ITRM20090081A1 - Uso di inibitori della proteina 90k per la preparazione di un medicamento per la cura o prevenzione dei tumori. - Google Patents

Description

Uso di inibitori della proteina 90K per la preparazione di un medicamento per la cura o prevenzione dei tumori

La presente invenzione concerne l’uso di inibitori della proteina 90K per la preparazione di un medicamento per la cura o prevenzione dei tumori.

Più in particolare, l’invenzione concerne l’uso di inibitori della proteina 90K per la preparazione di un medicamento per la cura o prevenzione dei tumori quali il carcinoma della mammella, dell’ovaio, del polmone, dell’apparato gastrointestinale, il melanoma, i linfomi o altri tumori che iperesprimono la 90K.

Il termine tumore sarà utilizzato qui di seguito per indicare il tumore maligno, noto anche come cancro.

Il tumore è una malattia caratterizzata dalla proliferazione incontrollata di cellule trasformate che invadono i tessuti vicini e diffondono in altre regioni del corpo attraverso un processo noto come metastatizzazione. I tumori in fase metastatica portano a morte i pazienti in un tempo variabile da pochi mesi a qualche anno. I farmaci più utilizzati nel trattamento dei tumori sono i chemioterapici citotossici (detti anti antiblastici o semplicemente chemioterapici). Questi farmaci agiscono danneggiando il DNA o inibendo la duplicazione cellulare, e quindi provocano la morte in maniera aspecifica sia delle cellule tumorali sia delle cellule normali in fase di replicazione. La mancanza di specificità d’azione dei chemioterapici è alla base della considerevole tossicità che fa seguito alla loro somministrazione.

Nell’ultimo decennio la ricerca scientifica di base ha notevolmente incrementato le conoscenze sui meccanismi molecolari responsabili della trasformazione e della proliferazione delle cellule tumorali. Ciò ha portato allo sviluppo di farmaci “a bersaglio molecolare” o “targeted therapy”, cioè di farmaci disegnati per agire in modo specifico sulle cellule tumorali che presentano una determinata alterazione molecolare e/o funzionale. Anche le “targeted therapy” sono però gravate da effetti collaterali e spesso riescono a contrastare la crescita tumorale solo temporaneamente. Nonostante i progressi scientifici e l’introduzione in clinica di nuovi agenti chemioterapici e “targeted”, il tumore rimane una malattia difficile da curare, responsabile di circa il 13% delle morti in tutto il mondo.

Alla luce di quanto esposto sopra risulta evidente l’esigenza di avere a disposizione nuove terapie antitumorali, più efficaci e possibilmente meno tossiche. In quest’ambito, la nostra attenzione si è focalizzata su trattamenti volti ad inibire l’azione di una proteina associata ai tumori chiamata 90K.

La 90K, nota anche come Mac-2 BP o LGALS3BP, è una molecola complessa, oligomerica, composta da subunità di circa 90.000 daltons, ricca di catene glucidiche e con diversi domini funzionali [1-4]. La proteina è secreta prevalentemente da cellule epiteliali e si ritrova nel sangue ed in altri liquidi biologici dell’uomo alla concentrazione di mg/ml [3, 5]. La 90K si localizza anche nella matrice extracellulare (ECM) dove si lega ai collageni ed alla fibronectina [6]. Pur non essendo una proteina “transmembrana”, la 90K si trova spesso associata con la membrana di rivestimento delle cellule [7, 8], dove lega in modo specifico la galectina-3 [2], la galectina-1 e -7 [9], le beta-1 integrine [6], la kitenina [10] e l’endosialina [11].

Per le sue funzioni di “multi-ligando” la 90K è coinvolta nei processi adesivi che regolano l’omeostasi tissutale, come l’adesione omotipica, cioè tra cellule dello stesso tipo (per esempio tra cellule epiteliali), l’adesione eterotipica, cioè tra cellule diverse (per esempio tra cellule epiteliali da un lato e fibroblasti, cellule endoteliali o cellule del sangue dall’altro), e l’adesione tra cellule e ECM. Evidenze sperimentali indicano che la 90K ha un ruolo importante nei processi di crescita e diffusione metastatica dei tumori grazie proprio alla sua capacità di mediare fenomeni di adesione. Per esempio, allorché cellule tumorali mantenute in sospensione unicellulare in fiasche di coltura in vitro vengono esposte a 90K ricombinante purificata, si assiste ad un aumento dell’adesione cellula-cellula (adesione omotipica) con formazione di aggregati multicellulari (vedi esempio 1). Questo fenomeno, dovuto alla capacità della 90K di legare residui di galectina-3 e galectina-1 presenti su cellule adiacenti [12, 13], può avere particolare rilevanza nella progressione neoplastica in quanto favorisce la sopravvivenza delle cellule tumorali penetrate nel circolo sanguigno durante il processo di metastatizzazione.

La 90K è anche in grado di rendere le cellule tumorali resistenti all’azione dei chemioterapici. E’ noto infatti che l’adesione cellulare a proteine della ECM protegge le cellule dall’apoptosi indotta da farmaci antiblastici [14, 15]. E’ stato dimostrato che l’adesione di cellule di linfoma alla 90K, attraverso le beta-1 integrine, conferisce resistenza all’azione citotossica di alcuni chemioterapici, riducendo la percentuale di cellule in apoptosi [16]. Questo effetto della 90K può spiegare quanto osservato in clinica in pazienti affetti da linfomi non-Hodgikin, dove alti livelli ematici di proteina si associano a scarsa risposta alla chemioterapia e ridotta sopravvivenza [16-18].

Inoltre, la 90K secreta è in grado di aumentare la produzione di enzimi coinvolti nella degradazione della matrice extracellulare, come ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) [19] e MMPs (metalloproteasi) [20], evento essenziale nei processi di invasione e metastatizzazione tumorale [21-24]. La produzione di MMP-7 indotta dalla 90K sembra mediata dalla interleukina (IL)-6, visto che anticorpi anti IL-6 inibiscono tale effetto [20]. L’IL-6 è una citochina ad azione proinfiammatoria e proangiogenetica che favorisce la crescita tumorale e la metastatizzazione [25, 26]. La capacità della 90K di stimolare la produzione di IL-6 è stata dimostrata nelle cellule mononucleate del sangue [27, 28] e recentemente anche nelle cellule staminali mesenchimali di midollo osseo [29]. Quest’ultimo effetto è stato messo in relazione con la propensione del neuroblastoma a metastatizzare alle ossa [29].

La 90K originariamente è stata identificata nel mezzo di coltura di cellule di carcinoma della mammella umano[1]. Grazie allo sviluppo di un anticorpo monoclonale specifico, denominato SP2, è stato possibile studiare i livelli di 90K nel sangue ed in altri liquidi biologici, nonché di valutarne l’espressione nei tessuti tumorali [1-4]. Questa proteina è risultata particolarmente elevata nel sangue di pazienti con varie forme di tumore, quali il carcinoma della mammella, dell’ovaio, del polmone, dell’apparato gastrointestinale, il melanoma ed i linfomi [5, 30] e in pazienti non oncologici affetti da infezioni virali come l’epatite da HBV o HCV, e l’infezione da HIV [31, 32]. Nell’epatite da HCV, i livelli ematici di 90K sono correlati alla severità della malattia ed alla durata dell’infezione. Inoltre, elevati livelli di 90K sono un fattore predittivo indipendente di mancata risposta al trattamento con interferone [32] o al trattamento combinato con peginterferone e ribavirina [33]. Nei pazienti con infezione da HIV la quantità di proteina presente in circolo è direttamente correlata allo stadio della malattia, con livelli più elevati negli stadi più avanzati [34]. Inoltre elevati livelli di 90K alla diagnosi sono un fattore prognostico indipendente di progressione ad AIDS conclamata [35].

Per quanto riguarda i pazienti affetti da tumore, destinatari del presente brevetto, i livelli ematici di 90K sono risultati associati alla prognosi. Infatti, pazienti con carcinoma della mammella [36] o dell’ovaio [37] con più alti livelli ematici della proteina presentano una più breve sopravvivenza rispetto ai pazienti con livelli normali. Anche in pazienti con linfoma (Hodgkin o non-Hodgkin), alti livelli ematici di 90K sono associati a ridotta sopravvivenza e ridotta sensibilità ai trattamenti chemioterapici [16-18].

Il significato prognostico sfavorevole della 90K nei pazienti oncologici è stato osservato anche quando l’espressione della proteina è stata valutata nel tessuto tumorale. In pazienti affetti da carcinoma polmonare non a piccole cellule [38] o carcinoma della mammella [39], l’elevata espressione della proteina nelle cellule tumorali (valutata in immunoistochimica) è risultata predittiva di ridotta sopravvivenza. Inoltre, in questi pazienti, alti livelli tumorali di 90K sono predittivi di diffusione metastatica della malattia, analogamente a quanto osservato per gli alti livelli ematici [36]. Un altro tumore che frequentemente esprime alti livelli di 90K è il melanoma. In questo tumore la 90K è associata alla trasformazione maligna ed assume valore diagnostico dal momento che i melanociti normali non esprimono la 90K [40].

Complessivamente i dati sperimentali e clinici indicano che la 90K ha un ruolo non secondario nello sviluppo e nella progressione dei tumori e, quindi, la disponibilità di agenti in grado di inibire l’attività di questa proteina potrebbe essere di ausilio nel contrastare la malattia tumorale.

L’Autore della presente invenzione ha ora trovato che la 90K rappresenta un fattore determinante nella progressione tumorale e usando specifici inibitori della proteina è possibile far regredire il tumore. In particolare, come inibitore della 90K, è stato impiegato l’anticorpo monoclonale SP2. Questo anticorpo è stato ottenuto utilizzando la tecnica degli ibridomi [41], mediante immunizzazione di topi BALB/c con proteine secrete nel terreno di coltura di cellule di carcinoma mammario umano [1]. Si tratta di un anticorpo di isotipo IgG1 che riconosce in maniera specifica la 90K. L’anticorpo è stato utilizzato per lo sviluppo di un kit per il dosaggio immuno-enzimatico (ELISA) della 90K nei liquidi biologici [5]. L’anticorpo è stato brevettato come reagente per la determinazione in vitro della concentrazione di 90K per la diagnosi e la prognosi nei pazienti affetti da infezione da HIV (brevetto statunitense 5298391). La linea cellulare murina di ibridoma, da cui si purifica l’anticorpo SP2, è stata depositata, in data 5 febbraio 1993, a nome di Stefano Iacobelli, presso il DSMZ (DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH), sotto il trattato di Budapest, con il numero di accesso DSM ACC2116, Mascheroder Weg 1 B D-3300 Braunschweig, Germania, e presso il C.N.C.M.(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) dell’Istituto Pasteur di Parigi, Francia, con il numero di accesso I-1083.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione l’uso di inibitori della proteina 90K per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o la cura dei tumori. In particolare, gli anticorpi sono scelti nel gruppo che consiste in anticorpi policlonali, monoclonali, quale ad esempio anticorpo monoclonale è l’anticorpo SP2 prodotto dall’ibridoma DSM ACC2116, anticorpi bi-specifici, a singola catena o frammenti di anticorpi. L’anticorpo monoclonale può essere ottenuto mediante la tecnica degli ibridomi descritta da Koheler et al [41] o mediante tecnica del DNA ricombinante. Gli anticorpi monoclonali possono anche essere ottenuti da librerie di anticorpi da fagi con la tecnica descritta da Clackson et al [42].

I tumori che possono essere trattati sono quelli che colpiscono la specie umana quali ad esempio il carcinoma della mammella, dell’ovaio, del polmone, dell’apparato gastrointestinale, i melanomi, i linfomi, ed altri tumori che iperesprimono la 90K. Per questi tumori è stato dimostrato un ruolo della 90K nel favorire lo sviluppo e la crescita del tumore, e quindi l’inibizione della proteina potrebbe dare sicuri benefici. Comunque, non è escluso che altri tumori che esprimono alti livelli di 90K possano beneficiare del trattamento anti-90K.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione l’uso di uno o più inibitori contro la proteina 90K, ad esempio quelli definiti sopra, per la diagnosi e la caratterizzazione dei tumori, sia in vitro che in vivo. A questo scopo l’anticorpo può essere marcato con cromogeni, fluorocromi, isotopi radioattivi ed utilizzato in saggi di immunoistochimica o per imaging molecolare in vivo. I tumori di interesse sono ad esempio, ma non esclusivamente, quelli scelti nel gruppo che presentano invariabilmente alti livelli di espressione di 90K come il carcinoma della mammella, dell’ovaio, del polmone, dell’apparato gastrointestinale, i melanomi o i linfomi.

La presente invenzione concerne inoltre una composizione comprendente la o consistente nella combinazione di uno o più inibitori della 90K, ad esempio quelli definiti sopra, e di uno o più sostanze antitumorali come principi attivi assieme ad uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili. Tra le sostanze antitumorali disponiamo di dati sperimentali sull’associazione dell’anticorpo anti-90K SP2 con docetaxel, ma possono essere utilizzati altri farmaci scelti nel gruppo dei chemioterapici quali ad esempio Paclitaxel, Antracicline, Fluoropirimidine, alcaloidi della vinca, derivati del platino o delle targeted therapy quali ad esempio trastuzumab, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, sunitinib, sorafenib, gefitinib, erlotinib.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati.

Figura 1 mostra l’aggregazione omotipica di cellule di melanoma umano a seguito dell’aggiunta di Figura 2 mostra la formazione di metastasi a seguito di inoculazione di 90K in topi singenici C57/BL6.

Figura 3 mostra l’inibizione da parte dell’anticorpo SP2 dell’aggregazione indotta dalla 90K in cellule di melanoma umano.

Figura 4 mostra le variazioni delle dimensione dei tumori nel corso del tempo che crescono nei topi a seguito dell’inoculazione di cellule di melanoma, negli animali del gruppo di controllo e in quelli trattati con anticorpo SP2.

Figura 5 mostra l’effetto del trattamento con SP2, da solo o in combinazione con Docetaxel, sulla crescita di tumori derivati dalla linea cellulare di carcinoma mammario umano MDA-MD-231 in topi nudi.

Esempio 1: Studio del ruolo della 90K sull’adesione omotipica di cellule di melanoma.

Materiali e metodi: Cellule di melanoma umano A375 sono mantenute in sospensione unicellulare in PBS (0,5 ml) in provette di prolipropilene, alla concentrazione di 1x10<6>cellule/ml, e lasciate in agitazione a 100 rpm, a 37 °C, in presenza o meno di 90K ricombinante purificata alla concentrazione di 10 µg/ml. Dopo 1 ora l’aggregazione cellulare è bloccata con l’aggiunta di 50 ml di paraformaldeide 10%. Il numero degli aggregati viene calcolato per differenza, contando al microscopio le cellule rimaste singole.

Risultati: In presenza di 90K si verifica un aumento del 60-70% dell’adesione cellula-cellula (adesione omotipica) con formazione di aggregati multicellulari (figura 1).

Esempio 2: Studio in vivo del ruolo della 90K nella formazione di metastasi polmonari da cellule di carcinoma polmonare murino di Lewis.

Materiali e metodi: Topi singenici C57/BL6 sono inoculati per via intramuscolare, sulla parte prossimale dell’arto posteriore, con 50.000 cellule di carcinoma polmonare murino di Lewis. Un gruppo rimane come controllo. Un gruppo viene invece trattato, dopo 3-4 giorni dall’inoculo, con 100 µg di 90K per via endovenosa, per 5 giorni consecutivi. Dopo 20 giorni i topi sono sacrificati ed il numero delle metastasi conteggiato nei polmoni fissati e colorati con soluzione di Bowen (acido picrico e formalina). Ciascun gruppo, controllo e trattato, consiste di 8 animali.

Risultati: I topi trattati con 90K sviluppano un numero di metastasi circa il doppio rispetto ai controlli, aumento statisticamente significativo (figura 2).

Esempio 3: Studio del ruolo dell’anticorpo SP2 sull’adesione omotipica indotta dalla 90K di cellule di melanoma.

Materiali e metodi: Cellule di melanoma umano A375 sono mantenute in sospensione unicellulare come nell’esempio 1, in presenza di 90K ricombinante purificata (10 µg/ml) e con l’aggiunta o meno di SP2 alla concentrazione di 100 µg/ml. Dopo 1 ora l’aggregazione cellulare è bloccata e gli aggregati contati come nell’esempio 2

Risultati: L’aggiunta dell’SP2 alle cellule A375 determina una significativa riduzione dell’aggregazione cellulare (figura 3).

Esempio 4: Studio in vivo del ruolo dell’anticorpo SP2 sulla crescita tumorale di cellule di melanoma.

Materiali e metodi: Topi nudi vengono inoculati sottocute con 5x10<6>cellule di melanoma umano MEL 8863 (cellule che esprimono 90K). Un gruppo rimane come controllo. Un gruppo viene invece trattato per via intraperitoneale con SP2 alla dose di 10 µg/kg due volte la settimana. La crescita tumorale viene monitorata misurando i diametri delle lesioni fino a 33 giorni dall’inoculo. Ciascun gruppo, controllo e trattato, consiste di 8 animali.

Risultati: I topi trattati con SP2 sviluppano tumori circa il 60% più piccoli rispetto al controllo (0.4 cm<3>vs 1 cm<3>) (figura 4).

Esempio 5: Studio in vivo del ruolo dell’anticorpo SP2 in associazione al docetaxel sulla crescita tumorale di cellule di carcinoma mammario.

Materiali e metodi: Topi nudi vengono inoculati sottocute con 5x10<6>cellule di carcinoma mammario umano MDA-MD-231 (cellule che esprimono 90K). Un gruppo rimane come controllo. Altri gruppi vengono invece trattati per via intraperitoneale con SP2 alla dose di 10 µg/kg due volte la settimana o con IgG di controllo alla stessa dose, o con Docetaxel alla dose di 7.5 mg/kg una volta la settimana o con la combinazione di SP2 e docetaxel. La crescita tumorale viene monitorata misurando i diametri delle lesioni fino a 44 giorni dall’inoculo. Ciascun gruppo, controllo e trattati, consiste di 8 animali.

Risultati: Sia l’anticorpo SP2 che il chemioterapico docetaxel riducono significativamente la crescita tumorale rispetto al controllo. Tale effetto risulta maggiore quando i due agenti sono utilizzati in combinazione (figura 5).

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Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1) Uso di uno o più inibitori della proteina 90K per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o la cura dei tumori.
2. 2) Uso secondo la rivendicazione 1, in cui detti uno o più inibitori sono scelti nel gruppo che consiste in anticorpi anti-90K.
3. 3) Uso secondo la rivendicazione 2, in cui gli anticorpi sono scelti nel gruppo che consiste in anticorpi policlonali, monoclonali, bi-specifici, a singola catena o frammenti di anticorpi.
4. 4) Uso secondo la rivendicazione 3 in cui l’anticorpo monoclonale è l’anticorpo SP2 prodotto dall’ibridoma DSM ACC2116.
5. 5) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti in cui i tumori sono scelti nel gruppo che consiste in carcinoma della mammella, dell’ovaio, del polmone, dell’apparato gastrointestinale, melanoma, linfoma.
6. 6) Uso di uno o più inibitori della proteina 90K per la diagnosi in vitro dei tumori.
7. 7) Uso secondo la rivendicazione 6 in cui gli inibitori sono quelli definiti in ognuna delle rivendicazioni da 2 a 4.
8. 8) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 6-7, in cui l’inibitore è marcato con cromogeni, fluorocromi, isotopi radioattivi.
9. 9) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 6-8, in cui i tumori sono scelti nel gruppo che consiste in carcinoma della mammella, dell’ovaio, del polmone, dell’apparato gastrointestinale, melanomi, linfomi.
10. 10) Composizione comprendente la o consistente nella combinazione di uno o più inibitori della 90K e di uno o più sostanze antitumorali come principi attivi assieme ad uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili.
11. 11) Composizione secondo la rivendicazione 10 in cui gli inibitori sono quelli definiti in ognuna delle rivendicazioni da 2 a 4.
12. 12) Composizione secondo ognuna delle rivendicazioni 10-11, in cui le sostanze antitumorali sono scelte nel gruppo che consiste in docetaxel, Paclitaxel, Antracicline, Fluoropirimidine, alcaloidi della vinca, derivati del platino, trastuzumab, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, sunitinib, sorafenib, gefitinib, erlotinib.
13. 13) Uso della composizione come definita in ognuna delle rivendicazioni 10-12 per la preparazione di un medicamento per la cura e/o prevenzione dei tumori.