JP2006511493A - 腫瘍成長及び転移を抑制するためのラミニン5ガンマ2鎖に対する抗体の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制する方法及び組成物であって、ラミニン5分泌腫瘍を有する対象に、ラミニン5γ2鎖の1以上のエピトープに結合する抗体の腫瘍成長及び/又は転移を抑制するために有効な量を投与することを含む方法及び組成物を提供する。
Description
本発明は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制する抗体、組成物、及び方法を提供する。
発明の背景
ラミニンは、細胞接着、増殖、遊走、及び分化を含む多様な生物学的機能を有する基底膜糖タンパク質である。これまで、少なくとも12個のラミニン・アイソフォーム形成する11の遺伝的に異なる鎖が特定されてきた。この成長タンパク質ファミリーの全メンバーは、細胞内自己組織化メカニズムを通して形成されるα、β、及びγ鎖のヘテロ三量体連鎖結合を有する。
ラミニンは、細胞接着、増殖、遊走、及び分化を含む多様な生物学的機能を有する基底膜糖タンパク質である。これまで、少なくとも12個のラミニン・アイソフォーム形成する11の遺伝的に異なる鎖が特定されてきた。この成長タンパク質ファミリーの全メンバーは、細胞内自己組織化メカニズムを通して形成されるα、β、及びγ鎖のヘテロ三量体連鎖結合を有する。
ラミニン5は、上皮基底膜の特異的構成要素であり、α3β2γ2の連鎖結合を有する(Kallunki, et al., J. Cell Biol.119 : 679-93,1992)。γ2鎖は、約130kdの分子量を有し、約200kdの「古典的」ラミニン1のβ1及びγ1軽鎖より小さい。ラミニン5鎖の発現は、扁平細胞癌及び胃癌などの上皮癌において上方制御されることが多いが、間葉系由来の癌では上方制御されない(Larjava, et al., J. Clin. Invest. 92:1425-35,1993) (Pyke, et al., Am., J. Pathol.145 : 782-91, 1994) (Pyke, etal., Cancer Res. 55:4132-9, 1995) (Tani, et al., Am. J. Pathol. 145: 782-91) (Orian-Rousseau, et al., J. Cell. Sci. 111: 19932004, 1998) (Sordat, et al., J. Pathol. 185: 44-52, 1998)。しかしながら、上皮性前立腺癌及び乳房癌において下方制御されることが報告された(Hao, J., Yang, 25 Am.J. Pathol. 149: 1341-9, 1996)(Martin, et al., Mol. Med. 4: 602-613, 1998)。大腸腺癌において、γ2鎖の遺伝子発現及びタンパク質発現の両方が、簇出(budding)表現型を有する癌細胞の特徴であるようだ (Larjava, et al., J. Clin. Invest. 92: 1425-35, 1 993) (Pyke, et al., Am. J. Pathol. 145: 782-91, 1994) (Pyke, et al., Cancer Res. 55: 4132-9, 1995)。結腸直腸癌における腫瘍細胞の簇出は、細胞内ラミニン-5の存在に関連した。(Sordat, et al., J. Pathol. 185: 44-52, 1998)。
in situハイブリダイゼーション及び免疫組織化学的染色により測定するとき、ラミニン-5のγ2鎖は、いくつかのヒトの癌の浸潤の最前線に位置する悪性細胞において強く発現されることが示された(Pyke, C., Romer, J., Kallunki, P., Lund, L.R., Ralfkiaer, E., Dano, K.&Tryggvason, K.(1994) Am. J. Pathol. 145: 782-791 ; Pyke, C., Salo, S., Ralfkiaer, E., Romer, J., Dano, K. & Tryggvason, K. (1995) Cancer Res. 55: 43 32-4139)。しかしながら、ラミニン5のγ2鎖に対する抗体が、腫瘍細胞増殖を抑制するために使用されうるということを示す研究はない。
発明の要約
本発明は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制する抗体、組成物、及び方法を提供する。一の態様では、本発明は、ヒトのラミニン5γ2鎖の第IIIドメインの1以上のエピトープに結合する抗体を提供する(配列番号2及び4)。
別の態様では、本発明は、腫瘍成長及び転移の抑制方法であって、ラミニン5を分泌する腫瘍を有する患者に、ラミニン5γ2鎖の1以上のエピトープに結合する抗体の腫瘍成長及び/又は転移を抑制するために有効な量を投与することを含む。1の実施態様では、抗体は、ラミニン5γ2鎖のドメインIIIの1以上のエピトープに結合する。
さらなる態様では、本発明は、ラミニン5γ2鎖に結合する抗体及び1以上のさらなる抗腫瘍薬剤を含む医薬組成物を提供する。本態様の様々な実施態様において、抗体は、ラミニン5γ2鎖のドメインIIIにおける1以上のエピトープに選択的であり、及び/又はさらなる抗腫瘍薬剤は化学療法薬である。
本発明は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制する抗体、組成物、及び方法を提供する。一の態様では、本発明は、ヒトのラミニン5γ2鎖の第IIIドメインの1以上のエピトープに結合する抗体を提供する(配列番号2及び4)。
別の態様では、本発明は、腫瘍成長及び転移の抑制方法であって、ラミニン5を分泌する腫瘍を有する患者に、ラミニン5γ2鎖の1以上のエピトープに結合する抗体の腫瘍成長及び/又は転移を抑制するために有効な量を投与することを含む。1の実施態様では、抗体は、ラミニン5γ2鎖のドメインIIIの1以上のエピトープに結合する。
さらなる態様では、本発明は、ラミニン5γ2鎖に結合する抗体及び1以上のさらなる抗腫瘍薬剤を含む医薬組成物を提供する。本態様の様々な実施態様において、抗体は、ラミニン5γ2鎖のドメインIIIにおける1以上のエピトープに選択的であり、及び/又はさらなる抗腫瘍薬剤は化学療法薬である。
一の態様では、本発明は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制する方法であって、ラミニン5-分泌腫瘍を有する対象に、腫瘍成長及び/又は転移を抑制するために有効な量のラミニン5γ2鎖の1以上のエピトープに結合する抗体を投与することを含む方法を提供する。好ましい実施態様において、対象は哺乳動物であり;さらに好ましい実施態様において対象はヒトである。
本明細書中に使用されるとき、「腫瘍成長の抑制」という用語は、治療されない場合に生じる腫瘍成長量を低減することを意味し、腫瘍サイズの減少及び/又は腫瘍成長割合を低減することを含む。
本明細書中に使用されるとき、「腫瘍転移の抑制」という用語は、治療されない場合に生じる腫瘍転移量を低減することを意味し、転移の数及び/又はサイズを低減することを含む。
本明細書中に使用されるとき、「ラミニン5分泌腫瘍」という用語は、検出できる量のラミニン5を発現する腫瘍を意味する。そうした腫瘍は、非限定的に癌を含む。そうした癌は、非限定的に扁平細胞癌(非限定的に皮膚、子宮頚部、及び外陰部の扁平上皮細胞癌)、胃癌、大腸腺癌、結腸直腸癌、及び子宮頚癌を含む。
本明細書中に使用されるとき、「ラミニン5γ2鎖」という用語は、好ましくは、配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質配列を有するヒト・ラミニン5γ2鎖、及びその誘導体を指す。
本明細書中に使用されるとき、「エピトープ」という用語は、抗体が結合するタンパク質中の特定部位を指し、この特定部位は、直鎖及び非直鎖のエピトープの両方を含む。
好ましい実施態様において、抗体は、ラミニン5γ2鎖のドメインIIIの1以上のエピトープに結合する。本明細書中に使用されるとき、「ラミニン5γ2鎖のドメインIII」という用語は、配列番号2の391〜567残基の177個のアミノ酸領域を指し(Kallunki et al., J. Cell. Biol. 119: 679-693(1992))、この領域は、本明細書中で配列番号8として提示される。さらに好ましい実施態様では、この抗体は、配列番号6のアミノ酸配列中に含まれるドメインIII中の1以上のエピトープに結合し、そして配列番号9及び10のアミノ酸配列中に存在するドメインIII中のエピトープには結合しない。
抗体はポリクローナル抗体でありうるし又はモノクローナル抗体でありうる。しかし、好ましくはモノクローナル抗体である。ヒトに使用する際には、ヒト化モノクローナル抗体が特に好ましい。
さらなる実施態様では、本発明の方法はさらに、対象を化学療法及び/又は放射線治療で治療することを含み、それにより抗体の使用は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制するために必要な化学療法薬剤及び/又は放射線の投与量の低減を許容する。化学療法薬剤又は放射線投与量を低減することは、標準の化学療法及び/又は放射線治療に比較して副作用を低減することにより、患者の利得となる。
この実施態様では、抗体は、化学療法及び/又は放射線治療での所定の回の治療前に、治療と同時に、又は治療後すぐに投与されうる。好ましい実施態様において、抗体は、化学療法及び/又は放射線治療の所定の回の前又は同時に投与される。最も好ましい態様では、抗体は、化学療法及び/又は放射線治療の各回の前に、又は同時に投与される。抗体投与の正確なタイミングは、幾つかの因子に基いて主治医により決定されるだろうが、抗体は、一般的に化学療法及び/又は放射線治療の所定の回の24時間前から化学療法及び/又は放射線治療の所定の回の時までの間で一般的に投与される。
本発明の方法は、1以上の細胞毒性薬剤(つまり、化学療法薬)、例えば非限定的に、シクロホスファミド、タキソール、5-フルオロウラシル、アドリアマイシン、シスプラチン、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、マイトマイシンC、プレドニゾン、ビンデシン、カーバプラチナ(carbaplatinum)、及びビンクリスチンを使用する化学療法と合わせた使用に適している。細胞障害性薬剤は、増殖細胞を破壊することができる抗ウイルス化合物でありうる。化学療法において使用される細胞障害性薬剤の一般的な議論については、Sathe, M. et al., Cancer Chemotherapeutic Agents: Handbook of Clinical Data(1978)を参照のこと。該文献は、本明細書中に援用される。
本発明の方法はまた、化学療法及び/又は放射線治療を繰り返すことを必要とする患者又は高濃度の化学療法及び/又は放射線治療を必要とする患者に特に適している。
本発明を行う際に、使用される抗体の量又は投与量範囲は、腫瘍成長及び/又は転移を効果的に抑制する範囲である。実際の投与量範囲は、様々な因子、例えば年齢、体重、性別、個人の病状、病気の重篤度、及び投与の経路などに基く。使用されうる抗体の抑制量は、0.01μg/体重kg〜15mg/体重kg、好ましくは0.05μg/体重kg〜10mg/体重kg、より好ましくは1μg/kg〜10mg/kg、さらに好ましくは10μg/体重kg〜5mg/体重kgの範囲である。
抗体は、いずれかの適切な経路により投与されうるが、好ましくは慣用の医薬として許容される担体、補助剤、及び溶媒を含む投与単位製剤で非経口的に投与される。「非経口」という用語は、本明細書中で使用されるとき、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、輸液技術、又は腹腔内を含む。好ましい実施態様では、抗体は静脈内又は皮下経路で投与される。
抗体は、固体形態(例えば顆粒、粉末、又は坐薬)又は液体形態(例えば、溶液、懸濁液、又は乳濁液)に作られうる。抗体は、様々な溶液中に適用されうる。本発明に従った使用に適した溶液は、滅菌され、十分な量の抗体を溶解し、そして適用形態に害を及ぼさない。
抗体は、滅菌などの慣用の医薬操作を受け、及び/又は1以上の保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳濁剤、緩衝剤などの慣用の補助剤を含みうる。
投与のために、抗体は通常、投与の指示された経路に適した1以上の補助剤と混合される。化合物は、ラクト-ス、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロース・エステル、ステアリン酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸ナトリウム、及びリン酸及び硫酸カルシウム、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及び/又はポリビニルアルコールと混合され、そして慣用される投与のために、錠剤化又はカプセル化される。或いは、抗体は、生理食塩水、水、ポリエチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、カルボキシメチル・セルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカント・ゴム、及び/又は多様な緩衝液中に溶解されうる。別の補助剤及び投与形態は、医薬技術分野において周知である。担体又は希釈剤は、時間遅延物質、例えば単独の又はワックスを伴うモノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリン、或いは当該技術分野に周知である別の物質を含みうる。
別の態様では、本発明は、ラミニン5γ2鎖のドメインIIIの1以上のエピトープに結合する単離された抗体、単離されたモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞、及びそうしたモノクローナル抗体を含む医薬組成物を提供する。さらなる好ましい実施態様では、単離された抗体は、配列番号6のアミノ酸配列中の1以上のエピトープに結合し、かつ配列番号9と10のアミノ酸配列中のエピトープには結合しない。単離された抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうるが、好ましくはモノクローナル抗体である。さらなる実施態様では、単離された抗体はヒト化される。さらなる実施態様では、単離された抗体は、1以上の上記適切な医薬担体と混合されて医薬組成物として調製される。
単離された抗体は、本発明の全ての方法において、並びに組織サンプル中に浸潤細胞が存在するかを検出する診断使用において有用である。好ましい実施態様では、本発明の単離された抗体の診断使用は、腫瘍組織を1以上の単離された抗体と接触して免疫複合体を形成し、そして免疫複合体の形成を検出することを含む。ここで該免疫複合体の形成は、組織における浸潤細胞の存在と相関する。上記接触は、標識された単離抗体及び標準のイメージング技術を使用してin vivoにおいて行われうるし、又は組織サンプル上でin vitroで行われうる。
好ましい実施態様において、組織は腫瘍組織である。さらに好ましい実施態様では、腫瘍組織はラミニン5を分泌する腫瘍組織である。より好ましくは、腫瘍組織は、癌であり、非限定的に扁平細胞癌(例えば、非限定的に皮膚、子宮頚部、及び外陰部の扁平上皮癌)、胃癌、大腸腺癌、結腸直腸癌、及び子宮頚癌を含む。
本発明のこの態様のさらに好ましい実施態様では、単離されたモノクローナル抗体は、IgGアイソタイプの抗体である。さらに好ましい実施態様では、単離されたモノクローナル抗体は、本明細書中に4G1、5D5、及び6C12と名付けられる抗体、並びにハイブリドーマが発現するモノクローナル抗体からなる群から選ばれる。ここで該ハイブリドーマは、American Type Tissue Collectionに、ATCC受入番号----、----、----で寄託された。これらの特定のハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作製のより詳細な記載は、以下に与えられる。
1以上の単離された抗体を含む医薬組成物のさらなる構成要素は、上部に記載される。
抗体は、周知の方法、例えば、Harlow and lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1998)に記載される方法により作られる。一の例では、免疫化前の血清を初回免疫する前に集めた。ラミニン5γ2鎖ポリペプチドのアミノ酸配列のペプチド部位は、適切な補助剤を伴い、免疫応答を誘発すために十分な量及び期間で動物に注射される。一定のインターバルで、好ましくは週毎に動物から採血して抗体タイターを測定した。動物は、初回免疫化に続いて、追加免疫注射を受けることもあるし、受けないこともある。各追加免疫の約7日後、又は初回免疫化の約1週後に、動物から採血し、血清を集め、そして一定量に分割して-20℃で貯蔵した。ラミニン5γ2鎖に対するポリクローナル抗体は、動物から集められた血清をカラムに通すことにより直接精製されうる。ここで、このカラムには、同じ発現系から精製されるラミニン5γ2鎖ポリペプチド以外の非抗原関連タンパク質が結合する。
モノクローナル抗体は、動物から脾細胞を取得することにより産生されうる(Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)を参照のこと)。一の例では、関心のモノクローナル抗体(mAb)は、近交系のマウスを、ラミニン5γ2鎖ポリペプチド又はその一部で免疫化することにより調製される。このマウスを、免疫応答を誘発するために十分な量及び間隔で、IP又はSC経路により免疫化する。このマウスは、初回免疫を0日に受け、そして約3〜30週休養された。免疫化マウスに静脈内(IV)経路により1回以上の追加免疫を与えた。当該技術分野に周知である標準方法に従い免疫化マウスから脾臓を取り出すことにより、抗体陽性マウスからのリンパ球を取得した。安定なハイブリドーマを形成することを許容する条件下で、脾臓リンパ球を適切な融合パートナーと混合することにより、ハイブリドーマ細胞を産生した。抗体産生細胞と融合パートナー細胞を、約30%〜50%の濃度のポリエチレン・グリコール中で融合した。当該技術分野に周知である方法により、融合ハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中での成長度により選択した。細胞の成長が見られるウェルから上清を集め、そして固層イムノラジオアッセイなどの免疫アッセイにより抗体の産生を選別した。MacPHersonの軟寒天技術(Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds., Academic Press, 1973)などの技術により抗体陽性のウェルにおけるハイブリドーマ細胞をクローン化した。
そうした抗体応答を作り出すために、ラミニン5γ2鎖ポリペプチド又はその一部は、典型的に、医薬として許容される非経口投与用担体とともに剤形される。そうした、許容される補助剤は、非限定的に、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿、コリネバクテリウム・パルヴム(Corynebacterium parvum)を含むオイル乳濁液中の水、tRNAを含む。ポリペプチドの濃度及び溶媒及び他の要素の選択を含むそうした組成物の製剤は、当業者の知識の範囲内である。
本明細書中で使用される抗体という用語は、ラミニン5γ2鎖のポリペプチドと選択的に作用する抗体断片を含むように意図される。抗体は、慣用の技術を使い断片化されることもあり、そして断片は、全抗体について上で記載されるのと同じ様式で有用性を選別された。例えば、F(ab')2断片は、抗体をペプシンで処理することにより作り出される。得られたF(ab’)2断片は、ジスルフィド架橋を還元するように処理されて、Fab’断片を作り出す。
別の態様では、本発明は、ラミニン5γ2鎖に結合する抗体及び一以上のさらなる抗腫瘍剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の態様の好ましい実施態様において、抗体は、上で記載されるように、ラミニン5γ2鎖のドメインIII中の1以上のエピトープに結合する。さらに好ましい実施態様では、単離された抗体は、配列番号6のアミノ酸配列中の1以上のエピトープに結合し、そして配列番号9及び10のアミノ酸配列中のエピトープには結合しない。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうるが、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の態様のさらに好ましい実施態様では、さらなる抗腫瘍薬剤は、化学療法薬剤、例えば上記における1以上の薬剤である。医薬組成物の構成要素は、一緒に前以って混合されていることもあり、又は医薬組成物を必要とする患者への投与前に混合されることもある。
以下の実施例は、例示の方法により表され、そして開示の範囲を制限することを意味しない。
以下の実施例は、ラミニン-5のγ2鎖を含むラミニン-5の、細胞接着及び細胞遊走についての効果を示す。
材料と方法
細胞と細胞培養
マウス扁平上皮癌株化細胞、KLN205(カタログ番号:ATCC・CRL-1454)を、American Type Culture Collection(ロックビル、MD)から取得した。この細胞を非必須アミノ酸を含むイーグル最小必須培地(MEM)及び10%ウシ胎児血清(FCS)を加えたアールのBBS中で単層培養として維持した。HaCatヒト・ケラチノサイト細胞系列は、Dr. Fuzenig(Heidelberg、ドイツ)から頂いた。HaCat細胞を、10%FCSを加えたダルベッコMEM中で培養した。しかしながら、ラミニン-5を産生するためにこれらの細胞を培養するとき、培地を無血清培地で置換した。
細胞と細胞培養
マウス扁平上皮癌株化細胞、KLN205(カタログ番号:ATCC・CRL-1454)を、American Type Culture Collection(ロックビル、MD)から取得した。この細胞を非必須アミノ酸を含むイーグル最小必須培地(MEM)及び10%ウシ胎児血清(FCS)を加えたアールのBBS中で単層培養として維持した。HaCatヒト・ケラチノサイト細胞系列は、Dr. Fuzenig(Heidelberg、ドイツ)から頂いた。HaCat細胞を、10%FCSを加えたダルベッコMEM中で培養した。しかしながら、ラミニン-5を産生するためにこれらの細胞を培養するとき、培地を無血清培地で置換した。
タンパク質の調製
マウスEHSラミニン(ラミニン1)を、GIBCO・BRLから取得した。Vuento, M. & Vaheri, A.(1979) Biochem.J.183:331-337.34 及びGillies, R. J., Didier, N.& Denton, M.(1986) Anal. Biochem. 159: 109-113に記載されるように、ゼラチン-セファロース4Bカラム(Sigma)を使用して、フィブロネクチンをFCSから精製した。ヒト・ラミニン5を、無血清中で3日間培養したHaCat細胞の培地から、イムノアフィニティー精製をした。簡潔に記載すると、先ず培地を5mlゼラチン-セファロース・カラム(Sigma、St.ルイス,MO)に通して、タンパク質調製からフィブロネクチンを完全に取り除いたことを確実にした。その後に、ラミニン-5分子を結合するために、培地を10ml抗ラミニンγ2-セファロース・アフィニティーカラムに通した。両方のカラムをリン酸緩衝生理食塩水中で平行化した。タンパク質A-精製された抗γ2IgG(8mg/ml)を10mlのCNBr-活性化セファロース(Pharmacia、Uppsala、Sweden)にカップリングすることにより、抗-ラミニンγ2-セファロースアフィニティカラムを調製した。γ2鎖のドメインIIIを含むGST-融合タンパク質に対して調製されたウサギ・ポリクローナル抗血清から、抗-γ2 IgGを精製した(Pyke, C., Salo, S., Ralfkiaer. E.., Romer, J., Dano, K. & Tryggvason, K. (1995) Cancer Res. 55: 4132-4139)。50mMトリエタノールアミン、pH11.25、0.1%トライトンX-100を使用して、ラミニン−5をイムノアフィニティー・カラムから溶出し、1M トリス-HCl、pH7.0で直接中和した。アフィニティー・カラムの製造に使用したのと同じポリクローナル抗体を使用して、収集した分画をSDS-PAGE及びウエスタンブロットにより分析した。ラミニン-5を含む分画を、貯蔵し、そして50mM・トリス-HCl、0.1M・NaCl、pH7.4に対して透析した。ラミニン-5の幾つかのバッチを、5M尿素で変性し、再構成して、接着及び遊走性質についてその処理の効果を試験した。
マウスEHSラミニン(ラミニン1)を、GIBCO・BRLから取得した。Vuento, M. & Vaheri, A.(1979) Biochem.J.183:331-337.34 及びGillies, R. J., Didier, N.& Denton, M.(1986) Anal. Biochem. 159: 109-113に記載されるように、ゼラチン-セファロース4Bカラム(Sigma)を使用して、フィブロネクチンをFCSから精製した。ヒト・ラミニン5を、無血清中で3日間培養したHaCat細胞の培地から、イムノアフィニティー精製をした。簡潔に記載すると、先ず培地を5mlゼラチン-セファロース・カラム(Sigma、St.ルイス,MO)に通して、タンパク質調製からフィブロネクチンを完全に取り除いたことを確実にした。その後に、ラミニン-5分子を結合するために、培地を10ml抗ラミニンγ2-セファロース・アフィニティーカラムに通した。両方のカラムをリン酸緩衝生理食塩水中で平行化した。タンパク質A-精製された抗γ2IgG(8mg/ml)を10mlのCNBr-活性化セファロース(Pharmacia、Uppsala、Sweden)にカップリングすることにより、抗-ラミニンγ2-セファロースアフィニティカラムを調製した。γ2鎖のドメインIIIを含むGST-融合タンパク質に対して調製されたウサギ・ポリクローナル抗血清から、抗-γ2 IgGを精製した(Pyke, C., Salo, S., Ralfkiaer. E.., Romer, J., Dano, K. & Tryggvason, K. (1995) Cancer Res. 55: 4132-4139)。50mMトリエタノールアミン、pH11.25、0.1%トライトンX-100を使用して、ラミニン−5をイムノアフィニティー・カラムから溶出し、1M トリス-HCl、pH7.0で直接中和した。アフィニティー・カラムの製造に使用したのと同じポリクローナル抗体を使用して、収集した分画をSDS-PAGE及びウエスタンブロットにより分析した。ラミニン-5を含む分画を、貯蔵し、そして50mM・トリス-HCl、0.1M・NaCl、pH7.4に対して透析した。ラミニン-5の幾つかのバッチを、5M尿素で変性し、再構成して、接着及び遊走性質についてその処理の効果を試験した。
組換えバキュロウイルスの生成と組換えラミニン2鎖の発現
バキュロウイルス・システムを使用して、ラミニン-5のγ2鎖を組換えタンパク質として発現し、そして、その機能性質に基いて試験用に精製した。5’UTRの6bp及び3’UTRの822bpを含む全長ヒト・ラミニンγ2鎖cDNAを、四つの重複するcDNAクローン、L52、HT2-7、L15、及びL61(Kallunki, P., Sainio, K., Eddy, R., Byers, M., Kallunki, T., Sariola, H., Beck, K., Hirvonen, H., Shows, T.B. & Tryggvason, K.(1992) J. Cell Biol. 119:679-693)から構築した。得られた4402bpのcDNAを制限酵素マッピング及び一部をシーケンスすることにより分析し、そしてpVL1393組換えトランスファー・プラスミドへとクローン化し、その後にMax Summers(Texas A & M University)から頂いたAcNPV-γ2バキュロウイルス・ベクター中に導入した。ポリへドリン・プロモーターの転写制御下にヒト・ラミニンγ2鎖cDNAを含むバキュロウイルスベクターを作り、そして以下の標準方法に従って精製した。ただし、このバキュロウイルスベクターは、Pen, et al.,(Pen, J., Welling, G.W. & Welling- Wester, S. (1989), Nucl. Acid. Res. 17: 451)の方法に従って、野生型ウイルス(AcNPV)DNAと組換えトランスファー・ベクターpVL1393-γ2とをSF9細胞に同時形質導入することにより得られたウイルスを含む培地から濃縮された。組換えタンパク質の発現のために、標準方法を使用して、細胞あたり5〜10pfuの感染効率(MOI)で組換えウイルスでハイファイブ(H5)細胞に感染させた。
バキュロウイルス・システムを使用して、ラミニン-5のγ2鎖を組換えタンパク質として発現し、そして、その機能性質に基いて試験用に精製した。5’UTRの6bp及び3’UTRの822bpを含む全長ヒト・ラミニンγ2鎖cDNAを、四つの重複するcDNAクローン、L52、HT2-7、L15、及びL61(Kallunki, P., Sainio, K., Eddy, R., Byers, M., Kallunki, T., Sariola, H., Beck, K., Hirvonen, H., Shows, T.B. & Tryggvason, K.(1992) J. Cell Biol. 119:679-693)から構築した。得られた4402bpのcDNAを制限酵素マッピング及び一部をシーケンスすることにより分析し、そしてpVL1393組換えトランスファー・プラスミドへとクローン化し、その後にMax Summers(Texas A & M University)から頂いたAcNPV-γ2バキュロウイルス・ベクター中に導入した。ポリへドリン・プロモーターの転写制御下にヒト・ラミニンγ2鎖cDNAを含むバキュロウイルスベクターを作り、そして以下の標準方法に従って精製した。ただし、このバキュロウイルスベクターは、Pen, et al.,(Pen, J., Welling, G.W. & Welling- Wester, S. (1989), Nucl. Acid. Res. 17: 451)の方法に従って、野生型ウイルス(AcNPV)DNAと組換えトランスファー・ベクターpVL1393-γ2とをSF9細胞に同時形質導入することにより得られたウイルスを含む培地から濃縮された。組換えタンパク質の発現のために、標準方法を使用して、細胞あたり5〜10pfuの感染効率(MOI)で組換えウイルスでハイファイブ(H5)細胞に感染させた。
組換えγ2鎖は、最初に細胞を10体積分の50mM・Tris-HCl、pH7.4、100mM・NaCl、2.5mM・EDTA、1%トライトンX-100、1mM・PMSF、及び1mM・NEMで懸濁し、続いてダウンス型(Dounce)のホモジェナイザーでホモジェナイズすることにより精製した。タンパク質を60分間氷上で抽出し、そして可溶化したタンパク質を4℃で10分間1500×gで遠心することにより取り除いた。ペレットを再び1〜3M尿素を含む緩衝液で抽出した。組換えγ2鎖を5M尿素を含む緩衝液で抽出し、そして50mM・Tris-HCl、pH7,4、100mM・NaClに対して透析することにより再生した。
抗体の調製
ラミニンγ2鎖のドメインIIIに対するポリクローナル抗血清を調製し、そして以前に記載されるように特性を明らかにした。簡潔に記載すると、γ2-GST融合タンパク質を抗原として使用して、ウサギをs.c.で4回免疫化した。抗原は、γ2のドメインIII(配列番号8)由来の177個のアミノ酸残基(res.番号391-567)を含んだ(Kallunki, P., Sainio, K., Eddy, R., Bayers, M., Kallunki, T., Sariola, H., Beck, K., Hirvonen, H., Shows, T.B. & Tryggvason, K.(1992) J. Cell Biol. 119: 679-693)。E.coli発現GSTタンパク質をCNBr-活性化セファロースにカップリングすることにより作られたGST-セファロースでネガティブ免疫吸着を行うことにより、GST-エピトープに対する抗体を抗血清から取り除いた。GST特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、抗GST・IgGを取り除いたことを確認した。ラミニンγ2鎖に対する抗体の特異性を、ウエスタンブロッティング及びELISAにより試験した。
ラミニンγ2鎖のドメインIIIに対するポリクローナル抗血清を調製し、そして以前に記載されるように特性を明らかにした。簡潔に記載すると、γ2-GST融合タンパク質を抗原として使用して、ウサギをs.c.で4回免疫化した。抗原は、γ2のドメインIII(配列番号8)由来の177個のアミノ酸残基(res.番号391-567)を含んだ(Kallunki, P., Sainio, K., Eddy, R., Bayers, M., Kallunki, T., Sariola, H., Beck, K., Hirvonen, H., Shows, T.B. & Tryggvason, K.(1992) J. Cell Biol. 119: 679-693)。E.coli発現GSTタンパク質をCNBr-活性化セファロースにカップリングすることにより作られたGST-セファロースでネガティブ免疫吸着を行うことにより、GST-エピトープに対する抗体を抗血清から取り除いた。GST特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、抗GST・IgGを取り除いたことを確認した。ラミニンγ2鎖に対する抗体の特異性を、ウエスタンブロッティング及びELISAにより試験した。
γ2-GST融合タンパク質を抗原として使用して、ラミニンγ2鎖のC末端に対するポリクローナル抗体を、上で記載したドメインIIIに対する抗体と実質的に同様に産生した。抗原は、γ2鎖のドメインI/II由来の161個のアミノ酸(res.番号1017-1178)を含み、そしてGST-エピトープに対する抗体を、GST-セファロースを用いてネガティブ免疫吸着を行うことにより、抗血清から取り除いた。抗体の特異性をウエスタンブロッティング及びELISAにより試験した。
ラミニン-1に対するポリクローナル抗血清は、Dr. Foidart(リージュ大学、Belgium)から頂いた。免疫化に使用するウサギから免疫化する前に、通常のウサギ血清を取得した。ラミニン-1及びラミニンγ2-鎖抗血清からのIgG、並びに通常のウサギ血清からのIgGを、タンパク質Aセファロース(Pharmacia, Uppsala, Sweden)を使用して精製した。
細胞接着アッセイ
マイクロタイター・プレート(96ウェル:Nunc, Copehagen, Denmark)を一晩4℃でインキュベーションすることにより、1ウェルあたり100μlのPBS又は50M・Tris-HCl、pH7.4中のラミニン-1(10μg/ml)、ラミニン-5(10μg/ml)、又は組換えラミニンγ2鎖(10μg/ml)でコートした。コントロール・ウェルを等量のBSAでコートするか、又はコートしなかった。幾つかの実験では、タンパク質を最初に5M尿素、50mM・Tris-HCl、pH7.5に対して一晩透析することにより変性し、続いて50mM・Tris-HCl、pH7.5に対して透析することにより再生した。プレート上の残存している潜在的な活性部位を、室温で2時間、PBS中の10mg/ml・BSA150μLでブロッキングした。ウェルをPBSで洗浄し、そして5mg/mlBSAを含む100mlのイーグルのMEMを加えた。接着アッセイのために、KLN205細胞を、トリプシン-EDTA(0.25%-0.03%)で、サブコンフルエントの細胞培養ディッシュから引き離し、そしてイーグルMEM/BSA(5mg/ml)中に2×105細胞/mlで再懸濁し、そして37℃で20分間正常な状態に戻した。全体で20000個の細胞を各ウェルに加えて、そしてさら90分間37℃で接着させた。600nmで生成する色を計測し、続いて3%パラホルムアルデヒドで固定し、そして0.1%クリスタルバイオレットで染色することにより、細胞接着の程度を測定した。抗γ2-抗体を用いる抑制アッセイのために、基質でコートされたウェルを、細胞とインキュベーションする前に、PBS中の抗-γ2鎖IgG(20μg/ml)で60分間インキュベーションした。
マイクロタイター・プレート(96ウェル:Nunc, Copehagen, Denmark)を一晩4℃でインキュベーションすることにより、1ウェルあたり100μlのPBS又は50M・Tris-HCl、pH7.4中のラミニン-1(10μg/ml)、ラミニン-5(10μg/ml)、又は組換えラミニンγ2鎖(10μg/ml)でコートした。コントロール・ウェルを等量のBSAでコートするか、又はコートしなかった。幾つかの実験では、タンパク質を最初に5M尿素、50mM・Tris-HCl、pH7.5に対して一晩透析することにより変性し、続いて50mM・Tris-HCl、pH7.5に対して透析することにより再生した。プレート上の残存している潜在的な活性部位を、室温で2時間、PBS中の10mg/ml・BSA150μLでブロッキングした。ウェルをPBSで洗浄し、そして5mg/mlBSAを含む100mlのイーグルのMEMを加えた。接着アッセイのために、KLN205細胞を、トリプシン-EDTA(0.25%-0.03%)で、サブコンフルエントの細胞培養ディッシュから引き離し、そしてイーグルMEM/BSA(5mg/ml)中に2×105細胞/mlで再懸濁し、そして37℃で20分間正常な状態に戻した。全体で20000個の細胞を各ウェルに加えて、そしてさら90分間37℃で接着させた。600nmで生成する色を計測し、続いて3%パラホルムアルデヒドで固定し、そして0.1%クリスタルバイオレットで染色することにより、細胞接着の程度を測定した。抗γ2-抗体を用いる抑制アッセイのために、基質でコートされたウェルを、細胞とインキュベーションする前に、PBS中の抗-γ2鎖IgG(20μg/ml)で60分間インキュベーションした。
遊走アッセイ
Hujanen 及び Terranova(Hujanen, E. & Terranova, V.P.(1985) Cancer Res. 45: 3517-3521)により記載されるように、改変されたBoydenチャンバー・アッセイを使用することにより、KLN205細胞の遊走に関する内在性ラミニン-5の効果を測定した。そして、Pelletier, et al., (Pelletier, A.J., Kunicki, T. 及びQuaranta, V.(1996), J. Biol. Chem. 271-364)により記載される改変されたトランスウェル・アッセイを使用して外来性ラミニン-5の効果を測定した。
Hujanen 及び Terranova(Hujanen, E. & Terranova, V.P.(1985) Cancer Res. 45: 3517-3521)により記載されるように、改変されたBoydenチャンバー・アッセイを使用することにより、KLN205細胞の遊走に関する内在性ラミニン-5の効果を測定した。そして、Pelletier, et al., (Pelletier, A.J., Kunicki, T. 及びQuaranta, V.(1996), J. Biol. Chem. 271-364)により記載される改変されたトランスウェル・アッセイを使用して外来性ラミニン-5の効果を測定した。
Boydenチャンバーアッセイは、以下の様に行われた。ポリカーボネート・フィルター(孔サイズ、10μM、直径12mm、Costar, Cambridge, MA)を2.5μgのEHSIV型コラーゲンでコートし、そして50μlのチャンバーの上部と下部を分離するために使用した。0.1%BSAを含むイーグルMEM中の1×105細胞を上部に配置し、そして下部を化学遊走物質(50μg/mlのラミニン-1又はフィブロネクチン)を伴うか又は伴わない培地で満たした。ラミニンγ2鎖抗体の細胞遊走についての効果を試験するために、抗-γ2(III)IgG又は抗γ2(C末端)IgGを20μg/mlの濃度で細胞と共に上部へと加えた。通常のウサギIgGをネガティブ・コントロールとして使用した。37℃加湿状態で8時間インキュベーションした後に、フィルターを取り除き、固定しそして染色した(Diff-Quick, Baxter Diagnostics, Tubingen, Germany)。遊走しない細胞を、綿で拭き取ることによりフィルターの上部表面から取り除いた。各フィルターの下部表面上の細胞を、ランダムに10回選んだ高倍率視野(×400)で細胞数をカウントすることにより、細胞の遊走を定量した。全てのアッセイを三回行った。
「トランスウェル」プレート・アッセイ(12μmの孔サイズ、直径12mmを有するトランスウェル・プレート;Costar,Cambridge,MA)を使用して、外来性ラミニン-5の細胞遊走についての効果を測定した。膜の下部を2.5μgのEHS・IV型コラーゲンで3時間室温でコートした。両側を、1%ウシ血清アルブミンで1時間ブロッキングした。上部に、1ウェルあたり10%FCSを含むイーグルMEM中の1×105細胞を加え、そして下部を2.5μg/mlラミニン-5を化学遊走物質として満たした。γ2鎖のC末端及びドメインIIIに対する抗体又は非免疫化IgGを20μg/mlの濃度で、細胞とともに加えた。37℃で16時間インキュベーションした後に、細胞を固定し、そして染色した。膜の上面上の細胞を、綿で拭き取ることにより取り除いて、そして膜の下部に遊走した細胞を計測した(12の領域±S.D.)。
免疫組織化学的染色
5μmの厚いパラフィン切片をラミニン-1又はラミニン-5γ2鎖に対するポリクローナル抗体で染色した。簡潔に記載すると、パラフィン切片を最初に0.1M・HCl中の0.4%ペプシンで37℃で20分間インキュベーションし、5%新生児ウサギ血清、0.1%BSAで非特異的結合をブロッキングし、そして次にTBS中に5〜10μg/mlに希釈したポリクローナルIgGで37℃一時間インキュベーションした。続いて、ビオチン化ブタ抗ウサギ抗体を適用し、続いて1:400希釈の西洋わさび-ペルオキシダーゼ-アビジン-ビオチン-複合体(DAKO、Copenhagen, Denmark)とインキュベーションした。ジアミノベンツアミジン(diaminobentsamidine)(DAB)中で発色させて、続いてヘマトキシリンでスライドを対比染色した。
5μmの厚いパラフィン切片をラミニン-1又はラミニン-5γ2鎖に対するポリクローナル抗体で染色した。簡潔に記載すると、パラフィン切片を最初に0.1M・HCl中の0.4%ペプシンで37℃で20分間インキュベーションし、5%新生児ウサギ血清、0.1%BSAで非特異的結合をブロッキングし、そして次にTBS中に5〜10μg/mlに希釈したポリクローナルIgGで37℃一時間インキュベーションした。続いて、ビオチン化ブタ抗ウサギ抗体を適用し、続いて1:400希釈の西洋わさび-ペルオキシダーゼ-アビジン-ビオチン-複合体(DAKO、Copenhagen, Denmark)とインキュベーションした。ジアミノベンツアミジン(diaminobentsamidine)(DAB)中で発色させて、続いてヘマトキシリンでスライドを対比染色した。
結果
タンパク質及び上皮由来細胞の特性
SDS-PAGEにより分析するとき、HaCat細胞の培養液から単離した免疫精製された三量体のラミニンー5は、2個の主要バンドを含んだ。このバンドは、以前に報告されたように、各々165kDaのγ2鎖、及び一つのバンドとして移動する155kDa及び140kDaのγ2及びβ3鎖に対応する。さらに、処理されたγ2鎖に対応する約105kDaの弱いバンドが見られた。
タンパク質及び上皮由来細胞の特性
SDS-PAGEにより分析するとき、HaCat細胞の培養液から単離した免疫精製された三量体のラミニンー5は、2個の主要バンドを含んだ。このバンドは、以前に報告されたように、各々165kDaのγ2鎖、及び一つのバンドとして移動する155kDa及び140kDaのγ2及びβ3鎖に対応する。さらに、処理されたγ2鎖に対応する約105kDaの弱いバンドが見られた。
バキュロウイルスシステムを使用して、全長ヒト組換えラミニンγ2鎖をスポドプテラ フルジペルダ(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞ハイ・ファイブ中に産生させた。γ2鎖は、細胞内で通常のヘテロ三量体に組み立てられないため培地中に分泌されないので、材料と方法で記載したように、細胞画分から単離した。タンパク質を5M尿素を使用する変性条件下で抽出し、50mM・Tris-HCl、100mM・NaCl、pH7.4に対してよく透析することにより再生して、そして精製した。精製された組換えγ2鎖は、全長であり(約155kDa)、そしてSDS-PAGE分析により測定すると、純度が高かった。
HaCatヒト・ケラチノサイト及びマウスKLN205扁平上皮癌細胞は、γ2鎖に特異的なポリクローナル抗体及び/又はcDNAプローブを使用することにより、免疫染色及びノーザン・ブロッティング分析に基いて、ラミニン-5を発現すると示された。さらにKLN205細胞は、マウスin vivoにおいて、γ2鎖陽性の原発腫瘍及び転移を発生させた(データー未掲載)。筋肉内又は皮下接種の後に、大きな原発腫瘍が4週間のうちに発生し、そして4〜6週間後に多数の肺転移を伴った。尻尾の静脈に注射されたKLN205細胞は、4週間のうちに複数の肺腫瘍(実験的転移)を作り出した。結果としてこの両方の細胞型は、本研究において行われた細胞付着及び遊走実験に適していると考えらる。
ラミニン5分子は細胞接着を促進したが、組換えラミニンγ2鎖は促進しなかった
本研究において調製されたラミニン5及び組換えγ2鎖、並びに市販のラミニン1を、共にラミニン5を発現する二つの上皮由来細胞系列HaCat及びKLN205についての付着アッセイにおける基層として使用した。両方の細胞系列は、約2.5時間でプラスチックよりはラミニン1によく付着した。細胞のラミニン5への付着は、ラミニン1への付着よりわずかに多いが、差異は統計的に有意ではなかった。上の組換えγ2鎖についての記載と同じ様に5M尿素中で変性され、次に50mM・Tris-HCl、100mM・NaCl、pH7.4に対して透析することにより再生したラミニン5標本に対しても細胞は同等に良く付着した。これにより、この処理が三量体分子の結合性質に影響しないということが示された。ラミニン5に対する付着は、γ2鎖の短腕又は長腕に対して作られた2つの異なるポリクローナル抗体或いは免疫化前のIgGの存在下において有意に減少しなかった。γ2鎖の短腕に対する抗体の異なる量(50μg/mlまで)も試験したが、細胞付着についての影響が見られなかった。組換えγ2鎖のみの上に細胞を蒔いたとき、付着は、プラスチックに対する付着より有意に多くなることはなく、この付着は、γ2鎖に対するポリクローナル抗体により影響されない。以前の結果により三量対のラミニン5が上皮細胞の付着を促進するということが示されるが、今回の結果によりこの付着がγ2鎖により調節されないということが強く示唆されるということをこのデーターは確かにした。
本研究において調製されたラミニン5及び組換えγ2鎖、並びに市販のラミニン1を、共にラミニン5を発現する二つの上皮由来細胞系列HaCat及びKLN205についての付着アッセイにおける基層として使用した。両方の細胞系列は、約2.5時間でプラスチックよりはラミニン1によく付着した。細胞のラミニン5への付着は、ラミニン1への付着よりわずかに多いが、差異は統計的に有意ではなかった。上の組換えγ2鎖についての記載と同じ様に5M尿素中で変性され、次に50mM・Tris-HCl、100mM・NaCl、pH7.4に対して透析することにより再生したラミニン5標本に対しても細胞は同等に良く付着した。これにより、この処理が三量体分子の結合性質に影響しないということが示された。ラミニン5に対する付着は、γ2鎖の短腕又は長腕に対して作られた2つの異なるポリクローナル抗体或いは免疫化前のIgGの存在下において有意に減少しなかった。γ2鎖の短腕に対する抗体の異なる量(50μg/mlまで)も試験したが、細胞付着についての影響が見られなかった。組換えγ2鎖のみの上に細胞を蒔いたとき、付着は、プラスチックに対する付着より有意に多くなることはなく、この付着は、γ2鎖に対するポリクローナル抗体により影響されない。以前の結果により三量対のラミニン5が上皮細胞の付着を促進するということが示されるが、今回の結果によりこの付着がγ2鎖により調節されないということが強く示唆されるということをこのデーターは確かにした。
ラミニンγ2ドメインIIIに対する抗体は、細胞遊走を抑制するが、ドメインI/IIに対する抗体は抑制しない
細胞遊走におけるラミニン5のγ2鎖の潜在的な役割を、in vitroで、材料と方法で記載されるように、Boyden及びトランスウェルチャンバーアッセイを使用して、KLN205細胞について試験した。
細胞遊走におけるラミニン5のγ2鎖の潜在的な役割を、in vitroで、材料と方法で記載されるように、Boyden及びトランスウェルチャンバーアッセイを使用して、KLN205細胞について試験した。
ラミニン1及びフィブロネクチンを下部チャンバーに化学遊走剤として使用して、Boydenチャンバーアッセイにおいて遊走を最初に試験した(図2A参照のこと)。走化性Bydenチャンバーの二つのコンパートメントは、IV型コラーゲンでコートされた孔フィルターにより分離される(孔サイズ8μm)。0.1%BSAを含むMEM中の細胞(1×105)は、上部コンパートメントに配置され、そして0.1%BSAを含むMEM中のラミニン1(+/−)又はフィブロネクチン(−/+)を化学遊走剤として、下部コンパートメントに加えた。γ2鎖ドメインIII、I/IIに対するIgG、又は免疫前IgGを上部コンパートメントに、濃度20μg/mlの濃度で細胞と共に加えた。37℃で8時間インキュベーション後、フィルターを取り、そしてフィルターの下部表面に遊走する細胞定量化した。データーは、高倍率視野あたりの遊走した細胞を、免疫化前のIgGにおいて存在する遊走細胞の割合を100%にして、割合(±SD(バー))で示した。ランダムに10回選んだ高倍率視野において細胞を計測して、実験を三回行った。γ2鎖の短腕に対するポリクローナルIgGを、細胞を含む上部コンパートメントに加え、フィルターを通した細胞の遊走は、免疫化する前の血清において観測される遊走に対し約35〜45%へと減少した。対照的に、C末端ドメインI/IIに対するポリクローナル・IgGは、細胞の遊走に影響を与えなかった。
未変性のラミニン5を化学遊走剤として下部コンパートメントに使用するトランスウェルアッセイにおいて、二つの抗体の効果を同様に使用した(図2B)。膜の下部をEHSIV型コラーゲンでコートし、そして下部コンパートメントを2.5μg/mlのラミニン5を化学遊走剤として満たした。免疫化前のIgG、γ2鎖ドメインIII又はI/IIに対するIgGを、細胞を含む上層へ加えた。16時間のインキュベーションの後、細胞を固定し、そして膜の下層にある細胞を計測した(12領域±SD)。
結果は、Boydenチャンバーアッセイの結果と実質的に同じであった。こうしてγ2鎖のドメインIIIに対して作られたIgGを加えることにより、免疫前IgGと比較して遊走を約50%抑制する。一方、ドメインI/IIに対するポリクローナルIgGは、細胞遊走に影響しなかった。
これらのin vitroの結果により、ラミニン5が上皮由来細胞の移動運動に役割を果たし、そしてこの機能が、γ2鎖のドメインIIIに対する抗体により抑制されうるということが示された。
こうして、ラミニンλ2鎖の短腕に対する抗体は、Boydenチャンバー遊走アッセイにおいて測定すると、KLN205扁平上皮癌細胞の遊走を約55〜65%抑制した。興味深いことに、ここで使用される抗体は、突然変異により欠失させると致死性表皮水疱症を引き起こすドメインIII(配列番号8)の177個のアミノ酸残基に対するものである。したがって、ラミニンλ2鎖の短腕は、このラミニン・アイソフォームが他の細胞外マトリックスタンパク質へと相互作用するために重要であり、そしてこの相互作用は、細胞遊走過程にも関与する。
実施例2
以下の例は、本発明に従ったモノクローナル抗体を調製すること並びにラミニン5を分泌する腫瘍における腫瘍細胞の成長抑制に使用することを詳細に記載する。
以下の例は、本発明に従ったモノクローナル抗体を調製すること並びにラミニン5を分泌する腫瘍における腫瘍細胞の成長抑制に使用することを詳細に記載する。
100μgのGST-ラミニン-γ2-III融合タンパク質を抗原としてBalb/cマウスに免疫化することにより、ラミニン5のγ2鎖に対するモノクローナル抗体を産生した。GST-ラミニン-γ2-III融合タンパク質は、ヒト・ラミニン-γ2-鎖アミノ酸残基391〜567位(配列番号8)を含む。免疫化に続いて、免疫化マウス由来の脾臓細胞を細胞系列P3X63Ag.8.653(ATCC・#CRL-1580)から得たマウス・ミエローマ細胞と融合した。次に凍結パラフィン切片(ヒト子宮頚部癌、通常の子宮頚部、及び通常の皮膚)を免疫組織染色して、抗-ラミニン-γ2抗体を産生するハイブリドーマ・クローンを選別した。染色結果をネガティブコントロール、マウス通常血清及びIgGの結果、並びに特性がよく明らかになっている抗-ラミニン-5、γ2鎖ポリクローナル抗体(Pyke, et al.,1995において記載される)で得られた陽性の結果と比較した。また、このハイブリドーマ・クローンをELISAで選別した。最良のハイブリドーマ・クローンを拾い、そして(単一細胞クローニング)で二回クローニングして、得られたハイブリドーマ細胞系列が、単クローン性であることを確かにした。
3種の特定のハイブリドーマ・クローンと、それらから産生される対応したモノクローナル抗体の産出の詳細を以下に記載する。4G1、5D5、及び6C12モノクローナル抗体に対して性質決定試験を行った。ウエスタンブロッティング分析及びELISAを行なって、ラミニン5のγ2鎖に対する抗体の特異性を確かめた。ウエスタンブロッティング分析は、SDS-PAGEゲル中で組換えラミニン5γ2鎖を泳動し、ゲルをナイロン膜に転写し、そして膜を抗体でインキュベーションすることを含む。
ELISA用に、0.1M炭酸/炭酸水素緩衝液(pH9)中の2.5ug/mlの濃度のGST-γ2-III融合タンパク質(抗原)100μl(0.25μl/ウェル)で、プレートを一晩4℃でコートした(Salo et al., Matrix Biology 18: 197-210(1999))。ELISAプレートを次に3回PBST溶液(200μL)(10mMリン酸カリウム、150mM・NaCl、pH7.5、及び0.05%Tween-20)で洗浄した。BSA-PBS(PBS緩衝液(10mM・K3PO4、150mM・NaCl、pH7.5)中の1%ウシ血清)を1ウェルあたり200μl、90分間加えることにより非特異的吸着を抑制した。このプレートに対し、ネガティブコントロール(通常のマウス血清)の希釈液及びBSA-PBS中の希釈されたサンプル(Mab・4G1、5D5、又は6C12)を加え、そして次にELISAプレートを1時間室温でインキュベーションした。インキュベーションの後に、ELISAプレートをPBSTで三回洗浄した。次に、HRP-結合抗-マウスIgG二次抗体(ペルオキシダーゼ(HRP)結合ウサギ抗マウスIgG(H+L)、Jackson Laboratories、#315-035-045)を加え、そしてプレートを室温で30分間インキュベーションした。ELISAプレートを次に再びPBST溶液(200ml)で3回洗浄した。ABTS-過酸化物基質(0.1Mクエン酸ナトリウム、pH5中に希釈されたABTSは、アッセイに使用する直前に、クエン酸ナトリウム緩衝液+2μl30%過酸化水素の溶液で1mlから10mlに希釈された)を次にウェルに加え、そしてプレートを暗室中で30分間インキュベーションした。マイクロプレート・リーダーを用いて405nmで、30分及び60分で吸光度を測定した。
これらの分析により、ラミニン5γ2鎖のドメインIIIに対するモノクローナル抗体の特異性が明らかにされた。Mab・4G1、5D5、又は6C12により認識されるエピトープのエピトープマッピングにより、これらの抗体が、配列番号6(配列番号6は、ドメインIIIのアミノ末端及びカルボキシ末端の部分を欠如するγ2鎖のドメインIIIの一部である)のアミノ酸配列内のエピトープに結合し、そして配列番号9及び10(それぞれ、ドメインIIIの9アミノ末端、及び41のカルボキシ末端である)のアミノ酸配列内のエピトープには結合しないということが示された。
ラミニン5のγ2鎖に対するモノクローナル抗体を、ラミニン5分泌腫瘍における腫瘍細胞成長の抑制効率について試験した。
試験1:免疫抑制マウスにおける腫瘍成長
以下の試験により、ヒト・ラミニン5、γ2-III-ドメインに対するIgG免疫グロブリン(Mab・5D5)が免疫不全マウスにおける転移の数及びサイズに影響を与える能力が示された。
以下の試験により、ヒト・ラミニン5、γ2-III-ドメインに対するIgG免疫グロブリン(Mab・5D5)が免疫不全マウスにおける転移の数及びサイズに影響を与える能力が示された。
腫瘍を移植させるために、106個のヒト扁平上皮癌細胞を免疫抑制マウスの尻尾静脈に注射した。使用された細胞系列は、ヒトの扁平上皮癌細胞、細胞系列A431とHSC-3であった。この細胞は、DMEM-グルタマックス(glutamax)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、5%FCSを含む培地中の懸濁液で提供された。接種するために、この細胞をCa及びMgを含まない滅菌PBS中に再懸濁した。対照細胞の計測を、細胞懸濁液について行ない、そして細胞濃度及び注射量を記録した。細胞の起源はHSC-3:日本厚生労働省研究資源バンク、JCRB0623 A431:ATCCカタログ番号CRL-1555であった。当該技術分野に周知であるように、ヒト起源の細胞を成長させることができる免疫抑制マウスを選択した。腫瘍転移させるために、群3と群6の腫瘍細胞は、試験物質(試験物質は50μg/mlである)と共にマウスへと注射された。腫瘍細胞を1週間成長させて、その後4週間のあいだ週2回、試験物質を静脈内注射した。
処置期間の後に、動物を屠殺し、そして組織サンプルを集めた。異なる組織における腫瘍の数及び大きさを計測しそして比較した。
試験物質と投与溶液
試験物質は、ヒト・ラミニン5、γ2-III-ドメイン(Mab5D5)に対するIgG免疫グロブリンである。この試験物質は、上で記載されるようにin vitroにおいてモノクローナル・ハイブリドーマ法で産生された。試験物質(Mab 5D5)を1mg/mlの濃度で滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に懸濁した。溶媒を0.2μmフィルターを使用して滅菌した。運搬された試験物質を、滅菌PBSで50:50に希釈して、500μg/mlの投与濃度を与えた。
試験物質は、ヒト・ラミニン5、γ2-III-ドメイン(Mab5D5)に対するIgG免疫グロブリンである。この試験物質は、上で記載されるようにin vitroにおいてモノクローナル・ハイブリドーマ法で産生された。試験物質(Mab 5D5)を1mg/mlの濃度で滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に懸濁した。溶媒を0.2μmフィルターを使用して滅菌した。運搬された試験物質を、滅菌PBSで50:50に希釈して、500μg/mlの投与濃度を与えた。
試験物質を0.1ml/動物の体積で、免疫抑制マウスの外側尻尾静脈中に投与した。投与を週あたり2回、月曜日と木曜日に行った。試験物質の初回投与量を実験的転移誘導の一週間後に投与した。
四週間の処置(試験物質の8回投与)の後、動物をCO2麻酔中に、心臓穿刺で全採血することにより屠殺した。血液を集め、血清を分離して、そして-20℃で凍結した。肉眼による検死を行ない、そして肉癌による腫瘍の塊に特に注意して、肉眼でわかる兆候を記録した。可能ならば腫瘍の塊を数えそして計測した。以下の器官/組織を集めそして重量を測った:肺、リンパ節(頚部及び腸管部)、肝臓、及び脾臓。器官/組織をPBSで洗浄し、そして4%リン酸緩衝ホルマリン中で固定した。
臨床的兆候
動物番号6は、5日目から試験が終わるまで尻尾の肥厚を有した。腫瘍細胞の接種後に、動物番号11の尻尾は黒/茶色になり、最終的には壊死した。7日目以降では、尻尾の半分が失われた。他に処置に関連する臨床的兆候は記録されなかった。腫瘍細胞接種の次の日の朝において、1匹の動物(動物番号8、群2)が死んでいた。肉眼による検死では、肉眼でわかる変化はなかった。残りの動物は全て、試験の間良好な状態で生存した。
動物番号6は、5日目から試験が終わるまで尻尾の肥厚を有した。腫瘍細胞の接種後に、動物番号11の尻尾は黒/茶色になり、最終的には壊死した。7日目以降では、尻尾の半分が失われた。他に処置に関連する臨床的兆候は記録されなかった。腫瘍細胞接種の次の日の朝において、1匹の動物(動物番号8、群2)が死んでいた。肉眼による検死では、肉眼でわかる変化はなかった。残りの動物は全て、試験の間良好な状態で生存した。
検死
注射された腫瘍細胞は、肺においてのみ腫瘍成長を誘導した。肉眼でわかる転移を有する別の組織は、脾臓、肝臓、小腸、及び包皮腺を含んだ。SCIDマウスは、肝臓における変化を有した。この変化は細菌が原因であると思われる。肺では、転移は、とても多くかつ小さいので、個々の転移を数え又は測定することは実用的ではない。以下の表2は、表1の処置を受けたマウスの結果の要約を表す。
注射された腫瘍細胞は、肺においてのみ腫瘍成長を誘導した。肉眼でわかる転移を有する別の組織は、脾臓、肝臓、小腸、及び包皮腺を含んだ。SCIDマウスは、肝臓における変化を有した。この変化は細菌が原因であると思われる。肺では、転移は、とても多くかつ小さいので、個々の転移を数え又は測定することは実用的ではない。以下の表2は、表1の処置を受けたマウスの結果の要約を表す。
上記表2からわかるように、試験化合物を処置されたBalb/c-nudeマウスでは、5匹のマウスのうち1匹が肉眼で観察される肺転移を有し、一方試験化合物を処置されないコントロールであるBalb/c-nudeマウスでは4匹中4匹が、肉眼でわかる肺転移を有した。
実施例3
腫瘍成長抑制アッセイにおいて、HT29癌細胞に対してモノクローナル抗体5D5を試験した。このアッセイは、5D5・75及び25μg/マウス、qod×15での免疫治療を、100mg/kgのCPT-11(イリノテカン/カンプト(Camptosar))、qwk×3と比較した。
腫瘍成長抑制アッセイにおいて、HT29癌細胞に対してモノクローナル抗体5D5を試験した。このアッセイは、5D5・75及び25μg/マウス、qod×15での免疫治療を、100mg/kgのCPT-11(イリノテカン/カンプト(Camptosar))、qwk×3と比較した。
材料と方法
メスの胸腺欠損ヌードマウス(Harlan)は、実験の1日目において13週齢であった。動物は水(逆浸透水、1ppm Cl)及びNIH 31が改変しかつ放射線を受けたLab Diet(商標)を自由に与えられた。LabDiet(商標)は、18.0%タンパク質、5.0%脂肪、及び5%繊維からなる。マウスを静かなマイクロ隔離飼育器中に、12時間の光サイクル、21〜22℃(70〜72°F)、及び40%〜60%の湿度で飼育した。
メスの胸腺欠損ヌードマウス(Harlan)は、実験の1日目において13週齢であった。動物は水(逆浸透水、1ppm Cl)及びNIH 31が改変しかつ放射線を受けたLab Diet(商標)を自由に与えられた。LabDiet(商標)は、18.0%タンパク質、5.0%脂肪、及び5%繊維からなる。マウスを静かなマイクロ隔離飼育器中に、12時間の光サイクル、21〜22℃(70〜72°F)、及び40%〜60%の湿度で飼育した。
腫瘍接種
HT29癌断片(1mm3)を、各マウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍が62.5〜126mgの大きさに達したら、群の平均腫瘍体重が84.2〜85.5mgとなるようにマウスを5個の処置群に分けた。見積もりの腫瘍重量を、以下の式:
[式中、w=HT29腫瘍の幅(mm)、及びl=HT29腫瘍の長さ(mm)]
を使用して計算した。
HT29癌断片(1mm3)を、各マウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍が62.5〜126mgの大きさに達したら、群の平均腫瘍体重が84.2〜85.5mgとなるようにマウスを5個の処置群に分けた。見積もりの腫瘍重量を、以下の式:
を使用して計算した。
5D5及びコントロールであるIgGの投与溶液を、リン酸緩衝生理食塩水で希釈することにより毎日新しく調製した。CPT-11(Pharmacia;20mg/ml)を投与する日に生理食塩水で希釈した。
1日目において、マウスを5の動物群へと分け(n=10/群)、そして以下の表3に記載されるプロトコルに従って投与を開始した。
1日目において、マウスを5の動物群へと分け(n=10/群)、そして以下の表3に記載されるプロトコルに従って投与を開始した。
陽性の対照薬剤として、CPT11を週に1度、100mg/kgの投与量で3週間投与した。CPT-11を0.2ml/体重20gの体積でi.p.でデリバリーし、ここでこの体積は体重により調整された。5D5又はコントロールのマウスIgGの投与量を、0.2ml/マウスの体積で静脈投与によりデリバリーした。抗体投与量は、体重により調整されなかった。未処置群Iのマウスは、CPT-11治療に対するコントロールとして役に立つ。群3のマウスは、15μg/マウスのコントロールIgG投与量を一日おきに1日1回受けた(qod×15)。群4及び群5のマウスは、75及び25ug/マウスの5D5の投与量×15をそれぞれ受けた。
評価項目
腫瘍成長抑制アッセイにおいて効力を評価した。31日目に試験を終わらせるまでに、週二回腫瘍を計測した。各動物を次に安楽死し、そしてそのHT29の腫瘍を切り離し、そして重量を測定した。処置により、動物において完全な腫瘍退行(CR)又は部分的な腫瘍退行(PR)が起こった。CR応答では、試験の終了時において、計測できる腫瘍体積が存在しない。PR応答では、腫瘍体重は開始日の重量より少ないが、0mgより重い重量であった。退行しない腫瘍を全て、腫瘍成長抑制の計算に含めた。
腫瘍成長抑制アッセイにおいて効力を評価した。31日目に試験を終わらせるまでに、週二回腫瘍を計測した。各動物を次に安楽死し、そしてそのHT29の腫瘍を切り離し、そして重量を測定した。処置により、動物において完全な腫瘍退行(CR)又は部分的な腫瘍退行(PR)が起こった。CR応答では、試験の終了時において、計測できる腫瘍体積が存在しない。PR応答では、腫瘍体重は開始日の重量より少ないが、0mgより重い重量であった。退行しない腫瘍を全て、腫瘍成長抑制の計算に含めた。
各動物の腫瘍重量の増加は、試験終了時の実際の腫瘍重量と一日目における計算された腫瘍重量との間の差として計算した。これらの値を群平均腫瘍重量増加を計算するために使用した。腫瘍成長抑制を以下の式:
により、処置及びコントロールマウスにおける群平均腫瘍重量の増加から計算した。
毒性
試験終了まで、週二回マウスの重量を計測した。薬剤に関連する有害副作用の臨床兆候についてマウスを頻繁に試験した。マウスの抗癌剤についての許容される毒性は、NIにより、試験の期間中において群平均体重減少が20%未満であり、かつ毒性死が10の処置動物において1以下であると定義される。
試験終了まで、週二回マウスの重量を計測した。薬剤に関連する有害副作用の臨床兆候についてマウスを頻繁に試験した。マウスの抗癌剤についての許容される毒性は、NIにより、試験の期間中において群平均体重減少が20%未満であり、かつ毒性死が10の処置動物において1以下であると定義される。
統計分析及び図解法分析
(平均値及び中央値、それぞれの分析に対し)対応のないt検定及びマン-ウィットニーU検定を使用して、処置群のマウスとコントロール群のマウスにおける平均腫瘍重量の差の統計的有意性を測定した。両側検定された統計分析をP=0.05で行った。
(平均値及び中央値、それぞれの分析に対し)対応のないt検定及びマン-ウィットニーU検定を使用して、処置群のマウスとコントロール群のマウスにおける平均腫瘍重量の差の統計的有意性を測定した。両側検定された統計分析をP=0.05で行った。
結果
効力:コントロール・マウスにおけるHT29大腸癌の成長
処置プロトコルを表3に記載した。群Iのマウスは、処置を受けず、そしてCPT-11及び5D5治療のコントロールとして役に立った。群3のマウスは、一日おきに75μg/マウスの投与量の無関係なマウスIgGを15回受けた(qod×15)。表4は、試験における全ての群の結果を要約する。31日目における腫瘍重量の平均値は、未処置マウス及びIgG処置マウスにおいて、それぞれ640.0と696.2mgであった。
効力:コントロール・マウスにおけるHT29大腸癌の成長
処置プロトコルを表3に記載した。群Iのマウスは、処置を受けず、そしてCPT-11及び5D5治療のコントロールとして役に立った。群3のマウスは、一日おきに75μg/マウスの投与量の無関係なマウスIgGを15回受けた(qod×15)。表4は、試験における全ての群の結果を要約する。31日目における腫瘍重量の平均値は、未処置マウス及びIgG処置マウスにおいて、それぞれ640.0と696.2mgであった。
腹腔内CPT-11治療に対するHT29異種移植片の応答
群2のマウスは、100mg/kgのCPT-11を腹腔内注射で、週一回、3週間処置した(qwk×3)(表3)。CPT-11に応答して腫瘍は退行しなかった。群3のマウスにおける最終平均腫瘍重量は、447.9mgであった(表4)。群2のマウスは、未処置マウスに比較して34.7%の腫瘍成長抑制を示した。図3において棒グラフで図示されるこの結果は、統計的に有意ではなかった(P=0.23.11、両側検定された対応のないt検定)。図4A〜Eは、キャリパー計測から計算された全ての処置群における各腫瘍の成長を示した。CPT-11処置により、腫瘍成長の勾配の減少した。
群2のマウスは、100mg/kgのCPT-11を腹腔内注射で、週一回、3週間処置した(qwk×3)(表3)。CPT-11に応答して腫瘍は退行しなかった。群3のマウスにおける最終平均腫瘍重量は、447.9mgであった(表4)。群2のマウスは、未処置マウスに比較して34.7%の腫瘍成長抑制を示した。図3において棒グラフで図示されるこの結果は、統計的に有意ではなかった(P=0.23.11、両側検定された対応のないt検定)。図4A〜Eは、キャリパー計測から計算された全ての処置群における各腫瘍の成長を示した。CPT-11処置により、腫瘍成長の勾配の減少した。
静脈内5D5免疫治療に対するHT29異種移植片の応答
5D5を群4及び群5のマウスに、qod×15の投与計画で、それぞれ75及び25ug/マウスで静脈内投与した(表3)。腫瘍の退行は観測されなかった。75及び25μg/mgのマウス5D5処置は、それぞれ543.5及び700.7の最終平均腫瘍重量をもたらした(表4)。5D5の高投与量は、未処置マウスの腫瘍成長に対し、HT29腫瘍成長を17.8%抑制した。群4マウスにおける腫瘍成長抑制は、未処置及びIgG処置マウスに対し統計的に有意ではなかった(P=0.6241及び0.453;t検定)。群5のマウスは、腫瘍成長の抑制を示さなかった。図3は、有意な腫瘍成長抑制の欠如を示し、大きなエラーバー(SEM)を与えた。図4A〜Eにより、75ug/マウスの5D5で処置される動物において腫瘍成長曲線の勾配が緩やかに減少することが示される。
5D5を群4及び群5のマウスに、qod×15の投与計画で、それぞれ75及び25ug/マウスで静脈内投与した(表3)。腫瘍の退行は観測されなかった。75及び25μg/mgのマウス5D5処置は、それぞれ543.5及び700.7の最終平均腫瘍重量をもたらした(表4)。5D5の高投与量は、未処置マウスの腫瘍成長に対し、HT29腫瘍成長を17.8%抑制した。群4マウスにおける腫瘍成長抑制は、未処置及びIgG処置マウスに対し統計的に有意ではなかった(P=0.6241及び0.453;t検定)。群5のマウスは、腫瘍成長の抑制を示さなかった。図3は、有意な腫瘍成長抑制の欠如を示し、大きなエラーバー(SEM)を与えた。図4A〜Eにより、75ug/マウスの5D5で処置される動物において腫瘍成長曲線の勾配が緩やかに減少することが示される。
副作用
全ての治療は、良好な耐容性を示した。最も高い群平均体重減少 (許容範囲である5.8%)は、CPT-11で処置されたマウスにおいて記録された。抗体処置されたマウスの体重減少は、3.6%又はそれ未満であった。
全ての治療は、良好な耐容性を示した。最も高い群平均体重減少 (許容範囲である5.8%)は、CPT-11で処置されたマウスにおいて記録された。抗体処置されたマウスの体重減少は、3.6%又はそれ未満であった。
考察
HT29大腸腫瘍異種移植モデルは、HT29細胞がラミニンを産生するため、5D5の評価に適していた。原発腫瘍の成長は、抗増殖剤、例えばCPT11により、並びに基層の浸潤を妨げる薬剤により抑制される。ラミニン5のγ2鎖に対するモノクローナル抗体、例えば5D5を、抗増殖剤、例えばCPT-11などと合わせて使用する組み合わせ治療は、本発明の一部として考えられる。治療効率は、腫瘍成長抑制、つまり31日間の試験におけるコントロールと処置動物群との間の平均腫瘍サイズ増加の差に基いている。25μg/マウスの投与量では、5D5に対する応答がなかったが、75μg/マウスの投与量で腫瘍成長を17.8%抑制した(表4及び図3)。こうして、5D5の75μg/マウスの投与量は、HT29大腸癌に対していくつかの治療効果をもたらす。一般的に、CPT-11及び5D5で治療されるマウスにおいて腫瘍成長曲線の勾配が減少する(図4A-E)。従って、これらの結果により、抗-ラミニン免疫治療が、ラミニン5分泌腫瘍のガン治療において適用性有するということが示された。
HT29大腸腫瘍異種移植モデルは、HT29細胞がラミニンを産生するため、5D5の評価に適していた。原発腫瘍の成長は、抗増殖剤、例えばCPT11により、並びに基層の浸潤を妨げる薬剤により抑制される。ラミニン5のγ2鎖に対するモノクローナル抗体、例えば5D5を、抗増殖剤、例えばCPT-11などと合わせて使用する組み合わせ治療は、本発明の一部として考えられる。治療効率は、腫瘍成長抑制、つまり31日間の試験におけるコントロールと処置動物群との間の平均腫瘍サイズ増加の差に基いている。25μg/マウスの投与量では、5D5に対する応答がなかったが、75μg/マウスの投与量で腫瘍成長を17.8%抑制した(表4及び図3)。こうして、5D5の75μg/マウスの投与量は、HT29大腸癌に対していくつかの治療効果をもたらす。一般的に、CPT-11及び5D5で治療されるマウスにおいて腫瘍成長曲線の勾配が減少する(図4A-E)。従って、これらの結果により、抗-ラミニン免疫治療が、ラミニン5分泌腫瘍のガン治療において適用性有するということが示された。
要約すると、定着したHT29大腸腫瘍は、5D5の75μg/マウスの投与量による治療に応答した。高投与量5D5の免疫治療は、CPT-11化学治療によりもたらされる50%の腫瘍成長抑制を達成した。図4A〜Eに示される腫瘍成長曲線により、5D5の免疫治療が、75μg/マウス又はそれ以上の投与量で大腸腫瘍成長を障害することができることを示した。
当業者は、さらにルーチンな実験を行なって、本明細書中に記載される発明の特定の態様に同等である実施態様を理解するだろうし、また確実にすることができるだろう。これら及び他の全ての同等である実施態様は、添付の特許請求の範囲により包含されるだろう。
Claims (13)
- 腫瘍を有する患者において腫瘍成長を抑制する医薬の製造のための、ラミニン5γ2鎖の1以上のエピトープに結合する抗体の使用。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の使用。
- 前記腫瘍が癌である、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記医薬が、1以上のさらなる抗腫瘍薬剤をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 前記さらなる抗腫瘍薬剤が、化学療法薬剤である、請求項4に記載の使用。
- ラミニン5γ2鎖のドメインIIIの1又は1以上のエピトープに結合するが、配列番号9及び10のアミノ酸配列内のエピトープに結合しない単離された抗体。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項5に記載の単離された抗体。
- 請求項5に記載の単離された抗体及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
- 請求項6に記載のモノクローナル抗体を発現する単離されたハイブリドーマ細胞。
- 腫瘍を有する患者において腫瘍成長抑制、腫瘍転移抑制、浸潤細胞の検出のうちの1以上を行う医薬の製造のための、請求項6〜8のいずれか1項に記載の単離された抗体の使用。
- ラミニン5γ2鎖のドメインIII内の1以上のエピトープに結合する抗体及びさらなる抗腫瘍薬剤を含む医薬組成物。
- 前記さらなる抗腫瘍薬剤が化学療法薬剤である、請求項6に記載の医薬組成物。
- 組織において浸潤細胞の存在を検出するための方法であって、
組織サンプルを請求項6〜8のいずれか1項に記載の抗体と接触させて、免疫複合体を形成し、そして
該免疫複合体の形成を検出することを含み、ここで該免疫複合体の形成が、上記組織における浸潤細胞の存在と相関する、前記方法。
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