 효소인 트립신 및 프로테아제 V8를 이용)로 분해

- 상기 결과로서 생성된 폴립펩티드를 역상 HPLC 로 분리

- 정제한 펩티드들의 서열결정.

α) 트립신에 의한 우레이트 산화효소의 가수분해, 펩티드들의 정제 및 서열 결정

암모늄카르보네이트 완충액 100 mM pH 8.9에 녹아 있는 농도 9mg/ml 의 우레이트 산화효소를 트립신(Worthington, TPCK) (우레이트 산화효소/트립신 무게비 = 30/1) 으로 30℃에서 24시간 처리한다. 트립신 가수분해 후, 소화된 우레이트 산화효소 60㎍을 아세토니트릴 1% (v/v) 및 트리플루오로아세트산 0.1% (v/v) 수용액으로 평형화시킨, Brownlee G18 접합 실리카의 역상 HPLC 칼럼(칼럼 : 10 x 0.2 cm)에 바로 주입한다. 이후 펩티드를 트리플루오로아세트산 (0.1%) 수용액에서 60분 동안, 아세토니트릴의 농도를 1%로부터 60%까지로 변화시키면서, 유속 150 ㎕분으로 하는 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 칼럼에서 용출되는 펩티드는 218 nm에서 광학밀도(optical density)를 측정하여 검출한다.

용출 양상을 제1도에 나타내었으며, 여기서 문자 T(trypsin : 트립신) 다음의 숫자는 확인된 피이크에 해당한다.

각 피이크를 모으고, 크로마토그라프 (모델 430 A, Applied Biosystems 사)가 장비된 단백질 서열결정 장치 (모델 470A, Applied Biosystems 사) (매번의 분해 사이클 마다, 형성되는 페닐티오히단토인 유도체들을 연속적으로 분석한다)로 분석할 때까지 -20℃에 보관한다. 하기 표1에 확인된 9개 피이크의 팹티트 서열이 나타나있다.

β) 프로테아제 V8에 의한 우레이트 산화효소의 가수분해, 펩티드들의 정제 및 서열 결정

암모늄 아세테이트 완충액 100mM pH 6.8 에서의 농도가 2mg/ml 인 우레이트 산화효소를 스타필로코쿠스 아우레우스의 프로테아제 V8 (Boehringer-Mannheim) (우레이트 산화효소/프로테아제 V8 의 비 = 60/1)로 30℃에서 72시간 소화시킨다. 이어서, 160㎍의 소화된 우레이트 산화효소를 아세토니트릴 1% 및 트리플루오로아세트산 0.1% (v/v)의 수용액으로 평형화시킨, Brownlee G18 접합 실리카의 역상 HPLC 칼럼 (칼럼 : 10 x 0.2cm : 입자 : 7 x 0.03㎛)에 주입한다. 이후 펩티드를 트리플루오로아세트산 (0.1% (v/v)) 수용액에서 60분동안, 아세토니트릴의 농도를 1%로부터 60%까지로 변화시키면서, 유속 150㎕ 분으로 하는, 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 칼럼에서 용출되는 펩티드는 218nm에서 광학밀도를 측정하여 검출한다.

용출 양상을 제2도에 나타내었으며, 여기서 문자 V (프로테아제 V8) 다음의 숫자는 확인된 피이크에 해당한다.

각 피이크를 모으고, 상기 단백질 서열결정 장치로 분석할 때까지 -20℃에 보관한다.

하기 표1에 확인된 5개 피이크의 펩티트 서열이 나타나 있다.

b) 비활성 (Specific activity)

정제된 우레이트 산화효소 추출물은 약 30 U/mg의 비활성을 갖는다.

c) 변성 조건하에서의 전기영동

정제된 우레이트 산화효소 추추물을 SDS(소듐 도데실수페이트)의 존재하에 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동을 하고, 질산은으로 전개처리하면 약 33 34 kDa의 강한 세기의 주 밴드와 약 70 71 kDa의 매우 약한 세기의 부 밴드가 나타난다.

d) 등전점의 결정

과 정

- 시판되는 겔 즉, pH 범위가 (3.5-9.5) 및 (5-8)인 파마시아사(Pharmacia) 제품 LKB Ampholines gel plate 의 사용

- 10㎕의 LKB 표준 단백질 (표준 단백질의 등전점 범위 : 3.5 9.5)과 4㎍ 및 8㎍의 정제된 우레이트 산화효소(두 개의 다른 레인 상에)를 조심스럽게 붓기.

- 12V, 6℃에서 1시간 30분 전개.

- 단백질을 염색하기 위하여 (25% 에탄올, 8% 아세트산)에 녹아 있는 0.1% 쿠마씨 블루(Coomassie blue)로 염색하고, 25% 에탄올 및 8% 아세트산을 함유한 용액으로 탈색 (배경을 제거하기 위함)

- 결과 : 2개의 레인 각각에서, 등전점이 8.1 과 7.9인, 2개의 인접 밴드(이중 밴드)의 관찰.

e) 2차원 겔 분석

2차원 겔 분석을 통하여 일차 단계에서는 단백질들의 등전점에 따라, 이차 단계에서는 단백질들의 분자량에 따라 이들을 분리하는 것이 가능하다.

방 법

시료 : 글리신 완충액 20mM pH 8.3에 녹인 정제된 우레이트 산화효소 추출물의 용액.

시료의 준비

- 우레이트 산화효소 5㎍ 및 10㎍의 두 시료.

- 진공 원심분리로 건조시키고, 다음의 조성을 갖는 5㎕의 용균 완충액으로 처리 : 우레아 2.5 M, 3-(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오프로판-1-술포네이트, CHAPS (시그마), 2% (v/v), pH 범위 5 8 및 3.5 9.5 인 Ampholines amphoterics (LKB), 0.4% 및 β-매르캅토에탄올 5%.

등전점전기이동 겔

- 우레아 9.5M, CHAPS 5%, LKB Ampholines (pH (3.5 9.5) 1% : pH (5 8) 1%), 아크릴아미드/비스아크릴아미드 (28.4%/1.7%) 최종농도 3.5%, 물을 포함하는 용액의 제조.

- 이 용액의여과, 가스제거 그리고 0.075%의 테트라메틸에틸렌디아민, Temed(Pharmacia), 및 0.015 %의 암모늄 퍼술페이트의 첨가.

- 이 용액을 튜브 (16 x 0.12cm)에 도입 -20℃에서 하룻밤 중합반응.

- 음극 용액 : 가스제거된 NaOH 0.1M

-양극 용액 : HPO25mM.

- 4mA (전압 300V → 1000V)에서 45분간 예비전개.

- 음극에 시료 침적.

- 20℃, 1000V에서 19 시간 전개.

- 겔을 탈몰딩(demolding) 하고 완충액(Tris 0.375M pH 8.8 : SDS 3% :디티오 트레이톨, DTT, 50mM)에서 20℃에서 10분간 평형화

PAGE/SDS 변성겔

- 아크릴아미드/비스아크릴아미드(30%/0.8%) 최종농도 15%, Tris-HCI (pH 8.8) 0.375M, 및 물을 포함하는 용액의 제조.

- 이 용액의 여과, 가스제거, 그리고 SDS(0.1%), 암모늄 퍼술페이트 0.05% 및 Temed 0.05%의 첨가

- 4℃에서 하룻밤 중합반응(겔 16 x 20 x 0.15cm).

- 평형화시킨 후, PAGE/SDS 겔 표면 위에 등전점전기이동 겔의 침적 및 아가로오즈의 봉합(sealing).

- 전기영동 완충액 : (Tris-HCI 25mM pH 8.3, 글리신 0.192 M, SDS 0.1%)

- 6℃, 100mA에서 6시간 전개.

- 50% 메탄올, 10% 아세트산에서 겔을 고정, 질산은으로 염색 (H. Blum의 방법, Electrophoresis 1987, 8, p. 93 99).

- 코닥사 제품의 비시지 2000 이미지 분석장치(Visage 2000 image analyzer)에서 겔을 스캐닝하여 각 반점의 광학밀도 및 표면적을 결정하고 반점들 간의 정량비를 계산.

- 아메샴(Amersham) 표준 단백질의 존재하에서 2차원 겔의 제조에 의한 분자량의 결정.

결 과

분자량이 약 33.5 kDa 인 2개의 반점이 관찰되었는데, 하나는 등전점이 8.0, 강도가 5.2인 주 반점(단백질 중량의 약 93%를 차지)이며, 다른 하나는 등전점이 7.4, 강도 0.41인 부 반점(단백질 중량의 약 7%를 차지)이다.

f) 아미노말단 서열 및 아미노 말단 차단기 질량의 결정

α) 아미노말단 서열의 보호 특성의 증명

아미노말단서열을 페닐티오히단토인 유도체의 분석장치인 Applied Biosystem model 120A analyzer 와 연결된 Applied Biosystem model 470A sequencer를 이용하여 분석한다. 정제된 우레이트 산화효소(200 pmol, 아미노산 분석으로 확인)를 표준 단백질인 20pmol의 β-락토글로불린 존재하에서 서열 분석장치에 넣는다.

우레이트 산화효소 서열에 해당되는 어떠한 아미노말단 서열도 확인되지 않았다 (이에 비해, 표준 단백질의 아미노말단 서열은 검출되었는데, 이것은 서열분석장치가 작동됨을 보여주는 것이다).

따라서, 아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소는 아미노말단이 보호되어 있는 것이다.

β) 32개 아미노산의 아미노말단 펩티드의 서열 및 아미노말단차단기 질량의 결정

방 법 : 시아노겐 브로미드(cyanogen bromide)에 의한 분해

7% 포름산을 포함한 용액으로 평형화시킨 Sephadex G25 (PD10-Pharmacia) [에피클로로히드린으로 덱스트란을 교차연결시켜 수득된 겔]상에서 정제 우레이트 산화효소 추출물을 겔 여과함으로써 염을 제거할 수 있으며 완충액을 교환할 수 있다. 포름산 농도를 진공 원심분리에 의해 70%까지 증가시킨다. 이후 시아노겐 브로미드를 가하여 최종 농도가 0.2M이 되도록 하고 반응을 빛이 존재하지 않는 실온에서, 아르곤 존재하에서 20시간 진행시킨다.

- 시아노겐 브로미드에 의한 단백질 분해로부터 수득된 펩티드들의 이온교환 크로마토그라피에 의한 분리

펩티드를 모노 S 친수성 수지(Pharmacia) 충진 이온교환 칼럼에서 분리한다.

완충액 A : 암모늄 아세테이트 10mM pH 6.2

완충액 B : 암모늄 아세테이트 1M pH 6.2

유속 : 0.6 ml/min, 278 nm에서의 광학밀도 측정으로 피이크 검출

농도구배 : 0% B 100% B/30min - 1ml 분획으로 모음.

이온 교환 단계에서 수득한 분획을 샤거(Schagger) 및 본 자고우(Von Jagow)에 의해 설명된 방법(1987) (Anal. Biochem. 166-p. 368 379)에 따라 PAGE/SDS 겔로 분석한다.

- 역상 HPLC 에 의한 아미노말단 펩티드의 정제 및 질량 스펙트로메트리에 의한 이의 분석

이온 교환 단계에서 수득된 분자량 약 4000 Da (PAGE/SDS 겔 위에서)의 펩티드를 C18 접합 실리카가 충진된 역상 HPLC 칼럼인 베크만 알텍스(Beckman Altex) C18 칼럼 (250 x 2.1mm)으로 정제한다.

유속 : 0.3ml/min, 218nm에서의 광학밀도 측정에 의한 피이크검출.

완충액 A : 물/0.1% TFA (트리플루오로아세트산)

완충액 B : 아세토니트릴/0.1% TFA

농도구배 : 1 50%의 B/60min

1차 역상 HPLC 단계에서 수집된 펩티드를 동일 역상 HPLC 칼럼을 통해 다른 농도구배에서 재정제한다.

농도구배 : 1 50%의 B/10min

수집한 피이크를 글리세롤 + 티오글리세롤 매트릭스를 갖는 고속 원자 충돌 질량 스펙트로메트리 (fast atom bombardment mass spectrometry, FAB/MS)를 이용하여 분석한다.

- 키모트립신에 의한 아미노말단 펩티드의 소화 및 역상 HPLC 에 의해 분리된 이들 펩티드들의 아미노산 분석

역상 HPLC 로 정제한 펩티드의 서열 결정을 위해, 상기 펩티드를 키모트립신으로 소화시킨다. 키모트립신으로 소화된 펩티드를 베크만 알텍스 C18 칼럼 (250 x 2.1mm)을 이용한 역상 HPLC 로 분리한다.

유속 : 0.3ml/min, 218nm에서 광학밀도 측정에 의한 피이크검출

완충액 A : 물/0.11% TFA

완충액 B : 아세토니트릴/0.08% TFA

농도구배 : B 1% 50%/60min - 피이크 수집

키모트립신에 의해 소화된 펩티드를 Applied Bissystem analyzer (모델 420-130A)를 이용한 아미노산 분석을 통해 확인한다.

결 과

아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소의 cDNA 서열과 이로부터 추정된 아미노산 서열(참조, 실시예 6)의 결정 후 얻어낸 하기의 결과는 다음의 설명으로서만 이해될 수 있다 :

- 질량 스펙트로메트리에 의한 아미노말단 펩티드의 분석

약 42 단위의 원자량의 차가 질량 스펙트로메트리로 결정한 두 분자량 3684 및 3666 사이에서 관찰되며, 이론적인 분자량은 카르복시말단 메티오닌 잔기가 시아노겐 브로미드와의 반응으로 부분변형되어 호모세린 (분자량 3642), 또는 호모세린 락톤(3624) 중 어느 하나를 생성하는 다음의 서열 (아미노말단 메티오닌기가 절단된, 그리고 첫 번째 메티오닌 잔기 다음이 시아노겐 브로미드로 펩티드 절단된 아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소의 cDAN로부터 추정된 아미노산 서열)로부터 결정된다.

따라서, 아미노말단 세린에는 약 42 단위의 원자량 추가를 설명하는, 아마도 상기 아미노말단 세린의 아세틸화(CH₃CO 질량 - H 질량 = 42 원자량)와 부합하는, 보호기가 존재한다.

- 키모트립신에 의해 소화된 펩티드들의 아미노산 분석

이 분석을 통하여 시아노겐 브로미드로 처리되어 수득된 아미노말단 펩티드가 상기 서열(1)을 구성함을 분명히 알 수 있다.

우레이트 산화효소의 완전한 아미노산 서열은 다음과 같다.

[실시예 5]

(박테리아의 스크리닝)

1) 표지 탐식자의 제조

단백질의 아미노산 서열로부터 추정된 두 개의 탐식자 풀을 BioSearch 4600 DNA synthesizer를 이용하여 합성한다. 첫 번째 풀은 5'→3' 방향의 His-Try-Phe-Glu-Ile-Asp 잔기들의 서열(T 27 서열의 일부)에 해당된다 :

이 풀은 실제로, 모든 가능한 조합을 나타내는, 2⁴X 3 = 48개의 서로 다른 올리고누클레이티드로 구성된다. 두 번째 풀은 5'→3' 방향의 Gln-Phe-Trp-Gly-Phe-Leu 잔기들의 서열 (V5 서열의 일부)에 해당된다 :

이 풀은 2⁴X 4 = 64 가지의 조합으로 구성된다. 이 탐식자는 데옥시누클레오티드 말단 전이효소 [terminal deoxynucleotide transferase (TdT, IBI 사 시판)]로 표지한다.

이 반응은 코발트 반응 완충액 (IBI 사에서 10배 농축물로 판매)에 녹아있는 올리고누클레이티드 혼합물의 용액 (100mg/ml) 100ng에 대해 수행한다 : 1.4 M 포타슘 카코딜레이트(pH 7.2), 300mM 디티오트레이롤, 1㎕의 데옥시쿠를레오티드 말단 전이효소(IBI사)그리고 P32로 표지된 50μCi의 데옥시시티딜 트리포스페이트, dCTP. 이 반응을 37℃에서 10분간 수행하고, 1㎕의 EDTA 0.5M을 첨가하여 반응을 종료시킨다. 페놀 추출을 하고 추출물을 Biogel P10 polyacrylamide (Biorad :150 - 1050) 칼럼에서 투석한다.

2) 우레이트 산화효소 cDNA를 함유한 콜로니의 하이브리드화(hybridization) 및 검출

약 40,000개의 콜로니를 Grunstein 및 Hogness 가 개발한 in situ 하이브리드화 기술 (1975, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A). 72, 3961)을 이용하여 스크린한다. 서로 떨어져 있는 콜로니를 얻기 위해 약 6000 개의 박테리아를 페트리 디쉬에 깐다. 37℃에서 24시간 배양 후, 각각의 디쉬를 2장의 필터에 포개어 모사하고, 각 필터를 2가지 풀의 탐식자 중의 하나로 처리하여, 수득된 모든 콜로니를 2개의 탐식자 풀로 나란히 테스트한다.

이 필터를 6 X SSC, 10 X Denhardt 용액, 초음파처리로 변성시킨 salmon sperm DNA(시그마) 100㎍/ml을 포함하는 완충액에서 2개의 탐식자 풀 중의 하나와 하이브리드화시킨다. 이 하이브리드화 반응은 42℃에서 16시간 수행한다. 6 X SCC 용액은 20 X SCC 용액을 희석하여 얻는다. 20 X SCC 완충액 제조는 Maniatis, Fritsch 및 Sambrock 법을 따른다. 요약하면, 이 완충액은 NaCl 175.3 g/ℓ 및 소듐 시트레이트 88.2g/ℓ를 포함하며, 10 N NaOH몇 방울로 pH = 7로 조절한 용액이다. 10 X Denhardt 용액은 최종 부피 500ml에 대하여 피콜(Ficoll) 1g, 폴리비닐피롤리돈 1g 및 사람 혈청 알부민 (human serum albumin) 1g을 포함한다.

42℃에서 6 X SCC 용액으로 세정(수욕조를 5회 바꾸면서 3시간) 한후, 필터를 조세프 페이퍼(Joseph paper)로 물기를 뽑아내고 방사능사진촬영 (autoradiography)을 한다. 이 필터를 16시간 후 현상한다. 콜로니의 약 0.5% 분획이 2개의 탐식자 풀과 하이브리드화한 것을 확인하였다.

이 분획에서 5개의 콜로니를 취하여 정제한다. 이들 콜로니 각각으로부터 플라즈미드 DNA를 준비하고, 이 DNA를 BamHI, 또는 HindIII, 또는 BamHI + HindIII 중의 어느 하나로 소화시켜서 분석한다.

아가로오즈 겔 상에서 분석한 결과, 수득된 5개의 플라즈미드가 BamHI, HindIII에 의해 선형화됨을 확인하였다. 이중 소화(double digestion)를 함으로써 클론된 cDNA의 전체에 해당하는 단편을 유리시킬 수가 있다. 이 단편의 크기는 3개의 경우는 약 1.2kb, 다른 2개의 경우는 0.9kb이다. 다음의 서열결정을 위하여, 0.9kb 단편중 하나와 1.2kb 단편중 하나를 선택하여 다시 클론한다(하기 실시예 6 참조).

[실시예 6]

(우레이트 산화효소 cDNA 서열의 결정)

한편은 0.9kb 단편중의 하나 (클론 9A), 또 다른 한편은 1.2kb 단편중의 하나(클론 9C)를 단일가닥 파아지 M13의 복제형의 DNA에 다시 클론한다. M13 클론의 DNA(한편은 0.9kb 단편을 함유하며, 또 다른 한편은 1.2kb 단편을 함유)를 헥산외부가수분해효소(exonuclease)로 분해하여 일련의 중복 M13 클론을 생성시킨다 (방법 : Cyclone I Biosystem, IBI 사). 상기 클론을 didecxyrivonucleotide 법 (Sanger et al., PNAS-U.S.A. - 1977, 14, 5463 5467)에 따라 염기 서열을 결정한다.

클론 9C의 염기서열이 제3도에 나타나있다 (화살표는 클론 9A의 기점, 염기심볼 뒤의 아스테리스크^*늡 클론 9C (두 서열과 후속의 제조들 (참조, 실시예 10)에 이용되는 AccI 및 BamHI제한 부위를 짜 마출때)의 염기와는 다른, 서열이 결정된 클론 9A의 염기를 의미한다.)

긴 단편 (클론 9C)의 염기서열과 짧은 단편(클론 9A)의 서열이 중복됨이 밝혀 졌지만 2개의 차이점이 존재한다. (참조. 제3도) 이들 차이점 중의 하나는 잠재적인 것이며, 다른 차이점은 트립토판 잔기가 글리신으로 치환된 점이다. 이들 차이점은 분리된 mRNA (참조, 상기 실시예 2)의 차이 또는 cDNA 유전정보 도서관(참조, 상기 실시예 3) 제조시 사용된 역전사효소내의 잘못에 기인될 수 있다. 아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소의 내놈 DNA의 염기서열을 결정함으로써 이러한 모호성을 해결할 수 있다 : 이것은 프립토판 잔기이다 (따라서, 역전사효소의 실수인 듯함).

긴 단편의 경우에 있어 ATG 코돈(제3도, 위치 109)이, 분자량이 약 34,240 Da이며 이의 서열이 정제된 아스페르길루스 플라부스 우레이드 산화효소(참조, 실시예 4)의 부분 서열에 해당하는 302 아미노산으로 구성된 폴리펩티드에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)을 풀어준다.

제4도에는 ATG 코돈에 의해 열린 DNA 서열과 이것에 의해 암호화된 폴리펩티드가 나타나 있고, 암호화된 폴리펩티드 반대방향의 화살표는 아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소를 트립신 및 프로테아제 V8로 가수분해 함으로써 수득한, 서열이 결정된 펩티드 (참조, 실시예4)를 나타낸다.

폴리펩티드 서열말단이, 퍼옥시좀에 위치하는 효소들(Gould S. J. et al., J. Cell Biol. 108(1989) 1657 1664)에 전형적인 Ser-Lys-Leu의 트리플리트로 되어 있음을 알 수 있다.

[실시예 7]

(우레이트 산화효소 cDNA 용 발현벡터의 제조)

대장균에서의 발현벡터인 플라즈미드 p466을 제조한다. 이것은 복제 개시점과 암피실린 내성 유전자를 갖는 pBR327 단편으로 구성된다 : 이것은 또한 대장균의 합성 프로모터 (R. RODRIGEZ. M. CHAMBERLIN, Promoters-Structure and function (1982), Preager), Shine-Dalgarno 서열, 바로 이웃한 특이한 NdeI 및 KpnI 부위를 갖는 폴리링커, 전사종결유전자(파이지 fd에서 유래) 및 lac i 유전자로 구성된다.

이 플라즈미드는 대장균에서의 hGH를 위한 발현 벡터(p462)로부터 이 hGH 유전자를 함유한 단편을 우레이트 산화효소 cDNA 로 대체시킴으로써 제조된다.

플라즈미드 p466의 제조는 보다 상세히 다음의 설명(참조, 제5, 6, 7, 8 및 9도)함께 기술한다.

제5도는 플라즈미드 p163,1에 대한 제한지도(restriction map)를 나타낸다. 다른 여러 단편들은 임의로 다음 설명에 따라 표지된다.

제6도는 플라즈미드 p160의 제한지도를 나타내고, 이것의 pvuI - XhoI - BamHI (1) 및 Pvul-ORI-BamHI (2)단편은 각각 플라즈미드 p163,1 및 pBR327로부터 유도되며, 작은 BamHI(2)-BamHI(1) 단편은 하기에 설명되는 단편3이다.

제7도는 플라즈미드 p373,2의 제한지도를 나타낸다. 다른 여러 단편들은 편의상 다음 설명에 따라 표지된다.

제8도는 플라즈미드 p462의 제한지도를 나타내며, 하기에 정의된 합성 BgIII-HindIII 단편은 다음으로 표시된다.

제9도는 플라즈미드 p466의 제한지도를 나타내며, 우레이트 산화효소를 암호화하는 유전자를 구성하는 Ndel-KpnI 단편은 다음과 같이 표시된다 :

1) 플라즈미드 p373,2 의 제조

사용 전략은 일반적으로 널리 이용되는 이미 존재하는 플라즈미드로부터 얻은 단편과 공지 기술로 합성 제조된 단편을 사용하는 것이다. 사용한 클로닝 기술은 T. MANIATIS, E.F. FRITSCH 및 J. SAMBROOK. (Cold Spring Harbor Laboratory (1982))에 의해 기술된 방법이다. 올리고누클레오티드는 Biosearch 4600 DNA synthesizer를 이용하여 합성한다.

유럽 특허 출원 제 A-0245138에 설명되어 있고, 조약 I-530에 따라, 1986. 2. 17일 CNCM에 기탁된 플라즈미드 p163,1(제5도)을 효소 Pvul 및 BamHI으로 분해한다. 이 플라즈미드는 hGH를 암호화하는 유전자를 갖고 있다. Pvul-BamHI 단편(이후, 단편1로 약칭하며, 제5도에 나타난 제한 요소 XhoI의 작용 부위를 함유)을 정제한다.

마찬가지로, 당해 분야에서 잘알려진 플라즈미드 pBR327 (SOBERON, X. et al., Gene, 9 (1980) 287 305)을 효소 Pvul 및 BamHI으로 분해한다. Pvul-BamHI 단편(이후, 단편2로 약칭하며, 복제 개시점을 함유)을 정제한다.

그리고, 단편 3을 제조한다 : 이것은 lac i 유전자와 이것의 프로모터를 함유하는 합성 BamHI(1) - BamHI(2) 단편이며, 이것은 다음의 서열을 갖고 있다 (이 서열 내에서 가닥의 두 말단은 제6도 및 7도에 기술된 플라즈미드에서 단편의 방향을 특정화 하기 위해 숫자 1 및 2로 확인한다):

이후 단편 1, 2 및 3을 제6에서와 같이 연결하여 플라즈미드 p160을 수득한다 :

이 플라즈미드를 제한 효소 HincII 및 PstI으로 부분 분해한다. 제6과 같이 복제개시점을 포함하고 있는 긴 HincII-PstI단편을 이후, 합성 DNA 단편 (자연상태의 hGH 전구체 중 앞부분의 44 아미노산을 암호화하는 서열과 이 서열 앞쪽에 조절 시그날을 함유)인 하기의 단편 4에 연결한다 :

이 단편에서 아미노산은 다음의 문자로 표시한다.

당해 업계에서 잘 알려진 프로모터 서열의 -35(TTGCTT) 및 -10 (TATAAT) 서열과 Shine-Dalgarno 서열은 이 단편에서 실선으로 표시한다.

이러한 방법으로 플라즈미드 p380,1을 수득한다.

이후 플라즈미드 p380,1을 제한효소 ClaI 및 NdeI 으로 처리하여 이것으로부터 상기 단편 4의 작은 단편인 ClaI-NdeI 단편을 제거하고, 이것을 하기 ClaI-NdeI 단편으로 치환한다 :

생성된 플라즈미드가 플라즈미드 p373,2 (제7)이다.

2) 플라즈미드 p466 의 제조

플라즈미드 p373,2를 효소 BgIII 및 HindIII로 이중 분해처리한다. 이 분해로부터 유도된 긴 단편을 정제하고 합성 DNA 단편(서열은 하기와 같으며, KpnI 및 SnaBI 클로닝 부위 옆의 3' 말단에 있는 hGH 유전저의 말단을 재구성)에 연결한다 :

이 단편은 BgIII 및 HindIII 접착성 말단으로 구성된다. 따라서 이러한 방법으로 생성된 새로운 플라즈미드 p462(참조, 제8도)는 발현벡터 내에서 우레이트 산화효소 cDNA를 함유하는 단편을 클로닝하는데 이용될 KpnI 부위와 NdeI부위로 구성된다.

pTZ19R에서 유도된 약 1.2kb의 우레이트 산화효소 cDNA(클론 9C) (실시예 3 참조)를 갖고 있는 혼성 플라즈미드는 독특한 KpnI 부위로 구성된다. 이 부위는 cDNA 클로닝 부위로부터 뒤쪽에 있는 몇몇 염기 쌍에 위치하고 있다. 또한, 우레이트 산화효소 cDNA는 5' 말단 근처에 위치한 AccI 부위를 포함하고 있다.

따라서, 이 cDNA 의 보다 큰 부분을 구성하는 AccI-KpnI 단편을 분리하고 정제한다. 또한 두 개의 상보적 올리고 누클레오티드도 합성하였으며, 하기 서열은 cDNA의 5' 말단을 재구성한다 :

이러한 방법으로 수득한 이 합성 단편은 NdeI 말단과 또 다른 AccII 말단을 갖는다. 이 단편과 합성 서열을 KpnI 및 NdeI으로 절단한 발현 벡터에 연결한다. 이 세 단편의 연결로 대장균 산화효소용 발현벡터 즉 p466 (참조. 제9도)의 수득이 가능해진다. 이 플라즈미드를 제한 효소로 일련의 가수분해를 함으로써, 예상되는 제한 부위, 특히 우레이트 산화효소를 암호화하는 유전자에 포함된 제한 부위들의 존재를 확인하는 것이 가능하다.

따라서, 플라즈미드 p466 은 제조에 의해 우레이트 산화효소에 대한 유전자를 포함하며 다음의 서열을 가진다 :

(아스페르길루스 플라부스에서 분리된 cDNA의 염기와 다른 염기들은 상기 서열에서 밑줄로 표시되어 있다. 이들 특이한 것을은 합성 AccI-KpnI 단편에 도입하여, ATG 뒤쪽에 원핵세포 유전자에서 보통 나타나는 것과 매우 유사한 염기 서열을 가지게 한다).

[실시예 8]

(우레이트 산화효소 cDNA 의 발현)

대장균 K12 RRI (Bethesda Research Lab. Inc.)을 암피실린 내성을 위하여 플라즈미드 p466 과 네가티브 조절 플라즈미드인 pBR322로 형질전환 시킨다. 암피실린-내성 콜로니가 두 경우에서 수득된다. 각 타이프의 콜로니 하나를 배지에서 배양한다. (LB + 암피실린 100㎍/ml) 교반하면서 하룻밤 37℃ 에서 배양후, 두 배양액을 배지 (LB + 암피실린 100㎍/ml)로 100배 희석한다. 1시간 배양후, IPTG (Isopropy1-β- D - thiogalactoside)를 3시간 동안 첨가한다.

Western blot 에 의한 우레이트 산화효소의 면역 검출법

1) 방법

OD=1에서 0.2ml에 상당하는 분량을 IPTG 로 3시간 유도한후 수득된 배양액으로부터 취한다. 이것을 원심분리하여 상등액을 제거한다. 이후, 이 잔류물을 다음 단계로 구성되는 Western blot(당해 업계에서는 공지의 기술)를 행한다 :

- Tris-HCI 0.125M pH 6.8, SDS 4%, 브로모페놀블루 0.002%, 글리세롤 20%, β-메르캅토에탄올 10% 로 구성된 로우딩 완충액이라 불리우는 완충액(LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970) 680 685)에 기술된 방법에 따름)에서 10분간 가열함으로써 이 잔류물을 용해시킴 ;

- LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970) 680 685)에 의해 기술된 방법에 따라 이 용해물에 포함된 여러 단백질의 전기 영동에 의한 분리 : 및

- 겔 상에 포함된 상기 단백질의 니트로 셀룰로오즈 필터에의 이전 (H. TOWBIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(1979) 4350 4354 의 기술에 따름).

BURNETTE 의 방법(W.W BURNETTE, Ana. Biochem. 112 (1981) 195 203)에 따라 수행된 면역 검출법은 다음의 일련의 과정을 포함한다 :

니트로셀룰로오즈 필터를 10분간 완충액 A (Tris-HCI 10mM, NaCl 170mM, KCI 1mM)로 세정 :

니트로셀룰로오즈 필터를 37℃에서 30분간 완충액 B (완충액 A에 bovine serum albumin이 3g/100ml 속도로 첨가)와 접촉 :

니트로셀룰로오즈 필터를 37℃에서 1시간 면역 serum(아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소를 인식하는 폴리클로날 항체) 과 접촉 :

니트로셀룰로오즈 필터를 완충액 B로 세정 :

니트로셀룰로오즈 필터를 37℃에서 1시간 요오드 125로 표지된 (0.1μci/ml 속도) 단백질 G와 접촉 :

이 필터를 완충액 A로 세정 :

이 필터를 X-ray 필름과 접촉시키고 :

필름을 현상.

2) 결과

플라즈미드 p466으로 형질전환된 균은, 아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소에 대한 항체로 확인한 결과 겉보기 분자량이 약 33kDa 이고, 대조균에는 없는 단백질을 과잉 생산함을 확인하였다.

[실시예 9]

(우레이트 산화효소 활성의 평가)

앞의 실시예에서 설명된 배양조건 하에서 3시간 동안 IPTG 로 유도한 후 수득된 배양액으로부터 OD=1에서 0.5ml에 상당하는 분량을 취한다. 이 양을 원심분리하여 상등액을 제거한다. 잔류물을 1ml의 TEA(triethanolamin) 완충액 0.05M pH 8.9에 녹인다. 이 세포 현탁액을 얼음속에서 30초 동안 2회 W10 올트라소닉 초음파기(세기 8 및 강도 4로 셋팅)로 처리한다. 추출물을 10,000g에서 10분간 원심분리하고 상등액으로 활성 측정을 한다.

플라즈미드 p466에 의해 형질전환된 대장균 K12에서 임의로 선택한 4개의 콜로니(콜리니 A₁, B₁, C₁및 D₁)와 플라즈미드 pBR 322에 의해 형질전환된 하나의 콜로니에 대해 상기 방법을 수행한다.

1) 원리

요산의 알란토인으로의 전환은 292nm에서의 O.D 감소로 알수 있다. 반응은 다음과 같다.

2) 시약

a) TEA 0.05M pH 8.9/EDTA 완충액

- 7.5g의 TEA(분석시약 - Prolabo ref. 287.46.266)를 400ml 이온수에 녹인다 :

- 0.372g의 컴플렉슨 III (Merck-ref. 8418)을 50ml의 이온수에 녹인다

(용액 1)

- 이 용액의 pH를 0.2N HCI로 8.9로 조절하고 :

- 부피를 이온수로 1000ml 로 만든다. (용액 2)

b) 요산 저장액(Uric acid stock solution).

- 100mg 의 요산(Carbiochem-ref. 6671)을 50ml의 용액 1에 녹인다 :

- pH를 0.2N HCI로 8.9로 조절하고 :

- 부피를 이온수로 100ml로 한다.

이 용액은 4℃에서 일주일간 저장이 가능하다.

c) 요산 기질 용액

- 1.5ml 의 요산 저장액(Carbiochem-ref. 6671)을 취하여 TEA 완충액(분석시약 - Prolabo ref. 287.46.266)으로 100ml이 되도록 희석한다.

이 용액은 당일에 사용되어야 한다.

(3) 방법

다음의 양을 292nm로 셋트된 스펙트로포토메타의 수정 셀에 도입하고 30℃로 조정한다 :

- 600㎕의 요산 기질 용액(30℃로 미리 가온) 및

- 20㎕의TEA pH 8.9가 첨가된 100㎕의 상기 상등액(30℃로 미리 가온).

혼합후, 5분간 매 30초마다 O,D 변화를 읽는다. 분당 O,D 변화인 ΔE는 이들 값에서 계산된다.

4) 결과

U/ml OD 1 로 표시되는 우레이트 산화효소 활성 A는 다음식의 ΔE로부터 계산된다.

식중, Vr, d, εI 및 V_PE는 각각 반응부피(0.9ml), 희석인자(2), 292nm에서 요산의 흡광계수(12.5) 및 시료부피(0.1ml)를 나타낸다.

결과를 하기 표 2에 나타낸다 :

상기 표로부터, 플라즈미드 p466에 의해 형질전환된 대장균 세포는 IPTG 존재하에서 우레이트 산화효소 활성을 나타냄을 분명히 알 수 있다.

[실시예 10]

(효모내에서의 우레이트 산화효소 cDNA를 위한 3개의 발현벡터)

제조 : 플라스미드 pEMR469, pEMR473, pEMR515

이용 전략은 이미 존재하는 쉽게 이용 가능한 플라스미드로부터 수득되는 단편과 공지의 기술에 의해 합성 제조된 단편을 이용하는 것이다. 사용한 클로닝 기술은 T. MANIATIS. E.F. FRITSCH 및 J. SAMBROOK에 의해 기술된 방법이다. (Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbon Laboratory, 1984). 올리고누클레오티드는 Biresearch 4600 DNA Synthesizer를 이용하여 합성한다.

다음 설명은 제10도, 11도 및 12도 (이들은 각각 플라스미드 pEMR414, pEMR469, pEMR473의 제한지도를 나타낸다)를 참고함으로써 보다 명확히 이해된다.

이들 그림에 사용된 기호는 다음 설명에서 자세히 설명된다. 하나의 부위가 크레나우 폴리머라아제에 의해 평활화(Blunted)되는 경우는 。 로 표시되며 ; 부위가 연결화(Ligation)에 의해 제거되는 경우는 [ ]로 표시된다.

1) 플라스미드 pEMR469의 제조

이 플라스미드는 다음 성분을 연속적으로 연결(Ligation)하여 제조된 셔틀 벡터 대장균 - 효모 pEMR414로부터 제조된다 :

-PstI-HindIII°단편 - pBR322의 암피실린 내성 유전자 Amp 의 앞쪽부분(Sutcliffe, 1979, Cold Spring Symp. Quart. Biol. 43. 779)과 사카로마이세스 세레비지애의 프로모터(LEU2d라 함), STB 부위(REP3)의 유실로 인해 부분 변형된 사카로마이세스 세레비지애의 LEU2 유전자를 갖는 내부의 2μ 단편, B형과 2μ 복제 개시점 단편(HARTLEY 및 DONELSON, 1980, Naturem 286, 860 865)으로 구성된 플라스미드 pJDB207 (BEGGS, 1978 : Gene Cloning in yeast - p. 175 203 in : Genetic Engineering, Vol. 2 - WILLIAMSON - Academic Press - London UK)중 제10도에로 표시.

-HindIII-SmaI 단편 - 효모의 프로모터 (ROSE et al., 1984, Gene, 29. p.113 124)를 가진 URA3 유전자를 포함하고 있는 효모 염색체 V 중 제10도에서로 표시. 이 HindIII-SmaI 단편은 플라스미드 pFLI(CHEVALLIER et al., 1980, Gene 11, 11 19)에서 유래한 것이다. 이 플라스미드의 HindIII 말단은 클레나우 폴리머라아제에 의해 평활화 되었다.

-SmaI-BamHI 단편 - RUSSEL 및 SIMTH (RUSSEL et al., (1983) J. Biol. Chem. 258, 1674 2682)에 의해 기술된 자연 상태의 것과, 제한 부위를 도입하기 위하여 몇 개의 염기 쌍 만이 다른 ADH2 유전자(자연상태의 서열은 약간 다른 결과에서 이용가능)의 합성형 프로모터를 포함하는, 제10도에로 표시.

이 단편의 서열은 하기와 같다 :

-BgIII-HindIII 단편 - 효모 PGK 유전자의 3' 말단을 가지며, 제10도에서로 표시. 이 단편은 단 하나의 BgIII 부위만을 가지며, HITZEMAN et al., (1982, Nucleic Acids Res., 10, 7791 7808)에 의해 기술된 PGK 유전자를 함유하는 효모의 염색체 DNA의 HindIII 단편을 BgIII로 완전 분해함으로써 수득된다. 이 분해에 의해 효모 PGK 유전자의 3' 말단을 포함하며 약 0.4kb의 작은 단편이 포함된 두 개의 HindIII-BgIII 단편의 수득이 가능하다. 이 작은 단편의 서열은 HITZEMANN el al에 의해 기술되어 있다. BgIII 부위를 앞의 단편에 클로닝하고 (BamHI 및 BgIII 부위는 따라서 없어짐), 클레나우 폴리머라아제에 의해 평활화된 HindIII 부위는 하기에 기술되는 pBR322의 PvuII-PstI 단편의 PvuII 부위에 클론시킨다.

- PvuII-PstI 단편-복제개시점과 암피실린 내성 유전자 Amp^R의 뒤쪽 부분을 포함하는 pBR322중, 제10도에서로 표시.

이러한 방법으로 제조된 플라스미드 pEMR414는 따라서, 다음의 성분을 포함한다 :

- 대장균에서 복제 및 플라스미드의 선별을 가능하게 하는 복제개시점, 암피실린 내성유전자 Amp^R. 이들 성분들은 대장균에서의 형질전환을 가능하게 한다.

- 효모 (ARS)에 대한 복제 개시점, STB 부위와 프로모터가 없는 사카로마이세스 세레비지애의 LEU2유전자 및 프로모터를 갖는 사카로마이세스 세레비리애의 URA3 유전자. 이들 성분은 사카로마이세스 세레비지애 내에서의 복제, 플라스미드의 선발과 내부 2μ플라스미드 함유 세포에서 충분한 분배 효율을 가능하게 한다.

플라스미드 pEMR414를 제한효소 NheI 및 ClaI 으로 완전히 분해한다. URA3 유전자를 포함하는 작은 NheI-ClaI 단편(이후 단편 A라 한다)을 정제한다.

플라스미드 pEMR414를 완전히 NheI 및 BamHI 효소로 분해한다. 특히 LUE2d 유전자 및 플라스미드 pBR322의 복제 개시점을 함유하는 큰 NheI-BamHI 단편(이후 단편 B라 한다)을 정제한다.

우레이트 산화효소 cDNA 서열(클론 9C)로부터 추정된 단백질을 암호화하는 유전자의 개시를 포함한 합성 ClaI-AccI 단편도 제조된다. 이 단편은 클론 9C 에 대해 상대적 변형, 즉 아미노산에 변화없이 효모 내에서 일반적인 코돈의 삽입 (SHARP et al., 1986, Nucl. Ac. Res., Vol 14, 13, pp. 5125 5143)목적으로 도입되는 변형(Modification)을 포함한다. 이 단편(이후 단편 C 라 한다)의 서열은 다음과 같다(밑줄의 염기는 클론 9C에 대한 변형된 염기이다) :

클론 9C의 플라스미드(참조, 제3도)를 효소 AccI 및 BamHI 으로 분해한다. 우레이트 산화효소 cDNA의 말단을 포함하는 AccI-BamHI 단편(이후 단편 D라한다)을 정제한다. 이 단편은 다음의 서열을 갖는다 :

단편 A, B, C 및 D를 연결하여 플라스미드 pMER469 (제11도)를 얻는다.

여기서 기호는 제10도 에서와 동일한 의미를 가지며, 새로운 ClaI-AccI 및 AccI-BamHi 단편은로 표시한다.

2) 플라스미드 pEMR473의 제조

플라스미드 pEMR469를 완전히 MluI 및 SphI 으로 분해한다. 이후, 우레이트 산화효소 유전자를 포함하는 긴 MluI-SphI 단편을 서열이 하기와 같으며, 사카로마이세스 세레비지애의 프로모터 GAL7의 TATA 성분으로 부터의 앞쪽서열 부분(200 bp)에 상당하고, 상기 부분이 상류 활성 서열(upstream activation sequences, UAS)을 구성하는 합성단편에 연결한다.

이러한 방법으로 수득한 플라스미드 pEMR473을 제12도에 나타내며, 여기서, 기호는 제11도 에서와 동일한 의미를 나타내고, 새로운 MluI-SphI 단편은로 표시한다.

3) 플라스미드 pEMR515의 제조

플라스미드 pEMR473을 Xbal으로 부분 소화시키고 MluI 으로 완전 분해한다. 큰 XbaI-MluI 단편을 정제한다. 이 단편은 특히 복제 개시점의 서열, 2μ단편의 STB 부위, LEU2d 유전자, 암피실린 내성 유전자 Amp^R, 우레이트 산화효소에 대한 pBR322의 복제개시점 및 발현 카세트를 포함한다. 반면에, 이것은 URA3 유전자와 XbaI 및 NheI 부위 사이에 있는 2μ 단편의 부분을 포함하지 않는다.

큰 XbaI-MluI 단편은 MluI 및 변형된 XbaI 접착성 말단을 갖는 다음 서열의 어댑타에 의해 재 원형화 된다 :

이러한 방법으로 수득된 플라스미드 pEMR515는 2μ 단편의 FLP 유전자에 의해 코드되는 리콤비나아제의 목적 FRT 부위의 세 성분 중 하나 만을 갖느다.

플라스미드 pEMR469, pEMR473 및 pEMR515는 우레이트 산화효소를 암호화하는 유전자를 가지며, 이것의 서열은 다음과 같다 :

[실시예 11]

(플라스미드 pEMR469, pEMR473 및 pEMR515에 의한 EMY761 효모 주의 형질 전환 - 플라스미드 pEMR515에 의한 EMY500 및 GRF18 효모주의 형질전환 - 우라실 프로토트로프 또는 루신 프로토트로프의 선택성을 갖는 형질전환)

세 개의 비동종 사카로마이세스 세레비지애 세포를 수용세포로 사용한다 :

- EMY761 세포 (Matα, leu2, ura3, his3, gal)

- EMY500 세포 (Matα, leu2, ura3, pep4)

- GRF18 세포(Matα, leu2, his3)

GRF18 세포는 당해 업계에서 잘 알려진 것이다 (Gerry FINK, MIT, USA). EMY761 및 EMY500 세포는 GRF18 세포와 관련된다. 이들은 연속적으로 GRF18 세포를 FL100 세포(번호 28 383 으로 ATCC에 기탁)과 교잡하고, E.W. JONES(E.W.JONES et al. (1977) Genetics, 85, 23)에 의해 기술된 20B12 세포(Matα, tspl, pep4)와 교접하여 얻는다.

GRF18 세포는 1989. 12도. 28일 참조번호 1-920 으로 CNCM에 기탁된 GR18 pEMR515 (leu⁺) 세포의 플라스미드 pEMR515를 교정함으로써 얻을 수 있고, EMY500 세포는, 1989. 12. 18 일 참조번호 I-919로 CNCM에 기탁된 EMY500 pEMR515(leu⁺)세포의 플라스미드 pEMR515를 교정하여 얻을 수 있다.

이들 세포는 플라스미드 pEMR469 및 pEMR473 각각에 존재하는 LEU2d 결핍 선택 표지 및 URA3 선택 표지에 의해 상보될 수 있는 돌연변이 (leu2 및 ura3)를 포함한다.

1) 우라실 프로토틀고프에 대한 선택을 갖는 형질전환

EMY761 세포의 콜로니를 이용하여 액체 YPG 배지라고 하는 100ml의 배지에 접종한다(참조, 하기 표III). 세포의 밀도가 10⁷cells/ml 일 때, 당해 업계에서 공지이며, ITO et al., 1983, J. Bacteriology 153, 163 168)에 의해 기술된 방법에 따라 형질전환을 하기 위하여 이 세포를 리튬아세테이트 0.2M로 처리한다.

EMY761 세포를 똑같이 플라스미드 pEMR469 및 pEMR473 각각 약 1㎍으로 형질전환시킨다. 이 형질전환된 세포는 무라실(uracil-free) 고체 배지(참조, 하기 표 3) 상에서 우라실 영양 요구성 성질(ura⁺)로 선별된다. 따라서, EMY761 pEMR469 (ura⁺)로 형질전환된 세포와 EMY761 pEMR473(ura⁺)로 형질전환된 세포가 얻어진다.

2) 루신 프로토트로프에 대한 선택을 갖는 형질전환

사용한 형질전환 기술은 Beggs et al. (1978) Nature, 275, 104 109)에 의해 기술된 것을 변형한 방법이다. 이것은 삼투압 안정화제 즉, 1M의 소르비톨 존재하에서 효모를 프로토플라스트 처리 하는 것으로 구성된다.

상세한 형질전환 방법은 하기와 같다 :

a) 200ml의액체 YPG 배지(참조. 표 3)를 정상기 (Stationary phase)에 있는 약 5 x 10⁶세포로 접종하고,이와 같이 접종된 배양액을 30℃에서, 밤새 교반한다.

b) 배양 세포의 밀도가 약 10⁷cell/ml 일때, 세로플 4000rpm으로 5분간 원심분리하고 잔류물을 1M 소르비톨로 세정한다.

c) 이 세포를 25mM EDTA 및 50mM 디티오트레이톨을 함유하는 소르비톨 1M 용액 5ml에 현탁시키고, 30℃에서 10분간 방치한다.

d) 이 세포를 1회 10ml의 1M 소르비톨로 세정하고 20ml 의 소르비톨에 현탁시킨다. 지모라아제 - 100T (아르토박터루테우스 (Arthobacter luteus) 배양 상등액을 친화 칼럼으로 부분 정제하여 얻어지며, β-1,3-글루칸 라미나리펜타히드로라아제를 포함하는 제제, 세이카가꾸고오교사 시판)를 첨가하여 최종 농도가 20㎍/ml 이 되도록 하고, 이 현탁액을 실온에서 약 15 분간 방치한다.

e) 이 세포를 소르비톨을 함유한 20ml의 배지(소르비톨 YPG 배지라 한다. 참고, 하기 표 3)에 재현탁시킨 후, 가볍게 교반하면서 30℃에서 20분간 방치한다.

f) 이 세포를 2500rpm에서 3분간 원심분리한다.

g) 이 세포를 9ml 의 형질전환 완충액(소르비톨 1M, Tris-HCl 10mM pH 7.5 및 CaCl₂10mM) 에 재현탁시킨다.

h) 0.1ml의 세포와 5㎕의 DNA 용액(약 5㎍)을 가하고, 수득된 이 현탁액을 실온에서 10 15 분간 방치한다.

i) 1ml의 다음 용액을 가한다 : 폴리에틸렌글리콜 PEG4000 20%, Tris-HCl 10mM pH 7.5 및 CaCl₂10mM.

j) I)에서 수득한 0.1ml의 현탁액을,미리 녹여 약 45℃에서 액체 상태인 무루신 고체 재생배지를 (참조. 하기 표 3) 함유한 튜브에 넣는다. 이 현탁액을 15ml의 무루신 고체 재생 배지가 고형화 된 층을 갖고 있는 페트리 디쉬에 넣는다.

k) 단계 j)를 h)에서 수득된 세포 현탁액의 나머지에 대해서 반복한다.

3일후 형질 전환 세포들이 나타나기 시작한다.

따라서 EMY761 pEMR469(leu⁺), EMY761 pEMR473 (leu⁺), EMY761 pEMR (leu⁺), GRF 18 pEMR515 (leu⁺)및 EMY500 pEMR515(leu⁺)로 형질전환된 세포들이 얻어진다.

[실시예 12]

(엘렌메이어 플라스크에서, EMY761 pEMR469 (ura ), EMY761 pEMR473 (ura ), EMY761 pEMR469 (leu ) 및 EMY761 pEMR473 (leu ) 세포에 의한 우레이트 산화효소 cDNA 의 발현 - 웨스턴 블롯에 의한 면역 검출법 - 우레이트 산화효소 활성으로 평가(Assay) 및 용해서 단백질)

1) 우레이트 산화효소 cDNA 의 발현

a) 무라실 배지(Uracil-free medium)에서 선별된 세포

EMY761 pEMR469 (ura ) 및 EMY 761 pEMR473(ura ) 세포 각각의 콜로니를 20ml 의 무라실 액체 배지 (참조, 실시예 11의 표 3)에서 배양한다. 30℃에서 하룻밤 교반후, 두 배양액을 7000rpm에서 10분간 원심분리한다. 잔류물을 10ml의 멸균 이온수에 취하고 다시 7000rpm에서 10분 원심분리한다. 우레이트 산화효소의 발현은, EMY760 pEMR469 (ura ) 세포의 경우는 20ml의 에탄올-글리세롤-YP배지(참조. 실시예 11의 표 3)에, EMY761 pEMR473(ura )세포의 경우는 20ml의 에탄올 - 글리세롤- YP 배지(참조, 실시예 11의 표 3) 에 취함으로써 유도된다. 이 배양액을 다시 30℃에서 22시간 교반하에 둔다.

b) 무루신 배지에서 선별된 세포

첫 단계에서, EMY469 (leu ) 및 EMY761 pEMR473(leu ) 세포 각각의 콜로니를 20ml의 무루신 액체배지(참조. 실시예 11의 표 3)에서 배양한다.

이렇게 하여 플라스미드 pEMR469 및 pEMR473에 의해 운반된 Leu2d 유전자에 의한 leu2 돌연변이의 상보성에 대한 선별을 수행함으로써 많은 수의 플라스미드 복제물을 수득하고 유지하는 것이 가능하다. 30℃에서 하룻밤 교반후, 두 배양액을 7000rpm에서 10분 원심분리한다. 잔류물을 10ml의 멸균 이온수에 취하고 다시 7000rpm에서 10분 원심분리한다. 우레이트 산화효소의 발현은, EMY761 pEMR469 (ura ) 세포의 경우는 이 세포를 20ml의 에탄올-글리세롤-YP 배지 (참조. 실시예 11의 표 3)에, EMY761 pEMR473 (ura )세포의 경우는 20ml 의 에탄올-글리세폴-갈락토오즈 YP배지 (참조, 실시예 11의 표 3)에 취함으로써 유도된다. 이 배양액을 다시 30℃에서 22시간 교반하에 두낟.

c) 대조 세포주(Control Strain)

비형질 전환 EMY761 세포, 즉 플라스미드가 없는 EMY761 세포를 상기와 같이 배양한다. 이것을 한편으로 10ml의 에탄올-글리세롤-액체 YP 배지에서 유도시키며, 또 다른 한편으로 10ml의 에탄올-글리세롤-갈락토오즈 YP 배지에서 유도시킨다.

2) 시료의 제조

a) 1a), 1b) 및 1c)에서 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 제거한다. 잔류물을 10ml 의 이온수에 취하고 7000rpm에서 10분 원심분리한다. 이와 같이 세정한 잔류물을 약 1ml 의 트리에틸렌 아민 완충액 (TEA, pH 8.9)에 취한다. 약 30㎕의 상기 완충액 세포를 직경 400 500㎛의 글라스 비이드 존재하에서(최종 부피의 약 반을 나타냄)분쇄시킨다. 이 혼합물을 격렬하게 보르텍스(Vortex)에서 1분간 4회 교반시킨다(시료를 분쇄하는 사이에 30초 동안 얼음에 놓아둔다). 액체를 파스테르 피펫으로 튜브로부터 빼내어 마이크로 튜브를 옮긴다. 글라스 비이드는 1회 약 200㎕의 TEA 완충액 pH 8.9로 세정한다. 이 비이드를 보르텍스에서 1회 1분간 교반하고 이 액을 파스테르 피펫으로 빼내어 상기 분쇄물 (lyzate)에 가한다. 이후, 이 분쇄물을 마이크로 튜브에서 7000rpm에서 5분간 원심분리한다. 상등액을 조심스럽게 빼내어 웨스턴 블롯, 우레이트산화효소 활성 및 단백질의 평가를 우해 -20℃에 보관한다. 분쇄된 세포잔류물을 개별적으로 웨스턴 블롯(참조. 3) 하기)을 위해 -20℃에 보관한다.

또한, 1a) 및 1b)에서 제조된 배양 시료는 유도에 앞서 다음과 같은 식으로 처리한다 : 2ml의 배양액을 7000rpm에서 10분 원심분리한다. 잔류물을 500㎕의 이온수에 취하고, 다시 7000rpm에서 10분 원심분리한다. 잔류물을 약 200㎕의 pH 8.9의 TEA 완충액에 취하고, 상기와 같이 글라스 비이드 존재하에 분쇄한다. 이 분쇄된 세포의 상등액과 잔류물을 각각 -20℃에 보관한다.

3) 웨스턴 블롯에 의한 우레이트 산화효소의 면역 검출법

a) 방 법

여러다른 시료의 잔류물 및 상등액을, 당해 업게에서 공지의 기술이며, 다음의 단계로 구성되는 웨스턴 블롯을 한다 :

- Tris-HCl 0.125M pH 6.8, SDS 4%, 브로모패놀 블루 0.002%, 글리세롤 20%, β-메르캅토에탄올 10% 로 구성된 로-딩 완충액이라 하는 완충액에서 10분간 끓여 잔류물을 용해시킴 (LAEMMLI (U. K. LAEMMLI, Nature, 227. (1970) 680 685)에 의해 기술된 방법에 따름) :

- LAEMMLI (U. K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970) 680 685)이 방법에 따라 이 용해물에 포함된 여러 단백질을 전기영동으로 분리 : 하고

- 겔 상의 상기 단백질을 니트로셀루로오즈 필터로 옮김 (H. TOWBIN et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 76 (1979)4350 4354의 기술에 따름).

BURNETTE (W.W. BURNETTE Ana. Biochem. 112 (1981) 195 203)의 방법에 따라 수행한 면역검출법은 다음의 일련의 과정이 포함된다 :

. 이 니트로셀룰로오즈 필터를 10분 완충액 A(Tris-HCl 10mM, NaCl 170mM, KCl 1mM)로 세정 :

. 니트로셀룰로오즈 필터를 완충액 B(완충액 A에 bocine serum albumin 이 3g/100ml 속도로 첨가된 것)와 37℃에서 30분 접촉 :

. 니트로셀루로오즈 필터를 면역 혈청(아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소를 인식하는 폴리클로날 항체)에 37℃에서 1시간 접촉 :

. 이 니트로셀룰로오즈 필터를 완충액 B로 세정 :

. 이 니트로샐룰오오즈 필터를 단백질 G(0.1μci/ml 속도로 요오드 125로 표식)와 37℃에서 1시간 접촉 :

. 이 필터를 완충액 A로 세정 :

. 이 필터를 두장의 흡수 쉬이트 사이에서 건조 :

. 이 필터를 X-ray 필름과 접촉시키고 :

이필름을 현상.

b) 결과

EMY761 pEMR496(ura ), EMY761 pEMR473(ura ), EMY761 pEMR469 (leu ) 및 EMY761 pEMR473 (leu ) 세포는 아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소에대한 항체에 의해 인식되며, 대조 세포에는 없는 겉보기 분자량 약 33 kDa 의 단백질을 생산함를 확인하였다.

또한, 비유도화된 세포는 상기 단백질을 완전히 생산하지 못하거나 또는 극히 약간 생산함도 확인되었다.

잔류물과 상등액에 대한 이 단백질의 양을 비교함으로써 약 80%의 상기 단백질이 이 분쇄물 내에서 용해성 형태로 존재함을 추정할 수 있다.

4) 우레이트 산화효소 활성의 평가

우레이트 산화효소 활성을 상기 실시예 9 에 따라 분쇄 세포의 상등액에 대해 측정한다.

수득된 결과를 하기 표 4에 정리한다(글리세롤 - 에탄올에 의해 유도된 각 세포, 글리세롤 -에탄올-갈락토오즈에 의해 유도된 각 세포, 및 비 유도된 각 세포에 대한 우레이트 산화효소 활성을 U/ml로 나타낸다).

상기 표로부터 분명히 이들 플라스미드 pEMR469 및 pEMR473 에 의해 형질 전환된 효모 세포는 유도 후, 우레이트 산화효소를 생성함을 알 수 있다.

5) 분쇄물 내의 총 용해성 단백질의 평가 (Assay)

BIORAD 사의 단백질 assay kit를 이용하여 분쇄된 세포의 상등액에 존재하는 총 단백질의 양을 결정한다. 이것은 단백질이 쿠마씨 블릴리언트 블루 g-250에 결합될 때, 쿠마씨 브릴리언트 블루 g-250 의 산 용액의 최대 흡수는 465nm로부터 595nm로 변한다는 사실에 기초한다. (Reisner et al., Anal. Biochem., 64, 509 (1975)).

a) 방법

다음의 부피를 595nm로 세트시킨 스펙트로포토메타의 셀에 넣는다 :

- 790㎕의 이온수가 가하여진 시료 10㎕.

- 200㎕의 농축 염료시약 (Biorad).

이 성분을 혼합하고 595nm에서의 광학밀도 값을 읽는다. 이와 같은 방법으로 BSA(bovine servum albumin)의 농도를 증기사키면서 표준곡선을 만든다. 수득된 상기 표준곡선으로부터 분쇄물 내에 있는 미지의 단백질 총량을 읽어낸다.

b) 결과

수득한 주요 결과를 하기 표 5에 나타낸다(용해성 단백질의 총량 mg/ml)과, 글리세롤-에탄올, 글리세롤-에탄올-갈락토오즈에 의해 유도된 각각의 세포 및 비 유도된 세포 (재조합 단백질의 비활성은 아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소와 동일함을 가정 : 30U/mg)의 경우에 총 용해성 단백질에 대한 우레이트 산화효소의 %를 나타낸다.

우레이트 산화효소의 생성속도는 형질 전환 세포와 형질 전환 세포(leu )의 선별 양식에 따라 5 20%로 변화됨을 알 수 있다.

[실시예 13]

(2.5ℓ 발효조에서, EMY761 pEMR473(ura )세포에 의한 우레이트 산화효소 cDNA의 발현)

1) 발효 방법

a) 배지

접종 배지

EMY761 pEMR473(ura )세포 콜로니를 200ml 의 무라실 액체 비지(참조, 실시예 11의 표 3)에서 배양한다. 광학밀도가 약 3이 될 때까지 배양을 교반하에 계속한다.

b) 발효인자

두 개의 터어빈이 장치된 총용량 2.5ℓ의 생물 반응기

온도 : 30℃

pH : 5

산소부분압 : 30mmHg

공기 유속 : 1ℓ/min

이 생물 반응기를 1.5ℓ의 배지 A로 채우고 150ml의 접종배지로 접종한다.

일단 글루코스가 OD 2.5로부터 약 OD 17에서 소모되면 갈락토오즈 용액 150ml(20%, w/v)을 가하여 효과적으로 유도를 일으킬 수 있다. 성장을 계속 진행시킨 후 OD 약 30에서 배지 B를 첨가한다. 또다시 약 15시간 성장을 계속시킨 후, OD 104에서 생성물을 수득한다.

2) 시료의 제조 및 분석

시료는 발효조 배양액으로부터 실시예 9 2) a) 에 따라 제된다.

두 개의 시료를 취한다 : 첫째는 유도 7시간 후, 두 번째는 유도 22시간 후, 실시예 9에 설명된 다음 테스트를 세포 분쇄후 수득된 두 분쇄물에 대해 수행한다 :

- 웨스턴 블롯에 의한 면역 검출법.

- 생물학적 활성 평가

- 단백질 총량

다음의 결과를 수득하였다 :

a) 웨스턴 블롯에 의한 면역 검출법

2ℓ발효조에서 배양된 EMY761 pEMR473(ura⁺) 세포는 아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소에 대한 항체(당해 업계에서 공지인 기술에 의해 토끼에서 상기 항체 제조 : VAITUKAITTIS et al. (1981) Methods in Enzymology, Academic Press, New York, Vol. 73, p.46)에 의해 인식되며, 대조 세포에는 없는 겉보기 분자량 약 33kDa의 단백질을 생산함을 확인하였다.

b) 생물학적 활성 평가

수득된 결과를 표 6에 정리하였다 :

발효조에서 배양된 EMY761 pEMR473(ura )세포는 유도후, 산화효소 활성을 나타냄을 알 수 있다.

c) 용해성 단백질 총량

결과를 하기 표 7에 정리한다.

이들 결과는, 발효조에서 배양된 EMY761 pEMR473(ura )세포에 의한 우레이트 산화효소의 합성 속도는 7시간과 22시간 유도후 세포 총 단백질의액 5%임을 뜻하는 것이다.

[실시예 14]

(에를렌마이어 플라스크에서 EMY761 pEMR515(leu ), EMY500 pEMR515(leu ) 및 GRF18 pEMR515(leu ) 세포에 의한 우레이트 산화효소 cDNA 의 발현)

상기 세 종류의 세포 각각의 콜로니를 20ml의 무루신 액체 배지에서 배양한다. 30℃에서 교반하에 하룻밤 지난 후, 이 세 배양액을 7000rpm에서 10분 원심분리한다. 세포 잔류물을 10ml의 멸균 이온수에 취하고 다시 10분 원심분리한다. 우레이트 산화효소의 발현은 이 세포를 20ml의 에탄올-글리세롤-갈락토오즈 YP 배지(참조 표 1, 실시예 8)에 취함으로써 유도된다. 이 배양액을 다시 30℃에서 교반하에 20시간 배양하낟. 비형질전환 호스트 세포는 대조 세포로 각각 배양한다.

여섯 배양액 각각의 세포를 다시 원심분리로 분리하여 상등액을 제거한다. 잔류물을 10ml의 이온수에 취한 후 7000rpm에서 10분 원심분리한다. 이와같이 세정한 잔류물을 약 1ml의 TEA 완충액 pH 8.9에 넣고, 실시예 9, 2)에서와 같이 분쇄 및 원심분리에 의한 입자의 제거과정을 수행한다. 각 배양액의 상등액은 앞에서와 같이, 우레이트 산화효소 및 총 단백질의 결정에 사용된다. 수득된 주요 결과를 하기 표 8에 정리한다 :

a): 세포를 글루코스 존재하에서 배양(비유도 조건)

b): 세포를 글루코스는 없고, 갈락토오즈가 있는 조건에서 배양(유도조건)

이들 결과로부터 우레이트 산화효소의 높은 정도의 발현은, 본 발명에 따르는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 세 비동종 수용체 세포(nonisogenic recipient strains)를 가지고 수득됨을 알 수 있다.

[실시예 15]

(2.5ℓ 발효조에서, EMY500 pEMR515 세포에 의한 우레이트 산화효소 cDNA의 발현, 재조함 우레이트 산화효소의 정제 및 일부 제 성질 :)

1) 2.5ℓ발효조에서 EMY500 pEMR515세포의 배양 :

EMY500 pEMR515 세포 배양은 다음과 같이 수행한다 :

a) 에를렌마이어 플라스크에서 예비배양 단계

1.28g의 MES(2-/N-모르포리노-에탄술폰산 : 시그마 No M8250)과 10ml의 성장배지 MCPF(한회여과 멸균)가 첨가된 90ml의 성장에서 성장 배지 MCPA, (오토 클래이브로 멸균)를 포함하는 500ml 에를렌마이어에 20% 글리세폴을 포함하는 배지에 광학밀도 2.35에 상당하는 세포수를 갖는 EMY500 pEMR515 세포현탁액 1ml를 접종한다. 배지 MCPA 및 MCPF 의 조성은 다음에 주어진다. 30℃, 교반하에 24시간 배양 후 배양액의 광학밀도는 약 7이된다.

b) 발효조에서의 배양 단계

상기 발효액은 다음 조성을 갖는 배양 배지를 포함한 2.5ℓ발효조를 접종할 때 사용된다 :

900ml MCPA

+200ml MCPF

배양액의 pH는 발효조에 의해 주어진 값 5.5로 조절된다. 30℃에서 67시간 배양 후, 72ml의 500g/ℓ 글루코스 용액을 9시간에 걸쳐 일정하게 가한다. (즉, 글루코스 총량은 36g)

c) 발현 단계

상기 혼합물에 대하여, 100ml 발현 배지 MEPA(오토클레이브로멸균) 및 다음의 조성을 갖는 150ml의 발현 배지 MEPFI(한외여과 멸균)를 첨가한다. 이후 배양을 5시간 계속한다. 그리고, 30g의 갈락토오즈, 15g의 글리셀롤 및 36g의 에탄올을 포함하는 용액 150ml을 20시간에 걸쳐 일정하게 가한다. 약 160의 OD 값이 얻어진다.

성장 및 발현 배지의 화학 조성

이 용액에 100ml에 농축 HCl을 가하여 1000ml로 한다.

가열하에 녹이고, 주위온도로 한후, 비타민 1을 가지고 0.2㎛필터로 여과,

녹인 후 100ml로 채운다

냉온에서 0.2㎛ 필터로 멸균

농축 H₂SO₄또는 농축 KOH 로 pH 5.5로 조절. 120℃에서 20분 멸균.

가열하여 녹이고, 주위온도로 한 후, 비타밀 1을 가하고 여과.

2) 세포의 분쇄

20시간의 유도화 후, 600nm에서 측정한 배양액의 광학밀도는 98이다. 800g의 발효액을 10,000g에서 5분 원심분리한 후, 세포 케이크를 80ml의 용균 완충액(글리신 20mM pH 8.5)에 현탁시킨다. 그리고 나서 세포를 4℃에서 2.5분간 2회 분쇄장치(Vibrogenic Zellmuhle mill VI 4)로 분해될 세포 현탁액 부피와 같은 부피의 비이드(직경 0.50mm)와 함께 분쇄한다. 분쇄후, 상등액을 취하고, 비이드는 2회 80ml의 용균 완충액으로 세척한다.

210ml의 분쇄물이 회수된다 : 상기 분쇄물은 약 3mg/ml의 총 단백질 양과 약 7.7U/ml의우레이트 산화효소 화성을 나타낸다. (즉, 이 단백질의 비활성이 30μ/mg 임을 고려하면, 총 단백질에 대한 우레이트 산화효소 %는 약 8.5%이다.)

3) 재조합 우레이트 산화효소의 정제

a)정제방법

상기 분쇄물을 이후 설명될 2단계 정제 방법에 따라 정제한다.

단계 1

음이온 크로마토그래피

지지체(Support) :

DEAE(diethylaminosulphate) sepharose fast flow (Pharmacia 참조. 17,07,09,91)이 압축겔은 70ml의 부피를 차지한다.

분리는 주위온도에서 수행하며, 회수된 분획은 0℃에 보관한다.

분리조건 : 완충액 1 (소둡보레이트 10mM, pH 9.2) 및 완충액 2 (소듐 보레이트 10mM, NaCl 1M)사이의 염소 이온력의 구배를 사용한다. 이 완충액을 미리 가스제거하고 용출동안 0℃에 보관한다. 각 완충액에 0.02% 아자이드를 첨가한다. 원료 추출물을 넣고(10ml) 완충액 1로 칼럼에 결합되어 있지 않은 우레이트 산화효소를 완전히 회수(10ml 분획)한다.

색소 및 오염 단백질은 완충액 2로 용출하여 제거시킨다.

정제 후 214nm에서 용출액의 광학밀도를 측정한다.

단계 2

HPLC 및 역상 HPLC

지지체 :

접합 C8 실리카 칼럼, Aquapore OD-300(100 x 2.1 mm)(Brownlee-Applied Biosystems)

운전조건 :

용출액 1 : 0.1% 트리플루오로 아세트산을 함유한 초 정제수(Millipore system 으로 여과)

용출액 2 : 0.08% 트리플루오로 아세트산을 함유한 아세토니트릴(스펙트로포토메타에 이용될 만한 품질 또는 이와 비슷한 품질).

유속 : 0.3ml/min

농도 구배는 20분 동안 35% 아세토니트릴 /TFA 70% 아세토니트릴/TFA이며, 5분 동안 70%로 유지된다.

분획의 회수 :

분리후 218nm에서 광학밀도를 측정한다. 아세토니트릴을 진공하에 원심분리 하여 증류시킨다.

b) 결과

일단계 정제 전후의 시료를 동일 농도 구배로 앞서 설명된 Aguapore OD-300, 즉 그라프트 C8실리카 칼럼 위에서 액체 크로마토그래피로 분석한다(투입량 50μ1). 출발분쇄물에서, 우레이트 산화효소는 총 단백질의 63%를 나타낸다. 일단계 정제후, 이 우레이트 산화효소는 총 단백질의 84%를 나타낸다. 단계 2 이후 수득된 시료 전체는 다음의 부분적 제반 성질 결정에 이용된다. 상기 시료는 확실히 84% 이상의 우레이트 산화효소를 포함한다.

4) 재조합 우레이트 산화효소의 부분적 재 성질

a) 아미노산의 분석

정제된 재조합 우레이트 산화효소의 산 가수분해물의 아미노산 분석은 Applied Biosystems model 420-130A 분석기를 사용한다. 정량화된 아미노산의 재구성은 예상된 서열과 일치한다. (큰 차이가 없음). 아스페르길루스 플라부스 추출물로부터 정제된 우레이트 산화효소(실시예 4에서 수득된)경우에도 동일한 결과가 관찰된다.

b) 트립신 처리 펩티드 지도

트립신 처리 펩티드 지도를 정제된 재조합 우레이트 산화효소와 실시예 4에서 수득된 추출물에서 정제한 우레이트 산화효소에 의해 다음 조건에서 만든다 : 농도가 1mg/ml 인 우레이트 산화효소 용액을 제조한다. 바로 농도 1mg/ml인 트립신 용액을 제조한다.

이 두 용액을 1/30의 효소/기질 비로 8시간 주위 온도에서 함께 혼합한다. 그리고 나서, 이 트립신 가수분해물을 기록기와 연결된 UV 검출기가 장치되어 있는 C 18 접합 실리카 칼럼(5μm : lichrosorb 250 x 4.6mm Hichrom-red. RP 18-5-250A)상에서 크로마토그래피(액체상 크로마토그래피)한다. 사용된 농도구배는 120분동안 1% 아세토니트릴 /TFA 60% 아세토니트릴/TEA이며, 이후는 5분간 60%로 유지한다. 수득된 펩티드 지도는 매우 좁은 양상을 갖는다.

5) 아미노 말단 서열의 보호기 특성의 결정

아미노 말단 서열은 페닐티오히단토인 유도체 분석기(Applied Biosystems model 120A)와 연결된 서열 분석기(Applied Biosystems model 470A)로 분석한다.

정제된 재조합 우레이트 산화효소(아미노산 분석에 의해 확인된 200pmoles)를 20pmole의 β-락토글로블린(대조 단백질, control protein)존재하에서 서열 분석기에 넣는다.

이 우레이트 산화효소의 서열에 해당하는 어떠한 아미노 말단 서열도 검출되지 않은 반면, 대조 단백질의 아미노 말단 서열을 검출되었다.

따라서, 본 발명의 재조합 우레이트 산화효소와 우레이트 산화효소 추출물은 아미노 말단이 보호되어 있다.

[실시예 16]

(동물세포에서 우레이트 산화효소 cDNA를 위한 발현벡터의 제조 : 플라즈미드 pSV860)

이 벡터는 다음과 같이 제조된다 :

- 첫 부분의 16개 아미노산이 예외인 우레이트 산호효소를 암호화하는 서열을 포함한 작은 AccI-SnaBi 단편-이 단편은 플라스미드 p466(대장균에서 아스페르길루스 플라부스에 대한 발현벡터로 이 실험 및 하기에서 이용됨)에서 유래-과 합성 HindIII-AccI 단편(아스페르길루스 플라부스 우레이트 산화효소를 암호화하는 완전서열을 포함한 HindIII-SnaBI 단편과 동물세포에서 발현을 촉진하는 비번역 5' 서열의 수득을 가능하게 한다.)을 연결: 하고

-HindIII-SnaBI 단편을 동물세포를 위한 발현벡터 즉 플라스미드 pSE₁의 다중클로닝 부위(폴리링커라고도 함)의 HindIII 및 SnaBI 부위 사이에 삽입한다.

다음은 플라스미드 p466, 플라스미드 pSE₁및 플라스미드 pSV860의 제조에 관해 게속 설명한다.

1) 플라스미드 p466의 제조

대장균에서 우레이트 산화효소 cDNA를 위한 발현벡터인 플라스미드 p466을 제조한다. 이것은 복제개시점과 암피실린 내성 유전자를 포함한 pBR327의 단편으로 CHAMBERLIN, Promoters-Structure and frnction(1982). Preager), 독특한 NdeI 및 KpnI 부위를 포함한 폴리링커에 이어진 Shine-Dalgarno (SD) 서열, 파아지 fd 유래의 전사종결인자, 및 lac i 유전자로 구성된다.

이플라스미드는 대장균에서 hGH에 대한 발현벡터(p462)로부터, hGH 유전자를 포함한 단편을 우레이트 산화효소 cDNA로 치환함으로써 제조된다.

플라스미드 p466의 제조는 상기 실시예 7에 상세히 설명되었다.

2) 동물세포에 대한 발현벡터의 제조 : 플라스미드 pSE₁

사용전략은 일반적으로 널리 이용되는 이미 존재하는 플라스미드로부터 얻은 단편과 공지 기술로 합성 제조된 단편을 사용하는 것이다. 사용한 클로닝 기술은 T. MANIATIS, E.F. FRITSCH 및 J. SAMBROOK의 molecular Cloning, a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory (1982))에 기술된 방법이다. 올리고누클레오티드는 Biosearch 4600 DNA Synthesizer를 이용하여 합성한다.

다음의 설명은 제13도 (플라스미드 pSE₁의 제한지도 및 괄호로 표시된 연결화에 의해 소멸된 부위를 보여준다.)을 참고하면 더 명확히 이해된다.

이 그림에 사용된 기호는 하기에서 설명된다.

이 플라스미드는 다음 성분을 연속적으로 연결하여 제조된다 :

1) -PvuII-PvuII 단편-플라스미드 pTZ18R (Pharmacia)을 제한효소 PvuII로 완전 분해하여 수득된 2525bp 중 제13도에서로 표시된 부분. 이 단편은 파아지 F1의 복제개시점(제13도에서 ORI F1으로 표시), 암피실린 내성을 갖는 유전자(제13도에서 Amp^R로 표시) 및 대장균에서 이 플라스미드의 복제를 가능하게 하여주는 복제개시점(제 13도에서 ORI pBR322로 표시)을 포함한다. 첫 번째 PvuII 평활부위(blunt site)는 7)에 기술된 단편의 EcoRV 평활부위(역시 소멸)와의 연결로 소멸한다.

2) -PvuII-HpaI 단편 VA-II RNA 에 대한 정보를 포함하는 위치 11299(PvuII 제한부위)와 위치 10239(Hpa 제한부위) (DEKKER VAN ORMONDT, Gene 27, 1984, 115-120)사이에 있는 타이프 5 아데노비루스 DNA의 1060bp중, 제13도에서로 표시된 부분. HpaI 평활부위는 3)에 기술된 단편의 PvuII 평활부위(역시 소멸)와의 연결로 소멸된다.

3) -PvuII-HindIII 단편-SV40 비루스 DNA 로부터 유도되고, 제한효소 PvuII 및 HindIII 에 의해 완전분해되어 수득되는 344bp 중, 제13도에서로 표시된 부분. 이 단편은 복제개시점과 SV40 비루스 DNA 의 초기 프로모터를 포함한다(참조. B.J. BYRNE et al., PNAS-USA (1983) 80, 721-725).

HindIII 부위는 4)에 기술된 단편의 HindIII에 결합하는 부위와의 연결로 소멸된다.

4) -합성된 HindIII 에 결합하는 부위-HindIII 단편-

하기의 서열이 HTLVI 비루스의 비번역 5' 서열과 유사한 419bp중, 제13도에서로 표시된 부분. (참조. WEISS et al., Molecular Biology of Tumor Viruses-part 2-2nd edition-1985-Cold Spring Harbor Laboratory-p. 1057).

5) - 합성 HindIII- BamHI 에 결합하는 부위 단편-

파아지 T7의 RNA 폴리머라아제의 프로모터와 또한 SmaI/ 클로닝 부위를 갖는 폴리링커를 포함하는, 제13도에서로 표시된 부분.

6) - 240bp의 BamHI-BcII 단편 SV40비루스를 효소 BCII 와 BamHI 으로 완전분해하여 수득되는 작은 단편이며, 상기 비루스(M. FITZGERALD et al., Cell, 24, 1981, 251-260)의 후기 폴리아데닐레이션 부위를 포함하는, 제13도에서로 나타나는 부분, 이 BamHI 및 BcII 부위는 각각 5) 에 기술된 단편의 BamHI과 결합하는 부위와, 7) 에 기술된 단편의 BamHI 부위(역시소멸)와 결합되면서 소멸된다.

7) - BamHI-EcoRV 단편-EcoRV와 BamHI 효소로 완전분해 후 플라스미드 pBR322에서 유해되는 작은 단편인 190bp중, 제13도에서로 표시되는 부분.

3) 플라스미드 pSV860의 제조

플라스미드 p466(참조 제9)을 효소 AccI 및 SnaBI으로 완전분해 한다. 첫부분의 16개 아미노산이 예외인 우레이트 산화효소를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 작은 AccI-SnaBI 단편을 정제하고, 다음의 서열을 갖는 합성 HindIII-AccI 단편과 연결한다 :

이렇게 연결함으로써 클론 9C의 서열과 동일하며, 우레이트 산화효소를 암호화하는 서열 및 동물세포에서 발현을 촉진하는 비번역 5' 서열을 포함한 HindIII-SnaBI 단편의 수득이 가능하다. (KOZAK. M. Nucl. Acids Res., 12. 2. 1984, 857-872)

HindIII-SnaBI 단편은 다음 서열을 포함한다.

이후 HindIII-SnaBI 단편을 최초로 효소 HindIII 및 SmaI로 처리한 벡터 pSE₁에 삽입한다. 이렇게 함으로써 제14에 나타난 플라스미드 pSV860이 수득되고 여기서, 기호는 제13도에서와 동일한 의미를 나타내며, 새로운 HindII-SnaBI 단편은로 표시된다.(SnaBI 및 SmaI 부위는 연결화에 의해 소멸된다)

[실시예17]

(COS 세포에서 우레이트 산화효소 cDNA의 일시적 발현-세포 분쇄물에서 우레이트 산화효소 활성의평가)

COS 세포는 S40 비루스의 T-항원을 발현시키는 원숭이 신장세포이다. (Gluzman, Y., Cell 23, 1981, 175-182)SV40 비루스 DNA의 복제개시점을 포함한 벡터의 복제를 가능하게 하는 이들 세포는 동물세포에서 유전자 발현 연구를 하는데 있어 바람직한 호스트세포이다.

1) 우레이트 산화효소 cDNA의 COS 세포예의 감염 및 일시적 발현

5% 태아 송아지 혈청(fetal calf serum, GIBCO 사), 0.6g/ℓ 글루타민 및 3.7g/ℓ NaHCO₃로 구성된 둘벡코의 변형된 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM으로 약칭) 5ml 이 들어있는 직경 6cm 의 페트리디쉬(Corning 사)에 4. 10⁵세포를 플레이트 한다. 5%의 CO₂를 포함하는 대기에서 37℃로 약 16시간 배양후, 배양액을 뽑아내고 세포를 3ml의 PBS(Phosphate buffered Saline, GiBCO)로세정한다. 이후 다음의 혼합물을 첨가한다 : 100㎕의 (DMEM + 10%의 태아 송아지혈청(GIBCO), 농도 2mg/ml에서 평균 분자량이 500,000인 110㎕의 디에틸아미노에틸덱스트란 (pharmacia), 1.1㎕의 클로로퀸 100mM(sigma) 및 플라스미드 pSV860 또는 플라스미드 pSE₁의 DNA 3㎍(대조용). 5%의 CO₂를 포함하는 대기에서 37℃로 약 5시간 배양후, 이 혼합물을 세포로부터 뽑아낸다. 이후 10%의 디메틸술폭시드(spectroscopic grade, MERCK)를 포함한 2ml의 PBS를 첨가한다. 실온에서 1분 배양후 혼합물을 뽑아 내고 세포를 2회 PBS로 세정한다. 2%의 CO₂를 포함하는 대기 하에서 37℃로 4일 계속 배양한다.

2) 시료의 제조

배양액을 뽑아내고 COS 세포를 2회 3ml의 PBS로 세정한다. 이후, 이 세포를 1ml의 PBS에서 고무 스파투라(rubber spatula (policeman))로 긁어 모은다. 긁은 후, 이 디쉬를 1ml의 PBS로 세정한다. 두 세포 현탁액을 합하여 1000rpm에서 10분간 원심분리한다. 상등액을 제거하고 세포 잔류물을 1ml의 트리에틸암모늄(TEA) 0.05M pH8.9/EDTA 완충액에 재현탁 시킨다.

이 세포를 12W의 출력으로 세트한 초음파기(Vibra Cell, Sonics and Materials Inc. U. S. A)를 이용하여 10초 펄스(pulse)로 초음파시켜 (얼음위에서)분쇄한다. 분쇄된 세포를 10,000rpm에서 10분 원신분리하고 상등액을 회수하여 우레이트 산화효소 활성을 측정한다.

3) 우레이트 산화효소 활성의 측정

우레이트 산화효소 활성을 실시예 9 에서와 같이 측정하였다.

결과를 하기표에 정리한다.

대조시료에서는 우레이트 산화효소 활성이 검출되지 않는데 반하여, 우레이트 산화효소 cDNA를 갖고 있는 플라스미드 pSV860에 의해 감염된 COS 세포에서는 상당한 정도의 우레이트 산화효소 활성을 나타냄을 알 수 있다. 즉 우레이트 산화효소 cDNA의 발현이 존재한다.

Claims (24)

1. 우레이트 산화효소의 비활성이 적어도 16U/mg 이고, 메티오닌이 선행할 수도 있는, 다음의 서열을 갖는 재조합 단백질 :
2. 제1항에 있어서, 우레이트 산화효소의 비활성이 적어도 30U/mg 인 재조합 단백질.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2차원 겔의 분석상 분자량이 33.5 kDa인, 단백질 질량의 적어도 90%를 차지하는 반점을 제공하는 재조합 단백질.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, C8 접합 실리카 칼럼상의 액체크로마토그라피에 의해 결정된 순도가 80%를 넘는 재조합 단백질.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 등전점이 8.0인 재조합단백질.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노말단의 세린에 원자 질량 단위가 43인 분자량의 차단기(blocking group)를 갖는 재조합 단백질.
7. 하기 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 갖는 재조합 유전자 :
8. 제7항에 있어서, 원핵세포 미생물에서 발현을 가능하게 하는 재조합 유전자.
9. 제8항에 있어서, DNA 서열이 하기 서열을 포함하는 재조합 유전자 :
10. 제8항에 있어서, 전핵세포에서 발현을 가능하게 하는 재조합 유전자.
11. 제10항에 있어서, DNA 서열이 하기 서열을 포함하는 재조합 유전자 :
12. 제7항에 있어서, 동물세포에서 발현을 가능하게 하는 재조합 유전자.
13. 제12항에 있어서, DNA 서열이하기 서열을 포함하며, 동물 세포에서의 발현을 촉진하는 비번역 5' 서열이 선행된 재조합 유전자 :
14. 제13항에 있엇어, 동물세포에서의 발현을 촉진하는 비번역 5' 서열은 제14항에서 기술된 서열로부터 바로 앞에 위치한 서열인 AGCTTGCCGCCACT로 구성되는 재조합 유전자.
15. 발현에 필요한 수단을 가진 제7항 내지 14항 중의 어느 한 항에 따른 재조합 유전자를 포함하고 있는, 발현 벡터.
16. 제15항에 있어서, 적어도 하나의 선택 표지를 갖는 발현 벡터.
17. 제16항에 있어서, 플라스미드, pEMR469, pEMR473, 및 pEMR515 중 하나의 특성을 가진 발현 벡터.
18. 제9도에 나타난 제한효소 지도를 갖는 플라스미드 p466로 형질전환된 E. Coli 균주.
19. 하기와 같은 특성을 갖는 플라스미드 pEMR469, pEMR473 및 pEMR515중 하나로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)균주:- 플라스미드 pEMR469의 제한효소 지도를 도11에 나타내고;- 플라스미드 pEMR473의 제한효소 제도를 도12에 나타내고;- 플라스미드 pEMR515는 URA3유전자 및 2μ단편중 XbaI-NheI 부분을 결실시킨 플라스미드 pEMR473으로부터 유래한다.
20. 제19항에 있어서, GRF18 pEMR515 (leu⁺) 균주 (CNCMI-920)인 균주.
21. 제19항에 있어서, EMY500 pEMR515(leu⁺) 균주(CNCMI-919)인 균주.
22. 제14도에 나타낸 제한효소 지도를 갖는 플라스미드 pSV860으로 형질전환된 COS 세포.
23. 제19항에 있어서, FL100 균주(ATCC 28 383)으로부터 유래된 ura3 균주와 GRF18 균주를 교잡하므로써 수득될 수 있는 EMY761 균주인 균주.
24. 제19항, 제20항, 제21 및 23항에 중 어느 한항에 따른 균주를 배양하고;- 세포를 분쇄시키고 ; 및 - 분쇄물에 포함되어 있는 재조합 우레이트 산화효소를 분리 및 정제하는 단계로 구성된 재조합 우레이트 산화효소의 제조 방법.