CN1082609A - 受体衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了对“小鼻病毒受体组”的受体有结 合活性的多肽的制备，制备多肽的方法，其应用以及 编码多肽的DNA。

Description

本发明涉及对“小鼻病毒-受体组”的人体鼻病毒具有结合位点的受体衍生物，它的应用以及对受体衍生物编码的DNA。

人体鼻病毒是微小RNA病毒系的一大属，并包括大约115种不同的血清型（Melnick，J.L.（1980）.Prog.Med.Virol.26，214-232）。这些DNA病毒侵袭人体的呼吸道，造成严重的感染，从而导致感冒病症。

如果用于分类的准则是以对在人体细胞培养基细胞，如海拉细胞（HeLa  cells）的表面上的结合位点的竞争为基础，则人体的鼻病毒可分为二个组。竞争实验指出，在细胞表面上存在着二种彼此不同的受体，只有87型血清是目前唯一单独存在的。至今91个血清型分属于“大鼻病毒-受体组”，而10个血清型属“小鼻病毒-受体组”。（Abraham和Colonno  R.J.（1984）.J.Virol.51，340-345;Uncapher等人，（1991）Virology  180，814-817）。

将“大鼻病毒-受体组”的受体纯化，同时按ICAM-1鉴定，它是免疫球蛋白总科所属一种蛋白质，起着细胞粘附分子的作用（Tomassini  et  al.（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86，4907-4911;Staunton  et  al.（1989）Cell  56，849-853;Greve  et  al.（1989）Cell  56，839-847）。按照证明纯化ICAM-1特异性结合到病毒上并通过基因转移将鼻病毒结合活性转移到细胞上，该细胞在转移前是不具有这种活性的，可清楚地表明ICAM-1是多数鼻病毒的受体（Greve  et  al.（1989）同上;Staunton  et  al.（1989），同上）。此外还表明，对ICAM-1的单克隆抗体通过鼻病毒抑制着海拉细胞的结合和感染（Staunton  et  al.（1989），同上）。再者抑制ICAM-1通过LFA-1（“连结抗原-1的淋巴细胞功能”）而连结到白细胞的单克隆抗体-另一种ICAM-1的天然配位体-也能阻断鼻病毒结合到受体。这样，LFA-1和鼻病毒的结合位点必须至少是相邻的。另外用嵌合的和突变的ICAM-1分子的试验表明，鼻病毒-ICAM-1相互作用的结合位点与LFA-1的结合位点是不相符的（Staunton  et  al.（1990）Cell  61，243-254）。

人体鼻病毒血清14型的受体结合位点是大鼻病毒-受体组的一个实例，它处在病毒表面下陷的所谓“谷（Canyon）”中，（Rossmann  et  al，（1985）Nature  317，145-153），位于这谷中的氨基酸大大地保存，而周围的氨基酸是可变的，并对有中性效果的抗体形成了结合位点。按照这种“谷假设”，病毒能在过变化的抗体结合位点中接受突变，这样避免自然的免疫应答。这样就保持了稳定的受体结合位点，它对抗体是不可接近的（Rossmann和Palmenberg（1988）Virology  164，373-382）。

至今已知，“小鼻病毒受体组”的受体可将人体鼻病毒的10种血清型摄入相应的宿主细胞中。通过不同的纯化步骤分离这种膜上的受体。用一种过滤结合测试法（filter  binding  assay）可证明不同分馏物中的结合活性。（Mischak  et  al.（1988）J.Gen.Virol.69  2653-2656）。在有非离子去污剂存在下，自然受体的表观分子量相当于约450kD（用凝胶色谱测定），而改性形式约为120kD，还找到了许多其它形式（Mischak（1988）同上）。此外还发现了一种从海拉细胞培养基的上清液中分离出的蛋白质具有与“小鼻病毒受体组”的鼻病毒结合的能力（Hofer  et  al.（1992）J.Gen.Virol.73  627-632）。

由于这种膜蛋白质在极性的如水溶液体系，如水的缓冲溶液中溶解性很小，天然受体对抑制“小鼻病毒受体”的鼻病毒的摄取是不大适宜的。

令人惊奇地发现，LDL（“低密度脂蛋白质”）受体系的成员可作为“小鼻病毒受体组”的鼻病毒受体。

LDL-受体系的受体与“小鼻病毒受体组”的受体具有相同的性质，这意外地可使之制备多肽，主要是可溶性多肽，它至少对“小鼻病毒受体组”的鼻病毒具有一个结合位点。

本发明的多肽在下文是指受体蛋白的“功能性衍生物”。因而一种功能性衍生物是一种具有生物活性的组份，它主要相当于“小鼻病毒受体组”的天然受体的生物活性。这种生物活性涉及对“小鼻病毒受体组”的鼻病毒受体的结合能力。名词“功能性衍生物”应包括“变异体”和“化学衍生物”。其中术语衍生物表示任何多肽衍生物，它与天然受体蛋白质相比，体积小些，同时对“小鼻病毒受体组”的鼻病毒具有至少一个结合位点。“变异体”包括，主要由天然受体分子按功能和结构，例如等位形式衍生的分子。因此，术语“变异体”包括，能与“小鼻病毒受体组”的鼻病毒结合，但具有不同的氨基酸序列的分子。

“化学衍生物”包括另外的化学基团，该基团一般不是这分子的一部分。这些基团可以改善分子的溶解性、吸附性和生物的半衰期等等，或者可以减少毒性或不希望的副效应，具有这种效应基因是已知的（Remington′s  Pharmaceutical  Sciences（1980））。

本发明的受体衍生物的生物活性以及改性后所获得的化学衍生物能采用已知的现有技术方法进行检测，如采用Mischak等人所阐述的过滤结合测试法（Mischak et al.（1988）.J.Gen.Virol.69，2653-2656以及Mishak et al.（1988）Virology，163，19-25）：将多肽置于一适宜的膜上，如硝基纤维素。为了阻断任何无特异性的结合可用混合去污剂进行饱和。然后将这样预处理的膜用标记的鼻病毒，如用³⁵S-蛋氨酸标记的HRV2培养以检测其特异性结合。将膜洗涤和干燥后，用放射自显影法可看到特异性结合。

本发明的一个方面是涉及受体衍生物，它以细胞外的可溶性多肽形式存在，并例如通过受体-载带细胞释放到培养基中。这些受体衍生物特别适宜于将鼻病毒结合到其受体上。因此它们可用于人体治疗性，或预防性处置或生产药物制剂，特别是可以考虑用作抗病毒的，优选是抗鼻病毒的制剂。释放可溶性受体衍生物的现象对许多受体蛋白质，如对白细胞介素-4-和白细胞介素-7-受体，已有描述（Mosley  et  al.（1989）Cell  59，335-348;Goodwin  et  al.（1990）Cell  60，941-951）。

当然可溶性受体衍生物也可用酶催，特别是蛋白水解的或化学分裂而生成。为此可以使用载有受体的细胞系，它与酶，如木瓜蛋白酶，胰蛋白酶等进行反应。假如受体分子的氨基酸序列为已知，则本领域专业人员可通过适当选择蛋白酶而制备细胞外的衍生物。这种衍生物的结合能力可用上述过滤结合测定法检测，这样使之可以制备更小的受体衍生物，它能结合“小鼻病毒受体组”的鼻病毒。除了酶催分裂外，也可用化学方法，如用溴化氰进行分裂而分裂细胞外受体区。

本发明的另一方面是通过酶催或化学分裂天然受体分子而形成可溶性衍生物。将天然受体蛋白质分离后，例如可通过与蛋白酶反应或通过化学分裂（如上所述）能将天然的受体蛋白质分裂，同时体积缩小的鼻病毒-连结区，例如可通过过滤结合测试法鉴定和分离。可从受体蛋白质的特定氨基酸序列衍生适宜的蛋白酶。也可采用溴化氰进行化学分裂反应或通过还原处理，如用二硫苏糖醇而分裂受体蛋白。

更具体地说本发明将包括下列方面：

意外地发现，LDL-受体系的蛋白质可以结合和内在化“小鼻病毒受体组”的鼻病毒。因而LDL-受体系的所有成员现在能用于制备功能性衍生物，它能结合“小鼻病毒-受体组”的鼻病毒。

LDL-受体系是由三种结合上相关的细胞表面-受体而形成，它能引起脂蛋白和其它血浆蛋白的内吞作用（Borwn  et  al.（1991）Curr.Opin.Lipidology  2，65-72）。受体有下列共同的特征：富半胱氨酸重复，它引起配位体的结合，EGF（“表皮增长因子”）-型的富半胱氨酸重复，Y-W-T-D-重复，一个单独横跨膜的区以及至少一个NPXY-内在化信号（Willnow  et  al.（1992）J.Biol.Chem，267，26172-21180）。

意外地表明，本系所有三种成员-LDL-受体，α₂MR/LRP（α₂-巨球蛋白/LDL-受体-相关的蛋白质）还有gp330（Heymann Nephritis antigen gp330-海伊曼肾炎抗体gp330），能结合并内在化“小鼻病毒-受体组”的鼻病毒（实施例1至2）。从而可将这些受体系的所有成员用于形成对“小鼻病毒-受体组”的鼻病毒具有结合性能的功能性衍生物。例如能按照实施例3的方法，将释放在培养基中的可溶性LDL-受体衍生物分离。这里阐述了释放在培养基上清液中的结合蛋白质的纯化。意外地发现这是LDL-受体衍生物（实施例4）。为了分离，用离子交换色谱（阴离子型），亲和（柱）色谱法（Lens营养外源凝集素和Jacalin琼脂糖）和硫酸铵沉淀法对受体衍生物进行纯化。用过滤结合测定法鉴定其结合活性（Mischak  et  al.（1988）163，19-25）。这种制备方法也能用于另外二种LDL-受体系蛋白质中。

自然受体蛋白质的分离是已知的，并描述于Yamanoto et al（1984）Cell 39，27-38，Goldstein et al.（1985）Annu.Rev.Cell Biol.1，1-39;Mischak et al.（1988）Virology 163，19-25;Kowal et al.（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86，5810-5815和Willnow et al.（1992）同上）。天然的蛋白质通过酶催化和化学分裂可转化为功能性、可溶性的衍生物。由于LDL-受体（图1），α₂MR/LRP（图2）和至少部分的gp330（图3）的氨基酸序列是已知的，能选择用分解蛋白的活性酶或化学制剂以便释放，特别是特定的细胞外的受体区。因此本发明也涉及由LDL-受体，α₂MR/LRP和gp330的氨基酸序列衍生的多肽类，特别是其可溶态能结合“小鼻病毒-受体组”的鼻病毒。优选地由氨基酸序列衍生的这些多肽，它相当于人体的LDL-受体系蛋白质，虽然如实施例1和2所说明的，由哺乳动物和两栖类的相应的受体也是适合的。

受体衍生物可按照释放入真核细胞的细胞上清液中的形式来应用。但本发明的受体衍生物也相当于LDL-受体系的膜-结合成员，其中导致使蛋白结合到膜上的部分蛋白消失或失去其功能。

特别优选的受体衍生物，按照图4主要包括受体蛋白的区1，2和3，或区1和2或仅仅区1。按此，区1包括结合不同配位体的N-端富半胱氨酸的受体部分，区2包括具有与EGF-前体蛋白质较高同系物的区域，区3包括一种相对短的，O-糖基化的肽区域，区4包括横跨膜区域和区5包括受体分子的胞浆部分。主要由区1，1和2以及1，2和3形成的多肽可从真核细胞的培养基上清液制得（例3）或通过已知的重组DNA-技术，如由Davis  et  al（1987）Nature  326，760-765关于LDL-受体所述进行制备。LDL-受体系蛋白质中，人体LDL-受体是优选的原料化合物。特别是本发明包括功能性受体衍生物，它主要包括氨基酸1至750（区1和2）以及1-322（区1）（图1）。这些多肽的C-末端可以减少，但仍保留对小鼻病毒-受体组的鼻病毒的结合能力。

优选的受体衍生物基本上具有以下氨基酸序列：

区1和2（氨基酸1～750，序列ID.No.1）

MGPWGWKLRW  TVALLLAAAG  TAVGDRCERN  EFQCQDGKCI  SYKWVCDGSA

ECQDGSDESQ  ETCLSVTCKS  GDFSCGGRVN  RCIPQFWRCD  GQVDCDNGSD

EQGCPPKTCS  QDEFRCHDGK  CISRQFVCDS  DRDCLDGSDE  ASCPVLTCGP

ASFQCNSSTC  IPQLWACDND  PDCEDGSDEW  PQRCRGLYVF  QGDSSPCSAF

EFHCLSGECI  HSSWRCDGGP  DCKDKSDEEN  CAVATCRPDE  FQCSDGNCIH

GSRQCDREYD  CKDMSDEVGC  VNVTLCEGPN  KFKCHSGECI  TLDKVCNMAR

DCRDWSDEPI  KECGTNECLD  NNGGCSHVCN  DLKIGYECLC  PDGFQLVAQR

RCEDIDECQD  PDTCSQLCVN  LEGGYKCQCE  EGFQLDPHTK  ACKAVGSIAY

LFFTNRHEVR  KMTLDRSEYT  SLIPNLRNVV  ALDTEVASNR  IYWSDLSQRM

ICSTQLDRAH  GVSSYDTVIS  RDIQAPDGLA  VDWIHSNIYW  TDSVLGTVSV

ADTKGVKRKT  LFRENGSKPR  AIVVDPVHGF  MYWTDWGTPA  KIKKGGLNGV

DIYSLVTENI  QWPNGITLDL  LSGRLYWVDS  KLHSISSIDV  NGGNRKTILE

DEKRLAHPFS  LAVFEDKVFW  TDIINEAIFS  ANRLTGSDVN  LLAENLLSPE

DMVLFHNLTQ  PRGVNWCERT  TLSNGGCQYL  CLPAPQINPH  SPKFTCACPD

GMLLARDMRS  CLTEAEAAVA  TQETSTVRLK  VSSTAVRTQH  TTTRPVPDTS

区1（氨基酸1～322，序列ID.No.2）

MGPWGWKLRW  TVALLLAAAG  TAVGDRCERN  EFQCQDGKCI  SYKWVCDGSA

ECQDGSDESQ  ETCLSVTCKS  GDFSCGGRVN  RCIPQFWRCD  GQVDCDNGSD

EQGCPPKTCS  QDEFRCHDGK  CISRQFVCDS  DRDCLDGSDE  ASCPVLTCGP

ASFQCNSSTC  IPQLWACDND  PDCEDGSDEW  PQRCRGLYVF  QGDSSPCSAF

EFHCLSGECI  HSSWRCDGGP  DCKDKSDEEN  CAVATCRPDE  FQCSDGNCIH

GSRQCDREYD  CKDMSDEVGC  VNVTLCEGPN  KFKCHSGECI  TLDKVCNMAR

DCRDWSDEPI  KECGTNECLD  NN.

本发明的多肽可以是二聚体，三聚体，四聚体或多聚体。制备受体衍生物的方法，酶催或化学处理天然的受体分子，由细胞释放的衍生物的分离和重组制备的方法也是本发明的部分。

本发明的又一个方面涉及DNA分子，它按本发明多肽编码。

本领域的专业人员使用已知方法可以制得起始分子。相应cDNA的克隆对所有三种成员都已叙述过（Yamomto  et  al.（1984）同上，Goldstein  et  al.（1985）同上;Pietromonaco  et  al.（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，1811-1815;Herz  et  al.（1988）同上）。此外，已知氨基酸序列的DNA也可用合成法（如按Edge  et  al.（1981）Nature，292  756-762）或用PCR-法（Sambrook  et  al，（1989）同上）制备。

本发明涉及已改性的DNA-序列，它可通过专业人员已知方法而简单制备，通过突变、删减、转位或加成而制备，本发明编码多肽的全部DNA序列和相应的DNA序列的退化形式都包括在内。

此外，本发明涉及DNA载体，它含有上述DNA序列。特别是这些可以是载体，其中所述的DNA分子在功能上与控制序列相结合，该序列可以表达相应的多肽。这些优选的质粒，在原核生物中，如E.Coli和/或在真核系统中，如酵母或哺乳动物细胞系中可复制和/或表达。

本发明也涉及相应的转化宿主生物体。

在原核生物中的表达可用现有技术中已知的其它有机体，特别是大肠杆菌（E.Coli）进行。本发明的DNA-序列可作为融合多肽或作为完整的，天然的多肽进行表达。

融合蛋白可有利地大量制备。一般来说，它们比天然多肽更稳定，并易于纯化。这种融合蛋白的表达能通过正常的E.Coli  DNA-序列进行控制。

例如本发明DNA序列可作为lacZ-融合基因而克隆并表达。为此本专业人员可用许多载体体系，如pUR-载体系列（Rüther，U.和Müller-Hill，B.（1983），EMBO J.2，1791）。也可用噬菌体启动子λP_R，按PEX-1至-3的载体形式使用以表达大量的Cro-β-半乳糖苷酶融合蛋白质（Stanley，K.K.和luzio，J.P.（1984）EMBO J.3，1429）。相同地也可应用能以IPTG诱导的tac-启动子，如以pROK-载体系列形式（Clontech laboratories）。

使用E.Coli制备完整的，天然的多肽的前题是应用一种强的，可调节的启动子和一种有效的核糖体结合位点。这些可用的启动子包括对温度敏感的噬菌体λP_L-启动子，用IPTG诱导的tac启动子或T7启动子。许多含有适宜启动子结构和有效核糖体结合位点的质粒已有描述，例如PKC30（λP_L;Shimatake和Rosenberg（1981）Nature 292，128，pKK 173-3（tac，Amann和Brosius（1985）Gene 40 183）或PET-3（T7-启动子（Studier和Moffat（1986）J.Mol.Biol.189，113）。

在E.coli中用于表达本发明DNA的许多其它载体体系，由现有技术是已知的，并例如描述于Sambrook  et  al.（1989）“A  labora-tory  Manual”Cold  spring  Harbor  laboratory  press）。

特定制造以表达所述载体的合适的大肠杆菌菌种，对专业人员是熟知的，（Sambrook  et  al.（1989），同上）。克隆试验的实验性实施、多肽在大肠杆菌中的表达以及多肽的建立和纯化都是已知的，并描述于如Sambrook  et  al.（1989，同上）中。

除了原核生物外也可应用真核的微生物体，如酵母等。

为了在酵母中表达可以选用如质粒YRp7（Stinchcomb  et  al.Nature  282，39（1979）;Kingsman  et  al.，Gene  7  141（1979）;Tschumper  et  al.，Gene  10  157（1980））和质粒YEp13（BWach  et  al.，Gene  8  121-133（1979））。质粒YRp7含有TRP1-基因，它对酵母突变体有选择性标记（如ATCC  No.440  76），它是不能在无色氨酸的培养基中生长。缺乏TRP1是所用酵母菌株的特征，然后建成一种有效助剂以便在没有色氨酸下进行培养时检测转化。与此相似，使用含有酵母-基因LEU-2的质粒YEp13，可用以完成LEU-2-负的突变体也是确实的。

其它适宜于酵母的标记基因例如是URA3-和HIS3-基因。最好，酵母杂种载体也含有一种复制起动和用于细菌宿主特别是大肠杆菌的标记基因，这样杂种载体的构建和克隆以及它们的前身可以在细菌宿主中进行。在酵母中适于表达的其它表达控制序列包括，如，PHO3-或PHO5-基因的那些。

对酵母载体的其它合适启动子序列含有ADHⅠ基因的5′侧区（Ammerer，Methods  of  Enzgmology  101，192-210（1983），3-磷酸甘油激酶（Hitzeman  et  al，J.Biol.Chem  255，2073（1980））或其它糖酵解酶（Kawaski  and  Fraenkel，BBRC，108，1107-1112（1982））例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶，已糖激酶，丙酮酸-脱羧酸、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶，磷酸葡糖-异构酶和葡糖激酶。当构建合适的表达质粒，为了能使mRNA进行多聚腺苷酰化作用和终止，连结这些基因的端序列也可插入要表达的序列的3′-端上的表达载体中。

其它启动子是适于醇脱氢酶-2、同种细胞色素C、酸性磷酸酶以及引起麦芽糖和半乳糖代谢的酶的基因的启动子区。通过结合型位点的酵母而调节的启动子，如基因BARI、MFα1、STE2、STE3、STE5的启动子、通过使用依赖温度的突变而插入温度调节系统。（Rhine  Ph.D.Thesis，University  of  Oregon，Eugene，Oregon（1979），Herskowitz  and  Oshima，The  Molecular  Biology  of  the  Yeast  Saccharomyces，PartⅠ，181-209（1981），Cold  Spring  Harbor  Laboratory）。但，通常，含有一个酵母适宜的启动子和源复制以及端序列的任何载体是适宜的。这样，含有与酵母2μ质粒DNA同种的序列的杂种载体也可以使用。这种杂种载体通过重组而掺入有2μ-质粒的细胞或自动复制。

除了酵母外，当然还有其它的真核系统也可用于表达本发明的多肽。通过重组体DNA以表达生物活性真核蛋白质经常还需翻译后的改性作用，如二硫桥形成，糖基化，磷酸化和/或寡聚化。也要求按本发明DNA表达不仅是在哺乳动物细胞中，而且也在昆虫细胞系中。

相应的载体系统的功能性的先决条件主要包括适宜的启动子，终止和多聚腺苷酰化信号以及使之能在哺乳动物细胞系中进行复制和选择的组分。为本发明的DNA-分子的表达，特别要求使用那些在哺乳动物细胞以及在原核细胞如E.coli中都能复制的载体。

由病毒体系如SV40，EB-病毒等等衍生的载体包括，如pTK2，pSV2-dhfv，pRSV-neo，pKO-neo，pHyg，P205，pHEBo，等等（Sam-brook  et  al.1989，同上）。

在适宜的宿主细胞，如CHO-细胞中转化后可藉助可选择性的标记（胸苷激酶，二氢叶酸还原酶等）而获得相应的转化细胞，并在表达后分离出相应的多肽。适用于载体的宿主细胞是已知的转化技术（微注射法，电击穿法（electroporation）、磷酸钙法等）也是已知的（如Sambrook  et  al.1989）。

在原核的或真核的体系中为克隆相应DNA-片段例如使用一种限制性核酸内切酶切割所选择的载体，有时在这样形成的线性载体改性后插入一种有相应限制性端的表达控制序列。在3′-末端（翻译方向）表达控制序列含有限制性核酸内切酶的识别序列，用所述的限制性核酸内切酶来消化已含表达控制序列的载体，并且可以插入具有合适末端的本发明的DNA-分子。在载体-DNA内用第二个限制性核酸内切酶分裂已含表达控制序列的载体，并且在所得的载体片段中插入有正确末端的DNA-分子是有利的。所需技术描述于Sambrook等人（1989，同上）的列举实例中。

除指定的DNA-分子外，本发明还涉及已叙述过的载体的制备方法，特别是表达载体。这些载体的特征是，将配有相应端和编码“小鼻病毒受体组”的受体的功能性衍生物的DNA插入用限制性核酸内切酶切割并含有实施例所述的表达控制序列的载体DNA内，其插入要使表达控制序列调节所插入的DNA的表达。通过重组体DNA表达而得到的本发明的多肽，或者从天然的受体分子制取的本发明的多肽，当然也可由化学的或酶催方法而衍生的。

LDL-受体的表达将在实例6中阐述。这里通过实例说明在真核细胞体系中产生的表达。明显表明，表达的LDL-受体引起与放射标记的人体鼻病毒血清2（HRV2）的结合（图5）。本发明的多肽可以如通过在表达质粒中的DNA-序列的删减而制得。为此可用Davis  et  al.（1987）Nature  326，760-765中的方法，它描述了整个EGF区的删减。此外在胞浆的或横跨膜的区前插入一种终止密码子可形成溶解性受体（Yokade  et  al.（1992）J.Cell  Biol.117  39）。

本发明还涉及杂种细胞系，它分泌专对本发明多肽或其功能性衍生物之一的单克隆抗体。这些单克隆抗体可以全部的或部分抑制多肽的活性;或者与所述多肽之一专一性地结合。单克隆抗体可用于对本发明多肽的定性和/或定量测定或纯化。当然本发明也包括含有所述单克隆抗体的测试系统。单克隆抗体制备方法的特征是宿主动物用一种多肽免疫接种，并且这些宿主动物的B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，分泌相应单克隆抗体的杂种细胞系就可以亚克隆并培养（Harlow，G.和Lane，D：“抗体，实验室手册”（1988）Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，U.S.A.）。

本发明的另一方面是应用LDL-受体系的生理配位体以制备“小鼻病毒-受体组”的鼻病毒结合的抑制药物组合物。其中生理配位体包括通过LDL受体系结合和/或被内在化的物质，例如，LDL（低密度脂蛋白）抑制“小鼻病毒-受体组”的鼻病毒的摄取（实例9）。其它LDL-受体系的天然配合体已描述于Willnow  et  al.（1992），J.Biol.Chem.267，26172-26180。

这样，例如，39  kDa受体-联合蛋白（RAP）能减少“小鼻病毒-受体组”的鼻病毒的产量（实施例7）。RAP本身是已知的。它对LDL-受体系成员的分离和结合已描述于Kounnas  et  al.（1992）J.Biol.Chem.267  21162-21166中。

与本发明受体衍生物一样，当然也能用LDL-受体系的天然受体，LDL-受体，α₂MR/LRP和gp330以抑制。

相反，当然也可使用“小鼻病毒-受体组”的鼻病毒物质以抑制生理的LDL-配位体的结合。这种鼻病毒例如，也可从人体鼻病毒2型血清（HRV2）衍生而得。优选地，失活的鼻病毒、鼻病毒膜材料或对LDL-受体系的受体有结合活性的鼻病毒肽都可用作鼻病毒材料。“小鼻病毒受体组”的鼻病毒可由“美国典型菌种保藏委员会”（American  Type  Culture  Collection）得到。并可用已知方法制备相应病毒材料（如Putnak和Phillips（1981）Microbiol.Reviews  45，287-315和Palmenberg（1990）Annu.Rev.Micro-biol.44，603-623和其中引证的文献）。

本发明当然也包括用于预防性和/或治疗性处置人或动物体的本发明多肽的药物上可用盐以及药物上允许的加成物，以及多肽和惰性载体之间的共价化合物。加成物和共价化合物例如可用聚乙二醇组成。本发明的多肽和天然的受体蛋白，LDL-受体系的生理配位体如LDL和RAP能用于制备人或动物所用的治疗性和/或预防性处置的药物制剂。特别是，多肽可用作竞争性的有效物质，以抑制病毒，特别是鼻病毒对天然受体和/或生理上的LDL-配位体的结合。多肽和天然配位体，特别是细胞外的，可溶性的受体，可用作抗病毒药，尤其是抗鼻病毒药剂。

为治疗病毒感染，所述物质可以按鼻给药，例如，所给剂量要足以压制，或有竞争性的作用或抑制鼻病毒对天然受体的结合。剂量一般为0.01微微克/公斤病人体重至1毫克/公斤病人体重，虽然也可使用多些或少些剂量。用于抑制生理LDL-配位体结合的鼻病毒物质可按在多肽给定的浓度范围内的适宜的药物组合物进行使用。

本发明的受体衍生物和其药理上可用的盐可用通常方法转为常用制剂，如使用惰性药物上可用载体或溶剂制成片剂、糖衣片剂、丸剂、粒剂、气雾剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂和液剂。药物有效化合物或化合物的比例可以是总组份量的0.5至90%。范围内，即其量要足以达到上面规定的剂量范围。

制剂的制备，例如，可将有效物质与溶剂和/或载体，有时也用乳化剂和/或分散剂配制，如果用水作稀释剂，可用有机溶剂作增溶剂或助溶剂。

所用的赋形剂包括，如水，医药上许可的有机溶剂，如石腊，植物油，单或多功能醇，载体，如天然无机粉，合成无机粉，糖，乳化剂和润滑剂。

用普通方法给药，主要是鼻部给药。在口服的情况下，片剂除了含有上述载体外，当然可含有添加剂如柠檬酸钠，碳酸钙和磷酸二钙和各种添加剂如淀粉，优选的是土豆淀粉、明胶和类似物一起。另外润滑剂，如硬脂酸镁，十二烷基硫酸钠和滑石也能用于成片。在水的悬浮液情况下则除上述赋形剂外有效物质还可含有各种香料调味剂和着色剂。

本发明还涉及用于抑制配位体对LDL-受体结合的物质的分离方法。这些方法包括用一潜在的抑制物质培养LDL-受体蛋白或LDL-受体衍生物。这方法可在有标记的鼻病毒物质存在下进行。标记的鼻病毒物质的结合能力的大小可以说明测试物质的活性。例9列出了具有各种结合活性的鼻病毒物质的制备。

本发明还涉及LDL-受体的测试方法，其中，由“小鼻病毒受体组”的病毒物质衍生的物质，具有对LDL-受体的结合活性，它进行标记，用适宜的试样进行培养，并检测其结合能力。另一方法是用于提供治疗的有效物质，其中，具有对LDL-受体结合活性的“小鼻病毒受体组”的病毒物质与治疗物质相配合，所述共轭物加到带有LDL-受体的细胞物质中，治疗有效物质通过结合和内在化而插入细胞。

附图说明

图1  “低密度脂蛋白受体”的氨基酸序列（LDL，Yamamoto  et  al.（1984）Cell  31  21-38）。

图2  “低密度脂蛋白受体有关蛋白质”的氨基酸序列（LRP，Herz  et  al.（1988）EMBO  J.7，4119-4127）。

图3  海曼肾抗原gp  330的部分氨基酸序列（Pietromonaco  et  al.（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87  1811-1815）。

图4  LDL-受体系的受体的示意图（按Yamamoto  et  al.同上）。受体有5个区：区1包括N-端富半胱氨酸受体部分，它可能引起配位体结合。有与EGF-前体蛋白同系的区2连结区3，区3的氨基酸是部分O-糖基化。区4形成位于膜的受体部分而区5形成受体胞质部分。

图5  A）分别在正常人体成纤维细胞上和在LDL-受体缺乏FH细胞上的标记HRV2的结合和内在化（实施例1），

↑：没有添加胆固醇/25-羟基胆固醇的培养。

↓：添加胆固醇/25-羟基胆固醇的培养。

B）：对受体结合位点的HRV2和LDL的竞争，

+：添加未标记的HRV2或LDL，

-：没有添加未标记的HRV2和LDL。

图6 [³⁵S]-标记的HRV2对α₂MR/LRP和gp330的结合。膜提取物用电泳分离并转移到硝基纤维素上。用[³⁵S]-标记的HRV2（痕迹1和2），用α₂MR/LRP抗血清（痕迹3）或用gp330抗血清（痕迹4）进行检测。

痕迹1：LM-提取物

痕迹2：老鼠肾的微绒毛-提出物

痕迹3：蛋白质提取物，如痕迹1

痕迹4：蛋白质提取物，如痕迹2。

图7  结合蛋白的纯化HRV2的凝胶电泳分析，

a）结合蛋白的纯化HRV2在7.5%SDS凝胶上，在还原条件（痕迹1）和非还原条件（痕迹2）下进行电泳，并用银染色，使之可以看见。在非还原条件下得到的分子量约120kDa，而在还原条件下分子量为160kDa。

b）如a所述，凝胶配位体印迹（痕迹2），用[³⁵S]-HRV2（痕迹1）按Mischak et al.（1988）Vicology 163，19-25所述展开。痕迹2表明用对人体DLD-受体（IgG-C₇，Beisie-gel et al.（1982）J.Biol.Chem.257 13150-13156）专一性的抗体展开。

图8  表明由海拉细胞上清液制得的、“小鼻病毒受体组”的可溶性受体的胰蛋白酶肽的柱色层分离。肽在一种μBondapak  C18，250-4柱上在下列条件下进行分离：缓冲液A：蒸馏水/0.06%TFA（三氟乙酰丙酮）;

缓冲液B：80%乙腈/0.052%  TFA;流速：0.5毫升/分;

梯度：从0至60分钟2%至37.5%，

由60至90分钟37.5%  B至75%  B，

由90至105分钟75%  B至98%  B，

温度：室温;

检测：在214毫微米下的分光光度法，0.08AUFS（满刻度吸光单位）（进纸速度：0.25厘米/分）。

图9  色谱分离分馏物23-27，按下列条件：

柱：Merck Superspher  4μm，C18，125-H，

缓冲液A：蒸馏水/0.1%  TFA;

缓冲液B：乙腈/0.1  TFA;

流速：1毫升/分，

线性梯度：在70分钟内由0%  B到70%  B;

温度：30℃;

检测：在214毫微米下的分光光度法，

0.1AUFS

进纸速度：1厘米/分。

图10  分馏物29的再色谱分析。试验条件如图9所述。

图11  分馏物38的再色谱分析。试验条件如图9所述。

图12  所分析肽的序列，

X＝氨基酸（没有确定的）;

附注脚的＝氨基酸，（鉴定不明确的）。

^＊：分馏物33（图9）的序列每次分解步骤有2个氨基酸;但肽B和E由于不同量而可以分类。

图13 通过jacalin抑制[³⁵S]-标记的HRV2结合到固定结合LDL-受体上，

A）无Jacalin时的过滤结合试验，

b）如A试验但在0.1毫克/毫升Jacalin的存在下。

图14  人体LDL-受体在COS-7-细胞中的表达（例6）。

结合[³⁵S]-HRV2的检测，在

U：非转染的COS-7细胞

+：用“感觉”（pSVL-LDLR+）-载体的转化。

-：用“反感觉”（pSVL-LDLR-）-载体的转化。

图15  通过RAP降低病毒产量，

以P.f.U./ml为单位（感染颗粒/毫升）

图16  通过人体LDL抑制的海拉细胞的HRV2-感染。

图17  用于测定在谷中或在谷边的位置的序列比较，该谷在小组的鼻病毒中保存。

图18 HRV2_{1148 P：G}和HRV2_{3182 R：T}对海拉的细胞结合特性

△HRV2_{1148 P：G}

·HRV2-野生型

〈 〉HRV2_{3182 R：T}。

图19  通过HRV14（口）或HRV2（·），

HRV2_{1148 P：G}和HRV2_{3182 R：T}

的结合竞争。

实施例1：通过人体成纤维细胞对[³⁵S]-标记的HRV2的结合和内在化以及在HRV2和LDL之间对受体结合位点的竞争

a）HRV2的结合和内在化作用

将正常的人体成纤维细胞或LDL-受体缺乏细胞（FH细胞;NIH  Collection  No.GM  00486A）置于6-孔试验板上（Nunc），在含有10%脱脂、胎牛血清（Gibco）的MEM中，并在有（↓），或者没有（↑）添加12微克/毫升胆固醇和2微克/毫升25-羟基胆固醇下生长24小时。然后用PBS洗涤细胞两次，再加入10000cpm的[³⁵S]-标记的HRV2，它在0.5毫升含有2% BSA和30mM MgCl₂的PBS中，将混合物在34℃下培养60分钟。（Mischak et al（1988）Virology 163，19-25）。用10微克/毫升胰蛋白酶和25mM在PBS的EDTA除去表面结合的HRV2后，将细胞再清洗一次，然后测定结合的放射性，数据是按每个情况取四次实验的平均值给出。由没有胆固醇培养的正常成纤维细胞所得细胞沉淀的放射性（一般为约1900cpm）减去本底放射性，作为100%。本底放射性的测定或在有加热到56℃ 30分钟的HRV2（Mischak et al.（1988）同上）下或通过用过量1000倍的未标记的HRV2培养下而进行的。二种方法的结果为40-50cpm之间，由四个独立实验所得数据列于图5a。

b）HRV2和LDL对受体结合位点的竞争

正常成纤维细胞是按（a）所述条件培养（没有添加胆固醇和25-羟基胆固醇）。用约1.4×10⁶cpm¹²⁵I-标记的LDL（250cpm/ng;Huettinger et al.（1992）J.Biol Chem.267，18551-7），在纯化，[³⁵S]-未标记HRV2上的每细胞添加（+）或没有（-）添加100Pfu（“成斑单位”相当于约2400～24000病毒粒子;Abraham & Colonno（1984）J.Virol.51，340～345）下或者用约10000cpm[³⁵S]-标记的HRV2，在有（+）或没有（-）80μg/ml未标记LDL下在37℃培养60分钟。结合细胞的放射性用γ-或β-计数器测量。¹²⁵I-LDL高亲和结合的放射性量，由总的LDL-结合中（150000cpm/mg）减去在有20倍过量未标记LDL所得的放射性（约4000cpm/mg总细胞蛋白）后而测定的，无竞争者时对HRV2-结合通常测得的放射量为1900cpm。最大结合量在任何情况下放在100%。所测定数据（图5b）是二次单个试验结果。

实施例2：通过α₂MR/LRP和gp330结合[³⁵S]-标记的HRV2

为了证明“小鼻病毒-受体组”的鼻病毒结合到LDL-受体系的其它成员测试了原生质膜制剂的HRV2的结合。原生质膜可从鼠类LM成纤维细胞和肾上表皮-微绒毛中分离（Malathi  et  al（1979）Biochem.Biophys.Acta  554，259-263;Fornistal  et  al（1991）Infect.Immun  59，2880-2884和Kerjaschki和Farquhar（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79  5557-5561），从膜提取的蛋白质通过SDS-梯度-聚丙烯酰胺-电泳进行分离，并转移到硝基纤维素上。

培养含[³⁵S]-标记HRV2的分离出的LM-提取物表明，结合到具有约500kDa（图6，痕迹1）的表观分子量的蛋白质上。这种谱带用α₂MR/LRP迁移。通过用α₂MR/LRP-抗血清（Moestrup和Glie-mann（1991）J.Biol.chem.266，14011-14017）展开的相同印迹而证明（图6;痕迹3）。

从鼠肾微绒毛提取物中，用放射性标记的HRV2可检测蛋白质的表观分子量约为500kDa。（见图6，痕迹2）。用gp  330-抗血清分析后，可鉴定其带谱为海曼（Heymann）肾脏抗体gp  330（见图6，痕迹4）。

实施例3：对“小鼻病毒受体组”的鼻病毒连结的蛋白质的纯化

200升海拉细胞上清液（由Computer Cell Culture Center，Mons，Belgium制备）用超过滤浓缩到20升，并对250升蒸馏水（含0.02%NaN₃）进行透析，然后将缓冲液浓度调到20mM N-甲基哌嗪，（pH4.5），混合物在Beckman J6B离心机中以4000rpm下离心，经0.8μm初级过滤器过滤，并将滤液转到阴离子交换柱（0.5升Makroprep  50Q，Biorad）上。用20mM  N-甲基哌嗪，pH4.5，0.5M  NaCl洗脱所结合的物质。洗脱液用1M  Tris-HCl（pH＝8.0）调pH到7.2，并转移到Lens营养外源凝集素（Lens  Culinaris  lectin）-柱上（100毫升;Pharmacia），将结合的蛋白质用0.5摩尔在PBS中的α-[D]-甲基葡糖洗脱，洗脱的蛋白质在50%饱和硫酸铵，（pH＝7.2）下沉淀，用50%饱和的硫酸铵溶液（pH＝7.2），洗涤沉淀，并置于200毫升PBS中。蛋白质溶液移入Jacalin琼酯糖柱上（40毫升;Vector-Labs），并用120毫升，100mM  α-[D]-甲基-吡喃半乳糖苷的PBS溶液洗脱。洗脱的蛋白质如上述用硫酸铵沉淀，洗涤，置于20mM甲基-哌嗪，（pH＝4.5）中，并用PD  10-柱（Pharmacia）脱盐。脱盐物质以1ml的5等分试样，加到1Mono  Q-阴离子交换柱上（HR5/5，Pharmacia），并用梯度为0至0.5摩尔NaCl，20mM甲基哌嗪，（pH＝4.5）洗脱，收集0.5毫升馏份，并用过滤结合测定法检测结合活性（Mischak  et  al.，Virology（1988）163，19-25）。在Centricon  30（Amicon）上将所有5个色谱分析的活性馏份浓缩到1.5毫升，在非还原条件下在含7.5%聚丙烯酰胺凝胶上通过制备凝胶电泳法而解析（Laemmli，U.K.（1970）Nature  227，680-685）。用氯化铜将这种凝胶染色（Lee  et  al（1987）Anal.Biochem  166，308-312），将相应活性蛋白质的带定位并切割。凝胶片段在0.25M  Tris-HCl，0.25M  EDTA，pH＝9.0下脱色，并将蛋白通过电泳洗脱到50mM  N-乙基吗啉醋酸盐，pH＝8.5中。一个等分用过滤结合测定法重新检测其活性，然后在还原条件下，用凝胶电泳法分离蛋白质，并洗脱和冷冻干燥。

实施例4：对“小鼻病毒受体组”的鼻病毒结合的蛋白的胰蛋白酶消化和序列的分析

将纯化的，冷冻干燥的蛋白质（实施例3）放入30μl6M胍-HCl，0.4M碳酸氢铵，（pH＝7.6）中，再与3μl  45mM二硫苏糖醇混合并在56℃下培养15分钟。冷至室温后加入3μl100mM碘乙酰胺，在室温下再培养15分钟。然后加入84μl水和80μl，0.1M碳酸氢铵（pH＝7.6），蛋白溶液与800ng胰蛋白酶（在5μl中）按制造商（promega）规定的条件下进行混合，并在37℃下培养18小时。用1/10体积的10%的三氟醋酸（TFA）酸化溶液，离心5分钟，并将肽置于C-18“反相”柱（Baker）上，（该柱已用0.06%  TFA溶液平衡过），用高到80%乙腈的梯度液和20%水、0.052%TFA洗脱（图8）。

使用气相序列分析仪直接测定分馏物20和30的序列，在图中规定的条件下将23至27分馏物以及29和38分馏物进行重新色谱分析（C18“反相”柱，Merck;图9、10和11）。在图中用“A”、“D”和“F”表示的肽和分馏物33和20是选择用于在气相序列分析仪中进行序列测定。结果综述于图12。将所得序列与“Swiss-Prot”-数据库中的蛋白质序列进行比较。从比较中得出，与人体LDL-受体的相应肽序列完全相符：

下表表明了所分离的胰蛋白酶的肽的序列和在人体LDL-受体序列中的位置（图1）。

肽  位置  序列

A  165  XLYVFQGDSSPXXAFEFXXLXXXXI

B  373  XFGSIAXLFFTN

C  420  XYWSDLSQR

D  451  DIQAPXGLAVXXIXSNIYXXXXVL

E  500  XIVVXPVHGFMYXTXXGTPAK

F  584  XAHPFSLAVFEXK

测定分馏物33的序列，在每一分裂步骤得到2个氨基酸。在LDL-序列和每一分裂步骤中氨基酸量之比为40%～60%的基础上，分馏物33鉴定为二种肽的混合物。这些二种肽的序列也相当于人体LDL-受体的序列。

图1列出了人体LDL-受体的全部序列（Yamamoto  et  al.（1984）Cell  31，27-38）。

实施例5：人体LDL-受体在COS-7细胞中的表达

将含有由质粒pLDLR2（Yamamoto  et  al，同上）得到的人体LDL-受体的完整编码序列的质粒pTZ1使用已知方法（Sambrook  et  al，同上）引入有能力的大肠杆菌5K并放大。在质粒DNA经提取和纯化后，用限制性酶HindⅢ消化质粒DNA并将片段在0.8%琼脂糖凝胶中分离。洗脱编码LDL-受体的片段后，用乙醇沉淀，放入TE-缓冲液并在使用dATP和dGTP以Klenow-片段部分填充。

将真核的表达载体PSVL（pharmacia）在大肠杆菌5K中复制，纯化并用XbaI切割。用dCTP和dTTP部分填充后，用酚-氯仿萃取和乙醇沉淀，质粒用碱性磷酸酶进行脱磷酸化。

对载体和对LDL-受体-DNA部分充填后，使限制性切割位点相容，而且用T4-连接酶连结LDL-受体编码和载体DNA。如前所述，转化适宜的大肠杆菌细菌。通过用XhoI限制性消化而研究了许多菌落，以定位涉及SV40“迟启动子（Late  promoter）”的插入物。将插入物的一种带正（感觉（sense），pSVL-LDLR+）定位的菌落和一种带负（反感觉（antisense），pSVL-LDLR-）定位的菌落进行培养，得到大量质粒。

在9厘米的陪氏培养皿中按制造商的指南用脂染（Lipofection）（酯染试剂（Lipofectin），BRL）进行COS-7细胞（ATCC CRL 1651）的转染。转染后将细胞接种于6孔盘中，并在RPMI/10% HiFCS和12微克/毫升胆固醇以及2微克/毫升25-羟基胆固醇中再培养24小时。细胞用PBS/2% BSA洗涤，然后在34℃下用约10000cpm/孔的[³⁵S]-HRV2的PBS/2% BSA溶液培养1小时。多次洗涤后将细胞溶解在PBS/2% SDS中，用一液体闪烁计数器计数测定结合的[³⁵S]-HRV2的量。加入胎牛血清，胆固醇和25-羟基胆固醇引起内生的LDL-受体的抑制（Davis et al.，1987，Nature 326，760），这样在下一个结合试验中，通过转染只检测到表达的LDL-受体。如图14指出，结合的HRV2的量与未转染的对照细胞相比。假如细胞用感觉构建PSVL-LDLR+转染则大二倍。用pSVL-LDLR-转染则与对照细胞相比表明在结合中没有差别。

实施例6：通过Jacalin抑制[³⁵S]-标记的鼻病毒血清2型（HRV2）的结合

将2个通过除Jacalin琼脂糖色层外的全部步骤而纯化的等分样品（见实施例3，相当于细胞上清液的起始量约50ml）在7.5%  SDS聚丙烯酰胺凝胶上（Laemmli，U.K.1970，Nature  227，680-685），在非还原条件下进行分离，并通过电泳转移到固定膜（微孔隙的）（Mischak  et  al.1988，同上，Hofer  et  al.，1992，同上）。在没有（见图13，痕迹A）或有（痕迹B）0.1毫克/毫升Jacalin（Vector  Labs）下用放射性标记的鼻病毒（Mischale  et  al）1988，同上）进行培养、洗涤、干燥并在X-射线胶片上曝光（Hofen  et  al，1992，同上）。如图13所示，在LDL-受体上结合的病毒在给定条件下完全被抑制。

实施例7：通过RAP（连结蛋白的受体）降低病毒的产量

在24-孔盘（Nunc）中，将FH细胞（见实施例1）接种在含有10%胎牛血清的RPMI中并培养过夜使细胞密度达到每孔约5×10⁴细胞。用PBS洗涤细胞一次，并与RPMI/2%胎牛血清/30mM MgCl₂混合。如在Kunnas等人（同上）中所述，得到人体重组体RAP，然后纯化并加到浓度为0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的培养基中并将细胞在4℃下培养2小时。将HRV2，按m.o.i为100加到每个测试样品中，并在4℃下再继续培养2小时。然后将细胞用PBS洗涤三次，与RPMI/2%胎牛血清/30mM MgCl₂混合，并在34℃下培养过夜。第二天将细胞通过三次冷冻和融化而破碎。在10，000×g下离心除去细胞碎片，用印迹试验（Neubaues et al，同上）测定在上清液的感染病毒粒子数。图15指出，HRV2的产量随RAP浓度升高而下降，在RAP浓度为20微克/毫升则降低到约5%的没有RAP的比较值。

实施例8：通过人体LDL抑制海拉细胞的HRV2感染作用

在24孔盘（Nunc）中将海拉-细胞接种在有10%胎牛血清的MEM中并培养过夜使细胞密度约为2×10⁵细胞/孔。用PBS洗涤细胞一次，并与RPMI/2%胎牛血清/30mM MgCl₂混合。按0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.5mg/ml，以及1mg/ml浓度加入纯化的LDL （Hüttinger et al，同上），在34℃下将细胞培养30分钟。将HRV2或HRV14（大受体组病毒，用作对照），在按m.o.i为100加到每一个试验品中，并在34℃下继续培养45分钟。然后用PBS洗涤细胞3次，与RPMI/2%胎牛血清/30mM MgCl₂混合并在34℃下培养60小时。抽吸过滤培养基并将完整的细胞用结晶紫染色。图16表明，在有1mg/ml浓度的LDL时阻止了由HRV2感染海拉细胞（所有细胞是完整的）。在HRV14情况下未观察到效果（细胞全部溶解）。

实施例9：HRV2-受体结合位点的突变

“小”和“大鼻病毒受体组”的鼻病毒的不同受体结合位点也应在病毒衣壳的“谷结构”中反映，它引起与相应的受体相互作用。术语“谷”是用于表示病毒衣壳的对称的5-编号轴（5-numbered-axis），其范围约30A。关于谷结构的一种假设，认为在这区域的氨基酸侧基团是不能进入免疫球蛋白的，因此不会遭受任何免疫压力（Rossmann  et  al.（1985）Nature  317，145-154）。受体组的不同鼻病毒血清型可以这样保持结构，它对与相应受体作用是重要的，而且同时产生宽的不同血清型（Rossmann（1989）Viral  Immunology2，143-161）。假设进一步认为，在“大”和“小鼻病毒受体组”之间的谷结构中的差异引起二种不同受体的使用。这将含有一组氨基酸基团，它保持在“大鼻病毒受体组”的鼻病毒的特定位置，而第二组保持在“小鼻病毒受体组”的鼻病毒的特定位置。

图17表明对照序列，它用于测定在谷中或在谷边的位置，该谷是保持在小组的鼻病毒中，与大组的鼻病毒相比较。它们包括在位置1081（HRV2编号：Blaas  et  al.（1987）Proteins  2，263-272）以及3182的碱性基团，在位置3229的Ile或Leu和序列Thr-Glu-Lys（在位置1222-1224的TEK）。

构建下列HRV2突变体：在VPI蛋白中在位置1081（1081K∶E）和1222-1224（由HRV14，HRV39，HRV89衍生的相应序列代替TEK），以及突变体3182R∶T和在VP₃中的3222g L∶T。构建与HRV14（1155P∶G）相似的另一种突变体（1148 P∶G）（Colonno et al.（1988）Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.85，5449-5453）。

诱变所必需的cDNA制备，相应感染RNA的体外制备以及相应细胞上的转染已有描述（Duechler  et  al.（1989）Vivology  168，159-161，Maniatis  et  al（1982）“Molecular  Cloning：A  lahoratory  manual”Cold  Spring  Harbour  Laboratory，Cold  Spring  Harb-our，NewYork;Taylor  et  al.（1989）Nucl.Acids.Res.13  8764-8785;Ho  et  al.（1989）Gene.77，51-59和Herlitze  &  Koenen（1990）Gene  91，143-147）。

使用相当于野生型HRV2和突变体HRV2_{1148 P：G}以及HRV2_{3182 R：T}的RNAs进行转染，在海拉细胞中生产出约300Pfu/毫升。野生型的斑点的大小和形态与二种突变体是一致的。图18也表明，对海拉-细胞（HRV2 Wt（·），HRV2_{1148 P：G}（△）和HRV2_{3182 R：T}（〈 〉）;Neubauer et al（1987）Virology 158，255-258）这两种病毒在结合特性方面没有明显差异。从1081 K∶E，3229 L∶T或在位置1222上具有交换TEK-motif的突变体中都没有得到存活的突变体。

为了说明突变体，能否结合到小鼻病毒组的受体上，进行了竞争实验（图19）。当未标记的HRV2（·）在海拉细胞的培养中出现增加量时，突变体的[³⁵S]标记的病毒物质的结合就减少。加入HRV14（□）对结合无作用。很明显，通过突变，病毒对小鼻病毒受体组的受体的亲和性没有影响。这些数据表明，VPI的Pro  148（在HRV14中相当于Pro  155）不参与HRV2与其受体的相互作用。与HRV14不一样，它表明这种氨基酸在HRV14与ICAM-1相互作用中的重要功能。（Colonno  et  al.（1988）Proc.Natl  Acad.Sci.U.S.A.85，5449-5453）。

在大组的鼻病毒中能监测相当于TEK部分的未保存的寡肽序列。

突变体HRV2_{1081 K：E}，HRV2_{3229 L：T}和TEK突变体不是活的。HRVIA的三维结构的分析-一种与HRV2紧密相关的血清型-提出了没有因变更氨基酸侧基团而引起空间或静电的异常迹象。所有侧基团位于表面并易于接近溶剂。因此，确实可能它们参与和小组受体的相互作用，而且它们的改变导致结合能力和感染能力的损失。

在HRV2中，由Pro₁₁₄₈改变到Gly对病毒结合到其受体上的能力没有影响。在HRV14中，相应的改变会导致更稳定地结合到受体。Pro₁₁₅₅在谷底形成一种基质并阻止受体进一步渗入病毒衣壳。通过Gly代替Pro使结合的亲和力提高，因而能说明位阻的减少。由于在HRV2中没有观察到这种效应，就有可能，与那些由大组鼻病毒所用的相比，在小组鼻病毒中，病毒/受体的相互反应将在不同地方发生。

Claims (29)

1、多肽，其特征在于，它是用于“小鼻病毒受体组”的鼻病毒的一种受体的功能性衍生物。

2、按权利要求1的多肽，其特征在于，它是一种可溶性的衍生物。

3、按权利要求1-2的多肽，其特征在于，它是可溶的，细胞外形式的受体蛋白质。

4、按权利要求1-3之一的多肽，其特征在于，它是由LDL受体系衍生的。

5、按权利要求4的多肽，其特征在于，它是由按图1人体的LDL-受体氨基酸序列或由按图2α₂MR/LRP或按图3gp 330衍生的。

6、按权利要求5的多肽，其特征在于，它主要包括按图4的LDL-受体系的受体的区1、区1和2或区1，2，和3。

7、按权利要求6的多肽，其特征在于，它包括按序列ID.No.1或序列I.D.No.2的氨基酸序列。

8、按权利要求6的多肽，其特征在于，它主要由LDL-受体的区1和区2组成，由真核细胞释放，其分子量约为120kDa，分子量是由SDS-凝胶电泳法在非还原条件下测定的。

9、按权利要求1-8之一的多肽，其特征在于，它可以是二聚体，三聚体，四聚体或多聚体。

10、按权利要求1-9之一的多肽编码的DNA。

11、按权利要求10的DNA，其特征在于，它是插入一种载体。

12、按权利要求11的DNA，其特征在于，按前面权利要求之一的DNA是与有载体的表达控制序列功能性地相结合，并在微生物和/或哺乳动物中是可复制的。

13、宿主生物体，其特征在于，它是用权利要求11或12的DNA转化。

14、用于制备权利要求12的DNA分子的方法，其特征在于，所提供的DNA用合适的终端插入载体DNA，该合适终端是编码按权利要求10的小鼻病毒受体组的受体的功能性衍生物，而载体DNA含有表达控制序列并用限制性核酸内切酶切割，插入要使表达控制序列调节所插入DNA的表达。

15、用于制备“小鼻病毒受体组”的受体的功能性衍生物的方法，其特征在于，多肽是通过酶催，优选地是蛋白质分解或化学处理，特别是还原处理而由天然受体分子制得的。

16、用于制备“小鼻病毒受体组”的受体的功能性衍生物的方法，其特征在于，它是通过按权利要求10-12之一的DNA的表达而得到的。

17、杂种细胞系，其特征在于，它分泌对按权利要求1-9之一的一种多肽的单克隆抗体。

18、单克隆抗体，其特征在于，它们是专一地中和，按权利要求1-9之一多肽的活性或专门与所述之一的多肽相结合。

19、按权利要求18单克隆抗体的应用，它可用于对按权利要求1-9之一的多肽进行定性和/或定量测定或纯化。

20、用于测定按权利要求1-9之一的多肽的试验合，其特征在于，它含有按权利要求18的单克隆抗体。

21、用于制备按权利要求18的单克隆抗体的方法，其特征在于，宿主动物用一种按权利要求1-9之一的多肽进行免疫接种，这些宿主动物的B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，分泌单克隆抗体的杂种细胞系进行亚克隆和培养。

22、按权利要求1-9之一的多肽和LDL受体系的天然受体分子或相应的药物上可用盐在人体的治疗性或预防性处置中的应用。

23、按权利要求1-9之一的多肽和LDL受体系的天然受体分子用作抗病毒，特别是抗鼻病毒的制剂。

24、治疗处置用制剂，其特征在于，除了药物上惰性的载体以外，它还含有一种有效量的权利要求1-9之一的多肽或LDL-受体系的天然受体分子。

25、药物组合物，它含有按权利要求1-9之一的一种或多种肽以及适宜的载体物质。

26、用于抑制生理的LDL-配位体结合的“小鼻病毒受体组”的鼻病毒。

27、物质的鉴别方法，它抑制配位体结合到“LDL-受体系”的受体上，其特征在于，

a）能由培养基上清液分离的受体或可溶性受体是在有潜在的抑制物质下进行培养，

b）该物质具有“小鼻病毒受体组”的标记的鼻病毒物质，

c）测定结合的能力。

28、用于检测LDL-受体系的受体的方法，其特征在于，

a）将由对受体有结合活性的“小鼻病毒受体组”的病毒物质所衍生的一种物质进行标记，

b）用所述探针进行培养，

c）检测所标记病毒物质的结合能力。

29、用于将治疗活性物质送入载带细胞的方法，其特征在于，

a）在LDL-受体上有结合活性的“小鼻病毒受体组”的病毒物质与治疗物质相配合，并且

b）所述物质加到结合到受体的相应细胞物质，并这样将治疗活性物质引入细胞。

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