KR100417026B1 - 클로버황색엽맥바이러스프로테아제유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 외생의 폴리펩티드의 발현 체계를 제공하는 것으로 상기 폴리펩티드는 발현 후에 융합 단백질을 자가 분해하는 클로버 황색 바이러스 핵 함유물 a, 즉 NIa 와 함께 융합 단백질로서 발현된다. 이러한 체계는 KM31 - 7 단백질로 명명되고, 디클로로인도페놀 및 산화된 글루타티온을 환원할 수 있는 신규의 폴리펩티드를 발현 시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 산화성 스트레스에 의하여 야기되는 질환의 치료에 유용하다.

Description

클로버 황색 엽맥 바이러스 프로테아제 유전자

본 발명은 전구물질의 절단을 필요로하는 폴리펩티드의 발현 체계 및 그러한 체계에서 사용하기 위한 프로테아제에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 디클로로인도페놀 및 산화된 글루타티온을 환원할 수 있는 신규의 폴리펩티드, 그러한 신규의 폴리펩티드를 코딩 (coding) 하는 DNA, 그러한 DNA 를 포함하는 벡터, 그러한 벡터로 형질 전환된 숙주, 및 그러한 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 덧붙여서, 본 발명은 또한 이러한 폴리펩티드에 대한 단일 클론 항체 및 그러한 항체를 사용하여 그 폴리펩티드를 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

포티바이러스 (Potyvirus) 는 단일 사슬의 대략 10,000 염기의 RNA 게놈 (genome) 을 가지며 솔라나케아 (Solanaceae) 과와 같은 식물에 감염된다. 포티바이러스 게놈은 하나의 극단적으로 긴 개방 해독틀 (ORF) 을 가지는 것으로 특징된다 [도우헤티 및 히버트, (1980), Virology 101 : 466 -474; 알리손 일행 (1986), Virology 154 : 9 - 20]. 그 ORF 에서 코딩되는 각각의 단백질을 발현하기 위하여, 번역된 폴리단백질은 2 가지 형태의 프로테아제에 의하여 절단되며, 이러한 프로테아제 모두는 또한 ORF 내에서 코딩된다 [도우헤티 및 카링톤 (1988), Ann. Rev. Phytopath. 26 23 - 143].

담배 에치 바이러스 (TEV) 는 포티바이러스 과의 구성원으로 감염된 세포에서 트립판 블루로 염색되는 핵 함유물을 만든다. 그 핵 함유물은 분명히 두종류의 단백질로 이루어지며, 그 중 하나는 바이러스 프로테아제로 밝혀졌으며, 핵 함유물 a (Nuclear Inclusion a) 또는 NIa 로 간주된다 (J. Virol., 61 : 2540 - 2548, 1987).

포티바이러스의 핵 함유물 a 프로테아제는 Gln - Gly, Gln - Ser 및 Gln - Ala 중 하나를 포함하는 펩티드 서열을 인식하고 절단하며, 이러한 서열은 6 단량체이고, 폴리단백질내의 관련된 NIa 의 C - 말단에 나타나는 것으로 생각된다. 절단은 상기 다이머 (dimer) 를 구성하는 두 잔기 사이 이다.

포티바이러스의 또 다른 구성원인 TEV 및 담배 엽맥 얼룩무늬 바이러스 (TVMV) 의 완전한 유전자 서열은 밝혀졌으며, 상동성 조사로 NIa 의 위치가 그들 각각의 게놈내에 있었다 [Virology, 154 : 9 - 20 (1986); Nucleic Acid Res., 14 : 5417 - 5430 (1986)].

클로버 황색 엽맥 바이러스 (CYVV) 도 또한 포티바이러스 이다. 이제까지, CYVV 게놈의 3' 끝에서 발생하는 유전자와 그것이 코딩하는 외피 단백질의 서열을 분석 하였다 [우에다 일행 (1991), Intervirol. 32: 234 - 245]. 그 게놈의 NIa 부위의 구조는 명백히 밝혀지지 않았으며 해당 NIa 도 분리되지 않았다.

발현 체계에 의한 외생 단백질의 제조는 본 분야에서 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 외계에서 쉽게 발현될 수 없는 많은 폴리펩티드들이 있다. 이러한 문제는 폴리펩티드들이 많은 양으로 발현될 수 없기 때문이고, 이것은 단지 윗방향에 조절 유전자를 둠으로 교정될 수 없다. 그외에, 성숙한 형태를 수득하기 위하여 필요한 전사후 사건이 일어나지않거나 잘못 일어나기 때문이다.

예를 들면, 많은 진핵성 폴리펩티드는 N - 말단 메티오닌으로 초기 번역되고 이어서 결실되어 성숙한 형태를 얻는다. 이러한 프로세싱 (processing) 은 원핵 생물에서는 나타나지 않으며, 발현을 수득하는 또 다른 방법이 발견되었다. 그러한 방법중의 하나는 예를 들면, 원하는 외생 단백질을 말토스 결합 단백질 또는 글루타티온 S - 트랜스퍼라제와 융합시키고, 발현된 융합 단백질을 정제하고, 인자 Xa, 엔테로키나제 또는 트롬빈과 같은 프로테아제로 절단하는 것이다. 이러한 다루기 힘든 방법의 중요한 단점은 두 정제 단계가 필요하고, 실질적인 최종 산물의 손실을 야기 한다는 것이다.

미합중국 특허 5,162,601 에는 인체 tPA 와 같은 발현되기에 바람직한 각 단백질 사이에 연결 분위 (linker) 서열을 가지는 폴리단백질의 제조에서 TEV 프로테아제의 사용이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 특허에는 단지 숙주세포에서 이러한 폴리단백질을 코딩하는 다중 유전자의 클로닝 (cloning) 만 개시되어 있다. 단백질 분해로 절단된 최종 생성물의 발현이나 정제에 대하여는 어떠한 개시도 없다.

대사 에너지를 위한 산소는 일반적으로 세포 환경에서 산화제의 형태로 제공된다. 산소가 사용되는 활성화된 형태는 일반적으로 초산화물 (O₂ ^-), 과산화물(H₂O₂) 또는 수산화 라디칼 (OH^-) 과 같은 자유 라디칼 (radical) 이며, 이러한 것 모두는 사용 후에 환원되어 물 (H₂O) 을 형성한다. 산소 기체 그 자체는 매우 크게 산화력이 있으나, 여기에서 사용되는 "활성화된 산소" 용어는 대기 산소 보다 더 큰 산화력을 가지는 산소 및 산소 함유 물질에 관한 것이다. 활성화된 산소의 가장 능력있는 형태는 자유 라디칼이고, 하나 이상의 비공유 전자를 가지는 분자 또는 원자이다.

자유 라디칼은 전형적으로 불안정하며, 적절히 통제되지 않는 다면, 지방, 단백질 및 핵산을 변성 시킨다. 결과적으로, 활성화된 산소는 생명에 필수적이긴 하지만, 또한 잠재적인 생명 위험 요소이며, 매우 밀접하게 조절되어야 한다. 활성화된 산소는 매우 소량으로도 그 높은 반응성에 기이한 질병을 야기한다. 그 결과로, 살아있는 생명체는 활성화된 산소에 대한 방어 기작을 갖고 있지 않다면 생존할 수 없다.

세포내 환경에서, 활성화된 산소의 발생 위치, 양 및 시간은 관련된 위험을 중화시킬 수 있는 세포의 능력에 대하여 주의 깊게 균형이 잡혀야 한다. 이러한 능력은 전형적으로 그 자신의 산화방지제 또는 산화방지 효소를 사용하는 방어 기작에 의하여 제공된다. 본 발명의 내용에서, "산화방지제"는 예를 들면 지질의 자가 산화 반응을 방지 또는 억제할 수 있는 자연적으로 발생하는 물질에 대한 일반적인 명칭이다. 용어 "산화방지 효소" 는 활성화된 산소를 제거하는 반응을 촉매하는 효소에 대한 일반적인 명칭 이며, 따라서 용어 "산화방지 작용" 의 의미는 확인된다.

많은 비정상적인 환경, 예를 들면 스트레스를 받는다거나, 약을 먹는다거나, 담배를 핀다거나, 수술중이거나, 기관 이식이 있다거나, 또는 대뇌 또는 심근 경색으로 인한 국소빈혈로 고통받을때 과도한 양의 활성화된 산소가 만들어 진다. 이러한 많은 양은 체내 조절계가 제거할 수 있는 양보다 많아서, 과도한 활성화된 산소는 신체에 더 해를 줄 수 있고, 정상세포에 손상을 심각하게 일으킬 수 있다. 이른바, 그 결과의 산화성 스트레스는 많은 질병 조건을 담당한다.

예로써, 세동맥경화증의 경우, 활성화된 산소에 의하여 산화된 저비중 지질단백질의 출현은 질병의 원인중 하나로 생각된다 [스타인베르그 (1983), Arteriosclerosis 3, 283 - 301]. 산화성 스트레스는 대사 이상 및 당뇨의 혈관 합병증의 출현과 관련된 기작의 원인 및 영향에 긴밀하게 관여하는 것으로 생각된다 [콘도, "현대 의학에서 (4) 자유 라디칼에로의 접근", Medical View Pub., pp. 138 - 146].

활성화된 산소는 다른 병적 상태 및 조건 예를들면, 허혈성 질환 (레퍼퓨젼 질병, 허혈성 심장 질환, 대뇌 허혈성 질병, 허혈성 장염 등등), 부종, 혈관 투과성 항진, 염증, 위 점막 질병, 급성 췌장염, 크론스 질병, 궤양성 대장염, 간 질환, 파라쿼트 질환, 폐기종, 화학적 암발생, 암 전이, 성인 호흡 곤란 증후군, 전염성 혈관내 응집 (DIC), 백내장, 미성숙 망막증, 자기 면역 질환, 포르피린증, 용혈성 질환, 지중해성 빈혈, 파킨슨 질환, 알츠 하이머 질환, 간질, 자외선 조사 질환, 방사성 질환, 동상 및 화상등에 또한 관계 있다.

여러 방어 기작이 생리적으로 만들어진 활성화된 산소를 제거 하기 위한 유일한 목적으로 세포 내외 모두에 존재한다.

세포 내적으로, 하기에 주어진 바와 같이 산화방지제 및 산화 방지성 효소가 활성화된 산소를 제거한다는 것이 공지되어 있다. 예를 들면, 퍼옥시좀에 존재하는 카탈라제는 과산화수소를 환원시키고 제거한다. 세포질 및 미토콘드리아에서 발견되는 글루타티온 퍼옥시다제는 환원된 글루타티온의 존재하에서, 과산화수소 및 지방과산화물을 환원시키고 비독성화한다. 예를 들면, 트랜스페린, 페리틴 및 락토페린은 철 이온을 안정화시켜 활성화된 산소의 발생을 억제하고, 셀루로플라스민은 구리 이온과 관련하여 유사한 작용을 수행한다. 예로 덧붙여서, 세포질 및 미토콘드리아에 존재하는 초산화물 디스뮤타제는 초산화물의 환원을 촉매하여, 과산화수소를 형성하고, 그 과산화수소는 카탈라제에 의하여 제거된다. 이외에, 비타민 C 및 E, 환원된 글루타티온 및 다른 저 분자량 화합물은 활성화된 산소를 환원시키고, 제거할 수 있다.

한편, 세포외 초산화물 디스뮤타제와 같은 제제인 세포외의 글루타티온 퍼옥시다제 및 환원된 글루타티온은 세포외 환경에서도 존재하며, 그 세포내 작용에 해당되는 유사한 유형의 작용을 세포외에서도 가진다. 그러나, 세포내 상황과 비교하여, 더 작은 유형의 세포외 산화방지제 및 산화방지성 효소가 있으며, 세포외 산화방지 작용을 나타내는 것은 단지 적은 수 이다.

환원된 글루타티온은 세포 내외 모두에서, 환원된 형태를 유지하며 중요한 기능을 가지고, 하기식으로 표시된다. 글루타티온은 1988 년 효모에서 레이파일하데에 의하여 최초로 발견되었고, 후에, 1921 년 홉킨스에 의하여 하기 화합물로 분리되어 글루타티온으로 명명 되었다.

글루타티온은 3 종류의 아미노산으로 구성된다: 글루타민산, 시스테인 및 글리신. 두 글루타티온 분자의 티올기는 활성화된 산소의 존재하에서 산화되어 디술피드 결합을 형성하고, 그럼으로써 활성화된 산소를 환원 시킨다.

글루타티온은 주로 간에서 생성되며, 혈장을 통하여 신체를 순환한다. 정상적인 신체에서, 글루타티온은 거의 완전히 환원된 형태로 존재한다. 산화된 형태의 수준이 증가하면, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADPH) 의 존재하에서, 글루타티온 환원 효소의 작용에 의하여 환원된 형태가 재생성된다. 따라서, 환원된 글루타티온은 활성화된 산소 및 자유 라디칼을 환원시켜, 산화적 질환 및 기능으로 부터 세포막을 보호한다. 이러한 산화방지 성질을 가지는 결과로, 환원된 글루타티온은 또한, 방사성 효과에 대한 보호 역할 및 백내장에 대한 치료학적 약품으로 유용하다. 환원된 글루타티온의 전신 수준이 AIDS 환자에게서 감소된다는 사실이 최근에 보고되었으며, 이러한 사실은 생체내에서 환원된 글루타티온의 역할은 매우 중요하다는 것을 가리킨다. 그러나, 비정상적 상태에서, 활성화된 산소의 양은 너무 커서, 실제적으로 모든 글루타티온이 산화된 형태로 있게되고, 활성화된 산소는 가능한 빨리 제거되지 않는다.

인체의 티오리독신은 그 환원 활성으로 세포내외 모두에서 각종의 생리학적작용을 수행하는 기질의 두번째 예 이다. 인체의 티오리독신 (성인 T 세포 백혈병 유래 인자, ADF 로 공지) 은 성인 T 세포 백혈병 세포주에서, 인터루킨 2 수용기 (IL - 2R) 를 유도할 수 있는 인자로 클론 되었다. 그 활성 부위에서 두 시스테인 잔기를 가진 티올 의존 환원 효소이며, 활성화된 산소 및 자유 라디칼을 환원할 수 있다.

IL - 2 수용기의 유도 이외에, 인체 티오리독신은 또한

엡스테인 - 바르 바이러스 (EBV) 에 감염된 B 세포주 3B6 의 세포 증식을 촉진하고;

단핵구 기원 세포주 U937 로 부터 유래하는 종양 괴사 인자 (TNF) 에 대하여 보호하고; 및

호중성 백혈구에 의한 혈관내피 세포의 손상을 방지한다.

더욱이, 세포내 환경에서, 인체 티오리독신은 그 환원 활성을 통하여 전사 인자 NFkB, JUN 및 FOS 에 작용하여, DNA 에 대한 결합 능력을 촉진하여 전사 활성을 증가 시킨다. 인체 티오 리독신은 방사성 이상의 방지제 뿐만 아니라 레퍼퓨전 질환 류마티스성 관절염 및 염증에 대한 치료 약품으로 현재 개발 중이고, 이러한 질병 모두는 티오 리독신의 환원 능력에 의하여 세포내 손상을 방지함으로 보호될 수 있다.

상기에서 기술한 것처럼, 세포 내외 모든 환경에서, 활성화된 산소와 자유 라디칼을 제거하여 환원 상태를 유지하는 것은 생리학적으로 매우 중요하다. 아직 알려지지는 않았지만, 활성화된 산소 및 자유 라디칼을 제거하는 역할을 하는 세포내외의 산화방지제 및 산화방지 효소가 많다고 생각된다. 따라서, 예를들면 환원된 글루타티온을 재생성할 수 있는 환원 물질을 발견하는 것은 매우 유용할 것이다. 그러한 물질은 상기 언급된 것과 같은 비정상적인 신체 상태에 도움을 줄 수 있을 것 이다.

본 발명의 첫번째 목적은 신규의 프로테아제, 그 프로테아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 그 프로테아제를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터, 및 그 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 유의한 단백질을 코딩하고, 또한, 그 단백질의 윗 방향의 신규의 프로테아제를 코딩하며 그 코딩 서열 사이의 서열은 그 프로테아제에 의하여 절단될 수 있는 펩티드를 코딩하며 이러한 서열 모두는 동일한 개방 해독틀내에 존재하는 DNA 를 제공하는 것 이다. 그것은 또한 상기 DNA 에 의하여 코딩되는 단백질 뿐만 아니라, 그 DNA 를 포함하는 벡터 및 적절한 숙주 세포에서, 즉 자가 복제에 필요한 뉴클레오티드 서열을 포함함으로 자가적으로 복제될 수 있는 그러한 상기 벡터를 포함함을 특징으로 하는 발현 체계를 제공하는 것이다.

그 외에, 생체내에서 환원능을 가지는 신규의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이 본 발명의 첫번째 목적이다.

그것은 또한, 디클로로인도페놀 및 산화된 글루타티온을 환원할 수 있는 펩티드를 코딩하는 그러한 DNA 를 제공하는 것이다.

본 발명의 더 나은 목적은 상기 언급된 DNA 를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것으로, 그 벡터는 자가복제를 가능하게 하는 염기 서열을 가짐으로 적절한숙주 세포에서 자가적으로 복제할 수 있는 벡터이다.

더욱이, 본 발명의 더 나은 목적은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포 미생물을 제공하는 것이다. 그것은 또한, 형질전환된 숙주 세포에서 발현 산물로 상기 언급된 펩티드 및 그 펩티드에 대한 단일 클론 항체를 제공 하는 것이다.

우리는 신규의 CYVV 프로테아제 (NIa) 를 식별하고 클론 (clone) 하였으며, 이. 콜리 와 같은 숙주 세포에서 발현될 수 있는 융합 단백질의 부분 으로서, CYVV NIa 를 사용하여 자기 절단이 가능한 많은 양의 융합 단백질을 제조하여 원하는 외생의 단백질을 수득할 수 있다는 사실을 놀랍게도 발견하였다. CYVV NIa 유전자는 이. 콜리 에서 안정하게 유지되고, 발현될 수 있으며, 발현된 NIa 는 그 단백질이 융합 단백질의 부분을 형성할때 조차도 특이성 프로테아제로서의 활성을 유지한다.

우리는 또한, 디클로로인도페놀 [디클로로페놀인도페놀, 2, 6 - 디클로로인도페놀, 또는 2, 6 - 디클로로 - 4 - ((4 - 히드록시페닐)이미노) - 2, 5 - 시클로헥사디엔 - 1 - 원] 및 산화된 글루타티온을 환원할 수 있는 신규의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 그 상기의 폴리펩티는 적절한 유전 공학 기술을 사용하여 다량으로 수득할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 폴리펩티드는 특별히, 산성화 스트레스 또는 활성화된 산소에 의하여 야기되는 어떠한 질병, 예를 들면, 동맥경화증, 당뇨병 및 허혈성 질환 (레퍼퓨젼 질병, 허혈성 심장 질환, 대뇌 허혈성 질병 및 허혈성 장염을 포함) 등에 의해 야기되는 또는 관련된 상태에 대한 치료에 유용하다.

따라서, 본 발명의 첫번째 구현예의 관점에서, 5' 에서 3' 방향으로 및 동일한 개방 해독틀에서, 하기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다 :

a) 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질 또는 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질과 유사한 단백질 분해 특이성을 가지는 그의 돌연 변이체 또는 변이체를 코딩하는 서열;

b) 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질에 의하여 인식되고, 절단될 수 있는 펩티드 또는 그의 상기 돌연 변이체 및 변이체를 코딩하는 서열; 및

c) 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 서열.

본 발명은 또한, 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질 및 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질과 유사한 단백질 분해 특이성을 가지는 돌연 변이체 및 변이체를 코딩하는 서열을 제공한다.

본 발명은 벡터, 특별히 상기에서 정의된 서열을 가지는 발현 벡터를 더 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 정의된 벡터에 의하여 형질 전환된 숙주, 뿐만 아니라 그 숙주 및 그 발현 벡터를 특징으로 하는 발현 체계 및 그러한 발현 체계에 의하여 제조된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 먼저 서열 식별 번호 12 의 아미노산 번호 1 에서 526 의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 돌연 변이체 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하며, 그 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩된 폴리펩티드는 디클로로인도페놀 및 산화된 글루타티온을 환원시킬 수 있다.

벡터, 특히 상기 정의된 서열을 포함하는 발현 벡터도 또한 제공된다.

본 발명은 상기 정의된 벡터로 형질전환된 숙주 뿐만 아니라 그 숙주 및 상기 발현 벡터를 포함하는 발현체계, 및 또한 이러한 발현 체계에 의해 제조되는 폴리펩티드를 추가로 제공한다.

본 발명은 산화적 스트레스에 의하거나 이와 관련된, 및 활성화된 산소에 의해 야기되는 임의의 질환에 의한 상태의 치료와 예방에 있어서 이러한 폴리펩티드의 용도 및 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라, 상기 폴리펩티드의 치료에 있어서의 용도로 또한 제공한다.

또한 폴리펩티드에 대한 항체, 특히 단일 클론 항체, 및 그 상당물을 당량을 제공하며, 본 발명은 부가적으로 그러한 항체의 제조방법 및 항체를 사용한 폴리펩티드의 정제 방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 첫번째 구현예에 의해 우선 예시될 것이나, 다음의 논의는 또한 논의가 두번째 구현예에 적용 불가능한 것이라는 것이 명백하지 않다면 본 발명의 두번째 구현예에도 적합하다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열이 일반적으로 DNA 형태인 것이 바람직하며, 여기서의 참고는 이런 이유로 일반적으로 DNA 로 간주될 것이다. 그러나, 그러한 참고는 또한 적당한 RNA 도 포함한다.

RNA 는 그의 용도가 실제로 제한되기 때문에 그다지 바람직하지 않다. 예컨대, mRNA 는 제노푸스 난모세포 (xenopus oocytes) 또는 밀배아 용균 (lysate) 체계에서 발현될 수 있으나, 이들 중 어느것도 경제적 면에서 다량의 융합 단백질의제조에 실용적이지 못하다.

여기서 사용하는 용어 "펩티드" 는 펩티드 결합을 통해 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 모든 분자를 의미한다. 그러므로, 이 용어는 올리고펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 용어 "융합 단백질" 은 2 개 이상의 다른 펩티드 서열을 연합시켜 수득되는 모든 단일 폴리펩티드와 관련된다.

또한 본 발명의 서열은 이중 사슬의 형태인 것이 바람직하며 본 발명은 또한 본 발명의 서열에 상응하는 안티센스(antisense) 서열을 또한 예견한다. 본 발명의 이중 사슬 (또는 ds) 은 하나 또는 두개의 "접착성" 말단을 가질 수 있으며, 이 경우 안티센스 및 센스 사슬은 반드시 정확하게 대응할 필요는 없다.

상기 a) 에서 정의된 서열에 의해 코딩된 단백질은 상기 b) 의 서열에 의해 코딩된 펩티드를 절단하게 됨으로써, 본 발명의 서열이 적당한 발현 체계에서 발현되는 경우 상기 c) 의 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 방출하게 된다.

융합 단백질의 절단은 상기 a) 및 b) 의 서열이 번역된 후 어느 때라도 일어날 수 있다. 그러므로, 상기 c) 에 의해 코팅된 폴리펩티드는 절단 전에 완전히 번역될 필요가 없음을 생각할 수 있다.

그러나, 실제로는, 대부분은 아니더라도 약간의 융합 단백질은 절단전에 완전히 번역되는 것을 발견하였다.

상기 c) 의 서열이 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 경우, 예컨대, 비절단된, 융합된 복수의 폴리펩티드를 수득하는 것이 바람직하지 않다면 각각의 코딩된 폴리펩티드 사이의 추가의 절단 서열을 코딩할 필요가 있다.

상기 c) 의 서열이 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 경우, 서열은 전사 환경에서 약화 (attenuation) 에 민감할 수 있다.

약화의 과정중에, 본 발명의 mRNA 서열의 전사는 전체 mRNA 가 해독되기 전에 멈추며, 서열의 3' 말단에 더 가까운 코딩된 폴리펩티드를 5' 말단에 더 가까이 코딩된 폴리펩티드보다 더 소량으로 생산할 것이다. 약화는 수개의 폴리펩티드가 코딩되거나 및 / 또는 폴리펩티드가 매우 긴 경우를 제외하고는 일반적으로 문제가 아니다.

사용할 복수의 펩티드를 함께 제조하는 것이 바람직하거나, 이러한 복수의 것이 융합하는 경우가 아니라면, 상기 c) 의 서열이 단지 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 것이 일반적으로 바람직하다. 그렇지 않으면, 절단 후에 각각의 폴리펩티드를 분리할 필요가 있으며, 이것은 방해가 될 수 있으며 정제 과정을 통해 최종 생성물을 낭비할 수 있다.

그러나, 상기 c) 의 서열의 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩할때, 각각의 코딩된 폴리펩티드사이에는 절단 서열이 있으며, 그후 절단 서열은 반드시 CYVV NIa 에 의해 인식될 필요가 없다. a) 서열과 b) 서열의 5' 말단 사이의 절단 서열이 a) 서열에 의해 코딩된 프로테아제에 의해 인식되는 것이 필수적이다. 융합 단백질이 복수의 폴리펩티드를 생산하기 위해 자가 - 분해되도록 하는 것이 바람직하거나 허용 가능한 경우, 임의의 추가의 절단 서열은 a) 서열에 의해 코딩되는 프로테아제에 의해 인식될 수 있을 것이다. 그러나, 이러한 추가의 서열은 기타의 수단으로 절단 가능하도록 선택할 수 있으며, 그럼으로써 융합 단백질은 전사후에 그의 NIa부분에 의해 절단되어 NIa 와 폴리단백질을 수득케된다. NIa 는 그후 제거되며 폴리단백질은 예컨대 인자 Xa 또는 트립신에 의해 절단된다.

상기 b) 의 서열에 의해 코딩된 절단펩티드 (여기서 또한 "절단 서열" 및 "절단 펩티드" 로서 언급함) 는 a) 및 c) 의 서열 (각각 "NIa" 또는 "프로테아제", 및 "폴리펩티드)에 의해 코딩되는 서열중의 어느 하나에 일부 또는 전체가 포함되는 서열일 수 있다. 그러므로, 절단 펩티드의 N - 말단 끝은 또한 프로타아제의 C - 말단 서열중에 포함될 수 있는 한편, 절단 펩티드의 C - 말단 부분은 폴리펩티드의 N - 말단 부분중에 포함될 수 있다. 이러한 경우에, 절단 펩티드는 독립적 존재가 아니며, 프로테아제의 인식 부위는 프로테아제의 C - 말단 및 폴리펩티드의 N - 말단으로 구성된다.

절단 펩티드는 또한 프로테아제 또는 폴리펩티드 중의 하나의 일부만에 포함될 수 있다. 그러한 경우, 절단 펩티드의 N - 말단은 프로테아제의 C - 말단 부분중에 포함될 것이며 폴리펩티드의 N - 말단 부분은 절단 서열에 직접 연결되거나, 또는 폴리펩티드와 연결부위 사이에 하나 이상의 아미노산 잔기가 있을 수 있다.

절단 서열과 프로테아제 및 / 또는 절단 서열과 폴리펩티드 사이에 하나 이상의 아미노산 잔기가 있는 경우, 이러한 잔기의 수 및 성질은 프로테아제의 작용을 막지 않아야 한다. 폴리펩티드의 N - 말단상의 과다한 아미노산 잔기는 성숙한 형태의 폴리펩티드를 수득하기 위해 제거되어 일반적으로 이롭지 않다. 일반적으로 가능한 한, 또한 금기 사항이 없는 경우, 절단 펩티드를 조작하여 목적하는 성숙한 형태의 단백질을 융합 단백질의 절단상에서 수득하는 것이 바람직하다. 그러나, 예컨대 N - 말단에 붙은 Gly, Ser 또는 Ala 를 갖는 단백질을 수득하는 것은 전적으로 가능하며, 이들은 원한다면, 적당한 아미노펩티다제의 작용에 의해 제거할 수 있다.

몇몇 경우에, 폴리펩티드의 N - 말단과 절단 서열 사이에서 프롤린을 코딩하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예컨대 아미토펩티다제 P (3. 4. 11. 9) 의 작용으로 프롤린 잔기까지 잔기의 절단을 가능케 하나, 그 이상은 아니다. 대신에, 프롤린 잔기는 그후 프롤린 이미노 펩티다제의 작용에 의해 제거되어 성숙한 단백질으로 생산할 수 있다. 이것은 본 발명의 바람직한 구현예가 된다.

a) 의 서열은 본 발명의 서열에 의해 코딩되는 융합 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제를 코딩한다. 본 발명에서, 이 프로테아제는 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 프로테아제, 또는 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 프로테아제와 유사한 분해 특이성을 가진 이것의 돌연변이체 또는 변이체이다.

클로버 황색 엽맥 바이러스 NIa 프로테아제는 서열 목록중의 서열 식별 번호 1 에서 뉴클레오티드 번호 10 ∼ 1311 에 의해 코딩되는 한편, NIa 의 1 차 서열은 서열 목록중의 서열 식별 번호 2 에서 아미노산 번호 4 ∼ 437 에 의해 주어진다. 이들 서열은 신규하며, 그의 변종 및 돌연변이체와 같이 본 발명의 일부가 된다.

핵 함유물 a 는 기질 펩티드 중의 Gln - Ala, Gln - Gly 또는 Gln - Ser 사이의 펩티드 결합을 특이적으로 가수 분해하는 단백질 분해 활성을 갖는다. 또한, NIa 가 Gln - Val 을 절단할 수 있음도 알아내었다. 그러므로, 포티바이러스과의 다른 프로테아제와는 대조적으로, CYVV NIa (여기서 NIa 에 대한 참고는 달리 지정하지 않으면 CYVV NIa 를 의미하는 것으로 받아들여야 한다) 가 Asn Cys Ser Phe GlnX 의 서열을 절단할 수 있으며, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기이나, 특히 Gly, Ala, Val 또는 Ser 및 더욱 특히 Gly, Ala 또는 Ser 이다.

서열 Asn Cys Ser Phe GlnX 를 포함하는 펩티드는 특히 이런 서열이 입체적으로 NIa 의 작용에 노출되는 경우에, NIa 에 의해 절단될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 서열 Asn Cys Ser Phe GlnX 를 포함하는 폴리펩티드의 전구체 형태가 NIa 에 의해 절단되는, 폴리펩티드의 제조를 위한 체계를 제공한다. 이 체계는 기타의 프로세심 단계를 NIa 에 의한 절단전, 후 또는 동시에 적당히 포함할 수 있다.

일반적으로 자연 발생의 NIa (서열 식별 번호 2 에 따름) 를 코딩하는 서열을 사용하는 것이 바람직하지만, 본 발명은 일반적으로 NIa 의 돌연변이체 또는 변이체를 사용하는 것을 동등하게 생각한다.

언급하였듯이, 프로테아제는 자연 발생의 NIa 의 그것과 같이 동일 또는 비슷한 특이성을 가져야 한다. 이런 면에서, 프로테아제는 일반적으로, 인식 서열을 변화하거나 유용한 수준 아래로 활성을 감소시키지 않으면서 실질적인 변화가 가능한 것이 본 분야의 숙련자에게 명백한 경우를 제외하고는 서열 식별 번호 2 중의 아미노산 잔기 4 ∼ 437 과 실질적인 서열 상동성을 가져야 한다.

일반적으로, 임의의 주어진 단백질의 활성은 분자의 특정 보존 부위에 의존하는 한편, 사실상 또는 완전히 여분의 것일 수 있는 기타의 부위는 그들의 특별한 서열과 관련된 중요성을 거의 갖지 않는다. 따라서, 상기 언급했듯이, 본 발명은여전히 자연 발생의 NIa 의 것과 유사한 특이성을 나타내는 서열상의 임의의 돌연변이체 또는 변이체를 포함한다. 이러한 돌연변이체 및 변이체는, 예컨대, 결실, 부가, 삽입, 역위, 반복 및 형태 - 치환 (예, 하나의 친수성 잔기를 다른 것으로 치환, 그러나 규칙으로서 강한 친수성기가 강한 소수성기로 치환되지는 않음) 의 경우를 포함한다. 작은 변화는 그것이 분자의 중요 부분이 아니라면 활성에 거의 영향을 미치지 않으며 이러한 변화는 유전자 조작, 예컨대 원한다면, 여분의 제한 부위를 발생시키는 경우 부산물이 될 수 있다.

일반적으로, 본 분야의 숙련자에게 명백한 환경을 제외하고는, 대개는 NIa 의 구조 변화를 원하는 어떤 특별한 이유는 없을 것이다. 사실, 아미노산 또는 코딩 서열에 대한 대부분의 돌연 변이 및 변이는 원래의 야생 형태 바이러스상의 신규의 변이를 분리하는 결과로서 일것이다. 고의이건 우연이건 불구하고, 프로테아제가 필요한 특이성 및 충분한 단백질 분해 활성을 갖는다면, 변경은 본 발명으로 부터 제외되지 않는다.

여기서 사용하는 용어 "역효과" 는 프로테아제를 활성이 유용 수준 아래로 감소될 정도로 상기 정의한 자연 발생의 NIa 보다 훨씬 덜 효과적이게 하는 임의의 특이성 또는 활성에 대한 효과를 의미한다.

다수의 치환, 부가 등은 영향을 받을 수 있으며, 하나의 제한은 활성이 역으로 효과를 받지 않는다는 것이다. 일반적으로, 활성에 대한 역효과는 NIa 의 3 - D (3 차) 구조가 심각하게 영향받는 경우에만 발생할 것이다.

용어 "돌연변이체" 는 여기서 활성에 역효과를 주지 않는 서열 중의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입, 역위 및 치환에 관해 사용된다. 본 발명은 추가로 "변이체" 를 포함하며, 이 용어는 식별 번호 2 에 밀접하게 상응하는 많은 집단내에 기대되는 방식의 다양한 자연 발생의 CYVV NIa 와 관련하여 사용된다. 이런 정의내에는 대립 형질의 변이 및 활성이 비슷한 형태를 보이며 관련된 서열을 갖는 다른 배양물로부터의 펩티드가 있다.

NIa 나 본 발명의 두번째 구현예의 단백질 어느것도 서열 식별 번호 2 와 12 의 각각에 기술된 서열에 완전히 상응 필요는 없다고 생각할 수 있다. 단지 필요한 것은 폴리펩티드가 전체 자연 서열의 단편일 뿐이거나 그러한 단편의 돌연변이체 또는 변이체일지라도 각각이 목적하는 활성을 갖는 것이다.

인테 페론 유전자와 같은 진핵 생물의 유전자는 일반적으로 다형태 (polymorphism) 인 것으로 여겨진다 [참고, 니시 일행 (1985), J. Biochem. 97, 153 - 159]. 이 다형태는, 뉴클레오티드 서열의 치환에도 불구하고 아미노산 서열에 변화가 없는 경우 뿐아니라 폴리펩티드에 하나 이상의 아미노산이 치환되는 몇몇 경우를 가져온다.

따라서, 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로테아제 활성에 어떤 역효과도 없다면 임의의 바람직한 방법으로 변형될 수도 있다. 국소 돌연변이 및 기타의 변화는 제한 부위를 첨가 또는 삭제, 예컨대, 그렇지 않다면 유전자 조작 / 발현을 보조하거나, NIa 분자를 보강하거나 그렇지 않으면 편리하게 변경하도록 영향 받을 수 있다.

용어 "돌연변이체" 과 "변이체" 는 여기서 또한 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용되며 이러한 관련은 적합한 방법, 즉 준용하여 해석하여야 한다. 펩티드 서열의 돌연변이체이나 변이체가 항상 뉴클레오티드 서열의 코딩에서 반영될 것이나, 그 역은 항상 옳은 것은 아니다. 따라서, 뉴클레오티드 서열이 어떤 식으로든 펩티드 서열에 영향을 주지 않고 실질적으로 변화되는 것이 가능할 수 있다(하기의 유전자 코딩의 변성의 논의 부분 참조). 이러한 뉴클레오티드 서열의 돌연변이체와 변이체는 본 발명의 범주내이다.

예컨대, 인터루킨 2 (IL - 2) 유전자내의 시스테인 코돈을 세린 코돈으로 대치하여 수득되는 단백질은 여전히 IL - 2 활성을 나타낼 수 있는 것으로 정립되고 있다 [왕 일행 (1984), Science 224 : 1431 - 1433]. 그러므로, 서열이 적당한 NIa 활성을 갖는 자연 발생 또는 합성 단백질을 코딩하는 한, 본 발명에 포함된다.

본 발명의 NIa 를 코딩하는 유전자는 쉽게 식별 번호 2 로 부터 본 분야의 전문가에게 역의 공정을 행할 수 있다.

임의의 하나의 주어진 역 - 공정된 서열은 유전자 코딩의 변성때문에, 동일 펩티드로부터 역 - 공정된 임의의 주어진 상보성 서열과 함께, 반드시 혼성화가 잘되지는 않을 것이고, 또는 전혀 되지 않을 것이다. 이것은 본 분야의 전문가의 계산에 통상적인 요인이며, 임의의 주어진 서열의 변성은 흔히 광범위하여, 자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열의 프로브 (probe) 으로서 작용하기 위해 심지어는 짧은 상보성 올리고뉴클레오티드 서열을 합성하는 것이 극도로 어려워진다.

코딩의 변성은 예컨대, 대부분의 흔히 발생하는 아미노산에 4개 이상의 가능한 코돈이 있을 수 있는 것과 같은 것이다. 따라서, 임의의 주어진 펩티드의 가능한 코딩 서열의 수는 잔기의 수에 따라 지수적으로 증가할 수 있다. 이와 같아서, 본 발명의 NIa 의 가능한 코딩 서열의 수는 6 이상의 수를 가질 수 있다고 생각된다. 그러나, 관련된 발현 체계에 따라 G + C 의 함량을 균형 잡는 것이 바람직하며, 일반적으로 관련된 발현 체계의 코돈 빈도와 같은 기타의 요소를 고려하여야 한다.

상기와 같이, 혼성화는 서열 상동성의 믿음직한 표식이 되지 못하나, 그럼에도 불구하고, 50 % 초과, 바람직하게는 70 %, 더욱 바람직하게는 80 %, 가장 바람직하게는 90%의 서열 식별 번호 1 과의 상동성을 나타내는 서열이 일반적으로 바람직하다. 각각의 경우에, 상기 정의된 바와 같이, 프로테아제는 코딩되는 것으로 생각할 수 있을 것이다.

본 발명으로 프로테아제의 윗방향을 코딩하는 리더 (leader) 서열의 가능한 사용도 구상할 수 있다. 이것은 숙주에서 융합 단백질을 나오게 하고, 예를들어 배양 상층액으로 수집된다. 이어서 수득한 외부로 나온 융합 단백질은 자가분해를 허용하게 되고, 폴리펩티드가 수집된다. 이러한 신호 서열을 위하여, 특히 주어진 발현 체계를 위하여 구체적으로 전개되었을 경우, 적당한 서열이라면 어느것이라도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 서열을 포함하는 벡터 (vectorn) 를 구상할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 일반적인 벡터의 성질을 본 발명에서 중요하지 않다. 일반적으로, 적당한 벡터 및 발현 벡터 및 구성물은 당해 공지이며, 수행자가 클로닝 또는 발현과 같은, 서열로 성취하고자 하는 것을 정확하게 선택할 수 있다.

적당한 발현 벡터는 파지 또는 플라스미드에 근거 할 수 있으며, 이들은 종종 다른 숙주에 대하여 공정 될 수 있지만, 이들 모두는 일반적으로 숙주 특이성이 있다. 다른 적당한 벡터에는 코스미드 (cosmid) 및 리트로바이러스 및 어떠한 다른 운반체 일 수도 있으며 주어진 체계에 대하여 특이성이 있을 수도 또는 없을 수도 있다. 발현의 조절을 위해 필수적이며 및/또는 유용한 인식, 프로모터, 오퍼레이터, 유도자, 터미네이터등과 같은 적당한 조절 서열은 당해 숙련가에게는 명백히 알 수 있으며, CYVV 와 또는 사용된 벡터와 연합될 수 있으며, 또는 적당한 다른 원으로 부터 유도될 수 있다. 벡터는 다른 적당한 방법으로 변경되거나 공정 될 수 있다.

서열 식별 번호 2 가 전체 NIa 를 코딩하는 충분한 서열을 나타낸다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 터미네이터, 프로모터 및 요구되는 조절 서열등은 예를들어 연결 (ligation) 또는 발현, 또는 이 모두를 용이하게 하기 위하여 적당한 벡터에 첨가될 수 있다.

절단 서열을 코딩하는 절편과 함께, 본 발명의 NIa 를 코딩하는 DNA 절편 및 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 절편은 다른 적당한 벡터에 쉽게 삽입될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 전형적으로, 수용 벡터는 삽입의 용이성을 위하여 적당한 제한 부위를 갖지만, 예를들어 블런트 말단 (blunt - end) 연결도 사용될 수도 있다.

그러나 이것은 개방 해독틀 (open reading frame) 및 삽입 방향에 걸쳐서 불확실성을 초래할 수 도 있다. 이러한 예에서, 형질 전환 벡터에 의하여 정확한 방향 및 정확한 ORF 에 삽입된 필요한 절편을 갖는 벡터를 선택하기 위하여 형질 전환된 숙주를 시험하는 것은 당연한 일이다. 절편이 정확한 ORF 에 있다는 것을 확인 하기 위하여, 서열 a), b) 및 c) 의 구조를 창설하고, 이어서 벡터에 직접 삽입함으로써, 요구되는 발현 벡터를 수득하는 것에 대한 불확실성을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 적당한 벡터는 요구되는 발현 체계에 따라 당해 공지 기술에 의하여 당연히 선택될 수 있다.

예를들어 수득한 플라스미드로 이. 콜리를 형질전환하고, 암피실린 또는 다른 적당한 수단으로 형질전환체를 선별하고, 트립토판 또는 다른 적당한 프로모터 유도자 (인돌아크릴산 등)를 가함으로써, 요구되는 융합 단백질이 발현될 수 있다. 발현 정도는 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동 - SDS - PAGE [람니 일행, Nature, (1970), 227, PP · 680 - 685] 로 분석될 수 있다.

예를들어 다른 벡터를 사용하는 경우, 적당한 선별 표식자 또는 표식자들 또는 선별의 대안적인 방법을 사용하거나, 및/또는 필요하거나 또는 편리한 적당한 프로모터를 사용하는 것이 동등하게 허용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

배양후, 융합 단백질이 숙주 세포로 부터 수집되려면, 형질전환 세포는 적당하게 수집되고, 예를들어 초음파 처리로 파쇄, 및 원심 분리된다. 파쇄는 예를들어 셀룰라제를 사용한 효소 분해와 같은 방법, 또는 유리 비드등과 같은 제제로 흔들어서 수행될 수 있지만, 별도의 성분이 필요하지 않기 때문에 초음파등과 같은 방법이 일반적으로 바람직하다. 수득한 상층액은 폴리펩티드 활성을 위하여 분석될수 있으며, 절단 생성물은 예를들어 SDS - PAGE 로 결정될 수 있다.

통상의 단백질 정제법이 발현 생성물을 수득하기 위하여 적당하다.

본 발명의 DNA 는 클로버 황색 엽맥 바이러스로 부터 RNA 게놈을 분리하여 제조될 수 있다 [우에다 일행 (1975) Ann. Phytopath. Soc. Japan 41 : 92 - 203]. CYVV 의 적당한 재료는 미국형 배양 종균 번호 PV 123 이다. 어떠한 결과에서도, 클로버 황색 엽맥 바이러스는 비시아 파바 (Vicia faba) 의 괴사를 야기하는 바이러스로써 정의될 수 있다.

게놈 RNA 는 감염된 식물로 부터 정제된 CYVV 입자로부터 수득될 수 있고, 공지 방법으로 역전사되어 이중 사슬 cDNA가 제조될 수 있다.

바이러스가 동일한 CYVV 균주의 돌연변이체 또는 변이체인지 결정하기 위하여는, 서열 상동성이 양호한 지표이다. 여러 종류의 포티 바이러스가 공지이며, 이들은 모두 병원성에 있어서 다양하다. 주어진 바이러스가 과 (family) 의 분리 구성원을 형성하는 지는 바이러스 외피 단백질의 혈청학적 관계 및 아미노산 서열의 상동성에 근거한다.

따라서, 90 % 상동성을 공유하는 일차 아미노산 서열을 갖는 바이러스는 동일한 균주로 간주되는 반면, 70 % 미만의 상동성을 공유하는 일차 아미노산 서열을 갖는 바이러스는 구별되는 과 구성원으로 간주된다 [수클라, 왈드. (1989), Arch. Virol. 106: 171 - 200]. 본 발명에서 사용된 CYVV 외피 단백질의 여러가지 성질에 근거하여 [우에다 일행 (1991), Intervirol, 32: 234 - 245], CYVV 는 포티바이러스 과의 독립 구성원으로써 인지된다. 그러므로, 90 % 이상의 상동성을 공유하는일차 아미노산 서열의 외피 단백질을 갖는 바이러스, 또는 항- CYVV 항 - 혈청 (예를들어, American Type Culture Collection No. PVAS - 123: 클로버 황색 엽맥 바이러스 항 혈청) 을 사용한 ELISA 에 의하여 양성으로 검출되는 바이러스는 클로버 황색 엽맥 바이러스 균주로서 정의된다.

CYVV 가 증식할 수 있는 여러가지 식물종은 하기를 포함한다. 파세오루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris), 비시아 파바 (Vicia faba) 및 피숨 사티붐 (Pisum sativum) , 그러나, 비시아 파바 재배 와세 - 소라마메 (Wase - sormame) 가 바람직하다.

바이러스 입자를 정제하기 위한 바람직한 방법은 적당한 완충용액에서 감염된 식물의 잎 또는 잎들을 균질화 및 압착한 후, 클로로포름등과 같은 유기 용매로 추출하고, 선별 원심 분리를 반복한 후, 수크로스 밀도 구배 원심분리하는 것을 포함한다.

이와같이하여 수득한 바이러스 입자가 CYVV 인것을 확인하는 한 방법은 전자 현미경하에 바이러스 입자를 검사하는 것이다. 또 다른 방법은 어떤 증후가 일어날 것인가를 관찰하기 위하여 바이러스 입자로 비시아 파바 를 접종하는 것이다.

바이러스 입자로 부터 게놈 RNA 를 추출하는 적당한 방법은 구아니디늄 티오시아네이트 / 페놀 방법, 구아니디늄 티오시아네이트 / 트리플루오로 세슘 방법 및 페놀 / SDS 방법을 포함한다. 그러나, 염기성 수크 밀도 구배 원심 분리법을 사용하는 것이 바람직하다 [도우헤티 및 히버트 (1980) Virology 101 :466 - 474].

그후, 상술한 바와같이 수득한 RNA 로 무세포 번역 체계에서 번역에 의하여프로테아제를 확실히 코딩하는 것을 확인하는 시험을 할 수 있다. 자가분해(자가소화)로 용균액으로 부터 수확된 생성물의 분자량의 변화를 모니터하여 총 번역 생성물내에 있는 바로 그 프로테아제보다 더 많은 RNA 코딩이 있는 곳을 검출할 수 있다. 이러한 모니터링은 예를들어 항 - 외피 단백질 항체로 수행될 수 있다.

필요하다면, 번역 생성물의 생산은 그후 항 - 외피 단백질 항체를, 예를들어 제노푸스 라에비스 (Xenopus laevia) 난모세포로 주입하여 번역되는 게놈 RNA 와 함께 사용하거나 [구돈 (1972), Nature 233 : 177 - 182] 또는 토끼 망상 적혈구 또는 밀 배아 용균 체계를 사용하여 [쉴라이프 및 베니싱크 (1981), "Practical Methods in Molecular Bioogy" Springer - Verlag, N.Y.] 시간의 경로를 모니터링할 수 있다.

단일 사슬 DNA 는 상기에서 수득한 게놈 RNA를 주형으로 사용하고, 역 전사효소를 사용하여 합성될 수 있으며, ds - cDNA 는 하기 표준 방법을 수행하여 단일 사슬 (ss) 로부터 합성될 수 있다. 적당한 방법은 S1 뉴클라제 법 [에프스트라티디아티스 일행 (1976), Cell. 7 : 279 - 288 ; 오까야마 및 베르그 (1982) Mol. Cell. Biol. 2 : 161 - 170 등], 랜드 법 [랜드 일행 (1981) Nucleic Acids Res. 9, 2251 - 2266] 및 오 준 유 법 [유, O. J. 등 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1049 - 1053] 을 포함한다. 여러가지 선택중에서, 구블러 - 호프만 법 [구블러 및 호프만 (1983), Gene 25: 263 - 269] 을 더 선호하여 사용한다.

그후 이와같이하여 수득한 ds - cDNA 를 플라스미드 또는 람다 파지등과 같은 클로닝 벡터에 도입하고, 이어서 수득한 재조합 벡터를 이. 콜리 등과 같은 미생물로 형질 전환된다. 이. 콜리 균주 DH5α는 특히 바람직하다. 그후 형질 전환체는 당해 공지 기술로 테트라사이클린 또는 암피실린등과 같은 살균제에 대한 그들의 내성에 의하여 선별될 수 있다.

예를들어 형질전환은 하나한 법 [하나한 (1983), J. Mol. Biol. 166 : 557 - 580] 으로 수행될 수 있으며, 여기에서 재조합 DNA 벡터는 염화칼슘, 염화마그네슘 또는 염화루비듐으로 처리하여 콤피텐트 (competent)하게 만들어진 세포에 도입된다.

NIa DNA 를 갖는 형질 전환체를 선택하기 위한 적당한 방법을 하기에 나타낸다.

(1) 프로브에 의한 스크리닝 (Screeening)

야생형 CYVV 로 출발하는 것이 바람직하다면, 적당한 RNA 를 분리하는 한 방법은 cDNA 프로브를 사용하는 것이며, NIa 의 아미노산 서열은 밝혀진것이다 (사용된 서열의 부분은 NIa 의 어떠한 부분일 수도 있다). 그러므로, 적절한 아미노산 서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 일반적으로, 선택된 아미노산 서열은 최소량의 가능한 변형을 포함하며, 그렇지않으면 여러 가능한 코돈을 사용하여 여러개의 프로브를 제조할 필요가 있을것이다. 그러한 경우, 코돈 이용 빈도를 고려할 수 있다. 대안적으로, 복수의 뉴클레오티드 서열을 고려할 수 있으며, 이노신은 다양한 뉴클레오티드들 대치하는데 사용할 수 있다. 이어서 프로브는³²P,³⁵S 또는 바이오틴 등과 같은 방사성 동위원소로 표식할 수 있다. 그후 형질전환체 균주는 방사성 동위원소로 표식된 프로브를 사용하여 니트로셀룰로스 필터상에 변성된 플라스미드 DNA를 고정함으로써 검출되며 양성 클론이 방사선 자동 사진법에 의하여 검출된다.

(2) PCR 프로브의 사용

이 기술에서는, 공지 아미노산 서열의 부분에 해당하는 전사 사슬 및 비전사 사슬모두로 부터의 올리고뉴클레오티드을 합성할 수 있으며, 폴리머라제 연쇄 중합 반응 [사이끼 일행 (1988), Science 239, 487 - 491] 이 수행된다. 그후 이들은 NIa 를 코딩하는 DNA 절편을 증폭하기 위하여 조합하여 사용될 수 있다. 적당한 주형 DNA 는 NIa 를 코딩하는 것으로 알려진 바이러스 게놈 RNA 의 역 전사를 통하여 수득된 cDNA 이다. 이렇게하여 제조된 DNA 절편을³²P,³⁵S 또는 바이오틴 등으로 표식하고, 콜로니 혼성화 또는 플라크 혼성화를 이 프로브로 수행하여 관계가 있는 클론을 선별한다.

(3) 동물세포에 있어서 외생의 생성물에 의한 스크리닝

이 방법은 유전자를 증폭하기 위하여 형질 전환체 균주를 배양한 후, 유전자를 동물세포 (일반적으로 복제능이 있으며 전사 프로모터 부위를 포함하는 플라스미드를 사용하거나, 또는 적당한 염색체에 삽입될 수 있는 플라스미드를 사용한다) 로 형질전환하여 유전자에 의하여 코딩된 단백질을 발현하는 것을 포함한다. 관계 있는 활성을 측정함으로써, 균주가 선택될 수 있다.

(4) NIa 에 대한 항체를 사용한 선별

항체는 CYVV 로 감염된 식물로 부터 핵 함유물 (NIa 및 NIb) 에 대하여 제조되거나, 또는 적당한 체계에서 발현 벡터에 의하여 생성된 단백질에 대하여 제조될 수 있다. 그후 항체 또는 그의 안티 - 항체는 요구되는 NIa 또는 관계가 있는 균주를 검출할 수 있다.

(5) 번역 체계의 선택적 혼성화

형질 전환체 cDNA 는 상술한 바와 같이 NIa 를 발현하는 세포로부터 mRNA 와 혼성화 되며, cDNA 에 결합된 mRNA 는 해리 및 회수된다. 회수된 mRNA 는 번역 체계에서 예를들어 제노푸스 라에비스 난모세포 또는 토끼 망상 적혈구 용균 또는 밀 배아 용균과 같은 무세포 - 체계에 주입되어 단백질로 번역된다. 관련된 균주는 NIa 의 활성을 시험하거나, NIa 에 대한 항체로 NIa 를 검출하여 선별된다.

CYVV NIa 를 코딩하는 DNA 는 공지 방법에 의하여 관련된 형질전환체 균주로 부터 수득될 수 있다 [참조 마니아티스 일행 (1982), "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.]. 예를들어, 벡터 DNA 에 대응하는 분획은 세포로부터 분리되며, 상기 단백질을 코딩하는 DNA 부위는 상기 플라스미드 DNA 로 부터 절단된다.

이와같이 하여 수득된 DNA 서열의 결정은 예를들어 맥삼 - 길버트 화학 변형법 [맥삼 및 길버트 (1980), "Method in Enzymology" 65 : 499 - 276] 을 사용하거나, 또는 예를들어 M13 파지를 사용한 디데옥시뉴클레오티드 연쇄 종결법 [Messing, J. 및 Vieira, J. (1982), Gene 19 : 269 - 276] 을 사용하여 수행될 수 있다.

최근, 플루오로크롬이 DNA 서열을 결정하기 위한 더 위험한 방사성 동위원소의 사용을 대치하는 경향이 있다. 그밖에, 디데옥시뉴클레오티드 연쇄 종결법은 현재 일반적으로 컴퓨터 조절하의 자동장치에 의하여 수행된다. 전기영동후에 염기 서열을 판독하는 체계는 또한 풍부해졌으며, 예로서 "CATALYST 800" 서열 자동분석기 및 373A DNA 서열 분석기 (페킨 - 엘머 일본 어플라이드 바이오 시스템) 를 포함한다. 이들 체계는 수행될 DNA 염기 서열의 측정 방법을 효율적이고 안전하게 할 수 있게 한다.

본 발명의 벡터는 일반적으로 조직되어 원핵 또는 진핵의 "표준 세포" 에서 발현될 수 있게되었다. 그밖에, 형질발현을 위해 벡터에 적당한 프로모터 및 서열을 도입함으로써, 유전자는 여러가지 숙주 세포안에서 발현될 수 있다.

적당한 원핵 숙주는 이. 콜리 및 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 를 포함한다. 적당한 유전자의 형질 발현을 위하여, 벡터는 숙주와 상용성이 있는 종으로 부터 기원하는 레플리콘(replicon)을 적당하게 포함한다. 이. 콜리르에서, 플라스미드는 lac 또는 UV5 등과 같은 프로모터 서열 및 복제 원점을 포함할 수 있다. 형질 전환된 세포에 표현 특성 (표현형) 을 근거로한 선택성을 부여할 할 수 있는 벡터가 바람직하다.

이. 콜리는 종종 숙주로서 사용되고, 이. 콜리 균주 K12 로 부터 유도된 균주 JM 109 는 바람직한 숙주이다. 이. 콜리를 위한 벡터는 일반적으로 pBR322 또는 플라스미드의 pUC 계열로 부터 선택되지만, 필요에따라 다른 균주 및 벡터가 사용될 수 있다. 이. 콜리를 위한 적당한 프로모터는 락토스 프로모터 (lac), 트립토판프로모터 (trp), 트립토판 - 락토스 (tac) 프로모터, 지방 단백질 (lpp) 프로모터, 람다 (λ) PL 프로모터 (λ 파지) 및 폴리펩티드 사슬 신장 인자 Tu (tufB) 프로모터를 포함하지만, 본 발명은 이들 프로모터에 제한되는 것은 아니다.

적당한 바실루스 서브틸리스 균주는 균주 207 - 25 를 포함한다. 적당한 벡터는 pTUB228 [오무라 일행 (1984), J. Biochem. 95 : 87 - 93] 등을 포함한다. 적당한 프로모터는 바실루스 서브틸리스 α- 아밀라제 유전자의 조절 서열이다. 이것은 신호 펩티드 서열 (α- 아밀라제로부터) 인 적당한 보기이며, 세포외 분비를 위하여 사용될 수 있다.

진핵 세포에서 융합 단백질을 발현하는 것이 바람직하다면, 세포는 척추 동물, 곤충, 효모, 식물등이 사용될 수 있다. 바람직한 척추동물 세포는 COS 세포, 특히 COS - 1 세포 [예를들어, 글루즈만, Y. (1981), Cell 23 : 175 - 182], 또는 디히드로 엽산 환원효소가 부족한 차이니즈 함스터 난소 세포주 (Chinese hamster ovary cell line, CHO) [울랍 및 카신 (1980), Proc. Natl, Acad. Sci. USA 77, 4216 - 4220] 이다. 본 발명은 이러한 예에 제한되지 않는다.

상술한 바와같이, COS 세포는 척추동물 숙주 세포로서 적당하게 사용되며, 이들은 예로서 사용될 수 있다. SV40 레플리콘을 함유하는 발현 벡터는 COS 세포에서 자율적으로 복제될 수 있으며, 이들은 전사 프로모터, 전사 종결 서열 및 하나 이상의 스플라이싱 (splicing) 부위가 제공된다. 요구되는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터는 예를들어 DEAE - 덱스트란 법 [루드만 및 마그누손 (1983), Nucleic Acids Res. 11, 1295 - 1308], 인산칼슘 - DNA 공침강 법 [그라함 및 반 데 에브(1973), Virology 52, 456 - 472] 및 전기 영동법 [노이만 일행 등. (1982), EMBO J. 1, 841 - 845] 등과 같은 여러가지 방법으로 COS 세포를 형질 전환하는데 사용될 수 있다.

CHO 세포가 숙주 세포로 사용된다면, G418 내성을 갖게하는 네오 유전자를 발현할 수 있게 하는 벡터를 사용하는 것이 적당하다. 이러한 표식자를 운반하는 적당한 벡터는 pRSVneo [삼브루크 일행 등 (1989): "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY] 및 pSV2 - neo [서던 및 베르그 (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1, 327 - 341] 를 포함한다. 그 후 형질전환체는 G418 에 대한 그들의 내성에 의하여 선별된다.

선별된 형질 전환체는 통상의 방법으로 배양될 수 있으며, 본 발명의 두 번째 구현예의 경우에, 폴리펩티드는 세포내 및 세포외 모두에서 생성된다. 적당한 배양배지는 사용된 숙주 세포에 따라 일반적으로 사용되는 것에서 선택될 수 있다. 예를들어, COS 세포에 대하여, 태내 소 혈청등과 같은 혈액 성분을 함유하는 배지는 RPMI - 1640 배지 또는 둘베코 변형 이글스 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) 등과 같은 배지에 필요한 만큼 가할 수 있다.

실험자가 곤충 세포를 사용하는 것을 선호한다면, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 로 부터 유도된 세포 [스미드 일행 등. (1983), Mol. Cell. Biol. 3 : 2156 - 2165] 가 사용될 수 있다.

적당한 효모는 빵 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 및 분열 효모 (Schizosaccharomyces pombe) 를 포함한다.

적당한 식물 세포는 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 및 오리자 사티바 (Oryza sativa) 를 포함한다.

상기 열거된 숙주가 당 분야에서의 표준 숙주이고, 당 분야의 기술자는 상기 및 다른 숙주중에서 적절한 것을 선택할 수 있을 것으로 여겨진다.

척추동물 세포의 적합한 발현 벡터는 RNA 스플라이싱 위치, 폴리아데닐화 위치, 및 전사 종말 서열과 함께, 발현될 유전자의 상위에 위치하는 프로모터를 갖는, 또한 필요에 따라, 복제 원점을 갖는 것을 포함한다. 상기 발현 벡터의 적합한 예는 pSV2dhfr이고, 이는 SV40 초기 프로모터를 갖는다 [수브라마니 일행 (1981), Mol. Cell. Bio. 1 : 854 - 864].

곤충 세포에 적합한 발현 체계는 스포도프테라 프루기페르다 의 배양된 세포를 포함한다. 적합한 발현 벡터는, 예를들면, 폴리아데닐화 위치 및 동종 재조합에 필요한 AcMNPV (아큐토그라파 칼리포르니카 핵 다면성 바이러스) 게놈의 부위와 함께, 발현될 유전자의 상위에 위치하는 바큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터를 갖는다. 하나의 예로는 pBacPAK8 이 있다 [마투라 일행 (1987), J. Gen. Virol. 68: 1233 - 1250].

진핵세포 발현을 위해, 빵 효모 (S. cerevisiae) 와 같은, 효모가 대체적으로 사용된다. 효모에 적합한 발현 벡터는 예를들면, 알콜 디히드로게나제 프로모터 [베네및 할 (1982), J. Biol. Chem. 257 : 3018 - 3025], 산성 포스파타제 프로모터 [미야하라 일행 (1983), Proc. Natl. Acad, Sci. USA 80, 1 - 5], 또는 카르복시펩티다제 Y 프로모터 [이사가와 일행 (1993), Biosci. Biotech. Biochem. 57 :1686 - 1690] 를 포함한다. 상기 예에서, 세포외 공간으로 분비를 수행하기 위해, 카르복시펩티다제 Y의 단일 펩티드 서열이 또한 사용될 수 있다.

식물에 적합한 발현 벡터는, 예를들면, 35S 프로모터 (콜리플라워 모자이크바이러스의 초기 프로모터로 부터 유도) 를 갖는 pBI121, 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 합성 유전자의 폴리아데닐화 서열, 및 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자 전이 서열 [제퍼슨 일행 (1987), EMBO J. 6: 3901-3907] 을 포함한다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스의 감염 및 일렉트로포레이션 (electroporation) 과 같은 방법에 의해 식물세포로 주입할 수 있다.

플라스미드 pKK388-1 (Clonetech Co. 사 제조) 는 trc 프로모터를 가지며 이. 콜리 에서의 사용을 위해 적합하다. 상기 발현 벡터는 균주 JM109 와 같은, 이. 콜리 균주 K12 로 부터 유도된 균주에서 자가 복제될 수 있다. 상기 벡터는 상기 언급된 바와같이 이미 공지된 방법에 의해 이. 콜리로 용이하게 주입될 수 있다. 이어서 수득된 균주를 이미 공지된 LB 배지와 같은, 배지에 접종하여 잠시 동안 배양시킬 수 있다.

예를들면, 이소프로필 - β- 갈락토피라노시드 (IPTG) 를 첨가함으로써 trc 프로모터를 활성화시켜 프로모터를 유도할 수 있다. 더 배양시킨 후, 초음파처리로, 세포를 분쇄시켜 세포로 부터 발현된 단백질을 추출할 수 있다. N-말단에 Pro 를 갖는 단백질을 제조하고자 한다면, 일반적으로는 숙주로서 이. 콜리를 사용하는 것이 적합할 것이다.

상기 설명을 이용하고, 필요에 따라, 실행된 실시예를 설명함으로써, 목적한폴리펩티드를 함유하는 적합하게 형질전환된 세포의 배양액으로부터, 분획을 폴리펩티드의 물리적 및 화학적 성질에 따라, 공지된 방법으로 분리 정제할 수 있다. 적절한 상기 방법은 단백질 침전제로의 처리, 초여과법, 각종 크로마토그래피 [분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)], 투석 및 상기 방법들의 조합을 포함한다.

발현된 NIa 단백질이 필요한 프로테아제 활성을 갖는지를 측정하기 위해, 정제된 NIa 단백질을, 핵 함유물 b (NIb) 와 함께 바이러스 외피 단백질 (NIa 의 천연 기질) 을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 생성물과 같이, 프로테아제에 대한 절단 서열을 함유하는 기질 단백질과 반응시킬 수 있다 [도우헤티 일행 (1988), EMBO J. 7: 1281-1287]. 상기 융합 단백질을 바이러스 게놈 cDNA 로 부터 분리시켜 발현 벡터에 삽입시킬 수 있다. 생성된 발현 벡터를 적합한 숙주 세포로 도입하여 융합 단백질을 생성한다. 단백질 침전제 또는 크로마토그래피와 같은, 공지된 방법으로 생성된 융합 단백질을 처리함으로써, 융합 단백질을 분리 정제할 수 있다.

이어서 분리 정제된 기질 단백질을 적절한 온도, 적절한 완충용액중에서 상기 프로테아제와 반응시켜 반응 생성물을 회수할 수 있다. 회수된 반응 단백질을 전기영동하고 항-외피 단백질 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅 (Western Blotting) 을 수행함으로써 프로테아제 활성을 밴드의 이동성의 차이로서 확인할 수 있다. 상기 방법에서, 적당한 절단 서열을 함유하는 합성된 올리고펩티드를 사용하는 것이또한 가능하다.

본 발명의 프로테아제의 단백질 가수분해 활성을 정제하지 않고 확인할 수 있다. 이어서, 활성은 서열 및 동일한 개방 해독 틀내의 프로테아제 유전자를 trc 프로모터와 같은 프로모터의 하위, 및 프로테아제에 대한 절단 서열의 상위에 연결시키므로서 측정될 수 있다. 프로테아제가 발현 생성물에서 활성화된다면, 융합 단백질 보다 더 높은 이동성의 밴드는 웨스턴 블로팅에 의해 관찰될 수 있을 것이다.

절단이 관찰되는 겔로 부터 밴드를 회수하고 통상적인 방법으로 그의 아미노 말단 서열을 분석함으로써, 단백질이 목적한 펩티드 결합에서 절단되는지를 확인할 수 있다.

생성하고자 한 단백질은, 예를들면, 글루타티온 S - 트랜스퍼라제와 같은 단백질과 함께 융합 단백질로서 생성될 수 있으며, 본 발명의 NIa는 체외에서 연결 서열을 절단하는데 사용될 수 있다. 한편으로는, 목적한 단백질은 상기 프로테아제와 함께 융합 단백질로서 숙주세포에서 직접 발현되고, 목적 단백질이 자가-분해에 의해 제조된다.

필요에 따라, NIa 는 상기 방법을 사용하여 고수율 및 고정제도로 용이하게 생성될 수 있고, 이어서 수득된 본 발명의 재조합 NIa 는 프로테아제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 DNA 를 화학적으로 합성하고자 한다면, 포스파이트 트리에스테르 방법 [훈카필러 일행 (1984), Nature 310 : 105 - 111] 또는 핵산의 화학적 합성 [그란탐 일행 (1981), Nucleic Acids Res. 9 : r43 - r74] 와 같은, 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 필요에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열의 부분적 변형은, 목적한 변형을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드를 함유하는 프라이머를 사용하는, 부위-특이적 돌연변이 [마크 일행 (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81 : 5662 - 5666] 와 같이, 통상적인 방법에 의해 유효할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 예를들면, 무작위 프라이머 방법 [페인베르그 및 볼게스타인 (1983) Anal. Biochem. 132 : 6 - 13], 또는 닉 (nick) 전사법 [마니아티스 일행 (1982), in "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.] 으로, 예를들어, [α-³²P]dCTP 로 표지된 프로브를 사용하여 혼성화를 수행할 수 있다. DNA 를 예를들어, 니트로셀룰로스막 또는 나일론막에 흡착시킨 다음, 가열 또는 자외선을 조사하는, 통상적인 방법으로 고형상에 고정시킨다. 고형상을 전형적으로, 6 배의 SSC, 5 % 덴하르트 용액 및 0.1 % SDS 를 함유하는 예비 혼성액에 침지시켜, 55 ℃ 에서 4 시간 이상 반응시킨다. 이어서, 미리 제조된 프로브를 최종 고유 활성도 1 x 10⁶cpm/ml 로 예비 혼성액에 첨가하여 혼합물을 60 ℃ 에서 하룻밤 반응시킨다. 이어서 고형상을 6 배의 SSC 로 실온에서 5 분씩 5 회를 반복하여 세척한 다음, 이어서 57 ℃에서 20 분간 세척하고, DNA 가 혼성화되었는지를 측정하기 위해 방사선 자동 사진법을 수행한다. 상기 특정 실시예를 나타내는 것이고, 다른 방법도 동일하게 가능하다.

세포내 직접 절단법 및 세포외 절단법 중 하나에 의해 목적 단백질을 제조할 수 있다.

세포내 직접 절단법

NIa 를 코딩하는 DNA 는 절단 서열, 바람직하게는 Gln-Gly, Gln-Ser 또는 Gln-Ala 를 통해 목적 단백질을 코딩하는 DNA 에 연결된다.

생성된 DNA 는 융합 단백질을 코딩하며, 프로모터 및 터미네이터를 함유하는 벡터에 삽입되어, 적절한 숙주 세포에서의 발현을 수득했다.

생성된, 발현 융합 단백질은 프로테아제 활성을 통해 자가-분해되고, 그에 의해 목적 단백질의 N - 말단의 펩티드 결합에 Gly, Ser 또는 Ala가 부착된 펩티드가 생성된다. 발현되는 특히 바람직한 단백질은 IL - 11 이다.

생성된 단백질의 N - 말단으로 부터 임의의 잔기를 절단하고자 한다면, 상기 목적한 바 처럼, N - 말단의 Pro 잔기를 남기는 아미노펩티다제 P 를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.

어떠한 발현 체계는 이미 아미노펩티다제 P 가 존재한다. 그러나, 아미노펩티다제 P 가 존재하지 않고, N-말단 아미노산 잔기를 거기서 절단하고자 한다면, 아미노펩티다제 P 를 위한 발현 벡터를 숙주 세포로 도입시킬 수 있다. 아미노펩티다제 P 는 공지된 단백질이고, 효소의 유전자 서열은 당 분야에서는 용이하게 이용할 수 있다.

N - 말단에서 Pro 으로 개시되는 단백질을 수득하고자 하는 경우, 일반적으로 세포 아미노펩티다제 P 가 작용할 수 있도록 하기 위해서는 배양 기간을 늘이는 것이 유리하다.

상기 기재된 바와 같이, N - 말단 Pro 잔기는 내생 발현되거나 또는 외생 발현 벡터에 의해 발현되는 프롤린 이미노펩티다제 (3.4.11.5) 의 촉매 작용에 의해 제거될 수 있다 (효소는 공지된 단백질이고, 효소의 유전자 서열은 당분야에서 용이하게 이용할수 있다). 이와는 달리, 프롤린 잔기는, 융합 단백질이 세포로 부터 분비되는 것과 같은 발현 체계로 부터 회수후에 절단될 수 있다.

이어서, 본 발명이 임의의 목적한 N - 말단 잔기를 갖는 단백질을 생성한다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 서열이 Ala N - 말단을 갖는 폴리펩티드를 생성하는 경우, 상기 알라닌 잔기는 알라닌 아미노펩티다제 (3.4.11.14) 의 촉매 작용에 의해 제거될 수 있으며, 이 또한 공지된 효소이고, 유전자 서열은 당 분야에서는 용이하게 이용될 수 있다. 상기 방법은 또한 자유로이 선택된 N-말단 잔기를 갖는 폴리펩티드를 생성할 수 있다.

그리하여 목적 단백질을 이미 공지된 방법으로 분리 정제할 수 있다.

세포외 절단법

적합한 발현 체계를 포함하는 벡터에 적합한 DNA 를 결합시켜 NIa 를 생성할 수 있다. 형질전환된 세포에 의해 발현되어 생성된 NIa 는 이온 교환 컬럼, 겔여과 컬럼 또는 역상 컬럼과 같은 것을 사용하여 정제될 수 있다. 이와는 달리, NIa 는 글루타티온 - S - 트랜스퍼라제 또는 말토스 - 결합 단백질과 같은 또다른 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질로서 발현될 수 있으며, 이는 글루타티온 컬럼 또는 말토스 컬럼으로, 각각 사용하여 분리 정제될 수 있다. 엔테로키나제 또는 인자 Xa 를 갖는 정제된 생성물을 절단한 후, NIa 가 정제되어 사용될 수 있다.

반면, NIa 인식 서열 (절단 서열) 을 함유하는 단백질 전구체가 제조된다. 상기는 주어진 장소에 존재할 수 도 있고, 또는 단백질이, 적절한 링커 (절단 서열) 와 연결되어진, 예를들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 또는 말토스-결합 단백질과 같은 융합 단백질의 부분을 형성할 수 있다. 적합한 완충용액중에서 NIa 를 갖는 전구체의 반응이 체외에서 전구체를 절단한다. 필요에 따라, N - 말단 아미노산 잔기는 상기 기재된 바와 같이, 제거될 수 있다.

이전처럼, 생성된 단백질이 공지된 방법으로 분리 정제될 수 있다.

본 발명의 이차 구현예로서, 자연 발생 환원 펩티드는 서열 식별 번호12 로 나타내어진 서열을 가지며, N - 말단에 발린 잔기를 갖는, 526 아미노산으로 구성된 것으로 믿고 있다.

펩티드를 코딩하는 자연 발생 DNA 가 서열 식별 번호 11 로 나타낸 70 ∼ 1647 의 뉴클레오티드 서열을 갖는다고 믿고 있다.

본 발명의 펩티드는 산화된 글루타티온 및 디클로로인도페놀을 환원시킬 수 있다. 상기는 펩티드의 정확한 설명이지만, 다소 다루기가 어려우므로, 본 발명의 펩티드를 KM31 - 7 펩티드 또는 단백질로서 여기에서 또한 언급할 것이다.

KM31 - 7 단백질은 신체에서 유래되거나, 또는 그의 돌연변이 또는 변종이고, 그러므로 독성 및 / 또는 항원성에 최소의 문제가 있다.

본 발명의 이차 구현예에서, 서열 식별 번호 12 의 서열 -23 내지 526 을 갖는 폴리펩티드는 KM31-7 단백질의 전구체로 여겨지고 있다. 상기 처럼, 본 발명은 또한 상기 전구체, 뿐아니라 그의 변이 및 변종, 및 상기중 임의를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

하기의 논의는 주로 본 발명의 이차 구현예에 대한 것이다. CYVV NIa 와 관련하여 상기기재된 많은 공정은 또한 분리, 클로닝 및 본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA 의 발현에 적절하다고 이해된다. 주된 차이는 CYVV NIa 가 식물 바이러스 단백질이고, 반면 본 발명의 펩티드는 포유류 단백질이라는 사실로 부터 생긴다. 유전자 재조합 방법에 의한 포유류 세포로 부터의 발현된 특정 폴리펩티드를 수득한 일반적인 단계를 이제 설명하고자 한다.

KM31-7 을 코딩하는 mRNA 를 수득할 수 있고 이미 공지된 방법에 의해 ds-DNA 로 역전사시킬 수 있다. 임의의 적절한 포유류 세포, 세포주 또는 조직이 본래 mRNA 의 원료로서 사용될 수 있으나, 우리는 사람 골수 스트로마 세포로 부터 유도된 세포주 KM-102 의 사용을 선호한다 [하리가야 및 한다 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3447-3480].

포유류 세포로 부터 mRNA 를 추출하기 위해, 구아니딘 티오시아네이트 뜨거운 페놀 방법 또는 구아니딘 티오시아네이트 구아니딘 염산 방법과 같은 각종 방법이 사용될 수 있으나, 구아니딘 티오시아네이트 염화세슘 방법이 일반적으로 바람직하다.

진핵세포의 세포질에 존재하는 대부분의 mRNA 는 3' 말단 폴리 A 서열을 갖는 것으로 공지되므로, 포유류 mRNA 의 정제는 그에 의한 상기 특징을 이용하는 올리고(dT) 셀룰로스 컬럼으로의 흡착에 의해 수행된다. 용출된 mRNA 는 수크로스 밀도 구배 원심분리와 같은 방법으로 더욱 분획될 수 있다.

mRNA 가 실제로 목적 펩티드를 코딩하는 지의 확인은 제노퍼스 라비스 (Xenopus laevis) 난모세포 체계, 토끼 망상 적혈구 체계 또는 밀배아 체계(supra)와 같은, 적합한 체계에서 mRNA 를 번역함으로써 수행될 수 있다.

발현 생성물이 환원성의 측정은 하기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

i) 디클로로인도페놀 환원성의 측정

상기 측정의 방법은 문헌 [바이너트 in "Methods in Enzymology" (1962), 5, 546] 에 기재되어 있다.

50 μM 디클로로인도페놀 (Sigma 사 제) 은 20 mM 포스페이트 완충 용액 및 0.5 M NaCl (pH 7.8)로 제조된다. 상기 제조액 1 ml 을 큐벳 (SARSTEDT, 10 x 4 x 45 mm) 에 담은 다음 시료를 첨가하여 측정한다. 동일한 완충용액으로 조성된, 15 ㎕의 1 mM NADPH (Boeringer-Mannheim) 을 실온에서 큐벳에 첨가하여 반응을 개시시킨다.

환원효소 활성은 600 nm 에서 산화된 디클로로인도페놀의 흡광도의 감소 또는 340 nm 에서의 NADPH 흡광도의 감소에 의해서 측정될 수 있다.

ii) 산화된 글루타티온 환원성의 측정

상기 분석의 방법은 문헌 [나까지마 일행 in "New Basic Experimental Methods in Biochemistry (6) - Assay Methods Using Biological Activity", 3-34] 에 기재되어 있다.

10 mM 의 산화된 글루타티온 (Boeringer-Mannheim) 은 20 mM 인산 완충용액 및 0.5 M NaCl, pH 7.8 로 제조된다. 시료를 우선 큐벳에 담은 후, 상기 제조액의15 ㎕을 큐벳 (10 x 4 x 4 mm) 에 담는다. 동일한 완충용액에서 제조된 1 mM NADPH 의 15 ㎕을 실온에서 큐벳에 첨가하여 반응을 개시시킨다. 글루타티온 환원효소 활성을 340 nm 에서 흡광도의 감소에 따라 측정된다.

상기 기재된 바와 같이, 각종 방법으로 mRNA 로 부터 ds-DNA 를 유도할 수 있다. 상기는 S1 뉴클레아제 방법, 랜드 (Land) 방법 및 오준 유 (O. Joon Yoo) 방법을 포함하지만, 상기 경우에서는 오까야마-버그 (Okayama-Berg) 방법의 사용을 선호한다 [Okayama H. 및 Berg, P. (1982), Mol. Cell. Biol. 2, 161-170].

이어서 수득된 ds-cDNA 를 클로닝 벡터에 결합시킬 수 있고, 생성된 재조합 플라스미드를 상기 기재된 이. 콜리로 도입시킬 수 있다.

본 발명의 펩티드를 코딩하는 목적 DNA를 함유하는 균주를, NIa DNA 를 함유하는 형질전환체의 선별과 관련하여 상기 기재된 바와 같이, 방법의 임의 적절한 변형과 함께, 각종 방법에 의해서 선별될 수 있다. 예를 들면, PCR 이 프로브를 제조하기 위해 사용된다면, 적절한 주형 DNA 는 상기 기재된 cDNA, 또는 게놈 DNA 일 수 있다.

본 발명의 이차 구현예에서, 시험되는 형질전환체 균주의 수를 감소시키기 위해 일차 스크린을 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 펩티드가 시토키닌과 관련되었으므로, 그의 mRNA 가 시토키닌 mRNA 의 공통적인 AUUUA 모티프 (motif) 를 공유하므로 일차 스크린이 가능하다 [샤우 및 카멘 (1986), Cell 46, 659-667]. 이어서, AUUUA 모티프에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 프로브가 일차 스크린에 사용될 수 있다. 포유류 세포에서 외생 단백질 생성의 분석에 의한 스크린이 수행될수 있다.

펩티드를 코딩하는 DNA 를 벡터로 부터 절단하며, NIa DNA 와 관련하여 상기 기재된 것과 유사한 방법으로 서열분석을 할 수 있다. 또 다시, 상기 기재된 바와 같이, DNA 단편을 적절한 벡터로 도입시켜 필요에 따라, 원핵 또는 진핵 숙주를 형질전환시킬 수 있다.

KM31-7 단백질은 단독으로, 또는 산화성 스트레스에 의해 관련된 또는 이에 유발된 상태, 또는 활성화된 산소에 의해 유발된 임의 질병의 예방 및 치료에서 하나 이상의 치료 약제와 혼합되어 사용될 수 있다. 상기 상태는, 동맥경화증, 당뇨병, 허혈성 질환 (레퍼퓨젼 질병, 허혈성 심장 질환, 대뇌 허혈성 질병, 허혈성 장염 등), 부종, 혈관 투과성 항진, 염증, 위점막 질병, 급성 췌장염, 크론스 질병, 궤양성 대장염, 간 질환, 파라쿼트 질환, 폐기종, 화학적 암발생, 암 전이, 성인 호흡 곤란 증후군, 전염성 혈관내 응집(DIC), 백내장, 미성숙 망막증, 자기 면역 질환, 포르피린증, 용혈성 질환, 지중해성 빈혈, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 간질, 자외선 조사 질환, 방사성 질환, 동상 및 화상을 포함하며, 이에 국한되지 않는다.

본 발명의 이차 구현예의 약학적 조성물은 KM31-7 펩티드의 약학적 유효량 및 그의 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유한다.

본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 과립, 분말 및 시럽의 형태로 경구 투여에 의하거나 주사, 주입 및 좌약의 형태로 비경구 투여에 의해서와 같이 다양한 형태로 투여될 수 있다. 기타 적당한 투여 형태들도 당업자에게 명확할 것이다.

본 발명의 펩티드가 주사 또는 주입으로서 투여되는 경우에, 상기 펩티드의 피로겐 없는 제제를 비경구 투여용으로 적당한 약학적으로 허용가능한 수용액에 용해시켜 제조한다. pH, 등장도 및 안정도의 요구사항에 맞추기 위한 폴리펩티드 용액의 제법은 당업자의 기술 경험 안에 있다.

투여량 및 형태는 당업자들이 환자 상태, 체중, 성별, 나이, 식이요법, 기타 감염의 심각도, 투여 시간, 기타 임상적으로 유의한 인자들과 같은 항목을 고려하여 용이하게 판단할 수 있다. 일반적으로, 보통 성인의 경구 투여량은 하루에 약 0.01 mg 내지 약 1000 mg 의 범위일 것이다. 상기 양은 한번의 투여로 또는 24 시간의 기간에 걸쳐 여러번의 2차 - 투여로서 투여될 수 있다. 펩티드가 비경구로 투여될 경우에 투여 당 약 0.01 mg 내지 약 100 mg을 피하내로, 근육내로 또는 정맥내로 주사할 수 있다.

KM31-7 단백질을 완전히 특성화하기 위하여, 이 단백질에 대해 특이적인 항체를 얻는 것이 중요했다. 상기 항체는 KM31-7 단백질의 기능, 정량, 정제 및 조직 분포를 검정하는데 유용할 것이다.

따라서, 항-KM31-7 항체를 생산하는 히브리도마는 pMAL31-7에 의해 형질전환된 이. 콜리에 의해 생산된 폴리펩티드로써 실험실 동물을 접종시키고, 골수종 세포와 함께 항체 - 생산 세포의 히브리도마 (hybridoma) 를 제조하고, 이어서 이 히브리도마를 스크리닝하고 클로닝함으로써 얻었다.

결과생산된 히브리도마에 의해 생산된 항체는 pSRα31-7 로써 형질전환된 COS-1 세포의 혈청이 없는 배양물 상층액으로부터 얻은 폴리펩티드를 인식할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 또한 KM31-7 단백질, 또는 KM31-7 단백질의 돌연변이체 또는 변이체를 특이적으로 인식할 수 있는, 항체, 바람직하게는 단일 클론 항체 또는 그의 동등물을 제공한다.

본 발명의 항체는 KM31-7 단백질 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체에 관한 것이다. 이 항체가 다 클론 또는 단일 클론일 수 있으며, 단일 클론형태가 바람직함은 물론이다. 이는 일반적으로 다 클론 항체와 관련된 불확실성 때문이다. 결과의 동일성을 위해, 예컨대 치료용 또는 KM31-7 단백질의 정제용이든 간에 단일 클론 항체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항체는 임의 적당한 동물로부터 제조될 수 있다. 그러나, 항체가 사람이 아닌 경우에 항원성에 관련된 문제점이 발생할 수 있다. 이에 대하여, 항체가 사람 항체에 보다 더 근접하게 닮도록 조작하는 것이 가능하다. 이는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 화학적 또는 유전학적 변형에 의해 가능하다.

본 발명은 또한 항 - 유전형 (anti - idiotypic) 항체, 즉, 그의 인식 부위가 상기 항체의 인식 부위를 인식하는 항체에 관한 것이다. 상기 항 - 유전형 항체는 모 항체를 적당한 동물에게 투여함으로써 제조될 수 있다.

이 모 항체 또는 항 - 유전형 항체에 상응하는 각각의 세대에 걸쳐 유효하게 영구히 이러한 방법이 계속될 수 있음은 물론이다. 그러나, 항체가 각각의 세대 후에 정확한 인식에 의해 선택되지 않는다면 특이성은 효과적으로 손실될 것이다. 항 - 유전형 항체는 예컨대 유리 항 - KM31 - 7 항체를 검정하는데 유용할 것이다.

본 발명은 또한 KM31 - 7 단백질을 인식할 수 있는 본 발명의 항체의 단편 및 상기 항체의 인식 부위를 함유하는 분자에 관한 것이다. 상기 단편 및 분자는 본 발명의 항체의 "동등물"로서 본원에 언급되고 있다.

플라스미드 pMAL31-7을 사용하여 이. 콜리 를 형질전환시키고 발현 생산물을 정제시키고 이를 사용하여 실험실 동물을 면역화 시켰다. 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 사용하여 골수종 세포와의 융합에 의해 히브리도마를 제조하고, 항 KM31 - 7 단일 클론 항체를 생산하는 클론을 고농도로 및 매우 안정하게 얻었다 (이 클론은 MKM150 - 2 로 명명했고, 기탁 번호 FERM BP-5086 하에 일본 통상 산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소에 기탁했음). 이 클론을 배양하여 배양물 상층액으로 부터 항-KM31-7 단일 클론 항체를 얻었다.

결과 생산된 항 KM31-7 단일 클론 항체는 이. 콜리 에서 pMAL31 - 7 을 도입하고 발현시킴으로써 얻어진 융합 단백질과 면역화학적으로 반응한다. 이 항체는 또한 KM31 - 7 을 코딩하는 cDNA 로써 형질전환된 포유동물 세포의 배양물 상층액으로부터 얻은 KM31 - 7 단백질과 면역화학적으로 반응한다.

일반적으로, 단일 클론 항체를 생산하기 위해서 하기에 제시된 절차를 따라야 할 것이다. 이 절차는 하기 (a) - (h)로 구성된다:

(a) 항원으로서 사용될 생중합체의 정제;

(b) 항원의 주사, 및 샘플링 및 혈액 검정에 의해 비장으로부터의 적당한 시간에 항체-생산 세포 제조에 의한 생쥐의 면역화;

(c) 골수종 세포의 제조;

(d) 비장 및 골수종 세포의 융합;

(e) 원하는 항체를 생산하는 히브리도마 군을 선택하기 위한 스크리닝;

(f) 단일한 클론의 제조 (클로닝);

(g) 단일 클론 항체의 대규모 생산을 위한 상기 히브리도마의 배양, 또는 경우에 따라 상기 히브리도마로서 감염된 생쥐의 배양 ; 및

(h) 결과생산된 단일 클론 항체의 표식 시약으로서 생리학적 활성 또는 성질 검정.

항 - KM31 - 7 단일 클론 항체의 생산은 이제 상기 제시된 절차를 참고로 서술될 것이다. 반드시 하기 서술을 정확히 따를 필요는 없으며 임의 적당한 절차를 사용할 수 있음은 물론이다. 예컨대, 비장 세포외에 항체 - 생산 세포 및 골수종 및 기타 포유동물의 항체-생산 세포 및 골수종을 사용할 수 있다. 다음 절차는 항 - KM31 - 7 단일 클론 항체를 얻기에 현재 적당한 방법을 대표한다.

(a) 항원 정제

이. 콜리 로 pMAL31 - 7을 발현시키고 생산물을 정제시킴으로써 얻은 융합 단백질은 효과적인 항원이다. pMAL31 - 7으로 형질전환된 이. 콜리 TB - 1 의 배양물을 이소프로필 β- D - 티오갈락토피라노시드 (IPTG) 로 유발시켰다. 발현된 융합 단백질을 아밀로스 수지 컬럼 (뉴 잉글랜드 바이오랩) 을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. pSR_α31 - 7 으로 형질전환된 COS - 1 세포의 혈청이 없는 배양물 상층액으로부터 정제된 KM31 - 7 단백질도 또한 효과적인 항원이다.

(b) 항체-생산 세포의 제조

(a)에서 얻은 정제 융합 단백질을 프로운트의 완전 또는 불완전 보조약 또는 포트애쉬 명반과 같은 보조약과 혼합하고 실험실 동물을 결과생산된 백신으로써 면역화 했다. BALB/c 생쥐가 실험실 동물로 사용하기에 바람직하며, 이는 생쥐로부터 유래된 유용한 골수종의 대부분이 BALB/c 생쥐로부터 유래되기 때문이다. 더욱이, 상기 생쥐의 특성은 많이 상세히 연구되었다. 더욱이, 항체 - 생산 세포 및 골수종 모두가 BALB/c 생쥐로부터 유래된다면, 결과생산된 히브리도마는 BALB/c 생쥐의 복강에서 증식시킬 수 있을 것이다. 따라서, BALB/c 생쥐를 사용하면 복잡한 절차를 사용할 필요없이 복수(ascites)로부터 용이하게 얻을 수 있다는 이점을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 BALB/c 의 사용에 제한되지 않는다.

항원은 피하 주사, 복강내 주사, 정맥 주사, 피내 주사 또는 근육내 주사와 같은 임의 적당한 형태로 투여될 수 있고, 피하 주사 또는 복강내 주사가 바람직하다.

면역화는 한번 또는 적당한 간격으로 여러 번 수행할 수 있다. 바람직한 방법은 면역화한 후에 1 내지 5 주의 간격으로 한번이상 증강분을 주는 것이다. 후자의 절차의 유효성은 면역화된 동물의 혈청내 상기 항원에 대한 항체 역가가 정규적으로 검정되고 충분히 높은 항체 역가를 갖는 동물이 사용되어 항체 - 생산 세포를 제공한다면 개선될 수 있다. 차후의 융합을 위한 항체 - 생산 세포는 최종 면역화로부터 3 내지 5 일 후에 동물로부터 분리하는 것이 바람직하다.

항체 역가 검정 방법은 예컨대 방사성동위원소 면역 검정 (RIA), 효소결합면역흡착분석법 (ELISA), 형광 항체 기술 및 수동 헤마글루티네이션과 같은 다양한 공지 기술을 포함하며, RIA 및 ELISA 가 민감도, 속도, 정확도, 및 자동화 가능성 때문에 바람직하다.

ELISA의 적당한 형태는 다음과 같다. 항원을 고체 상에 흡수시키고 고체 상 표면을 소 혈청 알부민 (BSA) 과 같은, 상기 항원과 연관이 없는 단백질에 노출시켜 항원이 흡수되지 않은 임의 표면 영역을 차폐시킨다. 그 다음 고체 상을 세척하고, 그다음 이것을 제 1 항체 (예컨대, 생쥐 혈청) 의 일련의 희석된 샘플에 노출시킨다. 샘플내 임의 항-KM31 - 7 항체를 상기 항원에 결합시킨다. 세척한 후에, 제 2 차의, 효소 - 결합, 항 - 생쥐 - 항체를 첨가하고 결합된 생쥐 항체에 결합시킨다. 세척한 후에, 효소 기질을 첨가하고, 기질의 분해에 의해 야기된 색상 변화와 같은 척도를 측정함으로써 항체 역가를 계산할 있다.

(c) 골수종 세포 제조

구성된 생쥐 세포주를 골수종 세포원으로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세포주의 적당한 실례는 BALB/c 기원의 8-아자구아닌 내성 생쥐로부터의 골수종 세포계 P3-X63 Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3-NSI/1-Ag4.1 (NS-1) [European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], SP2/O-Ag14 (SP-2) [Nature 276, 269-270 (1978)], P3-X63-Ag8.653 (653) [J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)] 및 P3-X63-Ag8 (X63) [Natute 256, 495-497 (1975)] 를 포함한다. 이들 세포주는 적당한 배지, 예컨대 8-아자구아닌 배지( 8-아자구아닌, 1.5mM 글루타민, 5x 10^-5M 2-메르캅토에탄올, 10 ㎍/ ㎖ 겐타마이신 및 10 % 태내 소 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지), 이스코브 변형 듈베코 배지 (IMDM) 또는 듈베코 변형 이글 배지 (DMEM) 내에서 2차 배양시킬 수 있다. 세포수는 세포 융합 3 내지 4 일 전에 완전 GIT [GIT 배지 (워코 퓨어 케미칼 인더스트리) 500 ㎖ 내 MEM 비필수 아미노산 용액 (NEAA, 깁코) 5.5 ㎖, NCTC109 (깁코) 27.5 ㎖, 페니실린-스트렙토마이신 용액 (시그마) 6 ㎖ 및 글루타민 200mM 용액 (시그마) 11 ㎖] 로서 공지된 보통의 배지로써 2차 배양함으로써 융합 일에 2 X 10⁷이상이 되도록 증식시킨다.

(d) 세포 융합

항체 - 생산 세포는 플라스마 세포 및 그의 전구체 림프구이다. 이들은 비장, 림프절, 말초 혈액 또는 적당한 이들의 조합물과 같은 개개 동물의 임의 적당한 부위로부터 얻을 수 있다. 그러나, 비장 세포가 보통 가장 일반적으로 사용된다.

항체 - 생산 세포를 최종 면역화 3 내지 5일 후에 전술된 것 이상의 항체 역가를 갖는 생쥐로부터 수확한다. 그 다음 결과생산된 항체-생산 세포를 상기 (c)에서 얻은 골수종 세포와 융합시킨다. 현재 가장 일반적으로 사용되는 방법은 비장 세포를 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시키는 것이며, 이는 비교적 낮은 수준의 세포 독성 및 이 화합물의 조작의 용이함 때문이다. 이 방법은 하기와 같이 수행된다.

비장 세포 및 골수종 세포를 배지 또는 인산염 완충 식염수 (PBS) 로써 완전히 세척하고, 비장 세포 대 골수종 세포의 비율이 대략 5 내지 10 : 1이 되도록 혼합한 다음 원심 분리시킨다. 상층액을 따라 버리고 세포의 덩어리를 완전히 부순 다음 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, 분자량: 1000 내지 4000)의 혼합 용액을 교반하면서 첨가한다. 몇 분 후에, 세포를 원심분리시킨다. 상층액을 다시 따라 버리고, 침전된 세포를 5 내지 10 ng/㎖의 생쥐 IL - 6 를 함유하는 완전 GIT 적당량 내에 현탁시킨 후에 배양판의 홈으로 옮긴다. 일단 각각의 홈에 세포가 확실히 증식하면 배지를 HAT 배지 (생쥐 IL-6 5 내지 10 ng/㎖, 10^-6내지 10^-3M 히포크산틴, 10^-8내지 10^-7M 아미노프테린 및 10^-6내지 10^-4M 티미딘을 함유하는 완전 GIT)로 대체시킨다.

(e) 히브리도마 군의 선별

배양판을 35 내지 40 ℃ 에서 10 내지 14 일 동안 CO₂배양기에서 반응 배양시킨다. 이 시간 동안, 배지량의 절반과 같은 새로운 HAT 배지를 매 1 내지 3 일 마다 첨가한다.

골수종 세포는 8 - 아자구아닌 - 내성 세포주로부터 유래되며 골수종 세포 및 골수종 세포만을 구성하는 히브리도마 모두는 HAT 배지에서 살아남을 수 없다. 그러나, 항체 - 생산 세포 및 골수종 세포의 히브리도마를 포함하여, 항체 - 생산 세포 부분을 함유하는 히브리도마는 살아남을 수 있다. 항체 - 생산 세포만으로 구성되는 히브리도마는 죽기 때문에 골수종 및 항체 - 생산 세포 모두로 구성되는 히브리도마는 BAT 배지내에서 배양함으로써 선별할 수 있다.

HAT 배지는 HT 배지 (HAT배지로부터 아미노프테린을 뺌) 로 대체하면, 히브리도마가 상기 홈들내에 콜로니를 발생시킨다고 관찰된다. 그 다음 배양물 상층액을 제거하고 항 - KM31 - 7 항체 역가를 예컨대 ELISA에 의해 검정한다.

상기 방법은 8 - 아자구아닌 - 내성 세포주에 관하여 서술되나, 기타 세포주도 히브리도마를 선택할 수 있다면 또한 사용될 수 있다. 당연히 사용된 배지 조성도 위의 경우에 변경된다.

(f) 클로닝

항 - KM31 - 7 특이적 항체를 생산한다고 판단된 (e)로 부터의 히브리도마를 클로닝을 위해 다른 판에로 옮긴다. 시이딩 (seeding) 법 (각각의 홈에 단지 하나의 히브리도마를 함유되도록 히브리도마를 제한 희석 분석에 적용시킴), 연질 한천법 (시이딩된 콜로니를 연질 한천 배지에서 취함), 시이딩법 (하나의 세포를 미세 - 조작기에 의해 제거함), 및 소오터 (sorther) 클로닝법 (개개 세포를 세포 소오터에 의해 분리시킴) 와 같은 다양한 클로닝 방법을 사용할 수 있다. 제한 희석 분석이 간단하기 때문에 가장 빈번하게 사용된다.

예컨대 제한 희석 분석에 의한 클로닝을 흠들에 대해 2 내지 4회 반복하고 항체 역가를 계속 관찰한다. 일정하게 항-KM31-7 항체의 생산을 나타내는 클론을 히브리도마로서 선택한다.

(g) 히브리도마 배양에 의한 단일 클론 항체의 제조

그 다음, (f) 로 부터의 선별 히브리도마를 보통 배지에서 배양시킨다. 큰 -부피의 배양은 대형 배양병 또는 스피너를 사용하여 회전 배양에 의해 수행한다. 항-KM31-7 단일 클론 항체는 세포 상층액을 겔 여과시키고 그 다음, IgG 분획을 수집 및 정제하여 얻을 수있다. 게다가, 히브리도마는 또한 상기 종의 생쥐 (예컨대, 상기 언급된 BALB/c 생쥐) 또는 Nu/Nu 생쥐의 복강내에서 증식시킬 수 있다. 이 단계를 수행하기 위한 간단한 방법은 단일 클론 항체 제조 키트 (예컨대 파마시아의 MAbTrap GII) 를 사용하는 것이다.

(h) 단일 클론 항체의 분류

(g) 에서 얻어진 단일 클론 항체의 동기준 표본 및 분류 측정은 하기 서술된 바대로 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 분류 기술의 실례는 오크테로니 법, ELISA 및 RIA 를 포함한다. 오크테로니 법은 간단하지만 농도가 과도하게 낮은 경우에는 단일 클론 항체를 농축시켜야만 하는 단점이 있다.

ELISA 또는 RIA 를 사용한다면, 배양물 상층액을 항원이 흡착되어 있는 고체상에 직접 노출시킬 수 있다. IgG 계의 각 유형에 대해 특이적인 제 2 항체를 사용하여 계 유형을 분류할 수 있다. 대안적으로, 동기준 표본화 키트 (예컨대, 아머샴의 생쥐 단일 클론 항체 동기준 표본화 키트) 를 사용할 수 있다. 단백질 정량은 폴린-로우리법에 의하거나 280nm에서 흡광도 측정 [1.4 (OD₂₈₀) = 면역글로블린 1mg / ㎖] 에 의해 수행할 수 있다.

첨부된 실시예에서, MKM150-2 로 명명된 히브리도마로부터 얻은 단일 클론 항체가 IgG 부류 동기준 표본을 가짐이 측정되었고 IgG1 계에 속한다고 확인되었다.

본 발명에 따라 얻어진 단일 클론 항체는 KM31-7 단백질에 대하여고 특이성을 갖는다. 더욱이, 단일 클론 항체가 일정하게 얻어지고 우수한 양으로 상기 언급된 히브리도마를 배양함으로써 KM31-7 단백질의 분리 및 정제를 위해 사용될 수 있고, 항원 - 항체 반응을 사용하여 면역 침강에 의해 상기 단일 클론 항체로써 KM31-7 단백질을 분리 및 정제하는 것은 본 발명의 일부를 형성한다.

지금 부터, 본 발명에 수반되는 비제한적인 실시예를 참조로 하여 설명한다. 모든 용액은 수성이며, 탈이온수로 제조 하였고, 백분율로 표시된 것은 특별한 지시가 없는 한 중량 / 부피 이다. 만일 방법이 구체적으로 기술되지 않았다면, "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" [제 2 판, Sambrook, J., Fritch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press] 에서 참조할 수 있다. 실시예에 주어지지 않은 용액 및 다른 매질의 제조방법은 "매질" 편에서 주어진다. 실시예에 언급되지 않은 방법은 앞선 실시예의 내용을 확인한다.

A) CYVV 의 재료 물질

클로버 황색 엽맥 바이러스로 감염된 잎을 냉동 상태로 저장하고 [CYVV - 분리 번호 30: 우에다 일행 (1975), Ann. Phytopath Soc. Japan 41 : 192 - 203] 10 배 부피의 접종 완충용액으로 분쇄 하였다.

CYVV 의 증식은 두번째 성잎에서 발생한 비시아 파바 (Vicia faba) 변종 와세 소라마메 (Wase - Soramame) 를 사용하여 수행 하였다. 성잎에 금강사 (400 메쉬) 를 사용하여 분무하고, 유리 스페튤라를 사용하여 상기 수득된 액체로 접종하였다. 접종후, 8 일 내지 10 일 후, 접종된 잎은 메쉬 유사 모자이크 상태가 되었다. 이러한 잎을 제거하고, CYVV 원료로 사용 하였다.

B) 바이러스의 정제

상기 A)에서 분리한 잎을 3 부피의 추출 완충용액을 포함하는 다지기(mincer)에서 잘게 다졌다. 다진 후, 막자 사발을 사용하여 더 분쇄하였다. 그 결과의 제조물을 스텐인레스 강철 회전날이 장치된 모타를 사용하여 실온에서 1 시간 동안 천천히 교반하였다. 그 액체 제조물을 이중 가제로 압출하였다.

그 다음의 방법은 모두 4 ℃ 에서 수행 하였다.

그 조 액체를 절반 부피의 클로로포름과 혼합하여 그 혼합물을 워링 혼합기 (Waring blender) 로 혼합하고, 그 제조물을 6,000 g에서 15분간 원심 분리 하였다. 원심 분리 후, 수용층을 모으고, 이 분획에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG # 6,000) 을 첨가하여, 이 분획을 4 % v/v 의 최종 농도로 하였다.

그 결과의 혼합물을 빙냉하에서 1 시간 교반하고, 다시 빙냉하에서 1 시간을 방치하였다. 그렇게 수득된 액체를 6,000 g 에서 15분 동안 원심 분리 하고, 침전물로 바이러스를 함유하는 분획을 수득하였다. 이러한 침전물을 0.5 M 의 우레아를 함유하는 10 mM 의 인산 완충용액 (pH 7.4) 50 ml 에 현탁하고, 동량의 사염화탄소와 혼합하여 그 결과물을 5 분 동안 크게 교반하고, 그 후 그 제조물을 3,000 g 에서, 10 분 동안 원심 분리를 수행 하였다. 그 후, 그 수상을 4 ℃ 에서, 히타치 RP - 30 로타를 사용하여 30,000 rpm 으로 90 분 동안 초원심 분리를 수행 하였다. 그 결과의 펠렛을 바이러스를 함유하는 분획으로 회수 하였다.

그 펠렛을 1 % 트리톤 X 100 을 함유하는 10 mM 의 인산 완충용액 (pH 7.4) 에 현탁하고, 4 ℃ 에서 8,000 g 로 1 분간 원심 분리를 수행 하였다. 그 결과의 상층액을 미리 10 mM 의 인산 완충용액(pH 7.4)에서 제조된 10 - 40 % 구배의 수크로스 밀도 구배 컬럼 관 (40 % : 10 ml, 30 % : 10 ml, 20 % : 10 ml, 10 % : 10 ml 이고, 4 ℃ 에서 밤새 방치해두었다.) 에 적층하였다. 그 상층액을 관에 적층하고, 4 ℃ 에서 히타치 PRS 25 로타를 사용하여 23,000 rpm 으로 120 분간 초원심 분리 하였다.

원심분리 후, 수크로스 밀도 구배 컬럼 관을 OD_260nm감지기가 장치된 분획기 (모델 UA - 2, ISCO 사 제조) 를 사용하여 분획 하였다. 약 20 - 30 % 의 수크로스 밀도를 가지며, OD_260nm에서 흡광도를 나타내는 분획을 바이러스 함유 분획으로 취하였다.

수득된 바이러스 분획을 2 배의 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.4) 으로 희석하고, 4 ℃ 에서, 히타치 RP 65 로타를 사용하여 40,000 rpm 으로 90 분간 원심 분리를 수행 하였다. 그 결과의 침전물을 10 mM 의 인산 완충용액 (pH 7.4) 에 재현탁하여, 정제된 바이러스 용액을 수득 하였다.

C) 바이러스 RNA 의 분리

CYVV 의 게놈 RNA 는 약 10,000 개의 염기를 가지며 그 3' 말단에 폴리아데닐화 되어 있다. 그 길이 및 폴리아데닐화 때문에 종래의 페놀 / SDS 방법 또는 구아니디늄 티오시아네이트 방법을 사용할 때에 어떠한 손실도 없이 완전한 길이의RNA 를 추출하기 어렵다. 따라서, 바이러스의 게놈 RNA 는 염기성 수크로스 밀도구배 원심분리법을 사용하여 수득하였다.

500 ㎕ 의 바이러스 용액 (1 mg / ml 의 바이러스가 2.5의 OD_260nm을 가진다는 것을 기준으로 하여, 2 mg 의 바이러스를 가지는 것으로 계산) 을 500 ㎕ 의 분해 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 20 분간 방치 하였다. 이 후, 이 혼합물을 1 배의 SSC 로 제조한 0 % - 33.4 % 의 수크로스 밀도 구배 컬럼 관 (33.4 % : 1.4 ml, 30.4 % : 7.6 ml, 27% : 7.0 ml, 23% : 6.3 ml, 18.7% : 5 ml, 12% : 3.2 ml, 0 % : 2.7 ml 이고, 4 ℃ 에서 미리 밤새 방치 하였다.) 에 적층하였다.

사용된 완충용액은 또한 1배의 SSC 였고, 적층된 관을 히타치 RPS 27 로타를 사용하여 15 ℃ 에서 24,000 rpm 으로 9 시간 동안 초원심 분리를 수행 하였다. 이 후, 수크로스 밀도 구배 분획하기 위하여 관의 바닥에 구멍을 뚫는다. 바이러스 게놈 RNA 의 분획은 260 nm 에서의 각 분획의 흡광도를 측정하여 구별하였다. 바이러스 게놈 RNA 의 침강은 약 20 - 30 % 의 수크로스 농도에서 일어났다. 게놈 RNA 는 약 25 ㎍ 수득되었다.

D) 바이러스 cDNA 의 합성

cDNA는 상기 C) 에서 제조된 게놈 RNA 를 주형으로 하여 합성 하였다. cDNA 합성은 cDNA 합성계 플러스 (아머샴사 제조) 를 사용하여 수행 하였다. 그 결과의 cDNA 는 세파덱스 G50 컬럼(등록상표, 파마시아 제조)을 사용하여 정제 하였고, 폴리 C 사슬을 dCTP 및 말단의 디옥시뉴클레오티드 전이효소 (베테스다 연구소 제조)를 사용하여 정제된 cDNA 의 5' 말단에 붙였다. 플라스미드 pBR322 (베테스다 연구소 제조) 의 제조는 제한효소 PSt I 으로 플라스미드를 절단하고, 양 말단에 3' 폴리 G 사슬을 붙임으로 만들었다. 그런 다음, 이 제조물에 cDNA 를 첨가하고, 그 혼합물을 65 ℃ 에서 5 분간 반응 시키고, 그 후, 57 ℃ 에서 2 시간 반응 시켰다. 그 결과의 혼합물을 점차로 냉각시켜, cDNA 의 폴리 C 사슬과 플라스미드의 폴리 G 사슬의 어닐링 (annealing) 을 수행하였다.

E) 형질 전환

상기 D) 에서 수득된 신규의 플라스미드로 염화칼슘 방법에 의하여 이. 콜리 균주 HB 101 를 형질 전환 하였다. 이. 콜리 균주 HB101 의 종균 배양을 LB 액체 배지에서 밤새 진탕하여 제조 하였다. 0.5 ml 의 종균을 50 ml 의 LB 액체 배지에 접종하고, 접종물을 0.5 의 OD_550nm값을 가질때까지 37 ℃ 에서 진탕 배양 하였다. 세균 세포는 4 ℃ 에서 5,000 g 로 5 분 동안 원심 분리하여 회수 하고, 그 결과의 펠렛 (pellet)을 25 ml 의 트리스 - 칼슘 완충용액에 현탁하고, 빙냉하에 5 분간 방치 하였다. 그 결과의 현탁액을 다시 4,000 g 로 4 분간 원심 분리하고, 그 펠렛을 5 ml 의 트리스 - 칼슘 완충용액에 현탁하고, 2 시간 동안 빙냉하에 방치하여 콤피텐트(competent) 세포를 수득 하였다.

상기 D) 에서 수득한 100 ㎕ 의 신규의 플라스미드를 상기 수득한 200 ㎕ 의 콤피텐트 세포에 첨가하고, 그 혼합물을 빙냉하에 30 분간 방치 하였다. 이 후, 그 혼합물을 42 ℃ 에서, 2 분간 배양하고, LB 액체 배지 1 ml 을 첨가한 뒤, 그 결과의 혼합물을 37 ℃ 에서 1시간 더 진탕 배양 하였다. 그 결과의 혼합물을 12.5 ㎍ 의 테트라사이클린 수염화물 및 1.5 % w/w 의 한천을 함유하는 LB 고체 배지에 분산 시켰다. 그 세포를 37 ℃ 에서 밤새 배양하여 cDNA 의 클론 라이브러리 (clone library) 를 제공 하였다.

F) 플라스미드 pNS51 의 제조 및 선별

cDNA 재조합 플라스미드 라이브러리는 염기성 - SDS 방법에 의하여 분석 하였다. 더욱 자세하게는 하기와 같은 방법이었다.

2 ml 의 LB 액체 배지에 테트라사이클린에는 내성을 가지나, 암피실린에는 감수성 있는 세균의 콜로니 (colony) (상기 E) 의 LB 고체 배지에서 수득한) 를 접종하고, 그 결과의 현탁액을 37 ℃ 에서 밤새 진탕 배양 하였다. 세포를 10,000 g 로 원심 분리하여 회수하고, 16 ㎕ 의 라이소자임 용액을 함유하는 70 ㎕ 의 용균 완충용액에 현탁 하였다 (10 mg / ㎕). 5 초 동안 흔들어, 현탁액을 만든 뒤, 그 현탁액을 실온에서 5 분간 방치 하였다. 그런 후, 160 ㎕ 의 염기성 - SDS 용액을 그 현탁액에 첨가하고, 그 결과의 혼합물을 처음에는 그 관을 수 회 뒤집어 혼합하고, 빙냉하에 5 분 동안 방치 하였다. 120 ㎕ 의 5 M 아세트산칼륨을 그 혼합물에 더 첨가하고 다시 한번 빙냉하에 5 분간 방치 하였다. 그 후, 그 혼합물을 4 ℃ 에서, 10,000 g로 5 분 동안 원심 분리 하였다.

원심 분리 후, 상층액을 새 관으로 옮기고, 250 ㎕ 의 이소프로판올을 더 첨가하고, 그 결과의 혼합물을 빙냉하에서 30 분간 방치 하였다. 그 후, 그 혼합물을 다시 10,000 g 로 5 분간 원심 분리하고, 그 결과의 펠렛을 100 ㎕ 의 TE 완충용액[10 mM 트리스, 1 mM EDTA (pH 8.0)] 에 용해 시켰다. 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 (25 : 24: 1) 을 그 결과의 혼합물에 첨가하여 격렬하게 혼합하고, 그 혼합물을 4 ℃ 에서 10,000 g 로 5 분 동안 원심 분리 하는 페놀 추출법 (이하, 이러한 방법을 페놀 추출법으로 간주한다) 을 수행하였다.

원심 분리로 부터 수득한 100 ㎕ 의 수성층을 10 ㎕ 의 3 M 아세트산나트륨 (pH 5.2) 및 250 ㎕ 의 에탄올과 혼합하고, 그 결과의 혼합물을 드라이 아이스 하에서 10 분간 방치하고, 10,000 g 로 5 분간 원심분리하여 핵산 분획 (이하, 동일한 상대 부피의 상층액, 에탄올 및 아세트산 나트륨 용액을 사용하는 이러한 방법을 에탄올 침전법으로 간주한다.) 을 회수 하였다.

그 결과의 펠렛을 50 ㎕ 의 RNase A (10 ㎍ / ml의 TE 완충용액) 용액에 현탁하고, 37 ℃ 에서, 1 시간 반응 시켰다. 이 후, 30 ㎕ 의 폴리에틸렌 글리콜 용액 (2.5 M 염화나트륨, 20 % 폴리에틸렌 글리콜 #8,000) 을 반응 현탁액에 첨가하고, 그 혼합물을 빙냉하에 1 시간 방치 하였다. 그 후, 그 혼합물을 4 ℃ 에서, 10,000 g 로 5 분간 원심 분리 하여 펠렛으로 DNA 분획을 수득하고, 에탄올 침전법을 2 회 더 수행하여 정제된 플라스미드 DNA 를 수득 하였다.

정제된 플라스미드 DNA 는 제한효소 Pst I 으로 절단하고, TBE 용액을 사용하여 1 % 아가로스 겔 전기영동을 수행 하였다. 전기영동 후, 그 겔을 서던 블럿 혼성화[Southern blot hybridzation, 서던 (1975), J. Mol. Biol. 89 : 503 - 517] 을 수행하였다. 더욱 구체적으로는 그 겔을 변성 용액에서 40 분 동안 혼들어준 뒤, 중성화 완충용액에 옮겨 2시간 동안 흔들었다.

그 후, DNA 를 스폰지위에 놓여 있는 Hybond - N 막 (아머샴 등록 상표) 에 옮기기 위하여 그 겔을 20 배의 SSC 를 함유하는 폴리우레탄 에스테르 스폰지로 옮겼다. DNA 가 Hybond - N 막에 옮겨지게 한 뒤, 그 막을 1 배의 SSC 에서 10 분간 흔든 뒤 80 ℃ 에서 1 시간 동안 건조하여 DNA 를 고정 하였다. 그런 다음 그 막을 예비 혼성화 용액 [5 ml 의 포름아미드, 1 ml 의 50 배의 덴하르트 용액, 2.5 ml 의 20 배 SSC, 100 ㎕ 의 효모 tRNA (50 mg/ml), 100 ㎕ 의 10 % SDS 및 1.3 ml 의 2 차 증류수] 에 두고 50 ℃ 에서, 3 시간 동안 반응 시켰다.

Mg²⁺로 절단된 바이러스 게놈 RNA 를 프로브 (probe) 로 사용 하였다. 더욱 특별하게는 4 ㎕ 의 5 배의 변성 완충용액에 1 ㎍ 의 바이러스 RNA 를 함유하는 상기 C) 에서 수득된 16 ㎕ 의 용액을 첨가 하여 그 혼합물을 37 ℃ 에서 3 시간 동안 반응 시켰다. 100 ng 의 RNA (1 mg/ml 의 RNA 가 20 의 OD₂₆₀값을 가지는 것에 근거하여 계산) 를 함유하는 5 ㎕ 의 변성 RNA 용액을 70 ℃ 로 5 분간 가열한 뒤, 빙냉하에 반응을 정지하고 에탄올 침전법으로 회수하였다.

4 ㎕ 의 5 배의 표식 (labelling) 완충용액, 1 ㎕ 의 3.3 mM [-³²P] ATP (0.37 MBq), 및 10 ㎕ 의 2 차 증류수를 변성된 RNA 용액에 첨가하였다. 20 U 의 T4 폴리뉴클레오티드키나제 용액을 그 혼합물에 첨가하고, 37 ℃ 에서 30 분 동안 반응 시켰다. 미 도입된 [-³²P] ATP 는 에탄올 침전법을 5 회 반복하여 제거 하였다.

그 결과의 표식 프로브를 혼성화 용액 (5 ml 의 포름아미드, 2 ml 의 50 % 황산덱스트란, 200 ㎕의 50 배의 덴하르트 용액, 2.5 ml 의 20배의 SSC, 50 ㎕의 효모 tRNA (50 mg / ml), 100 ㎕ 의 10 % SDS, 1.3 ml 의 2 차 증류수) 에 최종 농도가 5 ×10⁵cpm/ml 이 되도록 첨가 하여 상기에서 수득된 Hybond -N 막을 이 용액에 옮겨 50 ℃ 에서 밤새 반응하여 혼성화를 수행하고, 60 ℃ 에서 0.1 % SDS 를 함유하는 2 배의 SSC 로 흔들어 세척하였다. 이러한 방법을 3 회 반복하고, Hybond - N 막을 0.1 % SDS 를 함유하는 0.1 배의 SSC 로 실온에서 1 시간 더 흔들어 세척하고, 건조 하였다.

방사선 자동사진법으로 바이러스 게놈 RNA 와 혼성화된 6,500 염기쌍을 함유하는 삽입 절편을 가지는 우리가 고안한 플라스미드 pNS51를 확인하였다.

G) pNS51 삽입체의 서열 분석

pNS51 에 클론된 cDNA 의 제한 지도를 제작하기 위하여, 플라스미드를 각각의 제한효소 (BamHI, EcoRI, Hind III, KpnI, NcoI, PstI, SalI, SphI, SacI, SmaI, XhoI, XbaI, 및 그것들의 쌍) 로 절단 하였다. 그 결과의 지도는 제 1 도에 나타난다.

이어서, 제한효소 SalI 및 PstI 에 의하여 절단되어 수득된 절편 각각을 M13mp19 RF DNA 에 삽입시켰다. 이것은 제한효소 PstI 및 SalI 을 사용하여 pSN51 을 절단하고, 그 절단 산물을 1 배의 TBE 를 사용하여 5 % 폴리아크릴아미드 전기영동 겔을 통하여 수행 하였다. 전기영동 후, 자외선하에서 밴드를 확인하기 위하여 1 ㎍ / ml 의 에티듐 브로미드로 겔을 염색하였다. 각 DNA 밴드를 함유하는 겔을 면도날로 절단하여 Centricon - 30 (아미콘 사 제조) 이 장치된 전기용출기 (아미콘 사 제조) 를 사용하여 전기용출을 수행 하였다.

각 절편을 DNA 리게이션 키트 (ligation kit, 다까라 수조사 제조) 를 사용하여, 앞서 SalI 만으로 또는 PStI 및 SalI 모두로 절단하고 염기성 포스파타아제로 처리된 M13mp19 로 삽입 시켰다.

그 결과의 재조합 M13mp19 RF - DNA (여기서, 그 절편은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 삽입된 절편이다) 를 염화루비듐 방법을 사용하여 이. 콜리 균주 JM109 에 도입 하였다. M9 최소 한천 배지에서 배양한 균주 JM109 의 단일 콜로니를 SOB 액체 배지에 접종하고, 밤새 진탕 배양 하였다. 0.6 ml 의 이러한 배양액을 50 ml 의 SOB 액체 배지에 접종하고 OD_600nm이 0.5 에 도달할 때 까지 37 ℃ 에서 진탕 배양 하였다. 그 세포를 4 ℃ 에서 5,000 g 로 10 분 동안 원심 분리하여 회수하고, 그 펠렛을 25 ml 의 TFB1 완충용액에 부드럽게 현탁하고, 빙냉하에 20 분 동안 방치 하였다.

3,000 g 로 5 분간 원심분리하고, 그 펠렛을 다시 한번 2 ml 의 TFB2 완충용액에 현탁하고, 20 분 동안 빙냉하에 방치하여 콤피텐트 세포로 만든다.

상기 수득된 재조합 M13mp19 RF DNA 를 리게이션 이후, 1 - 10 ㎕ 사이의 양으로 사용하고, 100 ㎕ 의 콤피텐트 세포와 혼합하여 빙냉하에서 1 시간 동안 방치하였다. 이 후, 그 혼합물을 42 ℃에서 1.5 분간 반응 시키고, 37 ℃ 에서 1 시간더 진탕 배양된 상기 혼합물에 500 ㎕ 의 SOC 액체 배지를 첨가하였다.

0. 8 % 한천, 30 ㎕ 의 100 mM IPTG, 10 ㎕ 의 10 % 5 - 브로모 - 4- 클로로- 3- 인돌일- ↓ -갈락토시드 (X- 갈) 및 100 ㎕ 의 표식 세균 (2 배의 YT 배지에서, 37 ℃ 로 밤새 진탕 배양한 균주 JM 109) 을 함유하는 2 배의 YT 배지를 그 결과의 배양액에 진탕하에 첨가하고, 진탕하고 1.2 % 의 한천을 함유하는 고체의 2 배의 YT 배지위에 부었다. 그 혼합물이 고체화되면 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 재조합 파지는 백색의 플라크 (plaque) 를 나타내었다.

그 결과의 백색의 플라크 각각을 1/100 의 양으로 표식세균을 함유하는 2 배의 YT 액체 배지에 접종하고, 37 ℃ 에서 밤새 진탕 배양 하였다. 10,000 g 로 1 분간 원심 분리 한 후에, 그 상층액을 냉동하여, 파지 용액으로 4 ℃ 에 저장 하였고, 그 세포 펠렛은 파지의 복제 중간 산물인 RF 이중 사슬 DNA (이하, 약어로 RF DNA 로 표시) 를 회수하기 위한 플라스미드 제조의 표준 방법을 진행하였다. 삽입 절편의 존재는 제한효소의 절단으로 확인하였다.

그렇게 하여, 51SS/M13mp19 (즉, 차례로, CYVV 게놈의 5' 부위로부터 PstI - SalI 절편을 함유하는 51PS5'/M13mp19 게놈의 부분인 SalI/SalI 절편을 함유하는 M13mp19 ) 가 수득 되었다. RF - DNA 는 표준 방법에 따라, 염기성 - SDS 및 염화세슘 밀도 구배 원심분리에 의하여 이러한 파지 클론으로 부터 정제 되었다.

5 ㎍ 의 그 결과의 정제된 DNA 는 먼저 BamHI 으로 절단하여 5' 의 접착성 말단을 수득하고 그런 후, KpnI 으로 더 절단하여 3' 접착성 말단을 수득 하였다. 그런 다음, Erase-a-base System (프로메가 사 제조) 에 따른 실험 방법에 따라,엑소뉴클레아제 (exonuclease) 를 첨가하여 각각의 cDNA 선상화된 플라스미드의 5' 접착성 말단으로부터 염기를 하나씩(한단계씩) 결실 시킨다. 엑소뉴클레아제의 처리는 10 분 동안 계속 하였고, 1 내지 10 분간의 상이한 시간으로 시료를 제거 하였다. 벡터가 3' 접착성 말단을 가지므로, 엑소뉴클레아제에 의하여 공격받지 않는다. 1 내지 10 분 동안에 수득된 다양한 시료를 S1 뉴클레아제로 처리하여, 블런트 말단화 하고, T4 DNA 리가아제를 처리하여 환상의 형으로 결합시켰다.

그 결과의 환상의 재조합 M13mp19 RF - DNA 를 상기 언급한 염화루비듐 방법을 사용하여 이. 콜리 균주 JM 109 에 도입 하였다. 따라서, 다양한 길이의 cDNA 가 삽입된 재조합 파지는 백색 플라크로 수득 되었다.

RF - DNA 는 상이한 길이의 삽입체를 가지는 클론을 선별하기 위한 종래의 방법에 의해 상기 수득된 재조합 파지클론으로 부터 수득 되었다. 선별된 클론은 이. 콜리의 표식 균주를 함유하는 2 배의 YT 액체 배지에 접종하여 분리 배양하고, 37 ℃ 에서 진탕 배양하였다. 이 후, 1.5 ml 의 각각의 배양액을 4 ℃ 에서 10,000 g 로 5분간 원심 분리 하였다. 1 ml 의 상층액을 새 관에 옮기고 250 ㎕ 의 20 % 폴리에틸렌글리콜 수용액 (20 % 폴리에틸렌 글리콜 # 8,000, 2.5 M 염화나트륨) 을 그 관에 첨가하고 혼합한 뒤, 30 분 동안 빙냉하에 방치하였다. 이어서 그 혼합물을 4 ℃ 에서 10,000 g 로 5 분 동안 원심 분리 하였고, 그 결과의 펠렛을 100 ㎕ 의 TE 완충용액에 현탁 하였다. 단일 사슬 DNA 파지 게놈 (이하 약어로 ssDNA 로 표시) 은 페놀 추출법 및 에탄올 침전법으로 각 제조물로 부터 회수 하였다.

상기 수득된 각각 클론의 뉴클레오티드 염기 분석은 주형으로 ssDNA 를 사용한 디데옥시 사슬 말단 방법 (dideoxy chain termination procedure) 으로 수행 하였다. 더욱 구체적으로는 파지 ssDNA 를 7 - 디아자- 시쿼나제 버젼 2.0 dCTP 키트 (USB 사 제조) 를 사용하여 [α -³²P] dCTP (220 TBq/mmol, 아머샴 사 제조) 로 표식하였다. 그 결과의 반응 생성물을 8 M 우레아를 함유하는 5 % 폴리아크릴아미드 전기영동 겔에서 1 배의 TBE 완충용액을 사용하여 진행 하였다. 그 겔을 건조하고, 방사선 자동사진으로 뉴클레오티드의 서열을 분석하였다. pNS51 의 5'-PstI - SalI 절편 및 M- SalI - SalI 절편의 뉴클레오티드 서열을 분석하여, 총 3,839 염기를 결정 하였다.

상기 수득된 서열에서 개방 해독틀(이하, 약어로ORF로 표시)에 대한 연구의 결과로, 폴리펩티드에 대한 단일의 개방 해독틀은 바이러스 게놈의 + 센스 (sense) 사슬상에서 감지되었다. 개방 해독틀에서 코딩되는 폴리펩티드 서열은 그렇게 결정 되었다. 유전자 은행 (GeneBank) 을 이용한 공지의 서열과 이러한 폴리펩티드 서열을 비교한 상동성 연구로 TEV - HAT 와 상동성이 있음이 밝혀졌다.

TEV 와 같은 바이러스, 플럼 (Plum) 천연두 바이러스, 또는 소아마비 바이러스 (동물성바이러스) 는 프로테아제의 작용에 의하여 성숙되며, 일반적으로 그 프로테아제는 Gln - Ala, Gln - Ser 또는 Gln - Gly 연결을 포함하는 결합을 절단한다는 것이 공지되어 있다 [윌리엄 및 캄멘 (1988), Arch. Virol. 98 : 1 -26]. 또한, CYVV - No. 30 의 외피 단백질의 절단 부위의 분석 결과로 추정된 폴리펩티드에서 세개의 절단 부위를 감지할 수 있었다 [우에다 일행, (1991), Intervirology32 : 234 -245]. 이러한 절단 부위중 하나로 부터 아미노산 서열의 4 위치의 Gly 부터 437 위치인 Gln 까지의 폴리펩티드는 CYVV 로 부터 핵 함유물로 결정 되었다.

H) CYVV - NIa / IL - 2 융합 단백질의 제조

CYVV NIa 를 코딩하는 상기 G) 에서 식별된 DNA 는 Gln - Ala 를 코딩하는 연결 서열을 통하여 인간 인터루킨 - 11 (IL - 11) 를 코딩하는 DNA 3' 말단에 나란히 연결되어 있다.

하기 사항이 조사되었다:

첫째, 상기 G) 에서 식별된 DNA 가 단백질 분해 활성을 가지는 NIa 를 코딩하는지;

둘째, 프로테아제가 의도하는 아미노산 서열을 절단 하는지;

셋째, NIa 가 바이러스에 감염된 세포에 존재하는 것과 유사한 방식으로, 목적의 이형의 단백질과 함께 융합 단백질의 부분일때도 여전히 NIa 의 프로테아제 활성을 나타내는지; 및

넷째, 그러한 융합 단백질의 절단을 통하여 수득된 임의의 이형의 단백질이 통합성, 구조, 및 기능을 유지하는지를 조사하였다.

NIa 그 자체는 바이러스의 전구 폴리펩티드의 절단으로 부터 제조되기 때문에, NIa 시스트론은 어떠한 개시 코돈 (codon) 도 가지지 않는다. 그러므로, NIa 유전자의 5' 말단에 개시 코돈 ATG 를 첨가하는 것이 필요하다. NIa 유전자의 3' 말단은 동일한 개방 해독틀 내에서 IL - 11 유전자의 5' 말단과 연결되어야만 한다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, NIa 유전자의 중심에 존재하는 XhoI 절단 부위를 이용하여 폴리머라제 연쇄 중합 반응 (PCR)기술을 사용하여 NIa 를 변형 하였다.

NIa 5' 말단 (NIa5') 을 클론하기에 적당하도록 개시 코돈 ATG 및 제한효소 NcoI 의 인식 부위를 첨가하기 위하여 PCR 프라이머를 제조

TCGAG3' (이하, NSX1, 서열 식별 번호 : 4) 이었다.

0.8 ㎕ 의 dNTP 용액 (25 mM 의 각각의 dATP, dTTP, dCTP 및 dGEP), 10 배의 Taq 완충용액 (프로메가사 제조) 및 1 ㎍ 의 수득된 각각의 프라이머를 1 ㎍ 의 플라스미드 pNS51 DNA 에 첨가하였고, 그 혼합물에 2 차 증류수를 첨가하여 100 ㎕ 로 만들었다. 10 배의 Taq 완충용액의 5 U 의 DNA 폴리머라제를 첨가하여 PCR 을 수행 하였다.

PCR 은 한 주기를 92 ℃ 에서 1 분, 37 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 2 분으로 20 회 반복하고, 92 ℃ 에서 1 분, 37 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 30 분의 한 주기를 수행하였다.

그 결과의 증폭된 DNA 를 페놀 추출법 및 에탄올 침전법을 수행하고, 5 % 폴리아크릴아미드 전기영동 겔을 수행 하였다. 에티듐 브로미드에 의하여 DNA 를 함유하는 하나의 밴드를 확인하고, 그 밴드를 겔로 부터 절단하여 센트리콘 30 (Centricon 30, 아미콘 사 제조) 이 장치된 센터일루터 (Centreluter, 아미콘사 제조) 를 사용하여 전기용출을 수행 하였다. 용출 후, 용출된 DNA 절편을 4 ℃ 에서 센트리콘을 사용하여 7,500 g 로 45 분간 원심분리 하여 농축 시키고 회수 하였다. 그 결과의 DNA 농축물을 페놀 추출법 및 에탄올 침전법으로 더 정제 하였다.

별도로, SacI 인식 부위가 XhoI 부위로 대체된 1 ㎍ 의 플라스미드 pKK388 - 1 를 제한효소 NcoI 및 XhoI 으로 절단하고, 송아지 장의 염기성 포스페타아제 (이하 약어로 CIAP 로 표시; 다까라 수조 제조) 로 탈인산화 반응을 수행 하였다. 그 결과의 DNA 를 리게이션 키트(타카라 슈조 제품)로 제한효소 NcoI 및 XhoI 으로 절단하고, 상기와 같이 탈인산화한 100 ng 의 pKK388 - 1 과 리게이션 시키고, 그렇게 수득된 재조합 DNA 를 이. 콜리 JM 109 에서 클론하였다. pKK388 - 1 의 trc 프로모터로 부터 정상적인 아래 방향의 삽입을 가진 플라스미드 pKNI5 를 그렇게하여 수득 하였다 (제 2 도).

플라스미드 pCD20 - 2 [가와시마 일행 (1991), FEBS L. 283 : 199 - 202] 는 IL - 11 전구물질 (Pre - IL - 11) 을 코딩하며 분비 신호 서열을 가지는 cDNA 를 함유한다. 이러한 플라스미드를 제한 효소 BamHI 및 ApaI 으로 절단하고, Pre - IL - 11 및 SV 40 프로모터 모두를 가지는 부위를 절단 하였다. 그러한 절편을 pBLUESCRIPT II SK+ 의 BamHI 및 ApaI 부위와 연결 시키고, 다시 제한효소 XhoI 및 KpnI으로 절단하여 성숙한 IL - 11 의 N - 말단이 없는 단백질을 코딩하는 유전자 (Mat - IL - 11) 를 수득 하였다.

그 결과의 Mat - IL - 11 절편 (그것의 N - 말단을 피하는) 을 T4 리가아제를 사용하여 앞서 제한효소 XhoI 및 KpnI 으로 절단하고 CIAP 를 처리한 pKNI5' 로도입하였다. 그러한 결과의 pKNI5IL (제 3 도) 을 고안 하였다. 동일한 해독틀을 유지하면서, Ala 를 통하여 NIa 의 C 말단에서 특정의 서열과 Mat - IL - 11 를 연결 하기 위하여 4 종류의 PCR 프라이머를 합성 하였다:

첫번째 PCR 반응은 NIa 의 C - 말단 (CNI3 부위로 고안) 을 코딩하는 삽입 부위를 증폭하기 위하여, 주형으로 pNS51 DNA 를 사용하고 프라이머 NSX2 및 NSJ002N 의 한 쌍으로 수행 하였다. 별도로, IL - 11 펩티드의 N - 말단(5' IL 부위로 고안)을 코딩하는 삽입 부위를 증폭하기 위하여, 주형으로 pNS51 DNA 를 사용하고, 프라이머 NSJ001P 및 ILSAC 의 한쌍을 사용하여 또 다른 PCR 반응을 수행하였다. PCR 은 한 주기를 92 ℃ 에서 1분, 37 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 2 분으로 20 회 반복하고, 92 ℃ 에서 1 분, 37 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 30 분의 한 주기를 수행하였다. 그러한 각각의 PCR 방법으로 수득된 생성물을 페놀로 추출하고, 에탄올로 침전시켜 5 % 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행 하였다. 증폭된 DNA 를 함유하는 겔상의 밴드를 절단하고, 그 DNA 를 상기 설명한 전기 용출 방법으로 겔 조각으로 부터 전기적으로 회수 하였다. 그 결과는 제 4 도에 나타난다.

그 결과의 두 종류의 증폭된 DNA 는 NSJ001P 및 NSJ002N 의 프라이머 부위, 즉, CIN3 DNA 절편의 3' 말단 부분 및 5'IL DNA 절편의 5' 말단 부위로 뉴클레오티드 서열의 부분적인 상동성을 가진다.

그러므로, NSX2 및 ILSAC 의 프라이머로 다시 PCR 을 수행 한다면, 상동 부분이 연결 부분으로 작용하여 상동 부분은 혼성화하여, 양 유전자의 부분을 함유하는 융합된 DNA (제 5 도) 가 수득 될 것이다.

따라서, 회수된 CIN3 DNA 절편 및 5'IL DNA 절편을 혼합하고, NSX2 및 ILSAC 만을 프라이머로 사용하여 PCR 을 다시 수행하였다.

PCR 은 92 ℃ 에서 1 분, 37 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 2 분으로의 10 주기, 그 다음은 92 ℃ 에서 1 분, 45 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 2 분으로의 20 주기, 92 ℃ 에서 1 분, 55 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 30 분의 한 주기로 구성되었다. 생성물을 페놀로 추출하고, 에탄올로 침전시켜, 5 % 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행 하여, CNI3 과 5'IL 이 융합된 CNI3IL DNA 절편을 수득 하였다. 그 방법은 제 5 도에 나타난다.

CNI3IL DNA 절편을 제한효소 XhoI 으로 절단하고 그 결과의 절편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 앞서 제한효소 XhoI 으로 절단되고 CIAP 로 탈인산된 pKNI'5에 삽입 하였다. 그 결과의 플라스미드는 이. 콜리 균주 JM109 에서 클론하였다. cNI3IL 절편이 올바른 방향으로 삽입되어 있는 클론을 선별하기 위하여, 결과의 클론으로부터 플라스미드를 추출하고, NSX2 및 ILSAC 프라이머를 사용하여 PCR 을 수행 하였다. 이러한 방법에서, 올바른 방향으로 삽입된 클론에서만 DNA 밴드가 감지된다. NTa 및 Mat - IL - 11 가 절단 서열 Gln-Ala 을 통하여 동일한 해독틀에서 연결된 플라스미드 pKSUN9 가 수득 되었다 (제 6 도).

I) 세균 세포에서의 Ala - IL - 11 의 발현

플라스미드 pKSUN9 운반 이. 콜리(이하, 약어로 KSUN9 로 표시)를 42 ㎍ / ml 의 암피실린을 함유하는 5 ml 의 LB 배지에서 밤새 37 ℃ 에서 진탕 배양 하였다. 2.5 ml 의 그 결과의 KSUN9 배양액을 250 ml 의 LB 배지 (동일한 양의 암피실린 함유) 에 첨가하고, OD_600nm값이 1.0 에 달할때 까지 37 ℃ 에서 진탕 배양 하였다. OD_600nm값이 1.0 에 도달하면, IPTG 를 0.1 mM 의 최종농도가 되도록 첨가하고, 그 혼합물을 28 ℃ 에서 12 시간 더 진탕 배양 하였다.

성숙한 IL - 11 (N - 말단 Pro) 를 수득하기 위하여, 최종 배양을 28 ℃ 에서 1 mM 의 IPTG 의 농도로 36 시간 이상 수행한 것을 제외 하고는 정확히 동일한 방법을 수행하여 두번째 배양액을 제조하였다.

J) 웨스턴 블러팅 (Western Blotting)

웨스턴 블러팅은 pKSUN9가 이. 콜리 에서 기능이 있는지, 그리고 또한 고안된 재조합 DNA 에서 발현되는지를 결정하기 위하여 수행되었다.

IPIG 로 유도된 12 시간 및 36 시간 배양액 각각을 하기와 같은 방법을 더 진행하였다. 세포는 4 ℃ 에서 3,000 g 로 5 분간 원심분리하여 2 ml 의 배양액으로 부터 회수하였고, 펠렛을 100 ㎕ 의 20 mM 붕산나트륨 완충용액 (0.1 N 수산화나트륨으로 pH 9.0 적정) 에 현탁하였다.

그 결과의 현탁액을 초음파 분쇄기 (Handysonic UR - 209, 토미 세이코사 제조)를 사용하여, 8 로 맞추어 2 분 동안 세포를 파쇄하고 4 ℃ 에서 10,000 g 로 10 분간 원심분리 하였다. 가용성 단백질 분획을 함유하는 상층액을 회수하였다. 5 μl 의 상층액을 람니방법 [Nature 227 : 680 - 685, 1970] 에 따라 12 % SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 겔을 수행하였다.

전기 영동 후, 그 겔을 전이 완충용액 (25 mM 트리스, 192 mM 글리신, 20 % 메탄올) 에서 5 분동안 흔든뒤, PVDF 막 (Trans - Blot Transfer Medium, 바이오 - 래드사 제조) 에 Trans - Blot - SD Semi - Dry Transfer Cell (바이오 - 래드사 제조) 을 사용하여 15 V 로 1 시간 처리하여 블러팅하였다. 그 블러팅 된 PVDF 막을 PBS - Tw 매질로 10 분간 세척하였다. 그 세척된 PVDF 막을 5 % 스킴 밀크 (Skim Milk, 스노우 브랜드 밀크 제품사 제조) 를 함유하는 PBS - Tw 에 37 ℃ 에서 1 시간 동안 블러킹을 위하여 옮겼다.

블러킹 후, PVDF 막을 PBS - Tw 로 10 분 동안 1 회 세척하고, 5 분 동안 2 회 세척한뒤, PBS - Tw 로 10,000 배 희석한 항 IL- 11 토끼 혈청에 옮기고, 37 ℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 그 PVDF 막을 다시 PBS - Tw 로 10 분간 1 회, 5 분간 2 회 세척하였다.

이 PVDF 막을 PBS - Tw 로 5,000 배 희석된 홍당무 퍼옥시다제(아머샴 제조)로 표식된 항 - 토끼 IgG 염소 항체로 옳기고, 37℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 이후, PVDF 막을 PBS - Tw 로 다시 10 분간 1 회, 5 분간 4 회 세척하였다.

이러한 세척 이후, PVDF 막을 강화된 화학발광 (ECL) 감지 제제 (아머샴 제조) 로 처리하고 PVDF 막을 X - 선 필름에 30 초 내지 5 분동안 접촉시키면 항 - IL - 11 - 항체와 반응한 밴드가 나타난다.

상기 웨스턴 블러팅의 결과로, 분자량 50 kDa 및 약 23 kDa 에 해당하는 신호 밴드가 12 시간 및 36 시간 배양액에서 감지되었다. 23 kDa 밴드는 실질적으로 대조군으로 사용된 성숙한 IL - 11 와 동일한 이동성을 나타내었다. 따라서, 23 kDa 의 신호 밴드는 Gln - Ala 연결 서열에 NIa 의 단백질 분해 활성에 의하여, NIa / IL - 11 융합 단백질이 절단된 IL - 11 로 나타났다. 더 무거운 밴드 (50 kDa) 는 절단되지 않은 융합 단백질로 생각된다.

지금부터, 12 시간 배양액으로 부터 수득된 23 kDa 단백질을 23 kDa - ON 으로 간주하고 36 시간 배양액으로 부터 수득된 23 kDa 단백질을 23 kDa - 36 hr 로 간주한다.

K) 23 kDa - ON 및 23 kDa - 36 hr 단백질의 정제

23 kDa - ON 및 23 kDa - 36 hr 단백질을 N - 말단의 아미노산 서열을 결정하기 위하여 정제하였다.

12 시간 및 36 시간 배양액 각각의 250 ml 을 상기 I) 와 동일한 방법에 의하여 수득하였다. 각각의 배양액은 하기 과정을 더 수행하였다. 4 ℃ 에서 5,000 g로 15 분 동안 원심 분리하고 그 펠렛을 10 ml 의 20 mM 붕산 완충용액 (pH 9.0) 에 현탁하고, 각각을 프랜치 압력기 및 초음파 분쇄기로 파쇄하였다. 가용성 단백질 분획을 4 ℃ 에서 15,000 g 로 30 분간 원심분리하여 상층액으로 회수하였다.

그 결과의 가용성 단백질 분획을 하기와 같은 조건으로 파마시아에서 제조한 FPLC 를 사용하여 약이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다 :

컬럼 : CM Toyopearl Pack 650 M (2.2 ×20 cm, 토소사 제조)

용출 완충용액 :

- A 는 10 mM 붕산 - 수산화 나트륨 (pH 9.0), 13 mM 염화 칼륨.

- B 는 10 mM 붕산 - 수산화 나트륨 (pH 9.0), 13 mM 염화 칼륨, 400 mM 염화 나트륨.

용출 속도 : 2.5 ml /분

분획 부피 : 5 ml /관

사용된 농도 구배는 용리액 A 에서 용리액 B 의 선형적 구배로 120 분에 걸쳐 사용되었다.

IL - 11 을 함유하는 분획을 식별하기 위하여 각각의 용출된 분획을 연속적으로 효소결합면역흡착분석법 (ELISA) 을 수행하였다.

ELISA 는 하기와 같이 수행하였다. 96 - 홈 면역판 (Maxisoap ; 눈크사 제조) 의 각 홈에 1 ㎍ / ml 의 항 IL- 11 생쥐 단일 클론 항체를 함유하는 100 μl 의 50 mM 탄산나트륨 완충용액 (pH 9.6) 을 부하하고 그 판을 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이후, 각 홈을 PBS - T 매질 (0.1 % 의 Tween 20 을 함유하는 PBS) 로4 회 세척 하였다.

상기에서 수득된 FPLC 분획 각각을 PBS - T 로 100 배 희석하고 홈당 100 ㎕의 양으로 홈에 두었다. 그 판을 37 ℃ 에서 1 시간 반응시키고, 다시 PBS - T 로 세척하고, 각각의 홈에 최종 농도가 1 ㎍ / ml 이 되도록 PBS - T 로 희석한 항 IL - 11 토끼 IgG 100 μl 를 부하하였다.

그 판을 37 ℃ 에서 1 시간 더 반응시키고, PBS -T 로 세척한 뒤, 각각의 홈에 PBS - T 로 3,000 배 희석된 염기성 포스파타제 표식 염소 항 - 토끼 IgG 항체 (깁코 베테스다 연구소 제조) 100 μl 를 부하하였다.

그 판을 다시 37 ℃ 에서 1 시간 반응시키고 PBS - T 로 세척하였다. 각각의 홈에 100 μl 의 염기성 포스파타제 기질 용액을 부하하였다. 그 판을 실온에서 30 분 내지 1 시간 더 반응시키고, 각각의 홈의 발색정도를 405 nm 에서의 흡광도로 측정하여 유의한 분획을 식별하였다.

FPLC 방법에 따른 분획을 상기 ELISA 방법에 의해 식별하여 토끼 항 - IL - 11 항체와 반응하는 기질을 함유하는 분획 (분획 번호 19 - 25) 을 모아, Centprep - 10 (아미콘사 제조) 을 사용하여 100 배로 농축하고 람니 방법(supra)에 따라 12 % SDS 폴리아크릴아미드 전기동 겔을 수행하였다. 그 겔을 PVDF 막으로 Problot 막 (어플라이드 바이오체계사 제조) 을 사용한 것을 제외하고는 상기 웨스턴 블러팅과 유사한 방법으로 PVDF 막 조각에 전기 블러팅을 수행하였다.

블러팅 이후, 그 막을 2 차 증류수로 완전히 세척하고 코마시 브릴리언트 블루 R - 250 으로 착색하고, 50 % 메탄올로 탈색하여, 웨스턴 블러팅에서의 항 - IL- 11 항체와 반응한 단백질을 함유하는 밴드를 절단하였다.

단백질의 N - 말단 아미노산의 서열은 단백질 서열분석기 (어플라이드 바이오체계사 제조) 를 사용하여 분석하였다. 항 - IL - 11 항체와 반응한 23 kDa - ON 으로 부터의 밴드의 N - 말단 서열은 다음과 같이 결정되었다.

Ala - Pro - Gly - Pro - Pro - Pro - Gly (서열 식별 번호 9)

이러한 서열은 성숙한 IL - 11 단백질의 아미노산 서열의 -1 내지 +6 의 아미노산 서열에 해당한다. 이러한 발견에 근거하여, 12 시간 배양액으로 부터 수득되고 항 - IL - 11 항체와 반응한 23 kDa 단백질은 Ala - IL- 11 였다고 추정할 수 있다. 따라서, 이러한 단백질을 특정 절단 서열인 Gln - Ala 에서 NIa / IL - 11 융합 단백질을 절단하는 NIa 의 단백질 분해 활성에 의해 만들어진다는 것은 명백해 졌다.

항 - IL - 11 항체와 반응하는 23 kDa - 36 hr 의 밴드의 N - 말단 서열은 다음과 같다 :

Pro - Gly - Pro - Pro - Pro - Gly - Pro - (서열 식별 번호 10)

이러한 서열은 성숙한 IL - 11 의 아미노산 서열 +1 에서 +7 에 해당한다. 따라서, 우리는 하기 결론에 도달할수 있었다.

IPTG 에 의한 유도로, NIa / IL - 11 융합 단백질은 이. 콜리 에서 발현되었다.

유도후, 연이은 12 시간 배양으로, 발현된 NIa / IL - 11 융합 단백질은 NIa 의 프로테아제 활성에 의하여 특정 절단 서열내의 Gln - Ala 펩티드 결합에서 절단되었다.

NIa 에 의한 펩티드 결합의 절단 이후, 그 N - 말단에 여분의 Ala 를 갖지 않는 성숙한 IL - 11 는 이. 콜리 에서 발현되었다.

Ala - IL - 11 의 발현 이후에 24 시간 더 배양함으로, Ala - IL - 11 는 Ala - IL - 11 의 N - 말단에 존재하는 Ala 잔기가 결실되어 IL - 2 로 성숙되었다.

상기 발견에 근거하여, 36 시간 배양후 수득된 23 kDa 단백질은 N - 말단이 Pro 인 IL - 11 의 성숙형 이었음을 확인하였다.

그러므로, IL - 11 는 NIa 와의 융합 단백질로 발현되고, NIa 의 활성이 Gln - Ala 를 포함하는 특이적인 결합 서열을 절단하여 Ala - IL - 11를 생산할 수 있다는 것이 확인되었다. 그 후 계속된 배양은 알라닌 잔기가 이. 콜리 에 존재하는 인자에 의하여 결실되어 프롤린 N - 말단이 노출된 성숙한 IL-11를 생산할 수 있었다.

발현된 IL - 11 및 Ala - IL - 11 가 생물학적으로 활성이 있는지를 확인하기 위하여 지방세포화 억제 인자 (AGIF) 활성을 그 지표로서 확인되었다. IL - 11 가 지방세포화 억제 활성을 갖는다는 사실은 이미 공지되어 있다 [가와시마 일행 (1991), FEBS L. 283 : 199 - 202].

L) 3T3 - L1 세포로 부터 지방세포로의 형태학적 변화에 대한 억제 효과 측정

본 발명에 사용된 AGIF 활성을 측정하는 방법은 하기와 같다. 쥐의 배발생의 섬유모세포 세포주 3T3 - L1 [그린 및 케힌데 (1974), cell 1 : 113 - 116] 은ATCC 로 부터 구입하여 사용하였다. 그 세포는 모든 경우에, 37 ℃ 에서 10 % 이산화탄소 - 90 % 공기의 혼합 습윤 대기에서, 배지 A 로 배양하였다. 지방세포 분화의 유도는 루빈 일행 [루빈 일행 (1978), J. Biol. Chem. 253 : 7570 - 7578] 의 방법에 따라 수행하였다.

3T3 - L1 세포를 1.0 ×10⁴세포수 / ml 의 밀도가 되도록 배지 A에 현탁하고, 48 홈 배양판 (코스터사 제조, 0.5 ml /홈)에 접종하였다.

3 일 간의 배양후, 세포는 군집 상태에 이르렀다. 그런 다음 그 배지를 다시 신선한 배지 A 로 대체하고, 2 일간 더 배양한후, 배지를 지방세포 유도 배지인 배지 B 로 대체하고, 동시에 0.5 ml 의 실험 시료를 첨가하였다. 매 2 일 마다 신선한 배지 B 및 신선한 시료로 대체하였다.

배지 B 대신에, 지방세포 유지 배양액 배지 C 를 홈에 고갈된 배지 대신에 대체하여 사용하였고, 첫번째 실험 시료를 첨가한 이후 4 일 및 7 일 사이에 다양한 시간으로 상이한 홈에서 출발하였다.

2 일 동안 배지 C 에서 배양한 후, 세포를 5 % 포름알데하이드로 고정시킨 뒤, 세포 및 세포핵에 축적된 지방 입자를 오일 레드 O 및 헤모톡실린으로 각각 염색하였다. 현미경으로 염색된 지방 입자를 축적한 핵의 수 및 세포의 수를 센다. 지방 세포화 율 (AR) 은 하기식에 의하여 계산하였다.

세포의 고정 및 오일레드 O 및 헤모톡실린으로의 염색은 요시오 미또모 및 소지로 다까야마의 방법 ["Lectures on Clinical Testing" Vol. 12, Patholegy (1982), 이시야꾸 슈판 출판] 에 따라 수행하였다.

M) 지질 단백질 리파아제 억제 활성의 측정 방법

이 측정은 보틀러 일행 ( 보틀러 등, J. Immonol. 135 : 3972 - 3977, 1985) 의 방법에 따라 수행하였다. 지방세포로 분화된 3T3 - L1 세포는 지방세포로의 분화가 유도될때 어떠한 실험시료도 첨가되지 않은 것을 제외하고는 상기 L) 에서 기술된 방법으로 제조하였다.

대신에, 실험 시료는 새로운 배지 C 와 함께 첨가하고, 그 세포를 18 시간 동안 배양하였다.

이 시간 이후, 그 배지를 제거하고 세포를 PBS (-) (인산 완충용액 식염수, 니수이 세이야꾸 제조) 로 2 회 세척하였고, 각각의 홈에 300 μl 의 배지 D 를 부하하고, 1 시간 더 배양하였다. 배양 상층액 100 μl 각각을 지질단백질 리파아제 (LPL) 활성을 측정하는데, 사용하기 위하여 취하여, 각 시료당 3 회 실시하여 그 평균을 수득하였다.

LPL 활성은 닐슨 - 엘 및 스코트의 방법 (닐슨 엘, P 및 스코트, M.C. (1976) J. Lipid. Res. 17 : 536 - 541 ) 에 따라 측정하였다. 상기 수득된 상층액 적량을 동량의 LPL 기질 용액과 혼합하고 37 ℃ 에서 120 분간 반응시켰다. 1.05 ml 의 0.1 M 탄산 칼륨 완충용액 (0.1 M 붕산 칼륨으로 pH 10.5 로 적정) 및 3.25 ml 의 메탄올 / 클로로포름 / 헵탄 [141 / 125 / 100 (v / v)] 혼합물을 첨가하고격렬히 교반함으로 반응을 정지시켰다. 그런 후, 그 혼합물을 실온에서 3,000 g 로 15 분간 원심분리하였다.

수 - 메탄올 상의³H 함량은 리퀴드 신실레이션 카운터로 측정하였다.

LPL 활성의 1 단위는 1 분당 1 μmol 의 지방산을 생성시키는 활성으로 정의하였다. 기질 용액에서, 13 mM 글리세롤 트리 [9, 10 (n) -³H] 올레이트는 글리세롤 트리 [9, 10 (n) -³H] 올레이르 (37.0 GBg / mol, 아머샴사 제조) 를 트리올레인 (시그마사 제조) 으로 희석하여 제조하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.

하기 실시예는 본 발명의 글루타티온 환원 단백질의 구현예에 관한 것이다.

실시예 1

KM - 102 세포에서 폴리 (A)⁺RNA 의 추출

KM - 102 세포는 10 % 의 FBS (태내소혈청) 를 함유하는 이스코브의 변형 최소 배지 (베링거 - 맨하임) 로, 15 cm 구경의 36 플라스틱 배양 접시에서 배양하였다. 세포를 군집상태까지 성장시킨 후에 포볼 미리스틸 아세테이트 (PMA) 및 칼슘 이오노포아 (ionophore) A 23187 (시그마) 을 10 ng / ml 및 0.2 μM 의 최종농도가 각각 되도록 첨가하고 37 ℃ 에서 계속 배양하였다. 12 접시를 3, 6 및 14 시간 후에 수확하여, 각각의 접시에 별도로 구아니딘 티오시아네이트 용액을 용해하고, 액체상을 모았다.

폴리 (A)⁺RNA 의 분리는 기본적으로 "Molecular Cloning - 실험서" [마니아티스 일행, (1982) PP 196 - 198] 에 기술된 방법으로 수행하였다. 그 방법의 상세한 설명은 하기에 나타난다.

각각의 회수된 액체상을 개별적으로 하기와 같이 처리하였다. 그 액체를 21 G 의 주사바늘이 장치된 10 ml 주사기를 사용하여, 반복하여 혼합하였다. 3 ml 의 5.7 M CsCl - 0.1 M EDTA (pH 7.5) 용액을 RPS 40 - T 원심 분리기 (히따치 고끼) 로타의 크기에 맞는 폴리아로마 원심분리 관에 미리 가하였다. 세포 제조물을 그 관을 가득 채울때까지 그 용액위에 두었다.

20 ℃ 에서 30,000 rpm으로 18 시간 원심분리한 뒤, 그 결과의 펠렛을 400 μl 의 증류수에 현탁하고 에탄올 침전법을 수행하였다. 그 결과의 펠렛을 400 μl 의 증류수에 용해시키고, 동량의 클로로포름 / 1 - 부탄올 혼합액 (4 : 1, v / v) 을 첨가하여 교반하고, 원심분리로 수용층을 모았다. 다시 한번 에탄올 침전법을 수행하고, 그 결과의 펠렛을 600 μl 의 증류수에 용해시켜 총 RNA 를 수득하였다. 3, 6 및 14 시간의 PMA / A 23187 - 자극 시료 각각으로 부터 약 4.5 mg 의 총 RNA 를 수득하였다.

이러한 방법으로 수득된 세가지 형태의 총 RNA 600 ㎍ 각각을 모아, 올리고 (dT) 셀룰로스 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 폴리 (A)⁺RNA 를 정제하였다.

총 RNA 를 흡착 완충용액에 용해시키고, 65 ℃ 로 5 분간 가열하였다. 그 결과의 용액을 흡착 완충용액으로 부하된 올리고 (dT) 셀룰로스 컬럼 (파마시아, 7형) 에 적용하고, 용출 용액으로 용출시켜 100 ㎍ 의 poly (A)⁺RNA 를 수득하였다.

실시예 2

cDNA 라이브러리의 제조

cDNA 라이브러리는 오까야마 - 베르그 방법에 따라 제조하였다. 5 ㎍ 의 폴리 (A)⁺RNA 및 24 단위의 리버스 트랜스 크립타제 (세이가가꾸사 제조) 를 20 ㎕ 의 리버스 트랜스크립타제 반응 용액에서 42℃ 로 1 시간 동안 반응시켰다.

2 μl 의 0.25 M EDTA 및 1 μl 의 10 % SDS 를 첨가하여 반응을 정지시키고, 그 용액을 20 μl 의 페놀 / 클로로포름 혼합물 (1 : 1, v / v) 로 탈단백질화 하였다. 원심분리로 단백질성 분획을 제거하고 20 μl 의 4 M 암모늄 아세테이트 및 80 μl 의 에탄올을 상층액에 첨가하고 -70 ℃ 에서 15 분간 냉각시켰다. 이후, 원심 분리로 침전물을 모으고 75 % 에탄올로 세척하고 감압하에서 건조시켰다.

건조된 침전물을 15 μl 의 말단 트랜스퍼라제 반응 용액에 용해시키고, 37 ℃ 에서 3 분 동안 가온 하였다. 이 후, 18 단위의 말단 디옥시뉴클레오티드 트랜스퍼라제 (파마시아사 제조) 를 반응 용액에 첨가하고, 5 분 동안 반응을 수행하였다. 1 μl 의 0.25 M EDTA 및 0.5 μl 의 10 % SDS 를 첨가하여 반응을 정지시키고, 페놀 - 클로로포름으로 탈단백질화 시키고(상기 기술한 바와 같음), 원심분리로 단백질성 분획을 제거하였다. 상층액을 모은 뒤 15 μl 의 4 M 아세트산 암모늄 및 60 μl 의 에탄올과 완전히 혼합하였다. 이러한 혼합물을 -70 ℃로 15 분 동안 냉각 시킨 뒤, 원심분리로 침전물을 모았다.

그 결과의 펠렛을 10 μl 의 제한효소 완충용액에 용해시키고, 2.5 단위의 제한효소 Hind III 을 그 결과의 용액에 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 유지시켜 절단하였다.

반응용액을 페놀 - 클로로포름으로 탈단백질화 하고 에탄올 침전법을 수행하고, 상층액을 -70 ℃ 에서 15 분간 냉각하였다. 원심분리로 침전물을 모은 뒤 10 μl 의 TE 완충용액 [10 mM 트리스 - 염산 (pH 7.5) 및 1 mM EDTA] 에 용해하였다. 1 μl 의 그 결과 용액을 10 mM 트리스 - 염산 (pH 7.5), 1 mM EDTA, 100 mM 염화나트륨 및 10 ng 의 올리고 (dG) - 테일 링커 DNA [3' - 올리고 (dG) - tailed pL - 1 Hind III linker, 파마시아사 제조] 를 함유하는 10 μl 의 반응 용액으로 만든 뒤, 65 ℃ 로 5 분간 가열하고 42 ℃ 에서 30 분간 유지하였다. 그러한 반응 혼합물을 빙냉하에서 냉각하고, 거기에 10 μl 의 10 배의 리가아제 완충용액, 78 μl 의 증류수 및 8 단위의 T4 DNA 리가아제를 첨가하였다. 그 반응용액을 12 ℃ 에서 밤새 유지하였다.

그 다음날, 반응 혼합물을 10 μl 의 1 M 염화칼륨, 1 단위의 리보뉴클라제 H, 33 단위의 DNA 폴리머라제 I, 4 단위의 T4 DNA 리가아제, 0.5 μl 의 dNTP 용액 (20 mM dATP, 20 mM dCTP, 20 mM dGTP 및 20 mM dTTP) 및 0.1 μl 의 50 ㎍ / ml 의 BSA 와 함께 조합하고, 그 결과의 혼합물을 먼저 12 ℃ 에서 1 시간 유지하고, 25 ℃ 에서 1 시간 유지하였다. 이후, 그 반응 용액을 5 배의 증류수로 희석하고, 그 즉시 하나한 방법 (J. Mol. Biol. 166, 557 - 580) 을 사용하여 이. 콜리 DH 5 α를 형질 전환하는데 사용하고, 그럼으로써 KM - 102 세포의 cDNA 라이브러리를제조하였다.

실시예 3

올리고뉴클레오티드 프로브의 제조

사이토킨의 mRNA 중 3' 의 비전사되는 부분의 AUUUA 서열에 근거하여, ATT - 3 으로 고안된 15 염기 서열의 올리고뉴클레오티드 5' - TAAATAAATAAATAA - 3' (서열 식별 번호 13) 을 화학적으로 합성하였다. 그 합성은 실험서의 지시에 따라 380 B 자동 DNA 합성기 (페킨 - 엘머 일본 어플라이드 바이오체계사 제조) 를 사용하여 수행하였다. 사용된 방법은 카루테르스 일행 (J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 - 3191, 1981) 의 포스포아미디트 방법이었다. 15 개의 서열의 합성 이후, 그 결과의 올리고뉴클레오티드를 그 지지체로 부터 분리하고 보호기를 제거하였다. 그 결과의 올리고뉴클레오티드 용액을 동결 건조하여 분말로 만들고 증류수에 용해시킨 뒤, 사용시까지 20 ℃ 로 냉동 보관하였다.

실시예 4

cDNA 라이브러리의 스크리닝

상기 실시예 2 에서 제조된 cDNA 라이브러리로 부터 발생한 6,500 개의 콜로니를 그룬스타인 및 호그네스의 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 - 3965) 에 따라 니트로셀룰로스 여과지에 고정시켰다. 실시예 3 에서 제조된 ATT - 3 프로브를 하기 일반적인 방법 ("Molecular Cloning - 실험서" 참조) 에 따라³²P 로 5 ' 을 표식하고, 표식된 프로브를 콜로니 혼성화에 사용하였다.

예비 혼성화는 하기 조건에서 37 ℃ 에서 3 시간동안 수행하였다.

6 배의 SSC, 1 배의 덴하르트 용액, 0.25 % 의 SDS, 0.05 % 소듐 파이로포스페이트 및 100 ㎍ / ml 의 변성 연어 정자 DNA. 혼성화는 하기 조건에서 31 ℃ 로 밤새 수행하였다: 6 배의 SSC, 1 배의 덴하르트 용액, 17 ㎍ / ml 의 효모 tRNA 및 0.05 % 의³²P - 표식 프로브 ATTT - 3 을 함유하는 소듐 파이로포스페이트.

그 다음날, 니트로셀룰로스 여과지를 0.05 % 의 소듐 파이로포스페이트를 함유하는 6 배의 SSC 용액으로 실온에서 2 시간 동안 세척하였다. 이어서, 방사선 자동사진으로 33 양성 클론을 확인하였다.

하기 표준 방법에 따라 양성 클론으로 부터 플라스미드 DNA 를 추출하였다. 무작위로 여러개의 클론을 선별하고, 그것의 부분적인 cDNA 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 따라 확인하였다. 이러한 부분적인 서열을 개인 컴퓨터를 사용하여 EMBL 또는 유전자 은행 데이타베이스에 등록된 뉴클레오티드 서열과의 상동성을 조사하였고, ATT - 3 에 의해 감지된 클론의 몇몇 부분적인 서열과 Alu 반복 부위와의 상동성을 가진다는 것을 확인하였다(쉬미드 및 젤리네크, Science 216, 1065 - 1070, 1982).

Alu 반복 서열을 함유하는 DNA 절편을 인체 게놈 DNA 로 부터 제조하고, 표준 방법에 따라³²P 로 표식하였다. 이러한 표식된 DNA 를 상기 식별된 33 클론을 사용하여 콜로니 혼성화 프로브로 사용하였고, 12 개의 클론이 Alu 반복을 가진다는 것이 분명해졌다. 남아있는 21 개의 클론 각각의 cDNA 삽입 길이를 측정하여,그 길이가 50 내지 3,600 염기의 다양한 범위에 있음을 확인하였다.

남겨진 21 개의 클론의 cDNA 삽입체에서 제한 효소 지도 작성을 수행하였고, 부분적인 뉴클레오티드 서열은 상기와 같이 측정하였다. 이러한 부분적인 서열은 개인 컴퓨터를 통하여 EMBL 또는 유전자 은행 데이타 베이스에 등록된 뉴클레오티드 서열과의 사동성을 조사하였고, 신규의 서열을 가지는 클론을 선별하였다.

실시예 5

클론 번호 31 의 노던 혼성화 (Northern Hybridization)

클론중의 하나인 클론 번호 31 (pcD - 31 로 고안) 은 약 560 bp 의 cDNA 삽입체를 가졌다. pcD - 31 의 cDNA 의 삽입체로 부터 Pst I - Aat I 절편 (292bp) 을 수득하여, 노던 블러팅 방법에서의 프로브로 사용하기 위하여 KM - 102 세포로 부터 제조된 폴리 (A)⁺RNA 를 사용하여³²P 로 표식하였고, 실시예 1 의 방법과 유사한 방법을 수행하였다. 이러한 혼성화는 pcD - 31 의 삽입체에 해당하는 자연적으로 발생하는 mRNA 의 길이를 측정하기 위하여 사용되었다.

노던 혼성화 방법은 하기와 같다. 5.5 ㎍ 의 폴리 (A)⁺RNA 를 KM - 102 세포로 부터 제조하고, 1 M 글리옥살, 50 % 디메틸 술폭시드 (DMSO) 및 0.01 M 인산 수소 중나트륨 (pH 7.0) 의 혼합물에서 50 ℃ 에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이 시간이 끝날쯤, 4 ㎕ 의 전기영동 색소를 그 반응 혼합물에 첨가하고 1 % 아가로스 겔에서 1 배의 TAE 로 전기영동 하였다.

전기 영동 후, 아가로스 겔상의 RNA 를 나일론 막 여과지(바이오 래드, 제타- 프로브) 에 모세관 이전 방법 ("Molecular Cloning - 실험서") 에 따라, 20 배지 SSC 를 사용하여, 밤새 옮겼다. 이전 후, 그 여과지를 2 배의 SSC 로 부드럽게 세척하고, 공기중 건조하고, mRNA 를 고정시키기 위하여 80 ℃ 에서 2 시간 더 건조시켰다.

pcD - 31 의 Pst I - Aat I 의 절편을 멀티프라임 DNA 표식기 (아머샴 제조) 를 사용하여³²P 로 표식하였다.

예비 혼성화는 5 배의 SSCP, 2.5 배의 덴하르트 용액, 50 % 포름아미드, 10 mM 인산 수소중나트륨 (pH 7.0), 0.5 % SBS 및 100 ㎍ / ml 의 변성 연어 정자 DNA 를 함유하는 용액에서 37 ℃ 에서 3 시간 동안 여과지에서 수행하였다.

혼성화는³²P - 표식 프로브, 5 배의 SSCP, 1 배의 덴하르트 용액, 50 % 포름아미드, 10 mM 인산 수소 중나트륨 (pH 7.0), 0.1 % SDS 및 100 ㎍ / ml 의 변성 연어 정자 DNA 를 함유하는 용액에서 42 ℃ 로 밤새 여과지 상에서 수행하였다. 그 다음날, 여과지를 먼저 50 % 포름아미드, 5 배의 SSC 및 0.1 % SDS 를 함유하는 용액으로 37 ℃ 에서 1 시간 동안 세척하였고, 동일한 온도에서 40 % 포름아미드, 5 배의 SSC 및 0.1 % SDS 를 함유하는 용액으로 2 시간 동안 세척하고, 마지막으로 2 배의 SSC 용액으로 실온에서 15 분 동안 세척하였다. 연속적인 방사선 자동사진으로, 클론 pcD - 31 의 cDNA 삽입체는 완전한 길이가 아니며, 해당 mRNA 의 완전한 길이는 3.9 kb (분자량 표식자를 근거로 한 눈금 곡선으로 부터 측정) 로 나타났다.

실시예 6

클론 pcD - 31 cDNA 스크리닝을 위한 새로운 라이브러리의 제조

새로운 cDNA 라이브러리는 cDNA 합성기 플러스 및 cDNA 클로닝 기 (λgt 10, 어댑터 방법, 아머샴사 지원) 를 사용하여 제조하였다.

KM - 102 세포로 부터 5 ㎍ 의 폴리 (A)⁺RNA를 추출하였고 (실시예 1 과 유사한 하기의 방법에 따라), 50 ㎕ 의 리버스 트랜스크립타제 반응 용액에서, 100 단위의 리버스 트랜스크립타제와 42 ℃ 에서 40 분간 반응하였다. 이후, 20 μCi의 [α -³²P] dCTP, 93.5 ㎕의 2 차 사슬 완충용액, 4 단위의 리보뉴클라제 H 및 115 단위의 DNA 폴리머라제 I (모두 키트로 제공) 을 그 반응 용액에 첨가하고, 먼저 12 ℃ 에서 1 시간 반응시키고, 22 ℃ 에서 1 시간 더 반응시킨 뒤, 최종적으로 70 ℃ 로 10 분간 가열하였다. 가열 후, 10 단위의 T4 DNA 폴리머라제 (키트로 제공) 를 반응 용액에 첨가하고 37 ℃ 에서 10 분간 반응시켰다.

그 반응 혼합물을 페놀 - 클로로포름 탈단백질화 반응을 수행하였다. 그 반응 용액을 원심 분리하고, 상층액을 모은 뒤, 250 ㎕의 4 M 아세트산 암모늄 및 1 ml 의 에탄올과 잘 혼합하였다. 이 혼합물을 밤새 - 20 ℃ 로 냉각하고, 원심 분리로 침전물을 모았다. 그 결과의 펠렛을 30 ㎕의 멸균수에 용해시켰다. 10 ㎕의 결과 용액을 제거하여 2 ㎕의 리가아제 / 키나제 완충용액, 250 pmol 의 EcoRI 어댑터 및 5 단위의 T4 DNA 리가아제(모두 키트로 제공) 의 혼합물에 첨가하고, 그 결과의 혼합물을 15 ℃ 에서 밤새 반응시켰다.

그 전체의 반응 용액을 EcoRI 어댑터를 제거하기 위하여, 키트와 함께 제공된 크기 분획 컬럼에 적용하였다. 그 반응 용액을 120 ㎕ 의 양으로 모은 뒤, 그 각량을 200 ㎕의 0.25배 TE 완충용액과 혼합하였다. 10 번째에서 17 번째 분획을 모은뒤, 총부피 120 ㎕ 의 부탄올로 농축시켰다.

농축된 수득물 전부를 55 ㎕의 멸균수, 20 ㎕의 리가아제/키나제 완충용액 및 40 단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (모두 키트로 제공) 와 혼합하고, 그 결과의 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 이후, 반응 혼합물을 페놀 - 클로로포름 방법으로 3 회 탈단백질화 시키고, 에탄올로 침전시키고 -20 ℃ 에서 밤새 냉각하였다. 원심 분리로 그 결과의 침전물을 모으고, 10 ㎕의 멸균수에 용해하여 cDNA 시료로 제공하였다.

1 ㎍ 의 λgt 10의 EcoRI arm, 1 ㎕의 리가아제 / 키나제 완충용액 및 2.5 단위의 T4 DNA 리가아제 (모두 키트로 제공) 을 cDNA 시료 2 ㎕ 각각에 첨가하였고, 15 ℃ 에서 밤새 반응시켰다. 4 ㎕의 cDNA 시료를 함유하는 시료를 동일한 방법으로 제조하였다. 각각의 시료에 하기와 같은 부가 처리를 하였다. 그 결과의 반응용액 전체에, 먼저 10 ㎕의 추출물 A (키트로 제공) 를 첨가하고, 그 혼합물에 15 ㎕의 추출물 B (키트로 제공) 를 첨가한뒤, 그 결과의 혼합물을 20 ℃ 에서 20 분간 반응시켜 실험실 조건에서의 패키징 반응을 수행하였다.

이후, 470 ㎕의 SM 완충용액을 그 반응용액에 첨가하고 4 ℃ 에서 저장하였다. 이. 콜리 균주 NM 514 를 10 mM 황산마그네슘으로 처리하고, 저장된 용액으로 감염시켜 KM - 102 cDNA 의 λgt 10 라이브러리를 만들었다.

실시예 7

cDNA 라이브러리의 스크리닝

실시예 6 에서 제조된 조합되어 있는 cDNA 라이브러리로 부터 수득된 2 ×10⁵플라크를 나일론 여과지 (하이본드 N, 아머샴) 에 하기 방법에 따라 고정시켰다.

실시예 6 에서 제조된 감염된 이. 콜리 를 LB 고체 배지를 함유하는 10 개의 9 cm 배양판에 배양하여, 배양판당 1 ×10⁴내지 2 ×10⁴플라크가 형성되도록 하였다. 그 플라크를 배양판 상에 나일론 여과지로 부드럽게 압력을 가하여 옮겼다. 18 G 의 주사 바늘로 여과지를 구멍 뚫고, 참고로 3 위치의 겔에 표시하였다. 그런후 여과지를 4 ℃ 에서 5 분 내지 10 분간 유지한 뒤, 박리하고 염기성 용액 (0.1 N 수산화나트륨, 1.5 M 염화 나트륨) 에 20 초간 침지하였다. 그런 후, 여과지를 중성 용액 [0.2 M 트리스 - 염산 (pH 7.5), 2 배의 SSCP] 으로 20 초에서 1 분동안 옮기고, 그다음 실온에서 2 시간 동안 공기중 건조시켰다. 최종적으로, 여과지를 80 ℃ 에서 2 시간 건조시켰다.

실시예 8

프로브 제조 및 혼성화

pcD - 31 로 부터(실시예 4에서 수득), 멀티프라임 DNA 표식기를 사용하여 Pst I - Aat I 절편 및 EcoT221 - Aat I 절편 (223 bp) 를 표식함으로써³²P - 표식 프로브를 만들었다. 플라크 혼성화는 실시예 7 에서 수득한 여과지 상에 상기 프로브를 사용하여 수행하였다.

예비 혼성화는 50 % 포름아미드, 5 배의 SSCP, 2.5 배의 덴하르트 용액, 0.01 M 인산수소중나트륨 (pH 7.0), 0.5 % SDS 및 100 ㎍ / ml 의 변성 연어 정자 DNA 의 조 (bath) 에 여과지를 두고 37 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다.

그런 후, 혼성화는 상기 제조된³²P - 표식 프로브 및 50 %의 포름아미드, 5 배의 SSCP, 1 배의 덴하르트 용액, 0.01 M 의 인산수소중나트륨 (pH 7.0), 0.1 % SDS 및 100 ㎍ / ml 의 변성 연어 정자 DNA 를 함유하는 반응 용액에 여과지를 두고 37 ℃ 에서 밤새 반응시킴으로 수행하였다.

그 다음날, 먼저 여과지를 50 % 포름아미드, 5 배의 SSC 및 0.1 % 를 함유하는 용액으로 3 시간 동안 실온에서 세척하고, 그런 후, 2 배의 SSC 로 실온에서 5 분동안 세척하였다. 방사선 자동 사진은 이러한 기본 스크린에서 80 개의 양성 클론이 수득되었음을 나타내었다.

양성으로 식별된 클론을 사용하여 실시예 7 및 8 의 방법을 3 회 반복하였고, 궁극적으로 17 개의 양성 클론을 수득하였다. 각각의 17 개의 클론으로 부터 cDNA 를 분리하여, EcoRI 으로 삽입체를 절단하였다. 각각의 cDNA 삽입체의 길이를 아가로스 겔 전기영동으로 조사하여 원래의 mRNA 의 완전한 길이에 해당하는 3.9 kbp 의 cDNA 삽입체를 가지는 클론 번호 31 - 7 이 분리되었다.

실시예 9

클론 번호 31 - 7 의 제한 지도

클론 번호 31 - 7 을 EroRI 으로 절단하여 cDNA 삽입체를 함유하는 3.9 kb 절편을 분리 정제하였다. 이러한 절편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 pUC 18 로 삽입시켰다. 이러한 신규의 플라스미드를 사용하여 이. 콜리 DH 5 α를 형질 전환시켰다. 형질전환된 세포를 암피실린에 대한 내성으로 선별하고, 3.9 kbp cDNA 삽입체를 가지는 클론 pUCKM 31 - 7 을 EcoRI 으로 DNA 를 절단하고 절단된 DNA 를 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 식별하였다.

pUCKM 31 - 7 을 제한 효소 Hind III, Sac I, Xba I, Sma I, Bgl II, EcoT22I 및 Aat I 또는 그것들의 쌍으로 절단하였다. 그 결과의 절편을 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 표식자로 λHind III / φ×174Hae III 표식을 사용하여, 각 절편의 길이를 측정하였다.

그 결과의 제한 지도는 제 7 도에 나타난다.

실시예 10

클론 번호 31 - 7 의 서열 측정

pUCKM 31 - 7 의 cDNA 삽입체의 전체 뉴클레오티드 서열은 M13 파지를 사용한 디데옥시 방법에 의해 측정되었다. 덧붙여서, 서열의 한 부분을 373 A DNA 서열 분석기 (페킨 -엘머, 일본 어플라이드 바이오체계 사 제조)로 분석되었다. 그 결과의 뉴클레오티드 서열은 하기 서열 목록의 식별 번호 11 이다.

pUCKM 31 - 7 의 cDNA 삽입체의 길이는 3,815 염기이고, 메티오닌으로 시작되는 549 아미노산을 구성하는 하나의 개방 해독틀을 가진다. 폴리 (A) 테일은 분명히 없다. pcD - 31 삽입체의 3' - 말단의 염기서열과 클론 pUCKM 31 - 7 의 서열을 비교함으로 pUCKM 31 - 7 의 삽입체가 폴리 (A) 테일 부분 (제 8 도) 만을 잃어버린 것이라는 것이 밝혀졌다.

염기 및 아미노산 서열을 각각 비교하기 위하여, EMBL 및 유전자 은행 뉴클레오티드 데이타베이스 및 NBRF 및 SWISS - PROT 데이타베이스로 평가하였다. 밝혀진 가장 밀접한 조화는 인간 글루타티온 환원 효소의 펩티드 서열과 35.3 % 의 상동성을 가졌다. 따라서, pUCKM 31 - 7 의 cDNA 삽입체의 ORF 는 분명히 새로운 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 결론 지었다.

이러한 새로운 폴리 헵티드는 하기 서열 목록에서 서열 식별 번호 12 로 나타난다.

실시예 11

신규 폴리펩티드의 발현 및 정제

COS - 1 세포에서의 고 발현 벡터 및 발현의 구축

pUCKM 31 - 7 을 Hind III 으로 절단하고, cDNA 삽입체를 함유하는 3003 염기 절편을 분리한뒤, 하기 표준 방법에 따라 정제하였다. 그 결과의 절편의 말단을 DNA 블런팅 (blunting) 키트 (다까라 수조) 를 사용하여 블런팅 하였다.

한편, 고 발현 벡터 pcDL - SRα296 [다까베 일행, Mol, Cell. Biol. 8, 466 - 472, (1988)] 을 PstI 및 KpnI 으로 절단하고, 그 말단을 DNA 블런팅 키트를 사용하여 블런팅 하였다. 그후, 블런팅된 삽입체를 T4 DNA 리가아제를 사용한 반응에서, 블런팅된 플라스미드와 연결시켰다. 이. 콜리를 염화칼슘방법으로 그 결과의 DNA 로 형질 전환시키고, 그 결과의 암피실린 내성 형질 전환체를 선별하고, 그 세균에 보유된 플라스미드 DNA 를 분석하였다.

구체적으로, cDNA 의 전사 방향이 SRα프로모터의 방향과 동일한 균주를 Hind III 및 Bgl II 로 플라스미드를 절단하고 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 800 bp 절편을 위치를 확인하여 선별하였고 선별된 플라스미드는 pSRα31 - 7 로 고안되었다 (제 9 도). SRα프로모터는 SV 40 개시 프로로터 및 HTLV - 1 의 긴 말단 반복 (LTR) 의 R - 45 서열을 포함하며 SV 40 초기 프로모터보다 10 내지 100 배 더 강한 프로모터 환성을 가진다.

다음으로, 그 결과의 플라스미드 pSRα31 - 7 로 COS - 1 세포를 형질 전환 시켰다. COS - 1 세포의 형질전환은 GTE - 1 유전자 도입 장치 (시마쯔사 제조) 를 사용하여 일렉트로포레이션 (electroporation) 으 수행하였다.

COS - 1 세포는 각 25 ml 의 DMEM (10 % FBS 함유) 을 포함하는 7 개의 150 cm³플라스크 바닥에 준 군집상태로 성장시켰다. 그런 후, 그 배양액을 모아 각각 3 ml 의 트립신 - EDTA 용액 (10 배의 용액, 시그마 제조) 으로 처리하고, 세포가 분리될때까지 실온에 방치하였다. 1 ml 의 불활성 FBS 및 9 ml 의 새로운 트립신 - EDTA 용액을 첨가하고 원심분리로 세포를 모았다. 그런 후, 모아진 세포를 PBS (-) 완충용액으로 2 회 세척한뒤 PBS (-) 완충용액에 6 ×10⁷세포수 / ml 이 되도록 현탁 하였다.

반면, 플라스미드 DNA 는 염화 세슘 방법에 의해 제조하고 200 ㎍ / ml 의 PBS (-) 완충용액이 되도록 하였다.

상기 언급된 세포 및 플라스미드의 20 ㎕ 각각의 PBS (-) 제조물을 혼합하고, 그 혼합물을 2 mm 간격으로 떨어져 있는 전극이 구비된 챔버에 두었다. 1 초 간격으로, 그 혼합물에 30 μsec 동안 600 V 의 충격을 2 회 적용하였다.

전극실을 4 ℃ 에서 5 분 동안 냉각시킨 뒤, 내부의 세포 - DNA 혼합물을 10 % FBS 를 함유하는 10 ml 의 DMEM 과 혼합하였다. 이러한 혼합물을 페트리 접시에 옮기고 37 ℃ 에서 5 % CO₂분위기에서 밤새 배양하였다. 그 다음날, 배양 상층액을 버리고, 세포를 혈청이 없는 DMEM 으로 세척한 뒤 10 ml 의 DMEM 에 현탁하고 37 ℃ 에서 3 일간 배양하였다. 그 후, 세포 상층액을 수확하였다.

배양 상층액을 음성 대조군으로 또한 회수하였다. 음성 대조군을 cDNA 삽입체를 가지지 않는 플라스미드 pcDL - SRα296 에 사용하였으며, 시험 배양액에 유사한 방법으로 제조하였다.

음성 대조군의 배양 상층액 1 ml 각각 및 실험 배양액을, 분리하여 하기와 같이 진행하였다. 먼저, 상층액에 트리클로로아세트산 (TCA) 를 처리하여 단백질을 침전시키고, 그 침전물을 원심 분리로 모았다. 그 결과의 침전물을 빙냉 아세톤으로 세척한 뒤, 공기중 건조 시키고, 2 - 메르캅토에탄올을 함유하는 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS - PAGE) 시료 완충용액에 용해시켰다. SDS - PAGE 는 환원 조건에서 12.5 % 겔상에서 수행하였다.

은 염색제인 "다이찌" (다이찌 화학적 감지) 를 사용한 은 염색법을 전기 영동 후 밴드에 수행하였다. 실험 시료의 배양 상층액으로 부터 여러 특정 밴드 (분자량 : 약 60,000) 가 염색되었다.

pSRα31 - 7 에서 코딩되는 폴리펩티드의 분자량이 약 60,000 이기 때문에, 당 측쇄에 첨가되는 후전사 변형이 일반적이지 않다는 것을 아미노산 서열로 부터 추정할 수 있으며, 이러한 여러 특정 밴드가 pSRα31 - 7 의 cDNA 에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 해당된다는 것으로 결론 지을 수 있다.

실시예 12

COS - 1 세포의 고 발현 플라스미드의 제조

다음 단계는 실시예 11에서 식별된 여러 특정 60 kDa 밴드가 pSPα31 - 7 의 삽입체에 의하여 코딩되는 폴리펩티드와 동일함을 실증하기 위한 것이다. 이러한 폴리펩티드의 N - 말단 아미노산 서열을 결정하는 것도 또한 바람직하다. 따라서, pSRα31 - 7 삽입체에 의하여 정지 코돈 바로 전에서 코딩되는 폴리펩티드의 C - 말단에 대하여, 잔여의 6 개의 His 잔기가 코딩되는 클론을 제조하였다. 히스티딘 잔기는 Ni²⁺에 대하여 매우 높은 친화성을 가지며, 그 목적은 히스티딘 6 단량체(6 x His)를 가지는 폴리펩티드를 발현하기 위한 것으로, Ni²⁺로 전하된 친화성 수지 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다.

먼저, 66 염기의 올리고뉴클레오티드

(서열 식별 번호 14)

및 그 상보성의 66 염기 사슬을 자동화 DNA 합성기 394 (페르킨 - 엘머 일본 어플라이드 바이오체계) 를 사용하여 합성하고 정제하였다. 이러한 올리고뉴클레오티드 제조물을 혼합하고 70 ℃ 에서 3 분간 반응시키고, 그런후 37 ℃ 에서 10 분간 방치하여 어닐링을 수행하였다. 이어서, T4 폴리 뉴클레오티드 키나제를 사용하여 말단을 인산화 하였다.

그 결과의 이중 사슬 (ds) 절편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 앞서 Eco47 III 으로 절단된 pUCKM 31 - 7 과 연결시켰다. 그것은 제 10 도에 나타난다. 이러한 DNA 로 염화 칼슘 방법에 따라 이. 콜리 DH5α를 형질 전환시키고, 그 결과의 균주를 선별하고 스크리닝하여 pUCKM 31 - 7 His 를 수득하였다. 이러한 pUCKM 31 - 7 His 의 관련된 염기 서열의 부분을 분석함으로 그 절편이 삽입된 pUCKM 31 - 7 His 의 부분에는 어떠한 비정상도 없음을 확인하였다.

COS - 1 세포에서 고발현 플라스미드는 pUCKM 31 - 7 His 를 pcDL - SRα296 으로 준클로닝하여 제조되었다.

pUCKM 31 - 7 His 를 Xba I 및 Hind III 으로 절단하고, 그 절편을 정제한뒤, 그 말단을 1 단위의 클레노브 절편을 사용하여, 2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2mM dGTP, 2mM dTTP, 50 mM 트리스 - 염산 (pH 7.2), 10 mM 황산마그네슘, 0.1 mM 디티오트레이톨 및 50 ㎍ / ml 의 BSA 존재하에서 블런팅 하였다.

한편, 고발현 벡터 pcDL - SRα296을 Pst I 및 Kpn I 으로 절단하고 DNA 블런팅 키트를 사용하여 블런팅하였다. 블런팅된 절편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 블런트된 플라스미드와 연결하였다. 그후, 그 결과의 플라스미드로 이. 콜리 DH5α를 형질 전환하였다. 형질 전환체를 선별하고 스크리닝 하였다. cDNA 전사 방향이 SRα프로모터의 방향과 동일한 균주를 선별하고, 이러한 균주의 플라스미드로 pSRα31 - 7 His 를 고안하였다. COS - 1 세포를 그 결과의 플라스미드 pSRα31 - 7 His 로 형질전환 하고, 실시예 11 에서 기술한 방법과 동일하게 혈청 없는 상층액을 수득하였다.

실시예 13

정제 및 N - 말단 아미노산 서열 분석

실시예 12 에서 수득한 600 ml 의 상층액을 4 ℃ 에서, 17 배 부피의 투석 완충용액에 대하여 15 시간 동안 투석하였다. 그 투석 완충용액을 다시 17 배 부피의 트석완충용액으로 대체하여 4 ℃ 에서 4 시간 더 투석하였다.

그 투석된 제조물을 하기 조건하에서 FPLC (신속한 단백질 폴리 뉴클레오티드 액체 크로마토그래피 - 파마시아) 를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하였다.

조건 :

컬럼 : 20 ml 의 프로본드^TM수지 (인비트로겐) 로 채워진 XK 16 / 20 (φ 2.0 ×20 cm, 파마시아)

용출 완충용액 :

A) 200 mM 의 이미다졸, 0.5 M 염화나트륨이 함유된 20 mM 인산 완충용액 (pH 7.8)

B) 300 mM 의 이미다졸, 0.5 M 의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 인산 완충용액 (pH7.8)

용출 속도 : 1 ml /분

분획 용액 : 5 ml /관

용출 조건 : 용출 완충용액 A) 로 4 개의 분획을 회수한 후, 용출 완충용액 B) 로 16 개의 분획을 회수하고 그 분획을 1 에서 20 까지 번호를 매겼다.

300 ㎕ 의 각각의 분획 시료를 취하여, 각각 TCA 침전 처리를 수행하고, 그 결과의 침전물로 앞서와 같은 환원 조건에서 12.5 % 겔을 사용하여 SDS - PAGE 를 수행하였다. 은 염색법으로 밴드를 확인하였고, 분획 10 번 주위에서 3 개의 밴드가 확인되었다. 3 개 밴드의 존재는 pSRα31 - 7 His 삽입체가 N - 말단 서열이 다른 3 개의 상이한 길이를 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 가리킨다.

분획 7 에서 14 의 나머지를 TCA 침전법으로 농축하고, 침전물을 환원조건에서 10 % 겔을 사용하여 SDS - PAGE 를 수행하였다. 단백질 밴드를 폴리아크릴아미드겔로 부터 폴리비닐리딘 디플루오리드 (PVDF) 필름 (ProVlot, 어플라이드 바이오체계사 제조) 상에 겔 막 이전 장치 (마리솔, KS - 8441) 를 사용하여 4 ℃ 에서 이전 완충용액 [0.02 % SDS, 20 % 메탄올, 25 mM 트리스 - 붕산염 (pH 9.5)] 의 존재하에서 2.5 시간 동안 9 V 를 적용하여 이전하였다.

이 시간 후, 그 막을 0.2 % 나프톨 블루 블랙 (시그마) 으로 염색하고, 앞서 식별된 것에 해당하는 3 개의 밴드를 막으로 부터 절단하여, 기체상 단백질 서열 분석기 (시마쯔사 제조, PPSQ - 10) 를 사용하여 N - 말단으로 부터 6 번째 아미노산을 결정하였다. 두번째로 큰 분자량 (분자량 약 60,000) 을 가진 N - 말단은 하기와 같다.

Val - Val - Phe - Val - Lys - Gln (서열 식별 번호 12 의 아미노산 번호 1 내지 6)

이러한 6 개의 아미노산은 클론 번호 31 - 7 의 ORF 의 처음 6 개의 아미노산에 해당되며, 또한 pSRα31 - 7 His 및 pSRα31 - 7 의 cDNA 삽입체에 의하여 코딩되는 전구 폴리펩티드의 N - 말단으로 부터 24 번째 아미노산 (Val) 으로 부터 시작되는 6 개의 아미노산 서열에 해당한다. 따라서, 이러한 전구 폴리펩티드의 N - 말단으로 부터 1 에서 23 아미노산의 결실은 Val 잔기로 시작되는 단백질의 성숙한 형태의 분비를 야기한다.

실시예 14

환원 활성의 측정

1) 발현 벡터의 구축

앞서의 실시예에서 정제된 폴리펩티드는 COS - 1 세포에서 발현된 바와 같이 극히 소량으로 수득될 수 있었다. 그러므로, 활성분석과 같이 다른 목적으로 그 폴리펩티드를 사용하는 것은 가능하지 않았다. 따라서, 정제 및 분석용의 적당한 양의 제조를 허용하는 다른 숙주에서, pSRα31 - 7 의 cDNA 삽입체에 의하여 코딩되는 폴리펩티드가 발현되는 방법을 찾는 것이 필요하였다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 하기 방법을 수행하였다.

pUCKM 31 - 7 을 Hind III 으로 절단하여, cDNA 삽입체를 함유하는 3003 bp 절편을 분리하고 정제하여 그 말단을 DNA 블런팅 키트를 사용하여 블런팅 하였다.

그 절편을 다시 XbaI 으로 절단하였다.

발현 벡터 pMAL - c [구안 일행, Gene, 67, 21 - 30, 1987] 을 XbaI 및 StuI 으로 절단한뒤, 상기 XbaI - 변형 Hind II 절편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 절단된 폴라스미드와 연결하였다. 그 결과는 제 11 도에 나타난다. 그러한 구축물을 이. 콜리 TB - 1 을 형질전환 하는데 사용하고, 암피실린 내성 형질 전환체를 선별하여 스크리닝 하였다.

프로모터의 방향과 cDNA 전사 방향이 동일한 균주를 선별하였고, 그렇게 수득한 플라스미드는 pMAL 31 - 7 로 고안되었다.

2) 융합 단백질의 발현 및 정제

pMAL 31 - 7 을 가진 이. 콜리 종자 배양을 50 ㎍ / ml 의 암피실린을 함유하는 LB 배지 3 ml 에서 37 ℃ 로 밤새 진탕 배양하였다.

그 다음날, 1 ml 의 종자 배양을 50 ㎍ / ml 의 암피실린을 함유하는 새로운 LB 배양 배지 100 ml 에 가하여 OD_600nm가 0.5 가 될때까지 37 ℃ 에서 진탕 배양하였다. 이 시기에, IPTG 를 배양액에 첨가하여 최종 농도 0.1 mM 이 되도록 하고 37 ℃ 에서 밤새 진탕배양을 더하였다.

그 다음날, 세균 세포를 4 ℃ 에서 6500 rpm 으로 20 분간 원심분리하여 밤샘 배양액으로 부터 회수하였다. 펠렛을 10 ml 의 컬럼 완충용액에 현탁하고, 그 결과의 현탁액에서 초음파 분쇄기로 세포를 파쇄하였다. 온전한 세포 및 세포 파편을 0 ℃ 에서 8800 rpm 으로 30 분간 원심 분리하여 제거하고, 가용성 단백질 분획을 상층액으로 회수하였다. 이러한 가용성 분획 1 ml 을 아밀로스 수지 컬럼 (뉴 잉글랜드 바이오랩사 제조) 상에서 크로마토그래피를 수행하였다.

크로마토그래피용 용출 완충용액은 10 ml 의 컬럼 완충용액에 말토스를 최종 농도 10 mM 이 되도록 첨가하여 제조하였다.

음성 대조군 시료 또한 크로마토그래피를 수행하였다. 음성 대조군 시료는 어떠한 cDNA 삽입체 없는 pMAL - c 벡터를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법을 사용하여 제조하였다. 크로마토그래피 시료에서의 단백질의 환원 활성을 분석하였다.

3) 환원 활성의 측정

환원 활성의 측정은 디클로로페닐 - 인도페놀 (DCIP) 및 산화된 글루타티온을 사용하여 큐벳 (살스테드, 10 ×4 ×45 mm) 에서 수행되었다.

a) DCIP 를 사용한 환원 활성의 측정

상기 2) 에서 수득된 각각의 크로마토그래피 시료 90.4 ㎍ (단백질 분석 키트를 사용하여 측정, 바이오 -래드사) 을 별도로 1 ml 의 50 μM DCIP (시그마사 제조) 와 혼합하였다. 15 ㎕ 의 1 mM NADPH (베링거 - 맨하임) 를 시료 각각에 첨가하고 시간에 따른 OD_600nm및 OD_340nm의 값의 변화를 측정하였다. 제 12 도에 나타난 바와 값이 양파장에서 그 흡광도는 감소하였으며, 단지 pMAL 31 - 7 시료만이 DCIP 를 환원하는 인자를 함유하는 것으로 볼 수 있다.

b) 산화된 글루타티온을 사용한 환원 활성의 측정

15 ml 의 10 mM 산화된 글루타티온 (베링거 - 맨하임) 을 상기 2) 에서 수득된 각각의 크로마토그래피 시료 90.4 ㎍ 에 첨가하고, 이를 미리 분리된 큐벳에 부하하였다. 15 ml 의 1 mM NADPH 를 그 각각의 큐벳에 첨가하여 OD_340nm에서의 흡광도를 시간에 따라 측정하였다. 그 결과는 제 13 도에 나타나며, pMAL 31 - 7 시료로 부터의 단백질 만이 산화된 글루타티온을 환원할 수 있음이 나타난다. 또한, 산화된 글루타티온이 존재하지 않을때 NADPH 의 소모는 없음이 관찰되었고, 따라서 pMAL 31 - 7 시료의 단백질은 단지 NADPH 의 존재하에서 산화된 글루타티온을 환원시킬 수 있다.

실시예 15

N - 말단 아미노산 서열의 정제 및 분석

실시예 13 으로 부터, pSRα31 - 7His 로 형질 전환된 COS - 1 세포는 3 가지 유형의 N - 말단을 가지는 폴리펩티드를 발현한다고 결론지었다.

분리된 실험에서, pMAL31 - 7 로 형질전환된 이. 콜리 로 부터 회수된 융합 단백질로 토끼를 면역화 시켜 KM31 - 7 단백질에 대한 다클론성 항체를 수득하였다. 이러한 다클론성 항체를 사용하여 웨스턴 블러팅을 수행 하였고, pSRα31 - 7 로 형질전환된 COS - 1 세포로부터, 수득된 혈청이 없는 배양 상층액에서 세가지 유형의 밴드가 감지 되었다. 이러한 결과는 실시예 13 에서 수득된 결과와 유사하다.

따라서, COS - 1 세포는 KM31 - 7 단백질의 N - 말단 서열의 정제 및 분석을위하여 혈청이 없는 배양 상층액의 많은 양을 모을 목적으로, pSRα31 - 7 로 형질전환 되었다.

COS -1 세포를 pSRα31 - 7 로 형질전환 시키고, 각각 30 ml 의 DMEM 을 함유하는 150 mm 페트리 접시에서, 3 일간 배양 하였다. 그후 배양 상층액을 수확하고, 30 ml 의 신선한 배지를 그 각각의 접시에 첨가하고 3 일간 더 배양 하였다. 다시 한번, 배양 상층액을 모았다. 형질 전환 및 배양의 다른 면은 실시예 11 에서 기술한 바이나, 199 개의 접시를 배양 하였다.

수확된 상층액을 모아, 원심 분리하여 혈청이 없는 배양 상층액 10 l 를 모으고, 밤새 10 mM 트리스 - 염산 (pH 9.0) 에 대하여 투석 하였다. 이온 교환 크로마토그래피를 하기 조건에 따라 FPLC (파마시아) 를 사용하여 투석 제조물로 8 회 수행 하였다:

컬럼 : 20 ml 의 DEAE 세파로즈 패스트 플로우 (파마시아) 로 채워진 XK16/20 (φ2.0 ×20 cm, 파마시아)

용출 완충용액 :

A) 10 mM 트리스 - 염산 (pH 9.0)

B) 10 mM 트리스 - 염산 (pH 9.0) - 0.5 M 염화나트륨

용출 속도 : 1 ml / 분

분획 용액 : 3 ml / 관

용출 조건 : 용출 완충용액 A 에서 용출 완충용액 B 로의 60 분에 걸친 선형적 농도 구배.

0.1 - 0.4 M 의 염화나트륨 농도에서 용리된 분획을 모아, 0.1 M 트리스 - 염산, 5 mM EDTA (pH 7.6) 및 1 mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 투석 완충용액에 대하여 밤새 투석 하였다. 투석된 제조물을 2', 5' - ADP 세파로즈 4B (파마시아) 를 사용하여 하기 조건에서 친화성 크로마토그래피를 수행 하였다:

컬럼 : 20 ml 의 2', 5' - ADP 세파로즈 4B 로 채워진 XK16/20 (2.0 ×20 cm, 파마시아)

용출 완충용액 :

A) 0.1 M 트리스 - 염산, 5 mM EDTA (pH 7.6), 1 mM 2 - 메르캅토에탄올

B) 0.1 M 트리스 - 염산, 5 mM EDTA (pH 7.6), 1 mM 2 - 메르캅토에탄올, 10 mM NADPH

용출 속도 : 0.5 ml / 분

분획 용액 : 2 ml / 관

용출조건 : 용출 완충용액 A 에서 용출 완충용액 B 로의 120 분에 걸친 선형적 농도 구배.

100 ㎕ 의 각 결과의 분획을 TCA 로 침전시키고 침전물을 환원 조건에서 12.5 % 겔을 사용하여 SDS - PAGE 를 수행 하였다.

전기영동 후, 겔을 은 염색하여 단백질 밴드를 감지하였다. 분획 # 11 부터 시작해서 3 밴드가 나타났다.

분획 # 11 부터 # 14 까지 나머지 전부를 TCA 침전법으로 농축하고, 그 침전물을 환원 조건에서 12.5 % 겔을 사용하여 SDS - PAGE 를 수행 하였다. 전기영동후, 단백질을 겔에서 ProBlot PVDF 막 (어플라이드 바이오체계사 제조) 으로 옮겼다. 단백질을 막으로 옮긴 후에, 그 막을 0.2 % 나프톨 블루 블랙으로 염색하고, 3 종류의 단백질성 밴드를 절단 하였다. 기체상 단백질 분석기를 사용하여 N - 말단 서열 분석을 수행 하였다.

세 유형중 가장 작은 분자량을 분명히 가지는 밴드의 N - 말단은 Lys - Leu - Leu - Lys - Met 로 확인 되었다. 이러한 5 개의 아미노산은 pSRα31 - 7 의 cDNA 삽입체에 의하여 코딩되는 폴리펩티드의 N - 말단으로 부터 49 번째 아미노산으로 부터 시작되는 5 개의 아미노산에 해당된다. 따라서, 48 번째 잔기에서의 폴리펩티드의 절단은 N - 말단 Lys 로 시작되는 단백질의 성숙한 형태를 야기한다.

실시예 16

KM31 - 7 단백질에 대한 단일 클론 항체의 제조

(a) 항원 단백질의 제조

pMAL31 -7 을 함유하는 이. 콜리의 종자 배양을 37 ℃ 에서, 50 ㎍ / ml 의 암피실린을 함유하는 LB 배지 3 ml 에 한 루프의 세포를 밤새 진탕 배양함으로써 제조하였다. 1 ml 의 결과 종자 배양을 50 ㎍ / ml 의 암피실린을 함유하는 새로운 LB 배지 100 ml 에 접종하고, 이것을 OD_600nm가 0.5 에 도달할 때까지 37 ℃ 에서 진탕 배양하였다. 이 시기에, IPTG 를 최종 농도가 0.1 mM 이 되도록 배양액에 첨가하고 37 ℃ 에서 밤새 더 진탕배양 하였다.

4 ℃ 에서 6500 rpm 으로 20 분간 원심분리하여 그 결과의 배양액으로부터세포를 회수하고, 그 펠렛을 10 ml 의 컬럼 완충용액에 현탁하였다. 그 결과의 현탁액에서, 초음파분쇄기를 사용하여 세포를 파쇄하고, 그 액체를 0 ℃ 에서 8,000 rpm 으로 30 분간 원심 분리 하였다. 그 결과의 상층액에는 가용성 단백질 분획이 함유되었다.

이러한 가용성 단백질 분획을 1 ml 의 아밀로스 수지 컬럼상에서 크로마토그래피를 수행 하였다. 용출은 10 mM 의 말토스를 함유하는 10 ml 의 컬럼 완충용액으로 수행 하였다. 크로마토그래피로 수득된 융합 단백질을 저장하여 항원으로 사용하였다.

(b) 면역화된 생쥐 비장 세포의 제조

상기 a) 에서 정제된 2 ml 의 항원 (200 ㎍ 상당) 에 2 ml 의 프로인드(Freund) 의 완전한 보강재를 첨가하여 유제를 형성하였다. 이러한 유제를 유리관이 장치된 5 ml 의 주사기로 취하고, 그것을 8 주 생의 수컷 BALB/c 생쥐에게 피하주입으로 면역화하였다.

면역화의 두번째 단계를 시작하면서, 프로인드의 불완정한 보강재를 보강재로 사용하였으며, 그외에는 첫번째 면역화와 동일한 방법을 수행하였다. 면역화는 모두 4 회에 걸쳐 수행되었으며, 1 회의 면역화 기간은 매 2 주 마다 였다.

두번째 면역화를 시작하면서, 혈액은 면역화 직전에 안저의 정맥총으로 부터 시료로 채취되었으며, 혈청내의 항 - KM31 - 7 항체의 역가는 고체상의 효소 표식 면역 검사법 (ELISA) 으로 측정 되었다.

고체상 항 - KM31 - 7 ELISA

pSRα31 - 7 로 형질전환된 COS - 1 세포로 부터 수득된 혈청이 없는 배양 상층액의 150 내지 200 ㎕ (약 200 ng 의 융합 단백질에 해당) 를 항원으로 사용하기 위하여 96 홈 ELISA 판 (코스타 제조) 의 각각의 홈에 두었다. 그 판을 4 ℃ 에서 밤새 방치하여 판 홈의 바닥 표면을 덮도록 하였다. 그 다음날, 그 판을 0.1 % 의 트윈 20 / 인산 완충 식염수 (0.1 % Tween 20 / PBS) 를 사용하여 3 회 세척하고, 각각의 홈에 PBS 로 10 ㎍ / ml 로 제조된 BSA 100 ㎕ 를 부하하고, 실온에서 1 시간 방치 하였다.

이 시간 후, 그 판을 0.1 % 의 트윈 20 / PBS를 사용하여 3 회 더 세척하였다. 연속적으로, 희석된 시료의 형태로 1 차 항체(예를 들면, 생쥐 혈청, 히브리도마 배양 상층액 또는 단일 클론 항체 ) 30 - 100 ㎕를 각 홈에 부하하였고, 그 판을 실온에서 1 시간 동안 방치하였다.

이 시간 후, 그 판을 다시 0.1 % 의 트윈 20 / PBS 를 사용하여 3 회 세척하고, 각각의 홈에 2 차 항체 100 ㎕ 를 첨가하였다. 2 차 항체는 염소 항 - 생쥐 IgG - 퍼옥시다제 복합체 (아머샴 제조) 의 3,000 배의 희석 용액 또는 염소 항 - 생쥐 IgG 염기성 포스파타제 복합체 (바이오 - 래드 제조) 의 3,000 배의 희석 용액으로 제조하였다. 그 판을 실온에서 1 시간 내지 2 시간 방치 하였다.

이시간 후, 그 판을 다시 0.1 % 트윈 20 / PBS 로 3 회 세척하고, 퍼옥시다제 기질 용액 (바이오 - 래드, 퍼옥시다제 기질 키트 ABTS) 또는 0.001 % 의 파라 - 니트로페닐 인산 용액을 함유하는 10 % 의 디에탄올 아민 100 ㎕ 를 각각의 홈에 첨가하였다. 그런 후, 그 판을 실온에서 30 분간 방치하고, 거기에서 항체의 역가는 마이크로플레이트 해독기 (바이오 - 래드) 를 사용하여 415 nm 또는 405 nm 에서의 흡광도를 측정하여 계산 하였다.

(c) 생쥐 골수 세포의 제조

8 - 아자구아닌 - 내성 생쥐 골수 세포 P3 - X63 - Ag8.653 (653) (ATCC no. CRL - 1580) 을 정상 배지 (완전한 GIT) 에서 배양하여 최소 2 ×10⁷세포를 수득 하였다.

(d) 히브리도마 (hybridoma) 의 제조

상기 b) 에서 기술된 면역화 법 이후에 수득된 1.4 ×10⁸의 면역화된 생쥐의 비장 세포를 DMEM (니수이 제약 제조) 으로 완전히 세척 하였다. 그 세척된 세포를 상기 c) 에서 제조된 1.5 ×10⁷의 생쥐 골수 세포 P3 - X63 - Ag8.653 (653) 과 혼합 하고, 그 결과의 혼합물을 800 rpm 으로 6 분간 원심 분리 하였다.

비장 세포 및 P3 - X63 - Ag8.653 (653) 세포의 혼합물로 구성되는 세포군을 펠렛으로 모으고 파쇄 하였다. 미리, DMEM을 사용하여 50 % 용액으로서 폴리에틸렌 글리콜 4000 을 제조하고, 이 용액을 파쇄된 세포위에 2 ml / 분 의 속도로 1 분간 교반하면서 떨어뜨렸다. 유사한 방법으로 DMEM 을 1 분 동안 2 ml /분 의 속도로 세포 제조물에 첨가하였다. 이러한 방법을 폴리에틸렌 글리콜 및 DMEM 용액 모두에 대하여 1 회 더 반복 하였다. 최종적으로, 16 ml 의 DMEM을 3 분 동안에 걸쳐 점차 첨가하였다. 그 결과의 세포 제조물을 800 rpm 으로 6 분간 원심 분리 하였다. 그 결과의 상층액을 버리고, 세포를 5 내지 10 ng / ml 의 생쥐 IL - 6 을 함유하는35 ml 의 완전한 GIT 에 현탁 하였다.

(e) 히브리도마의 스크리닝

상기 d) 에서 제조된 100 ㎕ 의 현탁액을 96 홈 판 (스미또모 화학사 제조) 에 두고, 37 ℃ 에서 7.5 % CO₂배양기에서 배양 하였다. 반응 7 일 후, 50 ㎕ 의 HAT 배지를 각각의 홈에 첨가하였다. 4 일간의 배양을 더 수행한 뒤에 또다른 HAT 배지를 각각의 홈에 더 첨가 하였다. 그 판을 3 일간 더 배양하였다. 이 후, 융합 세포의 콜로니 증식이 관찰된 홈에서 배양 상층액 부분을 시료로 채취하고, 항 - KM31 - 7 항체의 역가를 상기 b) 에서 설명한 고체상 ELISA 로 분석 하였다. 시료 배지는 즉시 HT 배지로 대체 하였다.

(f) 클로닝

양성으로 실험된 홈으로 부터 세포의 클로닝은 한계 희석 분석법에 따라 3 회 반복하였다. 일정한 항체 역가를 가지는 것으로 관찰되는 것을 항 - KM31 - 7 단일 클론 항체 형성 히브리도마 세포주로 사용하기 위하여 선별 하였다. 이러한 시기에, 특별히 ELISA 는 상기 b) 에서 설명된 것 뿐만 아니라 pcDL - pSRα296 으로 형질전환된 COS - 1 세포로 부터 수득된 혈청 없는 배양 상층액을 고체상으로 제조하여 사용한 대조군 ELISA 도 수행되었다. 따라서, 전자와는 반응하나, 대조군 ELISA 에서는 반응하지 않는 그러한 세포주를 클로닝 하기 위하여 선별 하였다.

(g) 단일 클론 항체의 정제

항- KM31 - 7 단일 클론 항체 제조 히브리도마 세포주의 배양 상층액을 모으고, 0.22 ㎛ 여과지 (밀리포아 사 제조) 를 사용하여 여과 멸균시키고 MAbTrap GII (파마시아 사 제조) 을 사용하여 항체를 정제하였다.

(h) 단일 클론 항체의 분석

1) 단일 클론 항체의 항원 특이성

pSRα31 - 7 로 형질전환된 COS - 1 세포로 부터 수득된 혈청이 없는 배양 상층액을 사용한 면역 침전 검사법으로 KM31 - 7 단백질에 대한 단일 클론 항체의 특이성을 확인하였다.

2) 단일 클론 항체의 분류

이 시험은 생쥐의 단일 클론 항체의 동종형 키트 (아머샴 사 제조) 를 사용하여 수행되었고, 상기 항체는 IgG1 의 종에 속하는 것으로 식별되었다.

실시예 17

항원 - 항체 반응을 이용한 KM31 - 7 단백질의 분리 및 정제

이것은 상기 실시예 16 h) 1) 에서 기술한 바에 의해 수행 하였다. pcDL - pSRα296 으로 형질전환된 COS - 1 세포로 부터 수득된 항체 및 혈청이 없는 배양 상층액을 사용하여 동일한 실험을 반복 하였다.

1.4 ㎍ 의 단일 클론 항체를 1.7 ml 의 혈청이 없는 상층액 각각에 첨가하고, 2.2 ml 의 소원심분리기 관에서 20 rpm 으로 원심분리 하면서 실온에서 1 시간 반응 시켰다. 대조군으로는 단일 클론 항체를 첨가하지 않고 pSRα31 - 7 로 형질전환된 COS - 1 세포로 부터 수득된 혈청이 없는 배양 상층액을 사용하여 수행하였다.

미리 0.1 % 트윈 20 / PBS 로 세척한 30 ㎕ 의 프로테인 G 세파로즈 4 패스트 플로우 (파마시아 사 제조) 를 각각의 관에 첨가하여 항체를 흡착 시키고 실온에서 20 rpm 으로 30 분 동안 원심 분리하였다.

이 후, 각각의 혼합물을 10000 rpm 으로 수초간 소원심분리기로 원심분리하고, 상층액을 어떠한 침전물의 손실이 없도록 주의하여 제거하였다. 그런 뒤, 펠렛을 각각 0.1 % 트윈 20 / PBS 로 세척하고 소원심분리 한 뒤, 동일한 방법으로 5 회 더 세척 하였다.

그 결과의 침전물을 10 ㎕ 의 2 - 메르캅토에탄올을 함유하는 SDS - PAGE 시료 완충용액에 현탁하였다. 각각의 현탁액을 90 ℃ 에서 2 분간 가열한 뒤, 환원 조건에서 12.5 % 의 겔을 사용하여 SDS - PAGE 를 수행하였다. 전기 영동 후, 그 산물을 폴리아크릴아미드로 부터 니트로셀룰로스 필름 (바이오 - 래드 사 제조)으로 옮겼다. 웨스턴 블러팅은 실시예 1 (a) 에서 기술된 다 클론성 항 - KM31 - 7 항체를 사용하여 수행되었고, 항 - KM31 - 7 단일 클론 항체는 COS - 1 / pSRα31 - 7 혈청이 없는 배양 상층액으로부터 KM31 - 7 단백질을 특이적으로 침전 시키는 것을 측정 하였다.

실시예 18

CYVV - NIa / KM31 - 7 융합 단백질의 제조

CYVV - NIa 프로테아제 방법을 사용하여 KM31 - 7 을 발현시키기 위하여, KM31 - 7 단백질 DNA 와 동일한 ORF 에서 NIa 유전자의 3' 말단과 연결하는 것이 필요하다. 따라서, 하기 두 단계의 방법을 수행 하였다.

1) pKSUN9 로의 KM31 - 7 cDNA 의 3' 방향 사슬 (SmaI - XbaI, 1006 bp)의 도입

KM31 - 7 cDNA 의 3' 끝을 함유하는 SmaI - XbaI 절편을 수득하기 위하여, 7 ㎍ 의 pSRα31 - 7 플라스미드 DNA 를 제한효소 SmaI 및 XbaI 으로 절단하고, 그 결과의 절편을 모아서, 0.8 % 아가로스 겔을 사용하는 GENECLEAN II (후나꼬시 일본) 로 정제 하였다.

한편, 5 ㎍ 의 pKSUN9 플라스미드 DNA 를 SmaI 및 XbaI 으로 유사하게 절단하고, 그 절단 절편을 소의 염기성 포스파타제로 탈인산 시켰다 (Alkaline Phospatase E. coli C75, 다까라 수즈오, Japan). 그 결과의 탈인산되고 선상화된 DNA 를 리게이션 키트 (다까라 수조) 를 사용하여 SmaI - XbaI KM31 절편과 연결 하였고, 그 결과의 구축물을 이. 콜리 균주 JM 109 를 형질 전환 하는데 사용 하였다. 형질전환체를 선별하고, 스크리닝 하여 SmaI - XbaI 절편을 포함하는 클론 pNIa31 - 7SX 를 수득 하였다.

2) NIa 프로테아제 및 KM 31 - 7 의 연결

NIa C 말단 서열과 동일한 해독틀에서 Val N - 말단 잔기를 가지는 KM 31 - 7 서브타입의 N - 말단 서열을 연결하기 위하여, 펠킨 - 엘머 일본 어플라이드 바이오체계 모델 392 DNA 합성기를 사용하여 4 가지 유형의 폴리머라제 연쇄 중합반응 (PCR) 프라이머를 구축하였다.

그 프라이머는 하기이다 :

PCR 의 첫번째 단계는 주형으로서 1 ㎍ 의 pKSUN 9 플라스미드 DNA 를 사용하여 수행하였다. 프라이머 (1) 및 (2) 각각 100 pmol 및 10 배 농도의 Taq 폴리머라제 반응 완충용액 1 / 10 부피 및 최종적으로 5 단위의 Taq 폴리머라제 (다까라 수조) 를 반응용액에 상기 순서대로 첨가하였다. PCR 반응은 먼저 72 ℃ 에서 3 분간 수행한뒤, 94 ℃ 에서 1 분, 55 ℃ 에서 2 분 및 72 ℃ 에서 3 분간을 30 주기로 수행하고, 72 ℃ 에서 10 분간 마지막으로 수행하였다. PCR 반응이후, 강화된 DNA 생성물을 8 % 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 수행하였다. DNA 를 포함하는 겔을 에티듐 브로미드로 염색하여 식별하고, 분쇄하였다. 300 ㎕의 용출 완충용액 (0.5 M 아세트산암모늄, 1 mM EDTA, pH 8.0) 을 각각의 분쇄된 겔에 첨가하고 37 ℃ 에서 밤새 반응시켰다. 원심분리로 정제되고 증폭된 DNA 를 포함하는 상층액을 수득하였다.

유사한 유형으로 단, 주형으로 1 ㎍ 의 pUCKM 31 - 7 플라스미드 DNA 및 프라이머 (3) 및 (4) 를 사용하여 PCR 을 한번 더 수행하였고, 그 결과의 DNA 를 상기와 같이 정제하였다.

처음의 PCR 로 부터의 증폭된 절편은 NIa의 XhoI 부위로 부터 상위 31 bp 까지 KM 31 - 7 단백질의 Val - Val - Phe 로 시작되는 N 말단의 잔기를 코딩하는 서열을 포함하였다. 두번째 PCR 로 부터 증폭된 절편은 KM 31 - 7 cDNA 의 SmaI 부위로 부터 32 bp 하위까지 NIa C 말단으로 부터 Asn - Cys - Ser - Phe - Gln 을 코딩하는 서열을 포함하였다.

따라서, PCR을 프라이머 (1) 및 (4) 로 사용한 두번의 PCR 결과로부터 생성된 두 DNA 절편 모두를 사용하여 수행할때, KM 31 - 7 의 의도하는 N - 말단을 코딩하는 15 bp 의 서열 및 NIa 의 9 bp 의 3' 말단으로 구성되는 혼성화 사슬의 결과가 나타난다. 따라서, 연결로서 이러한 부분과 융합된 DNA 를 생성하는 것이 가능하다.

이러한 결과로, PCR 의 두번째 단계를 수행하여 겔로부터 강화된 절편을 모았다.

3) pNIa 31 - 7 SX 로의 NIa / KM 31 - 7 DNA 의 도입.

1) 에서 수득된 5 ㎍ 의 pNIa 31 - 7 SX 플라스미드 DNA 를 Xho I 및 Sma I 으로 절단하고, 그 결과의 DNA 를 소의 염기성 포스파타제를 처리하여 탈인산화 하였다. 2) 에서 수득된 PCR 생성물을 또한 Xho I 및 Sma I 으로 절단하고, 그 결과의 절편을 리게이션 키트를 사용하여 절단되고 탈인산된 pNIa 31 - 7 SX 와 연결시켰다. 그 결과의 구축물을 이. 콜리 균주 JM 109 를 형질전환 하는데 사용하였다.

암피실린 내성 형질전환체를 선별하고 스크리닝하였다. 스크리닝은 Xho I 으로 절단하고 전기 영동으로 수행하였다. 오직 8.0 Kbp 밴드를 가지는 클론이 선별되었다. 선별된 클론의 플라스미드를 Hind III 으로 절단하고 다시 전기 영동하였다. 선별된 플라스미드는 NIa cDNA 삽입체에 해당하는 330 bp 밴드를 가졌다. 이러한 플라스미드를 pNIa 31 - 7V 로 고안하였으며, Xho I 및 Sma I PCR 산물을 포함하였다.

클론 pNIa 31 - 7V 의 염기 서열을 측정하여, NIa 및 KM 31 - 7을 코딩하는 서열은 NIa 및 KM 31 - 7 단백질 사이에 필요한 Gln - Val 절단 서열을 가진 동일한 ORF 에 연결되어 있다는 것을 확인하였다.

4) KM 31 - 7 단백질의 제조

pNIa 31 - 7V 가 이. 콜리 에서 기능이 있으며, KM - 31 - 7 단백질을 구축된 재조합 유전자에 의해 발현되었다는 것을 웨스턴 블러팅으로 확인하였다.

플라스미드 pNIa 31 - 7V 를 가지는 이. 콜리의 종자 배양을 50 ㎍ / ml 의 암피실린을 함유하는 3 ml 의 LB 배지에서 밤새 진탕 배양하였다. 1 ml 의 종자배양을 50 ㎍ / ml 의 암피실린을 함유하는 100 ml 의 새로운 LB 배지에 첨가하고 37 ℃ 에서 OD_600nm가 1.0 에 도달할때까지 진탕 배양하였다. 이 시기에 IPTG 를 배양액에 최종 농도가 1 mM 이 되도록 첨가하고 28 ℃ 에서 2일 동안 더 진탕 배양하였다.

이후, 1 ml 의 배양액을 소원심분리관으로 옮기고 15,000 rpm 에서 5 분동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 펠렛을 300 ㎕의 멸균수 및 2 - 메르캅토에탄올을 함유하는 300 ㎕의 SDS - PAGE 시료 완충용액과 혼합하고, 세포를 파쇄하였다.그 결과의 현탁액을 95 ℃ 에서 2 분간 가열하고, 10 ㎕의 이 현탁액을 환원 조건에서 8 % 겔로 SDS - PAGE 를 수행하였다.

전기영동후, 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이것은 겔을 막에 접촉시키고, 전사 완충용액 (25 mM 트리스 -염산, 1.4 % 글리신 및 20 % 메탄올) 의 존재하에, 4 ℃ 에서 2.5 시간 반응시키고, 겔 막 전사 장치 (마리솔 일본) 를 사용하여 19 V 를 적용함으로 달성되었다.

그 니트로셀룰로스 막을 20 ml 의 PBS - T 매질로 세척하고, 5 % 스킴 밀크 (Snow Brand) 를 함유하는 PBS - T 20 ml 로 1 시간 동안 블러킹 (blocking) 을 수행하였다. 이후, 그 막을 20 ml 의 PBS - T 로 2 회 헹구고, 멸균수에 용해된 1 ㎕의 100 배 희석된 항 - KM 31 - 7 토끼 MAb 혈청 (1 차 항체) 을 함유하는 20 ml 의 PBS - T 에서 90 분간 반응시켰다. 그 니트로셀룰로스 필름을 20 ml 의 PBS - T 각각으로 15 분간 1 회 헹구고 5 분간 2 회 헹구었다.

세척된 막을 PBS - T 중의 3,000 배 희석된 퍼옥시다제 - 표식 항 - 토끼 IgG 염소 항체 (바이오-래드) (2차 항체로 사용) 의 조에 두고 1 시간 방치하였다. 그 막을 20 ml 의 PBS - T 로 세척하고 ECL 감지제 (아머샴) 의 조에 옮기고 항 - KM 31 - 7 항체와 반응한 밴드를 방사선 자동사진으로 감지하였다.

웨스턴 블러팅을 수행하여 대략 60,000 의 분자량을 가지는 밴드를 확인하였다. 이러한 밴드는 대조군으로 사용된 pSRα31 - 7 로 형질전환된 COS - 1 세포에 의해 수득된 혈청 없는 배양 상층액으로 부터 감지된 3 종류의 KM 31 - 7 단백질중 두번째 크기의 분자량을 가지는 단백질과 동일한 이동성을 나타내었다.

매질

x M 인산 완충용액

x M 의 Na₂HPO₄용액을 사용하여 원하는 pH 로 적정한 x M 의 Na₂HPO₄용액.

접종 완충용액

0.1 M 의 트리스 - 염산 완충용액, pH 7.0, 0.05 M 의 EDTA, 1 % 의 2 - 메르캅토에탄올.

추출 완충용액

0.1 M 의 트리스 - 염산 완충용액, 0.05 M 의 EDTA, 1 % 의 2 - 메르캅토에탄올, pH 7.0

분해 용액

200 mM 의 탄산암모늄, 2 % SDS, 2 mM EDTA, 400 ㎍ / ml 의 벤토나이트 및 20 ㎍ /ml 프로테아제 K (pH 9.0)

1 배의 SSC

0.15 M 염화나트륨, 0.015 M 시트르산 삼나트륨, pH 7.0.

LB 액체 배지

10 g 의 박토 트립톤 (딥코사), 5 g 의 박토 이스트 추출물 (딥코) 및 5 g 의 염화나트륨, 증류수로 최종부피 1 L.

트리스 - 칼슘 완충용액

10 mM 트리스, 50 mM 염화칼슘, 염산으로 pH 7.4 적정.

용균 완충용액

0.17 g 의 수크로스, 250 ㎕의 1 M 트리스 - 염산 완충용액 (pH 8.0), 200 ㎕의 0.5 M EDTA (pH 8.0), 2 차 증류수로 최종 부피 20 ml.

염기성 - SDS 용액

0.2 M 수산화나트륨, 1 % SDS

TBE 용액

100 mM 트리스, 100 mM 붕산, 1 mM EDTA.

변성 용액

1.5 M 염화나트륨, 0.5 M 수산화 나트륨.

중화 완충용액

0.5 M 트리스, 3 M 염화나트륨 (pH 7.4)

50 배의 덴하르트 용액

1 % 폴리비닐 피롤리돈, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 1 % 피콜 400. 이 용액은 원하는 농도로 적절하게 2 차 증류수로 희석한다.

5 배의 변성 완충용액

125 ㎕의 1 M 글리신 (pH 9.0), 25 ㎕ 의 1 M 염화마그네슘, 850 ㎕의 2 차 증류수.

5 배의 표식 완충용액

25 ㎕의 1 M 트리스 - 염산 완충용액 (pH 7.9), 5 ㎕의 1 M 염화마그네슘, 2.5 ㎕의 1 M 디티오트레이톨, 9.2 ㎕ 의 2 차 증류수.

10 배의 M9 염 용액

0.145 M 인산수소중나트륨, 0.172 M 인산중수소 칼륨, 0.187 M 염화암모늄, 0.137 M 염화 나트륨, pH 7.0.

M9 최소 한천 배지

10 ml 의 10 배의 M9 염 용액, 100 ㎕의 1 M 황산마그네슘, 1 ml의 20 % 글루코스, 50 ㎕의 1 % 염화수소 티아민 염, 1 ㎕ 의 0.01 M 염화칼슘 및 13 ml 의 2 차 증류수를 혼합하고 여과법으로 멸균한뒤, 50 ml 의 3 % 박토아가를 첨가후 즉시 배양판에 붓는다.

SOB 액체 배지

10 g 의 박토트립톤, 2.5 g 의 박토이스트 추출물, 100 ㎕의 5 M 염화 나트륨 및 125 ㎕의 1 M 염화 칼륨을 혼합하고 증류수로 500 ml 을 만든다. 고압살균후, 5 ml 의 1 M 염화 마그네슘 및 5 ml 의 1 M 황산 마그네슘을 첨가.

TFB 1 완충용액

5 ml 의 1 M 2 - (N - 몰폴리노) 에탄술폰산 (MES - 1 N 염산으로 pH 6.2 로 적정), 6.045 g 의 염화루비듐, 0.735 g 의 염화칼슘 이무수물 및 4.94 g 의 염화 망간 사수화물을 혼합하고 글락시알 아세트산으로 pH 5.8 로 적정하며, 2 차 증류수로 500 ml 을 만들고 여과법으로 멸균하였다.

TFB 2 완충용액

1 ml 의 1 M 2 - (N - 몰폴리노) 프로판술폰산 (MOPS), 1.102 g 의 염화칼슘 이무수물, 0.12 g 의 염화루비듐, 15 ml 의 글리세롤을 혼합하고 글락시알 아세트산으로 pH 6.5 로 적정하고, 2 차 증류수로 100 ml 을 만든 뒤, 여과법으로 멸균하였다.

SOC 액체 배지

5 ml 의 SOB 액체 배지, 90 ㎕의 20 % 글루코스

2 배의 YT 배지

16 g 의 박토트립톤, 5 g 의 박토효모 추출물 및 5 g 의 염화나트륨을 혼합하고 2 차 증류수로 1 ℓ 를 만들었다.

PBS - Tw 매질

80 mM 인산수소중나트륨, 20 mM 인산중수소나트륨, 100 mM 염화나트륨, 0.1 % 트윈 20.

PBS - T 매질

4 g 의 염화나트륨, 0.1 g 의 인산중수소칼륨, 1.45 g 의 인산수소중나트륨 도데카히드레이트, 0.1 g 의 염화칼륨 및 0.1 g 의 아지드나트륨, 2 차 증류수로 1 ℓ 를 만든다. pH 7.4.

염기성 포스파타제 기질 용액

0.01 % p - 니트로페닐 포스페이트를 10 % 디에탄올아민 수용액에 용해시키고 염산으로 pH 9.8 로 적정.

배지 A

DMEM (둘베코의 변형 이글 배지로 4.5g / ℓ 의 글루코스 함유), 10 % 불활성 태내 소 혈청 (하이클론사 제조) 및 10 mM HEPES (pH 7.2)

배지 B

DMEM (4.5 g / ℓ 의 글루코스 함유), 10 mM 의 HEPES (pH 7.2), 3 % 의 불활성 태내 소 혈청, 5 ㎍ / ml 의 소 인슐린 (시그마사 제조), 8 ㎍ / ml 의 d - 바이오틴 (시그마사 제조), 4 ㎍ / ml 의 판토테닉산 (시그마사 제조), 1.0 μM 덱사메타손 (시그마사 제조) 및 0.5 mM 이소부틸메틸크산틴 (알드리히 제조)

배지 C

5 % 불활성 태내 소혈청을 함유하는 DMEM (4.5 g / ℓ 의 글루코스 함유), 10 mM 의 HEPES (pH 7.2) 및 100 ng / ml 의 소 인슐린

배지 D

DMEM (4.5 g / ℓ 의 글루코스 함유), 5 % 불활성 태소 소 혈청, 10 mM HEPES (pH 7.2), 100 ng / ml 의 소 인슬린 및 10 U / ml 의 소듐 헤파린 (노보 산업사 제조)

LPL 기질 용액

13 mM 의 글리세롤 트리 [9, 10 (n) -³H] 올레이트 (51.8 KBq / μmol, 아머샴사 제조), 1.3 mg / ml 의 L - α - 포스파티딜콜린 디스테아로일 (시그마사 제조), 20 mg / ml 의 소 혈청 알부민 (시그마사 제조), 135 mM 트리스 염화수소 [트리스 - 염산 (pH 8.1), 시그마사 제조], 16.5 % (v / v) 글리세롤 및 16.5 % (v / v) 불활성 태내 소 혈청.

구아니딘 티오시아네이트 용액

4 M 구아니딘 티오시아네이트, 1 % 사코오실, 20 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 25 mM 시트르산나트륨 (pH 7.0), 100 mM 2 - 메르캅토에탄올 및 0.1 % 의 소포제 A (시그마).

흡착 완충용액

0.5 M 염화나트륨, 20 mM 트리스 - 염산 (pH 7.5), 1 nM EDTA 및 0.1 % SDS.

용출 완충용액

10 mM 트리스 - 염산 (pH 7.5), 1 mM EDTA 및 0.05 % SDS.

리버스 트랜스 크립타제 반응용액 (실시예 2)

50 mM 트리스 - 염산 (pH 8.3), 8 mM MgCl₂, 30 mM KCl, 0.3 mM 디티오트레이톨, 2 mM dATP, 2 mMdGTP, 2 mM dTTP, 10 μci [α -³²P] dCTP 및 1.4 ㎍ 의 벡터 프라이머 - DNA (3' - 올리고 (dT) - 테일 pcDV - 1, 파마시아 제조).

말단 트랜스퍼라제 반응 용액

140 mM 포타슘 카코딜레이트, 30 mM 트리스 - 염산 (pH 6.8), 1 mM CoCl₂, 0.5 mM 디티오트레이톨, 0.2 ㎍ 의 폴리 A 및 100 mM dCTP.

제한 효소 완충용액

50 mM NaCl, 10 mM 트리스 -염산 (pH 7.5), 10 mM MgCl₂및 1 mM 디티오트레이톨.

10 부피의 리가아제 완충용액

10 mM ATP, 660 mM 트리스 - 염산 (pH 7.5), 66 mM MgCl₂및 100 mM 디티오트레이톨.

전기영동 색소

50 % 글리세롤, 0.01 M 인산수소중나트륨 (pH 7.0) 및 0.4 % 브로모페놀 블루.

1 배의 TAE

0.04 M 트리스 - 아세테이트, 0.001 M EDTA.

1 배의 SSCP

120 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 13 mM 인산중수소칼륨 및 1 mM EDTA.

리버스 트랜스 크립타제 반응 용액 (실시예 6)

1 배의 초기 사슬 합성 완충용액, 5 % 소듐 파이로포스페이트, 100 단위의 리보뉴클라제 억제제, 1 mM dATP, 1mM dGTP, 1 mM dTTP, 0.5 mM dCTP 및 3.75 ㎍ 의 올리고 (dT) 프라이머, 이 모두는 cDNA 클로닝 체계 (아머샴사 제조) 으로 제공.

SM 완충용액

100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄ㆍ7H₂O, 50 mM 트리스 - 염산 (pH 7.5) 및 0.01 % 겔라틴.

투석 완충용액

20 mM 인산 완충용액 (pH 7.8) 및 0.5 M NaCl.

컬럼 완충용액

10 mM 트리스 - 염산 (pH 7.4), 200 mM NaCl 및 1 mM EDTA

Taq 폴리머라제 반응 완충용액

Taq 이 함유된 500 mM 트리스 - 염산 (pH 8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂,100 mM dATP, 100 mM dCTP, 100 mM dGTP, 100 mM dTTP 및 2 mg / ml 의 겔라틴.

제 1 도는 CYVV - cDNA 로 부터 분리한 NIa 부위의 cDNA 의 제한 효소 지도이다.

제 2 도는 NIa의 5' - 부위를 포함하는 플라스미드 pKNI 5' 의 구조를 나타낸다 ;

제 3 도는 IL - 11 유전자의 일부 및 NIa 의 5' - 부위를 포함하는 플라스미드 pKNI5IL 의 구조를 나타낸다 ;

제 4 도는 5' IL DNA 절편과 CIN3 DNA 절편을 제조하는데 사용되며 NIa 유전자의 3' - 말단과 IL - 11 유전자의 5' - 말단이 융합된 프라이머를 나타낸다 ;

제 5 도는 PCR 에 의한 CIN3 DNA 절편 및 IL5' DNA 절편의 융합을 나타낸다 ;

제 6 도는 플라스미드 pKSUN 9 의 구조를 나타낸다 ;

제 7 도는 pUCKM 31 - 7 의 제한 효소 지도를 나타낸다 ;

제 8 도는 pUCKM 31 - 7 과 pcD - 31 중의 3' 말단의 뉴클레오티드 서열의 비교 그림이다 ;

제 9 도는 pSR α31 - 7 의 구조 그림이다 ;

제 10 도는 서열의 히스티딘 6 단량체를 코딩하는 서열을 pUCKM 31 - 7 로도입한 그림이다 ;

제 11 도는 pMAL 31 - 7 의 구조 그림이다 ;

제 12 도는 디클로로페놀 - 인도페놀 환원 활성의 분석 그림이며 ;

제 13 도는 산화된 글루타티온 환원 활성을 나타낸다.

Claims (48)

1. 융합 단백질을 코딩하며, 5' 에서 3' 의 방향 및 동일한 개방 해독틀에서,

   a) 서열 목록의 서열 식별 번호 2에서 아미노산 번호 4 ∼ 437에 해당하는 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질 (NIa)을 코딩하는 서열;

   b) 절단 펩티드의 가수분해 자리가 Gln-Ala, Gln-Gly 또는 Gln-Ser 사이의 펩티드 결합인, 상기 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질에 의하여 인식되고, 절단될 수 있는 절단 펩티드를 코딩하며, 서열 a) 및 서열 c) 중 하나 또는 그 모두에 전체적으로 포함되는 폴리뉴클레오티드 서열; 및

   c) 서열이 상기 (a) 또는 (b) 에 기재된 단백질 또는 펩티드를 코딩하지 않는 것을 특징으로 하는, 외래 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열.
2. 제 1 항에 있어서, DNA 임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
3. 제 2 항에 있어서, 이중 사슬 형태임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
4. 제 1 항의 융합 단백질의 생산을 저해하는, 제 1 항의 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열.
5. 제 1 항에 있어서, c) 의 서열이 하나이상의 폴리펩티드를 코딩하고, 각 코딩된 폴리펩티드 사이에 절단펩티드의 가수분해 자리가 Gln-Ala, Gln-Gly 또는 Gln-Ser 사이의 펩티드 결합이고, 서열 a) 및 서열 c)의 하나 또는 그 모두에 전체적으로 포함되는 서열인 절단 서열을 더 코딩함을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 절단서열은 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질에 의하여 인식될 수 있음을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
7. 제 1 항에 있어서, c) 의 서열이 단지 하나의 폴리펩티드만을 코딩함을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
8. 제 1 항에 있어서, 서열 b) 가 a) 및 c) 의 서열에 전체적으로 포함됨을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
9. 제 1 항에 있어서, b) 의 서열에 의하여 코딩되는 절단 펩티드 와 c) 의 서열에 의하여 코딩되는 폴리펩티드 사이에 하나 이상의 아미노산 잔기가 코딩됨을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
10. 제 1 항에 있어서, a) 의 서열에 의하여 코딩된 핵 함유물 a 단백질에 의한 융합 단백질의 절단으로 그 말단 잔기가 글리신, 세린 또는 알라닌 잔기인 부가적인 N - 말단 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 수득함을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
11. 제 1 항에 있어서, a) 의 서열에 의하여 코딩된 핵 함유물 a 단백질에 의한 융합 단백질의 절단으로 그 말단 잔기가 글리신, 세린 또는 알라닌 잔기인 부가적인 N - 말단 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 수득하고, 원한다면, 적당한 아미노펩티다제의 작용에 의하여 그 상기 잔기가 제거됨을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
12. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 N - 말단과 절단 펩티드의 C - 말단 사이에 프롤린 잔기가 코딩됨을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
13. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 N - 말단과 절단 펩티드의 C - 말단 사이에 프롤린 잔기가 코딩되어 아미노펩티다제 P (3. 4. 11. 9) 의 작용에 의하여 프롤린 잔기를 넘어서는 모든 잔기들의 절단도 허용함을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
14. 제 14 항에 있어서, 프롤린 잔기 이전까지의 절단 후에, 프롤린 잔기는 프롤린 이미노 펩티다아제 (3. 4. 11. 5) 의 작용에 의하여 제거될 수 있음을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
15. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 N - 말단과 절단 펩티드의 C - 말단 사이에 알라닌 잔기가 코딩됨을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
16. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 n - 말단과 절단 펩티드의 C - 말단 사이에 알라닌 잔기가 코딩되어 아미노펩티다제 P (3. 4. 11. 9) 의 작용에 의하여 알라닌 잔기를 넘어서는 모든 잔기들의 절단 및 알라닌 아미노펩티다아제 (3. 4. 11. 14) 의 촉매적 작용에 의하여 알라닌 잔기의 절단을 허용함을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
17. 제 1 항에 있어서, a) 의 서열이 서열 목록의 서열 식별 번호 1 에서 뉴클레오티드 번호 10 ∼ 1311 임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
18. 서열 목록의 서열 식별 번호 1 에서 뉴클레오티드 번호 10 ∼ 1311 인 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질 (NIa)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
19. 제 1 항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
20. 제 19 항에 있어서, 벡터는 발현 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
21. 제 19 항의 벡터로 형질 전환된 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), COS 세포, 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomycesz pombe), 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 및 오리자 사티바 (Oryza sativa) 숙주.
22. 제 20 항의 벡터로 형질 전환된 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), COS 세포, 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 및 오리자 사티바 (Oryza sativa) 숙주.
23. 제 20 항의 벡터로 형질 전환된 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), COS 세포, 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 및 오리자 사티바 (Oryza sativa) 숙주를 포함하는 발현 방법.
24. 제 23 항의 방법에 의하여 발현된 폴리펩티드.
25. 서열 목록의 서열 식별 번호 2에서 아미노산 번호 4 ∼ 437에 해당하는 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질에 의하여 폴리펩티드의 전구형태가 절단됨을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
26. 제 25 항에 있어서, 상기 전구 물질이 융합 단백질임을 특징으로 하는 방법.
27. 서열 목록의 서열 식별 번호 2에서 아미노산 번호 4 ∼ 437에 해당하는 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질에 의하여 서열 Asn - Cys - Ser - Phe - Gln - X 를 포함하는 폴리펩티드의 전구 형태가 절단됨을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
28. 서열 목록의 서열 식별 번호 2에서 아미노산 번호 4 ∼ 437에 해당하는 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질에 의하여 서열 Asn - Cys - Ser - Phe - Cln - X 를 포함하는 폴리펩티드의 전구 형태가 절단되어 폴리펩티드의 성숙한 형태가 수득됨을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
29. 제 1 항에 있어서, 서열 a) 의 상류에 리더 (leader) 서열을 더 코딩함을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
30. 5' 에서 3' 의 방향으로 동일한 개방 해독틀에서,

    a) 서열 목록의 서열 식별 번호 2에서 아미노산 번호 4 ∼ 437에 해당하는 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질 (NIa)을 코딩하는 서열;

    b) 절단 펩티드의 가수분해 자리가 Cln-Ala, Gln-Gly 또는 Gln-Ser 사이의 펩티드 결합인, 상기 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질에 의하여 인식되고, 절단될 수 있는 절단 펩티드를 코딩하며, 서열 a) 및 서열 c)에 의하여 코딩되는 하나 또는 그 모두의 펩티드에 전체적으로 포함되는 펩티드를 코딩하는 서열; 및

    c) 서열이 상기 (a) 또는 (b) 에 기재된 단백질 또는 펩티드를 코딩하지 않는 것을 특징으로 하는, 외래 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 융합 단백질.
31. 제 30 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고, 그 각각의 폴리펩티드 사이에 절단 펩티드의 가수분해 자리가 Gln-Ala, Gln-Gly 또는 Gln-Ser 사이의 펩티드 결합이고, 서열 a) 및 서열 c)에 의하여 코딩되는 하나 또는 그 모두의 펩티드에 전체적으로 포함되는 펩티드인 절단 펩티드가 위치함을 특징으로 하는 융합 단백질.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 절단 서열은 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 에 의하여 인식됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
33. 제 30 항에 있어서, 클로버 황색 엽맥 바이러스 핵 함유물 a 단백질에 부가하여 단지 하나의 폴리펩티드로 구성됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
34. 제 30 항에 있어서, 상기 절단 펩티드가 a) 및 c) 의 서열에 의하여 코딩되는 펩티드에 전체적으로 포함됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
35. 제 30 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 절단 펩티드와 폴리펩티드 사이에 위치함을 특징으로 하는 융합 단백질.
36. 제 30 항에 있어서, 서열 a) 에 의하여 코딩되는 펩티드에 의한 자가 분해로 말단 잔기가 글리신, 세린 또는 알라닌인 부가적인 N - 말단 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드가 수득됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
37. 제 23 항에 있어서, 서열 a) 에 의하여 코딩되는 펩티드에 의한 자가 분해로 말단 잔기가 글리신, 세린 또는 알라닌인 부가적인 N - 말단 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드가 수득되고, 숙주에서 아미노펩티다제가 상기 N - 말단 잔기를 제거함을 특징으로 하는 발현 방법.
38. 제 30 항에 있어서, 폴리펩티드의 N - 말단과 절단 펩티드의 C - 말단 사이에 프롤린 잔기가 위치함을 특징으로 하는 융합 단백질.
39. 제 23 항에 있어서, 서열 a) 에 의하여 코딩되는 펩티드에 의한 자가 분해로 부가적인 N - 말단 프롤린 잔기 및 0, 1 또는 복수의 다른 아미노산 잔기를 가지는 폴리펩티드가 수득되고, 상기 프롤린을 넘어선 모든 부가적인 잔기는 아미노펩티다제 P (3. 4. 11. 9) 에 의하여 제거됨을 특징으로 하는 발현 방법.
40. 제 39 항에 있어서, 프롤린 잔기 이전까지의 절단 후에, 프롤린 잔기는 프롤린 이미노 펩티다아제의 작용에 의하여 제거됨을 특징으로 하는 발현 방법.
41. 제 30 항에 있어서, 폴리펩티드의 N - 말단과 절단 펩티드의 C - 말단 사이에 알라닌 잔기가 위치함을 특징으로 하는 융합 단백질.
42. 제 23 항에 있어서, 서열 a) 에 의하여 코딩되는 펩티드에 의한 자가 분해로 부가적인 N - 말단 알라닌 잔기 및 0, 1 또는 복수의 다른 아미노산 잔기를 가지는 폴리펩티드가 수득되고, 상기 알라닌을 넘어선 모든 부가적인 잔기는 아미노펩티다제 P (3. 4. 11. 9) 에 의하여 제거되고, 알라닌 잔기는 알라닌 아미노펩티다제(3. 4. 11. 14) 의 작용에 의하여 제거됨을 특징으로 하는 발현 방법.
43. 서열 목록의 서열 식별 번호 2 에서, 잔기 번호 4 ∼ 437 인 서열을 가지는 폴리펩티드.
44. 서열 목록의 서열 식별 번호 2 에서, 잔기 번호 4 ∼ 437 로 주어지는 서열을 가지는 폴리펩티드.
45. 서열 식별 번호 2 에서, 잔기 4 ∼ 437 로 주어지는 서열을 함유하는 폴리펩티드.
46. 제 23 항에 있어서, 숙주가 이. 콜리 임을 특징으로 하는 발현 방법.
47. 제 1 항에 있어서, c) 의 서열에 의하여 코딩되는 폴리펩티드는 서열 식별 번호 12 의 아미노산 번호 1 ∼ 526 의 아미노산 서열을 포함하며, 디클로로인도페놀 및 산화된 글루타티온을 환원할 수 있음을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
48. 제 47 항의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 융합 단백질.