CN1076489A - 90k肿瘤相关抗原ir-95的遗传序列 - Google Patents
90k肿瘤相关抗原ir-95的遗传序列 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1076489A CN1076489A CN93101805A CN93101805A CN1076489A CN 1076489 A CN1076489 A CN 1076489A CN 93101805 A CN93101805 A CN 93101805A CN 93101805 A CN93101805 A CN 93101805A CN 1076489 A CN1076489 A CN 1076489A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antigen
- sequence
- cell
- dna
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 131
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 130
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 130
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 49
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 13
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 12
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 50
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 44
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 abstract description 43
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 abstract description 42
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 abstract description 18
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 abstract description 18
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 abstract description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 68
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 39
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 30
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 15
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 12
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 12
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 11
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 8
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 8
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 7
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 7
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- XXPDBLUZJRXNNZ-UHFFFAOYSA-N promethazine hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 XXPDBLUZJRXNNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 3
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 3
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 3
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N Ala-Asp-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- VJTWLBMESLDOMK-WDSKDSINSA-N Asn-Gln-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VJTWLBMESLDOMK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000037716 Chondroitin-sulfate-ABC endolyases Human genes 0.000 description 2
- 108090000819 Chondroitin-sulfate-ABC endolyases Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- ZRZILYKEJBMFHY-BQBZGAKWSA-N Gly-Asp-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN ZRZILYKEJBMFHY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 2
- AUMNPAUHKUNHHN-BYULHYEWSA-N Val-Asn-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N AUMNPAUHKUNHHN-BYULHYEWSA-N 0.000 description 2
- FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N [C].O Chemical compound [C].O FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 238000012505 colouration Methods 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- RLLPVAHGXHCWKJ-UHFFFAOYSA-N permethrin Chemical compound CC1(C)C(C=C(Cl)Cl)C1C(=O)OCC1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 RLLPVAHGXHCWKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 2
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NURUARRJQOZSIF-DXIBHZBQSA-N (3s)-3-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-[[(2s)-1-[[(2s)-4-amino-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-(carboxymethylamino)-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-4-methyl Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 NURUARRJQOZSIF-DXIBHZBQSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N Arg-Val-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 239000000120 Artificial Saliva Substances 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WTMZXOPHTIVFCP-QEWYBTABSA-N Glu-Ile-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WTMZXOPHTIVFCP-QEWYBTABSA-N 0.000 description 1
- WKJKBELXHCTHIJ-WPRPVWTQSA-N Gly-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N WKJKBELXHCTHIJ-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288982 Loris Species 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101800004925 Speract Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 1
- 102100026497 Zinc finger protein 654 Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 108010036533 arginylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N gentamicin Chemical class O1C(C(C)NC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008271 glucosaminides Chemical class 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229940019452 loris Drugs 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 108091005485 macrophage scavenger receptors Proteins 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LVTHXRLARFLXNR-UHFFFAOYSA-M potassium;1,1,2,2,3,3,4,4,4-nonafluorobutane-1-sulfonate Chemical compound [K+].[O-]S(=O)(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F LVTHXRLARFLXNR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001007 puffing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108010028349 saliva Orthana Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 108091005725 scavenger receptor cysteine-rich superfamily Proteins 0.000 description 1
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000012991 uterine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了基本纯化的肿瘤相关90K抗原，
或其片段，特别是来自：人乳腺癌细胞系CG-5的培
养液；乳腺癌患者的血清；或卵巢癌患者的腹水。分
子量约为95,000道尔顿的天然抗原以高分子量复
合物存在。本发明还提供了该抗原的纯化和表征以
及它们的应用。本发明还提供了编码90K抗原或其
片段的核苷酸序列，含有该基因序列的载体，以此转
化的宿主，和由转化的宿主生产该抗原或其片段的方
法。
Description
本发明属分子和细胞生物等领域，涉及90K肿瘤相关抗原（IR-95）的纯化及鉴定、编码90K抗原的遗传序列、该抗原的克隆和表达以及其生产和应用。
在各种癌病患者的血清中已有肿瘤细胞排出或分泌的抗原的报道。对某些类分子的免疫检测显示，它们可用作诊断/预测指示剂，并可用于治疗性监视。部分已被鉴别的抗原包括：用于卵巢癌的CA125（Bast dt al.N-Ergl.J.Med，309：883-887（1983））;用于卵巢癌的MOV2（Miotti et al，Cancer Res.45：826-832（1985））;用于乳腺癌的CA15-3（Hilkens et al.，Cancer.Res.46：2582-2587（1986））;用于胃肠癌的CA19-9（Koprowski et al.，Scicnve211：53-55（1981））;用于胃肠癌的癌胚抗原（CEA）（Golp et al.，JAMA234：1331-1334（1968））;以及用于胃肠癌的CA50（Holmgren et aal.，Br.Med.J.288：1479-1492（1984））。但是，在所有这些肿瘤抗原血清检测方法中没有一种灵敏到足以对潜伏的癌症进行早期检测，或者对其复发或转移进行检测。
这类抗原大部分是表达在肿瘤细胞的表面，但也有一些被分泌到患者的循环系统中。其中后一类抗原已被证明可用于对肿瘤负荷及癌症的发展进行血清检测、预测和评估。
检测肿瘤相关抗原的单克隆抗体（MAb）已有报道。例如，已获得抗循环乳腺癌相关抗原的单克隆抗体。其中的sp-2能够识别一种称作90K抗原（a.k.a ImmunoRegulin-95或IR-95）的细胞质抗原。90K抗原在80%以上的乳腺癌中均有表达（Iacobelli et al.，Cancer Res.46：3005-3010（1986））。
在约50%乳腺癌患者、40%胃肠癌患者及30%妇科癌症患者的血清中，90K抗原的水平均有升高（Iacobelli et al.，Breast Cancer Res & Tneat.11：19-30（1988））。更重要的是，本发明的检测方法已显示在患有转移性疾病的个体中，显示出血清水平提高的患者的百分数更大，且90K血清变化与癌症的发展状况相对应（Iacobelli et al.，Breast Cancer Res & Tneat.11：19-30（1988）;Scanbia et al.，Anticancer Res 8：761-764（1988）;Beneketti-Panici et al.，Gynecol.Oncol.35：286-289（1989））。由于90K抗原不同于其它循环抗原，如CA15-3、CEA和CA125（Jacobelli et al.，Breast Cancer Res & Tneat.11：19-30（1988）;Benedetti Panici et al.，Gynecol.Oncil.35：286-289（1989）），它可以代表另一种有用诊断工具，用以对乳腺癌及其它癌症进行监测。
引用I型巨噬细胞清除剂受体（Kolana et al.，Natwve 343：531（1990））、海胆Speract受体（Dangott et al.，Proc.Natl.Acda.Sci.usA86：2128（1989））和人淋巴细胞糖蛋白T1/Leu-1（Jones et al.，Nature323：346（1986）），已经发现了90K抗原中氨基酸35-80区域的同源性。
90K抗原在欧洲专利申请91830153.2（1991年4月17日递交，公开号为0453419A2）中有所涉及。具有相同的15氨基酸末端序列的抗原则在PCT申请PCT/US85/02132（1985年10月30日递交，国际公开号为WO86/02735）中有所涉及。该PCT申请要求了1984年11月2日和1985年10月7日递交的美国专利申请667，521和785，177的优先权。但是，迄今没有一项研究具体阐明了该抗原的物理化学性质和免疫化学性质。因此，对SP-2反应性90K抗原进行纯化和鉴定十分重要。
本申请涉及的是以下来源的90K肿瘤相关抗原的纯化和鉴定：人乳腺癌细胞系的培养液、乳腺癌患者的血清以及卵巢癌患者的腹水液。所提供的纯化方法产生了至少50，000倍纯化的三种不同来源的90K肿瘤相关抗原。天然抗原是糖蛋白，表观分子量约为95，000道尔顿，并且是以高分子量复合物形式存在，所有三种不同来源的抗原具有相似的电泳图和免疫反应性。
本发明还涉及90K抗原的氨基酸序列以及编码90K抗原的遗传序列，也提供了90K抗原的诊断和治疗用途。
图1显示了90K蛋白的核苷酸和氨基酸序列（分别为SEQID-NO：1和SEQ ID NO：2）。信号肽以方框显示，SRCR同源区以阴影显示，潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点以圆圈显示。
图2显示了对以下来源的90K抗原进行琼脂糖CL-6B柱层析的结果：CG-5组织培养液（-）、乳腺癌患者的血清（---）以及卵巢癌患者的腹水液（---）。通过免疫放射检测法（IRMA）检测各级分的90K活性，箭头表示Dextran blue2000的洗脱体积。
图3显示了对90K抗原进行密度梯度离心的结果，将得自CG-5培养液（-）、乳腺癌患者血清（…）、卵巢癌患者腹水液（…）以及乳腺癌患者未分离血清的纯化90K在氯化绝中进行平衡超离心。通过IRMA检测各级分的90K活性并通过称量已知体积的各级分测定其密度。箭头表示β-半乳糖苷酶的浮力密度。
图4是对90K抗原的分子量进行测定。图4A：对来自人乳腺癌细胞的放射活性90K抗原进行免疫沉淀。利用MAbsp-2（泳道a-e）或抗α-胎蛋白MAb（泳道f）免疫沉淀（200，000cpm三氯乙酸可沉淀的）（35S）甲硫氨酸标记的培养液等份试样，并在2-巯基乙醇存在（泳道a-c和e）式不存在（泳道d）的情况下通过SDS：PAGE进行分析，接着进行荧光x线照相。泳道a含有CG-5细胞。泳道b含有MCF7细胞。泳道C含有T47D细胞。泳道d含有T47D细胞。泳道e含有得自与衣霉素接触之后但在被（35S）甲硫氨酸标记之前的CG-5细胞的组织培养液。（图4B）：对自CG-5培养液（泳道a，620单位）、乳腺癌患者血清（泳道b，920单位）和卵巢癌患者腹水液（泳道c，700单位）纯化的90K抗原的SDS：PAGE分析。凝胶用银染色。分子量标准品为磷酸化酶b（Mr97，000）和BSA（Mr66，000）。
图5是对得自CG-5培养液（泳道a和d）、乳腺癌患者血清（泳道b和e）和卵巢癌患者腹水液（泳道c和f）的纯化90K抗原的PAGE和Western吸印分析。在含0.1%NP-40的4-20%梯度凝胶上分析纯化的90K抗原。泳道a-c用银染色。泳道d-f蛋白电吸印到硝酸纤维素膜上，分子量标准品是β-半乳糖苷酶（Mr540，000）和BSA（Mr66000）。
图6显示了90K抗原酶促消化的结果。图6A：用各种蛋白酶消化得自CG-5培养物的纯化90K并在9%SDS：PAGE上分析，接着用银染色。图6B：相对于未处理的对照，显示了（125I）标记的SP-2与消化的90K的结合。对于图6A和6B：泳道a为纯化的90K对照;泳道b为链霉蛋白酶处理的90K抗原;泳道c为木瓜蛋白酶处理的90K抗原;泳道d为胰蛋白酶处理的90K抗原;泳道e为胰凝乳蛋白酶处理的90K抗原。对于图6B：泳道f为神经氨酸苷酶处理的90K抗原;泳道g为岩藻糖苷酶处理的90K抗原;泳道h为软骨素酶ABC处理的90K抗原;泳道i为α-半乳糖苷酶处理的90K抗原;泳道l为β-半乳糖苷酶处理的90K抗原。
图7为CMV-IR95的质粒图谱。
图8为CMCNEO-IR95的质粒图谱。
图9为人乳房癌BT20的细胞最初三个稳定克隆的免疫沉淀物的放射自显影图。
图10为35S-甲硫氨酸标记的在被PCMV-IR95质粒转染的293细胞中瞬时表达的IR-95的SDS-PAGE图。
图11为细胞溶解百分数与IR-95浓度的关系图。
本发明提供了一种基本上纯的肿瘤相关抗原，其表观分子量约为95千道尔顿（K）并被命名为90K抗原（a.k.a.ImmunoRegulin-95或IR-95）。在乳腺癌、胃肠癌和妇科癌症患者的血清中以及携带人免疫缺陷病毒（HIV）的患者的血清的血清中，该肿瘤相关抗原的浓度升高。
90K抗原与MAb sp-2反应，MAb sp-2是通过用被维持在其中的人MCF-7乳腺癌细胞释放到组织培养液中的蛋白质免疫小鼠而产生的。产生MAb sp-2的杂交瘤细胞系已按照欧洲专利公约第28条和第28a条的规定于1991年4月12日保藏于巴斯德研究所（Collection Nationale de Culture de Microrganisms，28 Rue de Doeteur Roux，75724 Paris Cedex 15，France）。该保藏物的登记号为I-1083。1991年4月22日经检测发现该细胞存活。利用MAb sp-2检测抗原发现，在正常个体中90K以低水平存在。而在50%乳腺癌患者中所检测到的抗原水平高达正常水平的100倍。在非乳腺癌患者，包括卵巢癌、子宫癌和结肠癌患者的血清中也检测到90K抗原。
按照本发明，可从含有90K肿瘤相关抗原的样品中分离出该抗原或其抗原决定簇。按照本发明的方法，任何含有该抗原的样品均可作为起始原料。在乳腺癌和其它恶性肿瘤患者以及感染HIV患者的组织和血清中发现的本发明90K肿瘤相关抗原是一种糖蛋白。因此，有可能从以下各处分离出90K蛋白：人或其它动物的血浆或血清;得自天然产生90K蛋白的人或其它动物的天然存在的肿瘤细胞系;得自本身不产生90K蛋白但在被90K表达质粒转染后已能产生90K蛋白的人体其它动物的永久细胞系;得自本身不产生90K蛋白但能够在无血清添加剂情况下生长（如u937细胞）且已被90K基因转染的人或其它动物的细胞系。例如，打算用于本发明的任何抗原来源包括，但不限于：人乳腺癌细胞系CG-5的培养液;乳腺癌患者的血清;卵巢癌患者的腹水液。这里仅简单地用“样品”来表示含有抗原的样品，它意指含有90K抗原的任何样品。
在实施本发明时，一般是用四步法纯化90K抗原。该方法包括硫酸铵沉淀，凝胶过滤层析，离子交换层析以及在MAb sp-2亲和基质上的吸附。但是，也已认识到，对该方法进行某些改动仍能够产生高纯度的90K抗原。
用于从样品中分离90K抗原的纯化方法总结于表1中。将样品离心后，加入固体硫酸铵沉淀蛋白质，并将样品在4℃放置过夜。离心收集蛋白质沉淀物。在每一纯化步骤测定总蛋白质并通过IRMA对抗原进行定量分析。在硫酸铵沉淀后几乎所有90K活性均被回收，导致其约4倍富集。
硫酸铵沉淀的抗原接着进行大小排阻层析。90K抗原在大峰中稳定发现，紧接在柱空隙容积后洗脱，它意味着该抗原是一大分子量复合物。与此不一致的是也观察到低分子量的小反应性峰，这可能是产物降解的结果。
通过DEAG-纤维素层析进一步纯化高分子量峰。90K抗原在NaCl浓度约0.25M昌从柱中被洗脱。
最后在偶联到MAl sp-2上的琼脂糖上通过免疫亲和吸附进行纯化。偶联按Schneider等人的方法（J.Biol.Cham，257：10766-10769（1982））完成。所结合的90K抗原用缓冲液，优选3M MgCl2洗脱。
该纯化方法产生基本上纯的90K抗原。“基本上纯的”指这里所述的对90K抗原的纯化产生至少50，000倍，一般为约50，000-80，000倍纯化的90K抗原。
因此，本发明涉及基本上纯的90K抗原，其表观分子量约为95，000道尔顿，还涉及含有抗原决定簇的片段以及其它片段。本发明也涉及天然的90K抗原片段，并涉及90K抗原的非糖基化残基。
这里所用的含有免疫交叉反应性抗原决定簇多肽意指具有特定抗体将与其反应的共同抗原决定簇的多肽。这类多肽包括90K抗原及其片段的糖基化和非糖基化残基、合成的多肽或其片段以及抗针对于90K蛋白的活性抗原决定簇的个体基因型的抗体。现已证实抗个体基因型试剂可用于诊断工具，用以检测具有与抗体上位点发生免疫交叉反应的位点的抗原（Ppotocnjak et al.，Science 215：1637-1639（1982））。
一旦抗原被纯化，被可利用本领域普通技术人员所熟知的普通技术产生抗该抗原的单克隆抗体和多克隆抗体（Klein，J.Immunology：The Science of Cell-Noncell Discrimination，John Wiley and Sons，New York，New York，usA（1982）;Kennethet al.Morwclonal Antibodcies，Hybridoma：A New Dimension in Biologcial Analyses，Plenum Press，New York，New York，usA（1980）;Compbell，A.，“Monoclonal Antibody Technology，“ln：Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Bivlogy，Vol13（Burdon et al.，eds），Elsevier，Amsterdem，The Netherlands（1984）;和Eisen，H.N.ln：Microbiology，3rd.Eaition（Davis et al.，eds），Harper & Row，Philadetphia，PA，usA（1980）。
本发明尤其是感兴趣的是在人体内产生的抗90K抗原或其衍生物的抗体，或者是通过重组DNA技术或其它技术“人格化”（即在人体中为非免疫原性）的抗体。通过例如用相应的非免疫原性部分（即嵌合抗体）取代抗体的免疫原性部分可产生人格化抗体（见Robinson等，国际专利公开PCT/us86/02269;Akira等，欧洲专利申请184，187;Taniguchi，M，欧洲专利申请171，496;Morrison等，欧洲专利申请173，494;Newberger等，PCT申请WO86/01533;Cabilly等，Science240：1041-1043（1988）;Liu等，Proc.Natl.Aced.Sci.usA84：3439-3443（1987））;Liu等，J.Immuvoloyy139：3521-3526（1987））;Sun等，Proc.Natl.Acad.Sei.usA84：214-218（1987）;和Shaw等，J.Natl.Cancer lnst.80：1553-1559（1988））。
Norrison，S.L.（Science229.1202-1207（1985））和Oi等人（Biotchncques 4：214（1986））对人格化嵌合抗体进行了综述。
可利用本领域熟练技术人员熟知的技术对纯化90K蛋白进行序列分析。对90K蛋白的末端氨基酸序列进行初步分析后发现了如下的氨基酸序列（SEQ ID NO∶3）：Val Asn Asp Gly Asp Met Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ala Thr Asn Gln Gly Arg Val Giu Ile Phe.对90K抗原的氨基酸组成进行分析的结果见表4。表2提供了对90K抗原作的进一步特征鉴定，它给出了物理和化学处理对90K活性的影响。
现在普遍认识到，有了蛋白质的氨基酸序列就能够制备出可用于鉴别该蛋白质克隆的核苷酸探针。因此，与合适核酸探针杂交就可鉴别出含有编码90K抗原的核苷酸序列的克隆。
这里所用的术语“DNA构建物”意指通过合成产生的或通过重组DNA技术产生的任何DNA序列。“DNA构建物”包括但不限于：合成的寡核苷酸、载体和含有插入子的载体。
根据所了解的90K蛋白的氨基酸序列可构建出用于鉴别90K抗原基因的特定核苷酸探针。氨基酸残基和肽的序列在本文中是以通常使用的三字母或单字母表示法表示。这些三字母或单字母表示法的目录可从例如以下教科书中找出：Lehninger，A.，Biochemistry，Worth Publishers，inc.，New York，NewYark，USA（1975）及其随后的各卷。
前22个氨基酸的N-末端序列保证了66个核苷酸长寡核苷酸的合成，用该寡核苷酸作为探针可从MCF-7细胞中筛选cDNA库。利用这种方法，本发明人完成了分子克隆并测定出90K抗原的完整cDNA序列。
本发明包括90K抗原的氨基酸序列、编码该抗原的遗传序列、含有该遗传序列的载体、用它转化的宿主、通过转化宿言的表达生产90K蛋白、从样品中纯化90K蛋白以及90K抗原的应用。
90K蛋白的核苷酸和氨基酸序列示于图1中（分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）。应当理解的是对特定氨基酸和核苷酸序列的修饰仍包括在本发明的范围之内。这里所用的术语“修饰”意指任意取代、添加或缺失多肽片段的一个或多个氨基酸或核苷酸序列的一个或多个核苷酸。这些修饰可通过操作氨基酸序列本身完成，或通过先改变核酸序列然后用该改变了的核酸序列合成肽的方法来完成。
核酸序列的修饰可通过PNA突变，通常是通过定点诱变完成。位点特异性诱变的技术是本领域技术人员所熟知的（例如见Adelman et al.，DNA2：183（1983）;Smith，M.，Ann.Rev.Genetcis19：423（1985））。突变包括，例如核苷酸的取代、添加或缺失，其条件是最终构建物具有所需生物活性。核酸的修饰一定不能将序列置于读码架之外，且最好不应产生能够产生次级mRNA结构的互补区（见欧洲专利申请公开号75，444）。
氨基酸和核苷酸的修饰方法是本领域已知的。氨基酸序列的插入包括将一个残基的氨基和/或羧基末端融合到基本上未限制其长度的多肽上，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。序列内插入的范围一般为约1-10个残基。更优选的范围是约1-5个残基。
氨基酸残基可用合适的氨基或羧基保护基保护起来，或不保护。另外，所合成的肽可被糖基化或不被糖基化。
为了表达90K抗原，需要有可被合适宿主识别的转录和转译信号。被克隆的编码90K蛋白的核酸序列（最好为双链形式）可被可操纵地连接到表达载体中控制转录性表达的序列上，并加到原核或真核宿主细胞中以产生重组90K蛋白或其变异体。根据可操纵地连接到控制转录性表达的序列上的90K蛋白编码序列链的类型，也可能表达90K蛋白反义RNA或其变异体。
这里所用的术语“表达载体”意指能够指导可操纵连接的DNA序列的表达的DNA构建物。表达载体包括，但不限于噬菌体和质粒载体。“表达载体”通常含有选自但不限于以下成分的一个或多个成分：操纵基因、启动子、核糖体结合位点、转译起始信号和转译终子信号。
这里所用的术语“宿主细胞”意指能够被DNA构建物或表达载体转化或转染的任何细胞。
90K蛋白在不同宿主中的表达可导致转译后修饰的改变，而这种改变可能会改变蛋白质的性质。
如果核酸分子如DNA含有具有转录调节信息的表达控制序列，则认为它“能够表达”多肽。为了表达多肽，控制序列必须“可操纵地连接”到编码多肽的核苷酸序列上。
可操纵的连接是指这样一种连接方式，即编码多肽的核苷酸序列按一定方式连接到一个调节序列（或多个调节序列）上，使得多肽编码序列的表达被置于调节序列的影响或控制之下。如果启动子的诱导作用导致了蛋白质编码序列的转录且如果两种DNA序列之间连接的性质没有（1）导致产生读码移动突变，（2）影响表达调节序列指导90K mRNA、反义RNA或蛋白质表达的能力或（3）影响90K模板被启动子区序列转录的能力，则可将两种DNA序列（如90K蛋白编码序列和连接到编码序列5′末端的启动子区序列）之间的连接称为可操纵的连接。因此，如果启动子能够影响DNA序列的转录，就可将该启动子区可操纵地连接到DNA序列上。
基因表达所需的调节区的确切性质在处与种之间或不同的细胞类型之间可能是不同的，但一般均包括与转录和转译的起始有关的5′非编码序列（如TATA盒）、带帽序列、CAAT序列等。该5′非编码控制序列主要包括含有对可操纵连接基因进行转录控制的启动子的区域。
在真核宿主中表达90K蛋白需要使用在该宿主中具有功能的调节区。最好是真核的调节区。根据真核宿主的性质，可使用各种转录和转译调节序列。也可从感染真核细胞的病毒的基因组序列中获得转录和转译调节信号，这类病毒包括腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猿猴病毒及疱疹病毒等。最好是将上述控制信号与能够在宿主细胞中高水平表达的特定基因相连。
使用编码可被转译的mRNA产物的哺乳动物基因的启动子较好，尤其是使用强启动子，如肌动蛋白、胶原蛋白、肌浆球蛋白等的启动子，只要它们也能够在宿主细胞中发挥启动子功能。关于真核启动子，一般参见Hamer等，H.Mal.Apppl.Gen.1：273-288（1982）;McKmights，S.，Cell 31：355-365（1982）;Benoistt等，Nature（London）290：304-310（1981）;Jognston等，Proc.Natl.Acaad Sci USA 79：6971-69675（1982）;和Silver等，Proc Natl.Acad Sci USA 81：5951-5955（1984）。
分子克隆和表达的一般方法请看Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d.ed.，Volss.1-3，Cold Sping Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA（1989）。
可对转录起始调节信号进行选择以让基因的表达被阻遏或激活，从而使得可操纵连接的基因的表达能够被调节。本发明的载体还可包括其它可操纵连接的调节成分（如增强子序列）或赋予可操纵连接基因细胞类型的特异性表达的DNA成分。
纯化蛋白及其抗体以及其遗传序列可用在诊断和治疗方法中。
具体地说，90K抗原的水平可用作乳腺癌、卵巢癌及其它癌症、病毒（包括HIV）感染、炎症、自体免疫疾病以及衰老等的诊断指示剂。
90K抗原可用各种方法进行检测。血清中的90K抗原可利用酶联免疫吸附检测（ELISA）夹层法进行检测。按这种方法，MAb sp2既被用作免疫吸附剂，又被用作酶标记探针。用以按夹层型ELISA检测和定量分析90K抗原。参照CG-5细胞裂解物标准制品中存在的量，利用线性回归计算机程序可计算出样品中存在的90K的量。该检测法已被Iacobelli等人所述（Breast Caruer Ras.and Treatment11：19-30（1988）），该文献整个被加到本文中。90K抗原的过量表达将表明疾病的出现。
通过测定RNA水平也可确定90K抗原的表达水平。按照该方法，可用核酸探针与样品中的RNA杂交。杂交方法是本领域技术人员普遍知道的（如见Nucleic Acid Hybridication，A Practiial Approach，IRL Press，Washington.D.C.，U.S.A（1985）及其中所引用的文献。
90K抗原或其遗传序列也可用于治疗。血清IR-95水平的升高不仅存在于癌病患者中，而且也存在于受不同病理生理条件（见表5），如被HIV或其它病毒感染和自该免疫疾病等影响的患者中，所有这些的特征在于它们均具有不同程度的与免疫激活相关的免疫缺陷。
体外实验也已证实90K抗原能够增强外周血单核细胞的天然条伤细胞（NK）和淋巴因子激活杀伤细胞（LAK）细胞活性（图11）。
根据以上发现，也可将90K抗原或其遗传序列作为免疫调节剂用于治疗。例如，通过输入90K抗原可治疗患有不诱导90K抗原过量表达的特定癌症的患者。而且，可通过输液给其血清中90K蛋白水平转高的癌症患者补充90K抗原。
90K抗原或其遗传序列也可用于基因治疗（综述在Miller，Nature357：455-460（June 1992）中）。在一优选实施方案中，是将含有IR-95编码序列的表达载体插入到细胞，细胞在体外培养后大量输给患者。在另一优选实施方案中，含有所选择启动子（如强启动子）的DNA片段以一定方式被转移到含有内源IR-95的细胞，使得启动子片段增强了内源IR-95基因的表达（例如，将启动子片段转移到细胞中，使得它直接与内源IR-95基因相连）。
利用本领域技术人员所熟知的普通技术及文献，可制备出90K抗原或其拮抗剂（如见Remington′sPharmaceutcial Sciencas，18th，ed，（A.R.Gennaro，Ed.）Mack Prblishircg Comp.Easton，PP.A.USA.18042（1990），尤其是其中的第八章（Pharmaceatcial Preparations and Their Manrbacture）和第4章（Testing and Analyssis）。
这里所用的术语“拮抗剂”意指在体外或体内降低90K抗原作用的任何化合物。
合适及最佳给药途径也可由本领域熟练技术人员按常规方法测定。前者包括口服给药、静脉给药、肌内给药、皮下给药、经皮给药和口腔给药。
可用于治疗的90K抗原及其拮抗剂的剂量为“治疗有效量”，这里所用的术语“治疗有效量”意指产生所需治疗效果的抗原、其片段或其拮抗剂的量。该量可由本领域普通技术人员按常规方法测出，它的变化取决于几个因素，如患者所患的具体疾病及其程度以及患者的身高、体重、性别、年龄和病史。一般来说，本发明的90K抗原以约5-5000mg/剂/周/患者的剂量较好，更具体地说，一优选剂量范围为50-500mg/剂/周/患者。
为了治疗自体免疫疾病、类风湿性关节炎、变态反应、器官移植物的排斥反应以及其它免疫系统被激活并需要被抑制的其它病理状态，可服用90K抗原拮抗剂。如上所述，拮抗剂的合适剂量也可由本领域普通技术人员按常规方法测定。一般来说，90K抗原的拮抗剂以5-5000mg/剂/周/患者的剂量提供较好。更具体地说，一优选剂量范围为50-500mg/剂/周/患者。
这里所使用的且未具体定义的任何术语的用法与本发明所属领域普通技术人员对它们的用法相同。
以下实施例旨在说明本发明而不是要限制本发明的范围。
实施例1
90K抗原的特征鉴定
材料和方法
细胞系和试剂。MCF-7人乳腺癌细胞系的雌激素超敏变异细胞系CG-5（Natoli et al.，Breast Caancer Res.Treat.3：23-32（1983））和其它人乳腺癌细胞系被维持在补充了10%胎牛血清（FCS）和抗生素的Dulbecco改性的Eagle氏培养基（DMEM）上。通过硫酸铵沉淀及离子交换层析（Iacvbelli et al.，Breast Cancer Rse.& Treat 11：19-30（1988）从腹水液中纯化由培养在注入了姥鲛烷的Balb/C小鼠中杂交瘤产生的鼠MAb.sp-2（Iacobelli et al.，Cancer Res.46：3005-3010（1986）。如前所述，产生MAb sp-2的杂交瘤细胞已按欧洲专利公约的规定保藏于巴期德研究所，其保藏号为I-1083。
通过乳过氧物酶用Na125I标记纯化MAb sp-2（Thorell et al.，Biochem.Biophys.Acta 251：363（1971））。蛋白酶和其它酶购自Sigma化学公司（St.：ouis，MO，U.S.A.）。电泳试剂购自Bio-Rad实验室（sehrate，ltaly），琼脂糖CL-6B购自Pharmacin（Uppsala，Sueken）。所有其它试剂均具有商业上能够获得的最高纯度。
固相放射免疫检测。已研究出一种测定90K活性的“两步”夹层IRMA。通过蛋白质-抗生物素蛋白-生物素捕获系统（Suter et al.，Mol.Immunol.26：221-230（1989），用生物素化的MAb sp-2涂覆聚苯乙烯珠（6.5mm，Preeission Plastci Balls，Chicago，Illinois，USA）。sp-2的生物素化按照Cuesdon等人的方法（J.Histochom Cytochem 27：113-118（1979））进行。涂覆之后，用0.9%NaCl溶液充分洗珠，并于室温下与生物素化的MAb sp-2（5μg/ml）一起保温18小时。涂覆过的珠用BSA封阻溶液（2mg/ml）于室温下处理1小时，经蒸馏水洗涤后于室温下保存待用。按这种方法处理过的珠能稳定至少6个月。
对每一次检测，将200μl适当稀释的样品或标准品与MAb sp-2涂覆的珠一起于37℃保温1小时。用蒸馏水洗珠后加入100μl（125I）标记的MAb sp-2（约50，000cpm;比活性10μci/μg）的PPBS溶液（pH7.4，含有5%BSA、0.1mg/ml正常小鼠IgG和0.1%NaN3），于37℃再保湿1小时。用蒸馏水洗珠并在γ-计数器上计数。通过与标准制品比较计算出90K的量，该标准品制剂是通过从乳腺癌患者中采用血清并滴定到含有40、20、10和5任意单位/ml而制得。利用IRMA和ELISA（Iacobelli et al.，Breast Cancer Res.& Tneat.11：19-30（1988）对取自乳腺癌患者的120个血清同时进行检测后得到校正系数0.91（Kendall Q试验）。与ELISA相比，IRMA的灵敏性约为ELISA的三倍，能更快地完成，仅需要下列3小时，并具有高度重复性，检测内和检测间系数的变化为4%。
PAGE和Western吸印。SDS-PAGE基本上是按照Laemmli的方法（Natare227：680-685（1970））在垂直平板凝胶装置上完成。用“样品缓冲液液”处理样品。该样品缓冲由含1.25%SDS和5%2-巯基乙醇的63mMTris-HCl组成，或由63mM Tris-HCl及0.25%NP-40（Nonidet-P40，Sigma Chem.Corp.，st Louis，MO，USA）组成。在本项研究中使用的是9%SDS凝胶和含NP-40的4-20%梯度凝胶，凝胶电泳是以恒定的电压在含有0.04%SDS或0.1NP-40的Tris-甘氨酸缓冲液（pH8.3）中进行。利用考马斯蓝R250或银染色盒（Bio-Red：aboratories，Segrate，Italy）肉眼观察蛋白质带，为了进行免疫分析，基本按照Towbin等人所述的方法（Proc.Natl.Acad Sci.USA76：4350-4354（1979）于50V电压下在2小时内将凝胶电吸印到硝酸纤维素膜上，所不同的是转移缓冲液不含甲醇。用脱脂牛乳封阻膜，然后于室温下与MAb sp-2（10μg/ml）一起保湿2小时。用PBS充分洗膜并按照制造商的说明用Extravidin生物素染色盒（Sigma Chamical Corp.，st.Louis，MO，U.S.A.）染色。
细胞的放射标记和免疫沉淀。为了进行代谢标记，将2×106细胞在含有250μci/ml（35S）甲硫氨酸（比活：1500Ci/mmole;The Rachiochenical Centre，Amershem，U.K.）的DMEM中于37℃保温6小时。按照Iacobelli等人所述的方法（Cancer Ras.46：3005-3010（1986））预先澄清含有放射活性蛋白质的培养液，然后将其与涂覆了MAbsp-2的聚苯乙烯珠一起于4℃保湿16小时。用蒸馏水洗珠后，于50℃用100μl SDS样品缓冲液萃取30分钟。萃取物进行SDS：PAGE，作为对照，将培养液等份试样与已被抗α-胎蛋白的MAb（Sorin Biomedia，Saluggia，Italy）涂覆的聚苯乙烯珠一起保温。通过荧光x射线照相目测（35S）甲硫氨酸标记的蛋白质带。在某些实验中，细胞是在5μg/ml衣霉素（SigmaChemical Corp.，St.Loris，MO，U.S.A）存在下被标记。衣霉素是在加入（35S）甲硫氨酸之前2小时加到细胞中。
90K纯化。（a）CG5组织培养液。使用CellFactory塑料室（Nunc，Roskilde，Denmark）将CG-5细胞（Natoli et al.，Breast Cancer Ras.Treat3：23-32（1983））培养于补充了3%FCS的DMEM中。当细胞开始融合后（5-7天）收集培养液。然后加入新鲜培养基。并在随后3-4天内每隔24小时收集一次培养液。在该条件下产生的90K抗原的浓度范围为100-400单位/ml。合并的培养上清液（10-20升）以4000xg（4℃）离心10分钟，然后用Minitam装置（Millipom Corpp.，Bedford，MA，USA）浓缩10倍，缓慢加入固体硫酸铵至43%饱和，然后于4℃静置过夜，通过10，000xg离心（15分钟，4℃）收集蛋白质沉淀物。在90K活性至少能稳定2个月的条件下于-20℃冷冻保存沉淀物。在（b）人血清。通过以10，000xg离心20分钟澄清采自晚期乳腺癌患者的全血，该全血已通过IRMA滴定至含有高浓度90K，在用PBS按1∶1稀释后，按上面所述对组织培养液那样用硫酸铵分级沉淀。（c）腹水液。该腹水液是通过穿刺术得自晚期卵巢癌患者。该腹水液象上面所述那样通过10，000xg离心20分钟澄清，并用硫酸铵沉淀。
将硫酸铵沉淀物向PBS中充分透析，并加到琼脂糖CL-6B柱（4.2×85cm）上。该主用流速为18ml/小时的PBS-0.5M NaCl（pH8.1）平衡和洗脱。收集5ml级分，通过IRMA检测90K。通过Bradford的方法（Anal.Bvochem.72：248-254（1976））定量分析蛋白质。收集含90K活性的级分，向0.005M磷酸钠缓冲液（pH7.4）中透析后加到用同样缓冲液平衡过的DEAE是纤维素柱（2×8cm）上。用缓冲液充分洗柱，并用渐进的氯化钠梯度（0.062-1.0M）洗脱吸附的蛋白质。收集含90K活性的级分。并按8∶1（样品∶树脂）的体积比与MAb sp-2结合的琼脂糖CL-4B（4mg抗体/ml树脂）混合。MAb sp-2已按Schneider等人的方法（J.Biol.Chem 25）10766-10769（1982））偶联的琼脂糖上。将混合物于4℃过夜旋转。用3M Mgcl2洗脱90K抗原。
密度梯度离心：分离自CG-5组织培养液的90K抗原、乳腺癌患者的血清、或卵巢癌患者的腹水在从亲和基质中解吸之后，在5mlCsCl密度梯度中进行离心。将抗原溶于起始密度为1.4g/ml的CsCl的PBS溶液中，于4℃，在Beckman SW SO.1转子中以145，000xg的速度离心72小时形成梯度。收集级分（0.25ml），用PBS稀释成1∶10并用90KIRMA测定抗原活性。量出每个级分的已知体积来确定其密度。
抗原的生化表征：对置于微量滴定板上的抗原直接进行表征。微量板（Dynatecs）用50μl纯化的90K（100ng/ml0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.0）包被并温育过夜。
（a）化学处理：于4℃进行30分钟甲醇处理。于45℃用6M尿素和6M盐酸胍或1%SDS进行1小时变性。按照Stahl等人的方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73：4045-4049（1976）在暗处用10、20、30、40、50mM NaIO4在乙酸盐缓冲液（50mm，pH4.5）中于室温进行1小时高碘酸氧化。于37℃用二硫苏糖醇（10mm，在50mMTris中，pH8.1）或5%2-巯基乙醇进行1小时还原。于30℃用20mM碘乙酸进行30分钟烷基化。
（b）蛋白水解酶：于37℃，使抗原包被的微量板暴露于50mMTris-2mMCaCl2（pH8.1）中的胰蛋白酶（2mg/ml）、胰凝乳蛋白酶（2mg/ml）或链霉蛋白酶（19mg/ml）下，或暴露于50mM盐酸半脱氨酸（pH6.0）中的木瓜蛋白酶下90分钟。在平行实验中，用相同的蛋白酶消化纯化的90K的等分试样，与相等体积的SDS样品缓冲液混合，并经SDS：PAGE分离，随后进行银染色。
（c）外切糖苷酶：使微量板暴露于50mM乙酸盐缓冲液（pH5.0）中的神经氨酸苷酶、岩藻糖苷酶、α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶，或250mM Tris，176mM CH3COONa，250mM NaCl（pH8.0）中的软骨素酶ABC下。于37℃温育90分钟，选择外切糖苷酶的浓度以确保低聚糖残基的完全消化。在单独的实验中检验这种酶，其中发现合适的底物被完全水解，如通过薄层层析法所检测到的。
处理后，用1%的明胶的PBS溶液洗涤并封闭微量板。将50μl（125I）标记的MAb sp-2（约为50，000cpm）加入到每个孔中并于37℃温育1小时，用PBS洗3次之后，用γ计数器计算结合放射性。对照孔是在相同的条件下与稀释缓冲液一起温育。
氨基酸分析：在还原条件下用Minigel仪器对纯化的90K进行9%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白质电吸到聚偏二氟乙烯膜（Immobilon;Millipore Corp.，Bedford，MA，USA）上，用酰胺黑10B（Sigma Chem CO.，St.Louis，MO）染色，并切下条带。为了进行氨基酸分析，总共大约50ug90K（由染色强度判断）的3-4个条带在真空下，在6N HCl中，于110℃水解22小时。水解后，在Beckman分析仪上，利用pH梯度系统分析氨基酸（Hirs，C.H.W.In：Mettwds of Enzymol 91：3-8，Academic Press，New York，New York，USA（1983））。
结果
90K抗原的纯化：
用于从CG-5组织培养液分离90K抗原，从乳腺癌患者分离血清，和从卵巢癌患者分离腹水的纯化过程总结于表Ⅰ中。在纯化的每一步，测定总蛋白质，并通过IRMA确定抗原的数量，实际上在43%硫酸铵沉淀物中回收到90K的全部活性，结果大约浓缩4倍。这一步除去了存在于最初制品中的绝大多数白蛋白。接着用SepharoseCL-6B柱对硫酸铵沉淀的抗原进行大小排阻色谱（图2）。所有三种来源的90K均见于柱的空体积之后立刻洗脱出的大峰中，这意味着它是一个高分子量复合物。可能是由于产物的降解使观察到与此不一致的低分子量的较小的反应性峰。在洗脱结束时看到的低分子量蛋白质是无反应活性的。
在进行色谱之前用6M尿素或6M盐酸胍处理样品产生相同的洗脱分布图（未示出）。高分子量峰（相应于图2的级分21-28）经DEAE纤维素色谱法进一步纯化。得自三个不同来源的每一个的90K抗原在0.25M的NaCl浓度下从柱洗脱下来。
通过在与MAb SP-2偶联的SepharoseCL-4B上的免疫亲和法完成最终的纯化。用3M MgCl2洗脱结合活性，所用的其它洗脱缓冲液，如甘氨酸（pH2.4），1M NaOH（pH11.2），和3M KSCN在抗原洗脱中不太有效。基于比活性（单位/μg蛋白）得自CG-5组织培养液的90K抗原，得自乳腺癌患者的血清，和得自卵巢癌患者的腹水的纯化分别是84，300，52，277和83，380倍。通过在3M MgCl2洗脱物（用IRMA从亲和基质中洗脱出来）中测定90K免疫反应性并将SDS：PAFE凝胶上90K条带的银染色强度与已知浓度的BSA标准品比较来确定蛋白质的量计算这些比活性。
经密度梯度离心分析纯化的90K：对已从MAb SP-2亲和基质中解吸的抗原样品进行密度梯度离心。这一步没有揭示得自三个不同来源的抗原的不同的平均浮力密度。浮力密度的变化范围为1.28g/ml-1.31g/ml（图3）。此外，来自乳腺癌患者的未分级分离的血清中的90K抗原产生基本相同的密度轮廓，这表明经本发明的纯化过程分离出的90K抗原不代表原始抗原的亚型。
从不同来源分离的90K抗原的PAGE和免疫吸印分析：与以前的数据（Iacobelle et al，CancerRes.46：3005-3010（1986））一致，如SDS：PAGE所示（图4A）释放到（35S）蛋氨酸标记的CG-5细胞和其它乳腺癌细胞系的组织培养液中的90K抗原以一个单一条带迁移，其表观分子量约为95，000道尔顿。（35S）蛋氨酸标记的抗原迁移率在还原或非还原条件下（有或没有2-巯基乙醇）是相同的（图4A，泳道a对泳道d），这表明该蛋白不含链间二硫键。再者，CG-5细胞在用（35S）蛋氨酸标记前用衣霉素处理没有改变细胞培养液中90K抗原的电泳迁移率（图4A，泳道C）。
图4B比较了由CG-5组织培养液、乳腺癌患者的血清和卵巢癌患者的腹水纯化的90K在SDS：PAGE上的电泳迁移率。对蛋白质的银染色清楚地显示出表观分子量约为95，000道尔顿的主带。90K条带也被考马斯蓝而不被高碘酸-席夫碳水化合物染色剂染色（未示出数据）。通过银染色检测到的纯化的来自乳腺癌患者血清的95K抗原和通过荧光仪检测到的来自CG-5培养液的（35S）蛋氨酸标记的免疫沉淀物共同电泳显示出可重叠的95K条带（未示出数据）。
对从含有0.25%NP-40，但不含SDS的4-20%聚丙烯酰胺凝胶转移的纯化的90K抗原的Western吸印分析表明存在相似的免疫反应性扩散带，全部三个来源的迁移率相似（图5），相比之下，从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移的90K抗原的免疫吸印呈现很低的MAb SP-2免疫反应性（未示出数据）。这些数据与sepharose CL-6B洗脱轮廓相关（图2）且表明从不同来源分离的天然90K抗原以高分子量复合物存在，该复合物很可能由Mr95，000亚单位组成。
90K的氨基酸分析：表4从CG-5组织培养液、乳腺癌患者的血清、和卵巢癌患者的腹水中缓化的90K抗原具有相似的氨基酸组成，该抗原富含谷氨酸/谷氨酰胺、丝氨酸、和亮氨酸。而且，头20个氨基酸的NH2末端序列揭示从三个不同来源得到的抗原之间强烈的相似性。这一序列未见于几个蛋白数据库如Genebank和EMBL。
90K抗原决定簇的性质：利用几种化学和酶促处理研究了90K抗原上所携带的抗原决定簇的生化性质。如表2所示，暴露于甲醇中与暴露于6M盐酸胍、6M尿素、1%SDS、冻干和加热一样大大降低了90K抗原决定簇的免疫反应性。无论是用二硫苏糖醇和2-巯基乙醇还原，还是用碘乙酰胺烷基化或者用非离子除垢剂NP-40，吐温20，和Triton X-100（Sigma Chem.CO.St.Louis，MO）处理都未明显影响90K的免疫反应性。暴露于偏高碘酸钠中在高浓度（50mm）下只具有边缘效应。
为了研究90K抗原对蛋白酶的敏感性，将纯化的90K与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶，或木瓜蛋白酶一起温育，然后用SDS：PAGE进行分析，接着进行银染色。如图6A所示，所有受试蛋白酶看来都能完全消化90K。剩余SP-2抗体结合的分析进一步证实了暴露于链霉蛋白酶或木瓜蛋白酶之后90K的初始活性丧失了80%以上，而用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化看来不太有效（图6B）。
用外切糖苷酶处理未影响90K的免疫反应性（图6B）。实际上，在用神经氨酸苷酶和β-半乳糖苷酶处理之后固定化抗原结合（125I）标记的MAb SP-2的能力有所增加。这表明末端碳水化合物部分的去除可增加MAb SP-2的能力有所增加。这表明末端碳水化合物部分的去除可增加MAb SP-2进入90K抗原决定簇。
讨论
MAb SP-2与抗原决定簇反应，根据该抗原的表观分子量为95，000道尔顿已将它命名为90K抗原（Iacobelli et al.，Cancer Res.46：300-3010（1986））。这里，我们已经描述了来自CG-5培养液、乳腺癌病人的血清，和卵巢癌患者的腹水的90K抗原的纯化。我们已经发现得自这些不同来源的天然90K以高分子量复合物存在，经SDS：PAGE分析该复合物易于离解成一个单个的90，000道尔顿种类。这表明该天然蛋白质代表一种由几个90，000道尔顿的基本亚单位组成的低聚物。有趣的是，得自这三个不同来源的90K抗原在大小排阻和离子交换色谱，PAGE和Western吸印分析，以及浮力密度超速离心上表现出相似的特性。而且，从这三个来源的每一个分离出的抗原具有相似的氨基酸组成和NH2末端氨基酸序列。这表明从所建立的长期癌细胞系和直接从癌症患者的血清或腹水中得到的90K抗原具有非常相似的物理化学和免疫化学特性。
为了进一步抗清由MAb S-2所识别的决定簇的性质对90K抗原进行了化学和物理处理。用蛋白酶消化90K抗原显著降低了抗体结合，从而证实了该抗原的肽部分包括在该决定簇中，而且，已知可使多数蛋白变性的处理也大大降低了抗体结合，从而进一步证实了MAb SP-2与构象肽决定簇结合。此外，经SDS：PAGE该抗原的低聚物结构离解成亚单位导致SP-2结合活性几乎全部丧失。这些结果有力地表明MAb SP-2限定的决定簇实际上是蛋白质并且抗体结合取决于整个抗原分子构象的完整性。然而，这不是90K抗原的唯一特性，因为其它肿瘤相关抗原决定簇，如那些被MAbOC125所识别的决定簇（Daviss et al.，Cancer Res.46：6143-6148（1986）），B72.3（Johnson etal.，Cancer Res.46：850-875（1986）），和C3（Zhang et al.，Cancer Res.49：6628-6628（1989）），看来至少部分是由构象依赖性肽所组成。
以前曾报道过许多肿瘤相关抗原，这些抗原在乳腺癌患者的血清中浓度升高。它们包括一系列与人乳脂“球”膜家系有关的抗原（Burchell et al.，Int.J.Cancer 34：763-768（1984）;Papsidero et al.，Cancer Res.44：4653-4657（1984）;Linsley et al.，Cancer Res.46：5444-5450（1986）;Kufeet al.，Hybridoma ＃：223-232（1984）;Hilkens et al.，InProtides of the BiologicalFlrids，（Peeters，H.，（ed.）），pp.651-653，Pergamon Press，Oxford，U.K.（1984）;Bray et al.，Cancer Res.47：5853-5860（1987）;Hilkens et al.，In：Monoclonal Antibodies and Breast Cancer，（Ceriani，R.L.（ed.）），pp.28-42，Martinus Nijhoff，Boston MA，U.S.A.（1985）;Linsley et al.，Cancer Res.48：2138-2148（1988）），TAG72which is recognized by MAb B72.3（Gero et al.，J.Chin.Lab.Anal.3：360-369（1989）），and MCA which is recognized by MAb 12（Bombardieri et al.，Cancer 63：490-495（1989））。这些抗原的生化表征已表明所有这些抗原都是大量糖基化的、高分子量的糖蛋白，它们具有类似粘蛋白的特性，在肿瘤细胞的表面得以表达并由肿瘤细胞分泌出来。这些抗原与90K比较显示出90K抗原是与前述抗原完全不同的。这一结论得到这样一个事实的支持，即它的电泳迁移率不受神经氨酸苷酶消化的影响，这表明它是一种缺乏粘蛋白所特有的O-配糖键连接的低聚糖（未示出数据）（Gahmberg et al.，Eur.I.Bilchem 122：581-586（1982）的非唾液酸化分子。
已经描述了其它肿瘤相关抗原，它们在SDS：PAGE中以Mr90，000道尔顿的分子迁移。我们已将这些抗原与90K抗原区别开。由MAb B6.2所识别的抗原（Kufe at al.，Cancer Res.43：851-857（1983））;Schlon et al.，Cancer 54：2777-2794（1984））是一种细胞表面糖蛋白并且与90K不同，它被高度限于乳腺癌细胞中。被称为p97，gp87，或gp95的黑素瘤相关抗原（Brown et al.，J.Immunol 127：539-546（1981），Dippold et al.，Proc Natl Acad Sci.USA77：6114-6118（1980）;Liao et al.，J.Cell.Biochem 27：303-316（1985）是一种结构上与转铁蛋白相关的膜蛋白（Brown et al.，Nature 296：171-173（1982））。另一种黑素瘤抗原，FD也是一种其表达仅限于极少数细胞中的表面糖蛋白（Mattes et al.，Cancer Res.47：6614-6619（1987））。最后，被MAb3G2-C6所限定的抗原（Zhang et al.，Cancer Res 49：6621-6628（1989））是一种可在大量膀胱癌中，且仅在乳腺癌的边缘被表达的表面组分（Young et al.，Cancrer Res 45：4439-4446（1985））。
实施例2
90K基因的克隆
90K抗原的末端序列分析表明了下列氨基酸序列（SED ID NO：3）：Val Asn Asp Gly Asp Met Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ala Thr Asn Gln Gly Arg Val Glu Ile phe。基于这一氨基酸序列，根据密码子使用频率（Lathe，J.Mol.Biol.183：1-12（1985）），利用氨基末端序列：VNDGDM（S）LADGGATNQGRVEIF（SEQ ID NO：4）设计了66个核苷酸的“推测物（guessmer）”。所用的核苷酸序列（SEQ NO：5）如下：
5′GTG AAT GAT GGC GAC ATG TCC CTG
GCT GAT GGC GGC GCC ACC AAC CAG
GGC CGG GTG GAG ATC TTC 3′
推测物或核酸探针末编被32P标记，用于筛选由MCF7poly A+RNA制备的λgt10库（复杂性：5×105）。在克隆鉴定中的核酸杂交技术可参见Maniatis et al.，和Sambrook et al的文章（both entitled：MolecrlarCloning，A Laboratory Manral，Cold Spring Marbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York（1982 and 1989，respectively））以及Hames et al.的文章（Nucleic Arid Hybriclization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，D.C.（1985）），这些参考文献合并于本文中。
分离出包括约1，200bp和约900bp两个EcoRI插入子的阳性菌体。然后，利用EcoRI部分插入子克隆完整的插入子。将该DNA片段克隆到BluescriptR质粒（Stratagene，La Jolla，（A）中。插入子大小约为2，206个核苷酸。
按照Sanger等人的方法（Proc.Natl.Acad Sci USA 74：5463（1977））和Maxam等人的方法（Proc.Natl.Acad Sci USSA74：560（1977）进行原始克隆和亚克隆的序列分析。
分析结果表明该蛋白质序列是585个氨基酸，1，755个核苷酸。发现了131个核苷酸的前导序列和320个核苷酸的3′尾部序列。图1中给出了完整的核苷酸和设计的氨基酸序列（分别为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）。来自肿瘤和正常组织的RNA的Northern吸印分析结果列于表3中。
实施例3
90K抗原的细胞培养和稳定表达
材料和方法
IR-95表达质粒的构建：利用标准方法，将2147bp Cla I/xho IcDNA片段亚克隆到真核、依靠细胞肥大病毒启动子的表达载体（pCMVNEO-IR95）中（图8），该表达载体分别含有用于扩增和选择的小鼠二氢叶酸还原酶（DHFR）CDNA的表达单位和细菌新霉素磷酸转移酶（neo）基因的表达单位。
细胞培养：在CO2增湿温育器内，在添加有3%FCS，2mM L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640（GIBCO，Gaithersburg，MD）中培养人BT-20乳腺癌细胞（美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA，保藏号HTB19）。在电击pCMVNEO-IR95质粒之后，在相同的培养基中进行新霉素抗性的选择。
电击：呈指数生长的BT20细胞用PBS洗两次，经胰酶消化收集并使之沉淀。沉淀物用PBS洗三次。将细胞以约5×106细胞/ml的浓度重新悬浮于PBS中。用基因脉冲发生器转染装置（Bio-Rad Laboratories，Segrate，Italy）进行电击。为了稳定表达，在电击容器中将0.8ml细胞悬浮液与20μg线性化质粒DNA和50μg剪切的鲑精子DNA混合。在室温下，从500μF电容器中释放出递增场强度（240-270V）的单脉冲。在该脉冲和于冰上温育10分钟之后，将细胞转移到如上的非选择性培养基中。在模拟电击过程中用锥虫蓝排阻试验检测在电击后10分钟时细胞的存活率。
选择和扩增：电击后两天，将细胞移到含有400μg/ml Geneticin（G418，GIBCO，Gaithersburg，MD）的选择性培养基中，用凡士林密封底部的金属克隆圆筒挑选克隆。在含有3%FCS，谷氨酰胺（2mM）和抗生素及氨甲蝶呤（Sigma Chemical CO.，St.Louis MO，USA）r α-MEW（GIBCO，Cat.＃072-019OOA）中，以10和50μM的浓度在12孔集簇板（Costar，Canbridge，MA）中扩充和培养这些克隆。在氨甲蝶呤选择之后，在添加有3%FCS，2mM谷氨酰胺，50μg/ml庆大霉素和1μM氨甲蝶呤的DMEW高葡萄糖（GIBCO，Gaithersburg，MD）中培养细胞。
（35S）蛋氨酸标记和免疫沉淀：在6孔集簇板（Nunc）中接近融合的细胞用1ml PBS洗两次并在1ml无蛋氨酸的DMEM/含50μCi（1Ci＝37GBq）（35S）蛋氨酸的0.5%ULTROSOR-G中培养过夜。为进行免疫沉淀，将条件培养基短暂旋转并与1μg/ml抑肽酶和1μg/ml leupepptin混合。蛋白A-Sephharose（pharmacia，Upppsala，Sweden）用PBS洗三次，将30μl（1∶1）悬浮液与2μg的MAb SP-2混合并在室温下温育30分钟。蛋白A-Sepharose-SP-2复合物用HNTG缓冲液（20mMHEPES，pH7.5/150mM Na-Cl/10%甘油/0.1%Triton X-100）洗三次并于4℃与条件培养基一起温育2小时。蛋白A-Sepharose珠粒用HNTG缓冲液洗三次。将湿珠粒悬浮于30μl 1×SDS凝胶填充缓冲液中，于100℃煮沸3分钟并在冰上立即冷却。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质并用放射自显影进行分析。
结果
为了表达该蛋白质，将编码整个585个氨基酸多肽的cDNA置于细胞肥大病毒早期启动子的转录控制之下。此外，表达载体含有neo抗性基因，该基因赋予对氨基葡糖苷抗生素G418的细胞抗性，因此便于初级转染体的选择。该载体还含有氨甲蝶呤抗性DHFR基因，利用该基因选择含有扩增的转染DNA序列的细胞。包括复制起点和氨苄青霉素抗性基因的细菌质粒序列允许整个表达质粒在大肠杆菌中复制。图9示出了前三个稳定的克隆的免疫沉淀物的放射自显影照片。
实施例4
90K抗原的瞬时表达
材料和方法
表达质粒的构建：利用标准方法（Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，and Edition，Cold Sring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA（1989）Vols.1-3），通过将2147bp Cla（在Bluescript Ⅱ KS的726位）-xho（在图1中2118位）限制片段引入到真核、依靠细胞肥大病毒启动子的表达载体pCMV中来构建表达质粒（图7）。
瞬时表达：在含有10%FCS和抗生素的DMEM中培养人胚肾293成纤维细胞（美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA，保藏号CRL1573）。
在转染前一天，将2×105细胞置于6孔平皿的每一孔中。按照Chen and Okayama Mol Cell Biol 7：2745-2752（1987）的方案进行转染。每孔总共含4μgCsCl梯度纯化的质粒DNA。加入沉淀物16小时后，用DMEM洗涤细胞一次，并加入新鲜的生长培养基。
代谢标记：为进行代谢标记，在含有1%经透析的FCS的无蛋氨酸DMEM（0.5ml/孔）中将细胞与（35S）蛋氨酸（50μci/ml）一起培养过夜。
衣霉素处理：
为阻断蛋白质N-配糖键的形成，将衣霉素加到培养基中，历时16小时，其终浓度为0.1-1.0μg/ml。
细胞溶解和免疫沉淀：用含有50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，1mM EGTA，10%甘油，1%Triton X-100，2mM苯甲磺酰氟（PMSF），200单位/ml抑肽酶，10mM焦磷酸钠，和10μg/ml leupeptin的0.3ml溶解缓冲液在冰上使细胞溶解。将溶胞产物转移到微量离心管中，涡动10秒钟，通过在4℃下以12，500rpm的速度离心15分钟进行预纯化。
为进行免疫沉淀，将10μl蛋白A-Sepharose（在20mM HEPES，pH7.5中溶胀和预洗）和1μg MAb SP-2加入到经纯化的溶胞产物中并于4℃温育3小时。在加入抑肽酶（200单位/ml）和PMSF（2mM终浓度）并经离心预纯化之后用条件培养基进行免疫沉淀。沉淀物用1ml洗涤缓冲液（含有0.1%Triton X-100的溶解缓冲液）洗三次。加入SDS样品缓冲液，煮沸样品并将其载于SDS-PAGE上以分离沉淀的蛋白质。
结果
将转化的293细胞系的细胞置于6孔平皿上并用如上所述的CMV-表达构建物转染（图10，泳道1-8）。用无插入子的质粒pCMV转染对照细胞（图10，泳道7和8）。
在细胞溶解前16小时，用含有50μCi/ml（35S）蛋氨酸的标记培养基更换生长培养基。在同样的温育时间内加入衣霉素，终浓度为0.1μg/ml（图10，泳道3和4）或1.0μg/ml（图10：泳道5和6）。
溶胞产物（L）和条件培养基（M）均用于用MAb SP-2进行的免疫沉淀。在8.5%SDS-PAGE上分离沉淀的蛋白质。图10示出了干燥的凝胶暴露20小时后的放射自显影照片。
用MAb SP-2从条件培养基免疫沉淀5型腺病毒-（Ad5）转化的细胞系293在95Kd时呈现单个条带（泳道8）。相应的信号在溶胞产物的免疫沉淀物中是不可检测的。
使用条件培养基，瞬时表达细胞（用携带cDNA插入子的CMV表达质粒转染的细胞）使得95K条带的信号强度增加几倍（图10：泳道2）同时，约77kd的蛋白质可在相应的溶胞产物的免疫沉淀物中检测到（图10：泳道1）用衣霉素处理瞬时表达细胞降低了95Kd蛋白质（泳道4和6）及77kd蛋白质（泳道3和5）二者的信号强度。衣霉素效应是剂量依赖性的。
实施例5
IR-95的纯化
用下述亲硫琼脂糖色谱法纯化IR-95。
材料
亲硫Sepharose（AFFI-T）
金属螯合Sepharose
蛋白A-Sepharose
硫酸铵
硫酸钠
硫酸铜
甘氨酸
无水磷酸二氢钠，
氯化钾
氯化钠
Hank氏平衡盐溶液（GIBCO）
缓冲液
1.缓冲液A：1升;氯化钠13克，氯化钾0.2克，无水磷酸二氢钠1.6克，硫酸钠0.5M和EDTA1mM，将缓冲液的pH滴定到8.2。
2.缓冲液B：1升;氯化钠13克，氯化钾0.2克，无水磷酸二氢钠1.6克，硫酸钠0.3M和EDTA1mM，将缓冲液的pH滴定到8.2。
3.缓冲液C：1升;氯化钠13克，氯化钾0.2克，无水磷酸二氢钠1.6克，和EDTA1mM，将缓冲液的pH滴定到8.2。
4.缓冲液D：1升;无水磷酸二氢钠7.098克和氯化钠5.8g，将缓冲液的pH滴定到8。
5.缓冲液E：1升;无水磷酸二氢钠7.098克，甘氨酸100mM和氯化钠5.8克，将缓冲液的pH滴定到8。
步骤1：亲硫Sepharose色谱法
亲硫Sepharose色谱法由以下步骤所组成：
A.硫酸铵沉淀：在空心纤维超滤柱体（40KD Nunc）上使预澄清的条件培养基浓缩10倍。用固体硫酸铵沉淀浓缩的培养基至42%饱和度（假定在533克/升时达最大饱和度）。缓慢加入硫酸铵并用稀氢氧化钠将pH滴回到大约8.0。搅拌溶液过夜。
若不浓缩条件培养基，则应用固体硫酸铵进行沉淀达42%饱和度。
B.离心：在GS3转子（Sorvall）中以8000rpm的速度离心硫酸铵沉淀物。弃去上清液并以10缓体积将沉淀物溶于缓冲液A中。
C.亲硫Sepharose分批洗脱：利用轻度抽吸在烧结玻璃板漏斗上用水彻底洗涤所需体积的亲硫Sepharose（Kem-En-Tec，Copenhagen，Denmark）（除去叠氮化钠）。吸出基质中的空气直到在床中出现裂纹。然后使5床体积的缓冲液A通过柱同时用玻璃棒轻度搅拌以消除基质中的残存空气。在轻度抽吸条件下使得自前一步骤的蛋白溶液通过基质而不使之干燥。使该蛋白溶液再循环三次。在不是搅拌条件下用50-100床体积的缓冲液A洗涤基质。然后在不时搅拌下用50-100床体积的缓冲液B洗涤基质而使之不干燥，用10床体积的缓冲液C洗脱亲硫Seharose，每次加1床体积，最后用无菌水洗。加入最后床体积之后，抽吸基质至干。
收集洗脱物，用70%硫酸铵沉淀并在冷室内搅拌至少4小时。以10000rpm离心收集沉淀物，并将沉淀物溶于缓冲液D中。
D.透析：在冷室内将蛋白溶液对缓冲液D透析至少4小时，更换两次缓冲液。
步骤2：金属螯合色谱法
金属螯合色谱法如下所述进行：
平衡和柱洗脱：在重力下将金属螯合Sepharose（pharmacia）填入玻璃柱中至4ml的填充体积。用水彻底洗涤基质以除去乙醇。使硫酸铜溶液（10mg/ml）流经基质。在正常情况下10ml硫酸铜溶液足够装载基质。用10-20柱体积的水再次洗涤基质以除去过量的硫酸铜。然后用10柱体积的缓冲液E洗涤并用20柱体积的缓冲液D平衡基质。
以10000rpm离心透析过的蛋白溶液以除去凝固蛋白。用平衡缓冲液将蛋白溶液稀释5倍并使之流经基质两次。用50柱体积的平衡缓冲液洗涤基质并利用缓冲液D和缓冲液E各20柱体积的线性梯度以1ml/分钟的流速洗脱蛋白质。在正常情况下，该蛋白在第二个峰中从柱上洗脱下来。收集活性级分并在Centricon-30上浓缩。经免疫沉淀检验纯化蛋白质的活性。
步骤3：免疫沉淀
检验纯化蛋白质被SP-2单克隆抗体免疫沉淀的能力。通过短暂旋转和抽气，用1ml缓冲液C洗涤50μl蛋白A-Sepharose的1∶1悬浮液三次。在冷室中将2μgSP-2MAb加蛋白质样品旋转2小时。通过反复离心和抽气，用1ml缓冲液C洗涤珠粒三次。最后，吸出珠粒中的空气且将湿珠粒溶解在1倍Laemeli缓冲液中并进行电泳。
步骤4：储藏
缓冲交换纯化的蛋白质，用Centricon-30与Hank氏平衡盐溶液一起缩至2-3mg/ml且与1体积2M葡萄糖混合，然后在-20℃下冷冻。
实施例6
天然杀伤（NK）和淋巴激活素活化的杀伤
（LAK）细胞活性的增强
在通过使单核细胞粘附于塑料表面（45分钟，37℃）而使之部分减少之后，通过Ficoll-Hypaque梯度离心从新鲜肝素化血中分离外周血单核细胞（PBL）。在添加有10%热失活胎牛血清和抗生素的RMPI-1640培养基中培养PBL，浓度为2×106细胞/ml。以不同的浓度（50ng/ml-2000ng/ml）加入纯化的IR-95，用时16小时。作为对照，在没有IR-95的情况下，在同样的培养条件下将PBL温育同样长的时间。温育结束时，洗涤细胞并在短期（4小时）41Cr-释放细胞毒性测定中（Coligan，J.E.et al.，Current Protocols in Immunology，Green Publishing Asssociates and Wiley Interscience，New York（1992））作为对抗靶细胞的效应细胞进行测试即在效应细胞与靶细胞之比为1∶40时测试K562细胞的NK活性和Daudi细胞的LAK活性。数据点是一式五份进行的5个不同实验的平均值。自发的51Cr-释放在所有情况下总计15%。以500-2000ng/ml的浓度加入IR-9516小时可显著提高NK和LAK细胞毒性活性（图11）。
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的技术水平。如同每一单独的出版物或专利申请被特别分别指明作为参考文献一样，所有出版物和专利申请均作为参考文献合并于此。
虽然前面已通过说明和实施例较为详细地描述了本发明以便于清楚地理解，但显然在所附权利要求书的范围内可进行某些变化和改进。为实施本发明做出上述方式的对本领域的技术人员是显而易见的改进，如在药物、免疫学、杂交瘤技术、药理学领域和/或相关的领域中的改进均包括在下列权利要求书的范围之内。
表1
90K抗原的纯化
表2
化学和物理处理对90K活性的影响
表3
肿瘤和正常组织中的RNA的Northern吸印分析
表4
90K抗原的氨基酸组成
表5
血清IR-95水平在不同病理状况中的分布
通过用mAb SP-2作为涂层抗体的固相酶联免疫吸附方法确定循环血清IR-95浓度（单位/ml）。大于1.75单位/ml（正常均值+/-2SD）被确定为阳性。IR-95的血清水平不受性别和血型影响。从Chieti大学医院中患下列疾病的患者中得到总共241个血清样品：乙型肝炎病毒感染（69例），E-B病毒感染（21例），自身免疫病（15例类风湿性关节炎，7例系统性红斑狼疮，6例自身免疫眼色素层炎），血液透析（19例），唐氏先天愚（12例）。此外，从18位处于不同妊娠期的妇女和29位年龄在85岁以上外表健康的受试者中获得血清样品。
血清IR-95的截止值为1.7单位/ml（均值+/-2SD）。
不同组受试者的所有均值都明显大于健康对照的均值（p＝0.0001，方差分析）。
序列一览表
(1）一般性信息：
（ⅰ）申请人：Ullrich,Axel
Sures,Irmingard
Azam,Mohammad
(ⅱ)发明名称：90K肿瘤相关抗原IR－95的基因序列
(ⅲ)序列数目：5
(ⅳ)通讯地址：
(A)地址： Sterne,Kessler,Goldstein & Fox
(B)街道：1225 Connecricut Avenue
(C)城市： Washington
(D)州： D.C.
(E）国家:U.S.A.
(F)邮政编码：20036
（ⅴ）计算机上可读出的表格：
（A）介质类型：Floppy 软盘
（B）计算机：IBM PC兼容制的
（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS
（D）软件：PatentIn Release # 1.0,Version # 1.25
(ⅵ)本申请的数据：
（A）申请号：US （被转让）
（B）申请日：
（C）分类：
（ⅶ）以前申请的数据：
（A）申请号：IT RM 92A000100
(B)申请日：17－FEB-1992
(ⅸ)电信信息：
（A）电话：（202）466－0800
（B）传真：（202）833－8716
（2）SEQ ID NO:1的信息：
（ⅰ）序列特点：
（A）长度：2206碱基对
（B）类型：核酸
（C）成股性：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅸ）特征：
（A）名称／符号：CDS
（B）定位：132..1886
（ⅹⅰ）序列描述：
Gly Arg Val Glu Ile Phe
20
(2)SEQ ID NO:4的信息：
（ⅰ）序列特点：
（A）长度：22个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）扑学：线性
（ⅹⅰ）序列描述： SEQ ID NO:4:
(2)SEQ ID NO:5的信息：
（ⅰ）序列特点：
（A）长度：66个碱基对
（B）类型：核酸
（C）成股性：单股
（D）扑学：线性
（ⅹⅰ）序列描述 :SEQ ID NO:5:
Claims (16)
1、编码IR-95多肽的DNA片段。
2、根据权利要求1的DNA片段，其中该DNA片段具有在SEQ ID NO：1中所述的序列，该序列编码在SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列。
3、根据权利要求1的DNA片段，其中该DNA片段具有在SEQ ID NO：1中所述的序列。
4、根据权利要求1的DNA片段，其中该DNA片段编码在SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列。
5、根据权利要求1的DNA片段，其中所述的IR-95具有在SEQ ID NO：3中所述的末端氨基酸序列。
6、重组DNA分子，该分子从5′至3′包括可在宿主细胞中有效地启动转录的启动子和权利要求1所述的DNA片段。
7、含有权利要求6所述的DNA分子的细胞。
8、重组DNA分子，该分子包括载体和权利要求1所述的DNA片段。
9、根据权利要求8的重组DNA分子，其中所述的载体是表达载体。
10、含有权利要求9所述的DNA分子的细胞。
11、含有权利要求10所述的DNA分子的细胞。
12、一种生产IR-95或其片段的方法，包括：
（a）提供一种包括编码所述IR-95或其片段的可表达序列的DNA分子;
（b）用所述的DNA分子转化宿主;
（c）在所述宿主中表达所述IR-95或所述DNA分子的片段序列;和
（d）分离所述的IR-95或其片段，其通过所述表达产生。
13、根据权利要求12的方法，其中所述DNA分子具有如在SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，该序列可编码在SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列。
14、根据权利要求12的方法，其中所述DNA分子具有如在SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。
15、根据权利要求12的方法，其中所述DNA分子可编码在SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列。
16、根据权利要求12的方法，其中所述DNA分子可编码IR-95，IR095具有在SEQ ID NO：3中所述的末端氨基酸序列。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM92A000100 | 1992-02-17 | ||
| ITRM920100A IT1254309B (it) | 1992-02-17 | 1992-02-17 | Sequenze genetiche per l'antigene 90k associato a tumori. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1076489A true CN1076489A (zh) | 1993-09-22 |
Family
ID=11400692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN93101805A Pending CN1076489A (zh) | 1992-02-17 | 1993-02-17 | 90k肿瘤相关抗原ir-95的遗传序列 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1076489A (zh) |
| AU (1) | AU3497893A (zh) |
| IT (1) | IT1254309B (zh) |
| WO (1) | WO1993016180A2 (zh) |
| ZA (1) | ZA931101B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101962405A (zh) * | 2010-09-30 | 2011-02-02 | 南开大学 | 一种人源乳腺癌抗原及其抗体 |
| CN110455848A (zh) * | 2018-05-08 | 2019-11-15 | 国家纳米科学中心 | 基于络合反应放大信号的铁离子纵向弛豫时间传感器及其构建方法、用途 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU1049895A (en) * | 1993-11-05 | 1995-05-23 | New York University | Methods relating to ir-95 |
| ATE402258T1 (de) * | 2000-01-10 | 2008-08-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Gene differentiell experimiert in brudtkrebs |
| US7081517B2 (en) | 2000-01-10 | 2006-07-25 | Chiron Corporation | Genes differentially expressed in breast cancer |
| AU3483001A (en) * | 2000-02-04 | 2001-08-14 | Corixa Corp | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
| ITRM20090081A1 (it) * | 2009-02-25 | 2010-08-26 | Stefano Iacobelli | Uso di inibitori della proteina 90k per la preparazione di un medicamento per la cura o prevenzione dei tumori. |
| WO2020099235A1 (en) | 2018-11-12 | 2020-05-22 | Mediapharma S.R.L. | Bispecific antibodies directed against human 90k and either endosialin or her3 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL76877A (en) * | 1984-11-02 | 1991-11-21 | Oncogen | Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies |
| IT1239719B (it) * | 1990-04-23 | 1993-11-15 | Univ Degli Studi Annunzio | Uso dell'anticorpo monoclonale sp-2 nella diagnostica clinica ed il monitoraggio del progredire dell'infezione hiv |
-
1992
- 1992-02-17 IT ITRM920100A patent/IT1254309B/it active
-
1993
- 1993-02-17 ZA ZA931101A patent/ZA931101B/xx unknown
- 1993-02-17 CN CN93101805A patent/CN1076489A/zh active Pending
- 1993-02-17 AU AU34978/93A patent/AU3497893A/en not_active Abandoned
- 1993-02-17 WO PCT/EP1993/000382 patent/WO1993016180A2/en active Application Filing
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101962405A (zh) * | 2010-09-30 | 2011-02-02 | 南开大学 | 一种人源乳腺癌抗原及其抗体 |
| CN110455848A (zh) * | 2018-05-08 | 2019-11-15 | 国家纳米科学中心 | 基于络合反应放大信号的铁离子纵向弛豫时间传感器及其构建方法、用途 |
| CN110455848B (zh) * | 2018-05-08 | 2024-02-23 | 国家纳米科学中心 | 基于络合反应放大信号的铁离子纵向弛豫时间传感器及其构建方法、用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA931101B (en) | 1994-08-17 |
| ITRM920100A0 (it) | 1992-02-17 |
| IT1254309B (it) | 1995-09-14 |
| ITRM920100A1 (it) | 1993-08-17 |
| AU3497893A (en) | 1993-09-03 |
| WO1993016180A3 (en) | 1993-09-30 |
| WO1993016180A2 (en) | 1993-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1076489A (zh) | 90k肿瘤相关抗原ir-95的遗传序列 | |
| CN1076629A (zh) | 90k肿瘤相关抗原ir-95的遗传序列 | |
| CN1190491C (zh) | Prv－1基因及其应用 | |
| CN1321673A (zh) | 一种新的多肽——人红细胞内收蛋白alpha亚基11和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1315389A (zh) | 一种新的多肽——人铁硫蛋白12和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1315433A (zh) | 一种新的多肽——人细胞分化转录因子58和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1327996A (zh) | 一种新的多肽——锌指蛋白34和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1328017A (zh) | 一种新的多肽——人含细胞色素c结构域的tnfr/ngfr蛋白12和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1315393A (zh) | 一种新的多肽——人核糖体s11蛋白12和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1314399A (zh) | 一种新的多肽——人调控转录因子14和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1315444A (zh) | 一种新的多肽——人间隙连接蛋白10和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1322749A (zh) | 一种新的多肽——人核糖体蛋白s18－12和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1322750A (zh) | 一种新的多肽——人核糖体蛋白s18－14和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1315445A (zh) | 一种新的多肽——人间隙连接蛋白8和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1345787A (zh) | 一种新的多肽——人鸟嘌呤互转因子12.65和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1315349A (zh) | 一种新的多肽——人核糖体蛋白s4－12和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1315404A (zh) | 一种新的多肽——人核糖体蛋白s18－18和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1322741A (zh) | 一种新的多肽——人核糖体蛋白s18－26和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1321681A (zh) | 一种新的多肽——人Pax蛋白11.3和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1322742A (zh) | 一种新的多肽——人核糖体蛋白s4－36和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1314406A (zh) | 一种新的多肽——人核糖体蛋白s4－9和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1351065A (zh) | 一种新的多肽——人铁硫蛋白9.9和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1363557A (zh) | 一种新的多肽－－人肌细胞增强结合因子13.31和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1315363A (zh) | 一种新的多肽——人核糖体蛋白s18－10和编码这种多肽的多核苷酸 | |
| CN1311254A (zh) | 一种新的多肽——人含细胞色素c结构域的 tnfr/nger蛋白13和编码这种多肽的多核苷酸 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |