CN114748627B - 可溶性cd58在胰腺癌预防和治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及可溶性CD58在胰腺癌预防和治疗中的应用。具体而言，肿瘤微环境中的局部高浓度可溶性CD58(sCD58)干扰T/NK细胞的有效黏附识别，阻碍T/NK细胞激活，减弱细胞毒性和释放细胞杀伤因子，促进了胰腺癌细胞的免疫逃逸，将sCD58作为治疗靶点为胰腺癌的预防和治疗提供了新策略。
Description
技术领域
本发明涉及生物、医学、临床诊断、肿瘤治疗领域。具体而言，涉及可溶性CD58在胰腺癌预防和治疗中的应用。
背景技术
胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是最具侵袭性和难治性的恶性肿瘤之一，约占所有胰腺癌的90％。PDAC患者的死亡率几乎等于其发病率，术后5年生存率仅为9％。
NCCN指南建议对任何分期的PDAC患者均应该考虑化疗，但化疗的疗效目前依然不尽如人意。PDAC有着特殊的肿瘤免疫微环境(Tumor immune microenvironment，TIME)，其显著特点是大量的免疫细胞浸润以及高度的免疫抑制状态，所以近年靶向免疫微环境联合化疗的免疫化疗成为了PDAC研究的潜在突破点之一。
针对PDAC癌细胞的化疗主要可以分为传统的细胞毒性方案和分子靶向方案。
细胞毒性方案涉及：吉西他滨(Gemcitabine，GEM)和氟尿嘧啶作为辅助治疗方案，但其反应率低于20％；以GEM为基础的联合方案，包括吉西他滨+卡培他滨的GEMCAP方案、纳米白蛋白紫杉醇+吉西他滨的AG方案；四药联合方案(FOLFIRINOX方案)，虽然细胞毒性增加，但反应率也达到了40％。
此外，超过75％的PDAC患者存在KRAS基因突变，以KRAS为靶点的分子靶向方案对PDAC疗效甚微。90％的PDAC细胞高表达EGFR，III期临床研究结果已经证实EGFR抑制剂未能提高GEM疗效。约5％的PDAC患者存在BRCA1/2基因突变，BRCA抑制剂奥拉帕尼对该类PDAC患者有一定的疗效，但并未延长总体生存期。
因此，本领域仍需探索针对胰腺导管腺癌的新治疗靶点。
发明内容
鉴于本领域的上述需求，根据一些实施方案，提供了靶向可溶性CD58的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于胰腺癌的预防和/或治疗，所述靶向可溶性CD58的试剂能够调节(尤其是降低、减少、阻断、抑制、中和、或失活)受试者中可溶性CD58的表达水平，所述表达水平是蛋白水平。
在一些实施方案中，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
在一些实施方案中，所述可溶性CD58位于选自以下的任一项或其组合：血清、血浆、全血、肿瘤组织的分泌上清、肿瘤微环境。
在一些实施方案中，所述靶向可溶性CD58的试剂是特异于可溶性CD58的抗体或其抗原结合片段。
在另一些实施方案中，所述靶向可溶性CD58的试剂是阻断可溶性CD58从膜型CD58上脱落的试剂(如酶抑制剂)。
在一些实施方案中，所述靶向可溶性CD58的试剂是多克隆抗体或单克隆抗体。
在一些实施方案中，当用于人的预防或治疗时，所述靶向可溶性CD58的试剂优选是人源化的抗sCD58抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自以下的任一项或其组合：Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、单域抗体、单链Fab、双抗体、线性抗体、scFv、多特异性抗体。
在一些实施方案中，所述胰腺导管腺癌的分期选自以下的任一项或组合：IIA、IIB、III、IV期。
在一些实施方案中，受试者是已经患有胰腺导管腺癌的受试者。
根据一些实施方案，还提供了可溶性CD58的定量试剂和膜型CD58的定量试剂的组合在制备检测装置中的用途。
在一些实施方案中，所述检测装置是选自以下的任一项或组合：试剂盒、孔板、芯片、试纸。
在一些实施方案中，所述可溶性CD58的定量试剂和所述膜型CD58的定量试剂在相同或不同容器。
在一些实施方案中，所述检测装置用于确定胰腺导管腺癌中癌细胞的免疫逃逸状态。
在一些实施方案中，所述可溶性CD58的定量试剂能够确定受试者中可溶性CD58的表达水平，所述表达水平是蛋白水平。
在一些实施方案中，所述膜型CD58的定量试剂能够确定受试者中膜型CD58的表达水平，所述表达水平是蛋白水平。
在一些实施方案中，所述定量试剂是选自以下任一项：抗体、抗原结合片段、质谱鉴定试剂。
在一些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体源自：鼠、兔、马、禽、羊、骆驼科、犬、牛、灵长类、重组抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自以下的任一项或其组合：Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、单域抗体、单链Fab、双抗体、线性抗体、scFv、多特异性抗体。
在一些实施方案中，所述可溶性CD58位于选自以下的任一项或其组合：全血、血浆、血清、肿瘤组织的分泌上清、肿瘤微环境。
在一些实施方案中，所述膜型CD58位于肿瘤组织表面。所述膜型CD58选自以下的任一项或其组合：跨膜亚型CD58、GPI锚定亚型CD58。
在一些实施方案中，相较于对照样本的比值，当可溶性CD58/膜型CD58的比值更高，判定受试者中胰腺癌细胞发生免疫逃逸的风险增加、或判定受试者中肿瘤微环境的免疫抑制状态更显著。
在一些实施方案中，对照样本来自未患胰腺导管腺癌的个体。
在一些实施方案中，所述对照样本来自以下的任一项或其组合：胰腺低度恶性肿瘤的个体、胰腺良性疾病的个体、健康个体。
在一些实施方案中，所述胰腺导管腺癌的分期选自以下的任一项或组合：IIA、IIB、III、IV期。
附图说明
图1：七种胰腺癌细胞系中，验证TGF-β1和CD58在转录水平上的相关性(Spearman相关，P＝0.0161)。
图2：流式细胞术检测胰腺癌细胞表面mCD58的表达水平。
图3：ELISA检测胰腺癌细胞上清中sCD58的含量。
图4：胰腺癌细胞上清中TGF-β1(ng/l/106细胞)和sCD58(ng/ml/106细胞)含量的相关性(Spearman相关，P＝0.0029)。
图5：胰腺癌细胞上清中TGF-β1(ng/l/106细胞)和细胞表面mCD58的表达水平(MFI)。均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图6A和图6B：流式细胞术检测共培养后胰腺癌细胞表面mCD58的表达。
图7：ELISA检测共培养后培养液中sCD58的含量(ng/ml)。
图8A和图8B：Western blot检测rTGF-β1和SB431542分别刺激和阻滞TGF-β/smad2/3信号通路激活的蛋白验证和CD58的蛋白表达。
图9A和图9B：流式细胞术检测rTGF-β1和SB431542分别刺激和阻滞TGF-β/smad2/3信号通路后，PDAC细胞膜表面mCD58(跨膜+GPI亚型)的表达(MFI)。
图10：ELISA检测rTGF-β1和SB431542分别刺激和阻滞TGF-β/smad2/3信号通路后，培养液上清中sCD58的含量(ng/ml)。平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图11A和图11B：PDAC患者血清中sCD58和TGF-β1的含量(Mann-Whitney检验)。
图12：PDAC中I期和II期患者血清sCD58和TGF-β1的含量差异对比(Kruskal-Wallis H检验)。
图13A至图13E：临床常用肿瘤标志物在PDAC患者血清中的水平，包括CA199、CEA、CA125、CA153以及AFP(Mann-Whitney检验)。所用检验均为非参数非配对Wilcoxon秩和检验，该换算并不影响最终的检验结果。肿瘤标志物存在部分缺失值，每种指标的例数已标记于统计图中括号内。n.s.不显著，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001。
图14A和图14B：LDH释放实验评估CD58过表达和rm-cd58对CTL细胞毒性的影响。
图15A和图15B：各组的皮下瘤照片。其中，lv-cd58+rm-cd58组为过表达CD58小鼠胰腺细胞荷瘤周围注射100μl浓度为5μg/ml的rm-cd58，每周两次。四周后，在戊巴比妥麻醉状态下颈椎脱臼法处死小鼠，取下皮下瘤称重、拍照。Panc02(图15A)每组8只；KPC(图15B)每组10只。
图16A和图16B：皮下瘤体积监测。利用游标卡尺对小鼠皮下瘤块的长短径进行测量，并计算体积(mm3)。
图17A和图17B：小鼠皮下瘤块质量对比(g)。
图18A和图18B：利用胶原酶将小鼠皮下瘤块消化为单细胞后，40μm滤网过滤，进行流式染色后(PerCP/Cy5.5)，上机进行流式检测和分析。
图18C：小鼠皮下接种前后胰腺癌细胞悬液CD58阳性率的对比。
图19A：各组瘤块HE染色，放大倍数：400×。
图19B：皮下瘤块CD58的免疫组化染色，放大倍数：400×。平均值±SD，n.s.不显著。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图20A至图20D：流式细胞术检测小鼠皮下瘤块内浸润NK细胞中CD107a+和NKG2D+的比例。均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图20E至图20H：流式细胞术检测小鼠皮下瘤块内浸润CTL细胞中CD107a+和穿孔素+比例。流式染色标记荧光分别为：CD49b-PE、CD107a-BV510、NKG2D-APC、CD8-PerCP/Cy5.5、穿孔素-PE。均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图21A：小鼠腹腔种植瘤模型建立，典型图展示，每组5只。圈内为肿瘤播散种植区域。
图21B：各组小鼠体重(g)。
图21C至图21D：各组小鼠腹腔内浸润CD3+淋巴细胞流式分析。均值±SD，n.s.不显著。*P<0.05，**P<0.01。
图22A至图22D：流式细胞术检测小鼠腹腔灌洗液中NK细胞中CD107a+和NKG2D+的比例。均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图22E至图22H：流式细胞术检测小鼠腹腔灌洗液中CTL细胞中CD107a+和穿孔素+比例。流式染色标记荧光分别为：CD49b-PE、CD107a-BV510、NKG2D-APC、CD8-PerCP/Cy5.5、穿孔素-PE。均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图23A至图23B：ELISA分别检测各组小鼠腹腔灌洗液中IFN-γ和TNF-α的含量。均值±SD，*P<0.05，**P<0.01。
图23C：各组小鼠脾脏质量(g)。均值±SD，*P<0.05，**P<0.01。
图24A和图24B：sCD58和TGF-β1的血清含量与胰腺癌患者预后的关联。
图25：胰腺癌细胞的免疫逃逸。
具体实施方式
术语
本申请所用术语“肿瘤微环境”是指：除肿瘤细胞外，癌灶中还存在间质成分，其由细胞和非细胞组分构成(包括上皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、免疫细胞以及细胞外基质和丰富的信号分子)，它们共同形成肿瘤所在的微环境。
CD58又称淋巴细胞功能相关抗原-3(Lymphocyte function associatedantigen-3，LFA-3)。CD58是一种高度糖基化的细胞粘附分子。CD58有两种亚型，其分别来源于不同的mRNA剪接：跨膜亚型和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的亚型。跨膜亚型具有一个胞外域，有6个N-连接糖基化位点依次连接到一个疏水跨膜区和一个12个氨基酸的胞浆段。GPI锚定亚型通过无跨膜区和胞浆结构域的GPI尾锚定在细胞膜的外侧。两种亚型在细胞内的定位不同：GPI锚定亚型位于脂筏，而跨膜亚型位于非筏微区。
CD58应作做广泛的解读，是指CD58基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于CD58基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。作为一个示例，CD58是CD58的亚型，例如但不限于可溶性CD58、GPI锚定亚型、或跨膜亚型。作为一个示例，CD58是人可溶性CD58。
在本申请上下文中，膜表面CD58或膜型CD58(简称mCD58)是跨膜亚型CD58和GPI锚定亚型CD58的统称。
在本申请上下文中，可溶性CD58(简称sCD58)是一种可溶性蛋白或多肽，它源自跨膜亚型CD58和/或GPI锚定亚型CD58经酶水解的胞外域。应当知晓的是，受切割位点和水解酶类型的影响，sCD58的氨基酸序列不严格一致，氨基端或羧基端可以存在截短。sCD58脱落释放至细胞外，而能够在血清、尿液、胸腔积液等体液以及体外细胞培养上清中被检测到。
TGF-β1应作做广泛的解读，是指TGF-β1基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于TGF-β1基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。作为一个示例，TGF-β1是人TGF-β1。
靶向试剂
在本申请中，靶标是指本申请的靶向试剂所针对的客体；其可以是核酸(基因、mRNA等)，也可以是蛋白(前体、同种型)。作为一个示例，靶标是抗原(如，但不限于sCD58或其表位)作为靶标。
靶向试剂是指能够在蛋白或核酸水平调节靶标水平、活性或其下游通路的试剂。
在一些实施方案中，靶向试剂是靶向sCD58的试剂，能够调节受试者中sCD58的表达水平、活性或其下游通路(如CD2-CD58轴)。在具体的示例中，所述表达水平是蛋白水平。
在一些实施方案中，所述调节是指负向调节，其选自以下的任一项：降低、减少、阻断、抑制、中和、失活。
在一些实施方案中，当在蛋白水平调节靶标时，靶向sCD58的试剂是抗sCD58的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗sCD58的抗体或其抗原结合片段中和(或捕获)受试者中的sCD58，或使其失活，从而降低sCD58在血清、血浆、全血、肿瘤组织的分泌上清、或肿瘤微环境中的有效浓度。
在又一些实施方案中，抗sCD58的抗体或其抗原结合片段阻断受试者中sCD58的下游通路，从而使得sCD58不能通过其下游分子发挥作用。
“抗原”是指能够由抗原结合蛋白(例如抗体)所特异性识别或结合的分子或分子部分。抗原可具有一个或多个表位。“表位”指能够与抗体或其抗原结合片段特异性结合的抗原上的区域。表位可以由连续氨基酸串(线性表位)形成；或包含非连续氨基酸(构象表位)。
“能够特异性结合”、“特异性结合”或“结合”是指相比其他抗原或表位，抗体能够以更高的亲和力结合至靶标抗原或其表位。通常地，抗体以约1×10-7M或更小(例如约1×10-8M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或其表位。可使用已知的方法来测量KD，例如通过表面等离子体共振测定法所测量的。
“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体；单特异性抗体，多特异性抗体；全长抗体和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性即可。
“抗体片段”或“抗原结合片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原(如sCD58)相结合。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、单域抗体、单链Fab(scFab)、双抗体、线性抗体、scFv；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
技术人员理解，本申请的技术效果不依赖与特定的抗体株，只要是能够靶向靶标(如sCD58)的抗体或其抗原结合片段都能够实施本申请的技术方案，可以是市售抗体或实验室制备的抗体。
在另一些实施方案中，靶向sCD58的试剂是酶抑制剂，其抑制sCD58从膜型CD58上脱落，从而降低sCD58在血清、血浆、全血、肿瘤组织的分泌上清、或肿瘤微环境中的有效浓度。
在一些实施方案中，解整合素和金属蛋白酶17(ADAM17)作为胞外酶对细胞膜表面蛋白分子进行酶解和剪切，使膜蛋白分子胞外域脱落至细胞外。
在一些实施方案中，靶向sCD58的试剂是ADAM17的抑制剂，如ADAM17的拮抗性抗体。
靶向sCD58的试剂的用途
在一些实施方案中，提供了根据本申请的靶向sCD58的试剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于胰腺癌的预防和/或治疗。
在本申请上下文中，胰腺癌根据WHO分类(2010版)，按照组织起源，胰腺肿瘤可分为：上皮性肿瘤、间叶性肿瘤、生殖细胞性肿瘤、继发性肿瘤；其中，上皮性肿瘤分为外分泌肿瘤和内分泌肿瘤。
在一些实施方案中，外分泌肿瘤分为：
-良性肿瘤：腺泡细胞囊腺瘤、浆液性囊腺瘤；
-癌前病变：胰腺上皮内肿瘤3级(PanIN-3)、导管内乳头状黏液性肿瘤伴轻-中度非典型增生、导管内乳头状黏液性肿瘤伴重度非典型增生、导管内管状乳头状肿瘤、黏液性囊性肿瘤伴轻度-中度不典型增生、黏液性囊性肿瘤伴高度不典型增生、
-恶性肿瘤：导管腺癌、腺鳞癌、胶样癌(黏液性非囊性癌)、肝样腺癌、髓样癌、印戒细胞癌、未分化癌、未分化癌伴破骨样巨细胞、腺泡细胞癌、腺泡细胞囊腺癌、导管内乳头状黏液性肿瘤伴有间质浸润、混合性腺泡-导管癌、混合性腺泡-内分泌癌、混合性腺泡-内分泌-导管癌、混合性导管-内分泌癌、黏液性囊性肿瘤伴浸润性癌、胰腺母细胞瘤、浆液性囊腺癌、实性-假乳头状肿瘤。
在一些实施方案中，内分泌肿瘤分为：胰腺神经内分泌微腺瘤；非功能性神经内分泌瘤(NET，G1、NET，G2)；神经内分泌癌NEC(小细胞NEC、大细胞NEC)；5-羟色胺生成性神经内分泌瘤；胃泌素瘤；胰高血糖素瘤；胰岛素瘤；生长抑素瘤；肠道血管活性肽瘤。
在一些具体的实施方案中，根据本申请的靶向sCD58的试剂用于制备预防和/或治疗胰腺导管腺癌的药物。
在一些实施方案中，胰腺癌分期可采用AJCC第八版的TNM分期，根据胰腺肿瘤大小、有无淋巴结转移、有无肝、肺等远处转移等因素，分成I期(A、B)、II期(A、B)、III期、IV期。
在一些实施方案中，先进行TNM分期，再根据TNM分期确定临床分期。
在一些实施方案中，TNM分期：
在一些实施方案中，临床分期：
IA：T1N0M0；IB：T2N0M0；
IIA：T3N0M0；IIB：T1至3N1M0；
III：T任意N2M0、或T4N任意M0；
IV：T任意N任意M1。
在一些具体的实施方案中，本申请的靶向试剂或药物尤其适用于胰腺导管腺癌受试者。在一些具体的实施方案中，本申请的靶向试剂或药物尤其适用于II期和以上(IIA、IIB、III、IV期)的胰腺导管腺癌受试者。
定量试剂
本申请提供一种定量试剂，其是可溶性CD58的定量试剂。
本申请还提供一种定量试剂，其是膜型CD58的定量试剂。
可溶性CD58的定量试剂是指能够确定sCD58是否存在(定性)或确定sCD58水平(定量)的试剂。在具体的示例中，所述确定是在蛋白水平上的确定。
膜型CD58的定量试剂是指能够确定mCD58(跨膜和GPI锚定亚型)是否存在(定性)或确定mCD58水平(定量)的试剂。在具体的示例中，所述确定是在蛋白水平上的确定。
在一些实施方案中，当在蛋白水平确定靶标(sCD58或mCD58)是否存在或确定靶标水平时，定量试剂是抗-靶标的抗体或其抗原结合片段。
技术人员理解，本申请的技术效果不依赖与特定的抗体株，只要是能够靶向sCD58或mCD58的抗体或其抗原结合片段都能够实施本申请的技术方案，可以是市售抗体或实验室制备的抗体。
在具体的实施方案中，任何检测和/或定量蛋白的试剂都可用于本申请的技术方案。例如，在一些实施方案中，所述定量试剂是质谱鉴定试剂(也涉及质谱鉴定靶标所用的定量参数)。比如，可以采用液质联用的方式定性/定量蛋白或多肽。技术人员理解，根据质谱仪的具体类型，可以自行调整仪器的鉴定模式。
作为一个示例，当采用质谱鉴定试剂时，使用非数据依赖性的采集方法和平行反应监测。非数据依赖性的采集方法将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。平行反应监测是一种基于二级质谱信号的靶标质谱定量分析技术，相较于传统的选择反应监测技术，不需要预先设计靶标蛋白的母离子/子离子配对信息，节约实验设计和操作时间；且选择性更高，灵敏度更佳，重现性更好，在复杂背景中的抗干扰能力更强。相较于免疫方法，不再受制于商业化抗体，克服了基于免疫方法对抗体特异性和滴度的限制。平行反应监测技术能够同时对多种蛋白质进行定性和定量分析。
标签肽是指能够代表某一个蛋白的肽段，其特征在于存在且特异性仅存在于某蛋白质氨基酸序列中。在一些实施方案中，本申请的定量试剂能够识别、或结合、或搜索、或监测、或靶向到这样的标签肽(如sCD58、mCD58中的序列)。
尽管具体示例中将基于特定的某段序列对蛋白进行了鉴定和定量，但是这不意味着靶标中其他位置的肽片段不能使用，只要这样的片段能将不同的蛋白彼此区分开，就适用于本申请。在本申请的教导下，技术人员根据常规技术结合所用鉴定方法的操作要求，便可确定片段的位置或长度。
在一些实施方案中，当在核酸(如RNA)水平确定靶标是否存在或确定靶标水平时，定量试剂是引物(对)或探针的形式，其识别并结合靶标核酸的一段或全长序列。
引物是指在核苷酸聚合作用起始时，促进合成的一种具有特定核苷酸序列的分子。引物通常是人工合成的两段核苷酸序列，一个引物与靶标区域(或模板、靶标序列)的一端互补，另一个引物与靶标区域的另一端互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，从而核酸聚合酶能够顺着其3’端开始合成新的核苷酸链。
引物可以是DNA引物或RNA引物。在本申请具体的示例中，优选RNA引物。应当理解的是，RNA引物所对应的DNA引物仍落入本申请的范围。由于引物通常以一对的形式出现，因此称为引物对。引物对中的一个引物特异于靶序列的上游，作为正向引物；另一个引物特异于靶序列的下游，作为反向引物。
当给定靶标序列时，技术人员根据教科书和核苷酸序列互补原理(例如《分子克隆实验指南》2017；P450“使用Primer3 Plus设计PCR引物”；第13章“标记的DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针的制备”)，知晓引物扩增靶向序列的原理、知晓探针结合靶向序列的原理，也清楚引物和探针的设计原则。现有技术中有多种引物/探针的设计软件，例如PrimerPremier、Oligo7、BeaconDesigner等。当技术人员知晓靶标序列时，可以涉及并获得特异性的引物或探针的序列信息和结构信息。因此，本申请的技术方案不限于特定的引物对或探针序列。作为一个示例，引物/探针的长度不超过50个nt。
应当理解，尽管具体示例中采用特定的鉴定方式及其对应的定量试剂，但是本申请技术效果的实现并不依赖于特定方式(例如质谱操作步骤、质谱仪型号、质谱方法中设定的参数、质谱鉴定中所识别的特定肽段序列、色谱柱型号、供应商、抗体株、抗体靶向的表位)，这是因为本申请技术方案的核心在于发现了sCD58/mCD58在样本中的比值与免疫逃逸之间的关系，因此任何确定蛋白含量的手段都是可用的。
根据本申请的定量试剂能够在选自以下的样本中对sCD58表达水平进行确定：全血、血浆、血清、肿瘤组织的分泌上清、或肿瘤微环境。
根据本申请的定量试剂能够确定肿瘤组织表面mCD58的表达水平。
根据本申请的一种或多种定量试剂可以以缀合物或标记的形式存在，以获得可检测/可定量的信号。当与合适的标记或可检测的生物分子(或化学物质)一起使用时，定量试剂尤其可用于体外和体内的诊断、检测或定量应用。
用于免疫分析的标记是本领域技术人员已知的，并且包括酶、放射性同位素、荧光、发光、颗粒(如胶乳、磁颗粒)、显色物质(例如胶体金)。
定量试剂的用途
在一些实施方案中，可溶性CD58的定量试剂和膜型CD58的定量试剂联合用于制备检测装置。
技术人员知晓，检测装置可以体现为任何已知的或将来的形式，例如但不限于试剂盒、试纸、孔板、或芯片的形式。
在一些实施方案中，检测装置包含至少一个容器，容器中分别包含本申请的一种或多种定量试剂。
所述可溶性CD58的定量试剂和所述膜型CD58的定量试剂在相同或不同容器。
所述可溶性CD58的定量试剂和所述膜型CD58的定量试剂固定/包被/吸附在相同或不同的支持物(如微珠、孔板、磁颗粒、芯片等)上。
所述可溶性CD58的定量试剂能够确定受试者(全血、血浆、血清、肿瘤组织的分泌上清、或肿瘤微环境)中可溶性CD58的表达水平。所述膜型CD58的定量试剂能够确定受试者中(肿瘤组织表面)膜型CD58的表达水平。可溶性CD58/膜型CD58表达水平的比值，被定义为IEV值。
在一些实施方案中，检测装置用于确定胰腺导管腺癌中癌细胞的免疫逃逸状态。
作为一个示例，抗体(或抗原结合片段)结合样本中的靶标(如sCD58、mCD58)，从而实现对靶标(如sCD58、mCD58)的可视化、量化、分选、和/或富集。当定量试剂和靶标的结合基于抗原-抗体相互作用时，所述检测装置可以是现有技术中任何适当的形式，包括但不限于ELISA检测试剂、免疫比浊检测试剂、磁颗粒检测试剂、化学发光检测试剂、放射免疫检测试剂、免疫荧光检测试剂。
例如，在ELISA中，当定量试剂用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，可检测的发色团或荧光团的底物)。此外，可以包括其他添加剂，如稳定剂、缓冲剂等。这种试剂盒可以包含一个或多个容器(如瓶、管等)。一个容器含有结合至不溶性或部分可溶性载体的定量试剂；第二容器可含有冻干形式或溶液中可溶性的可检测标记的二抗。可以提供标签或包装插页描述用途。
作为又一个示例，当采用质谱鉴定试剂时，定量试剂作广泛理解，不能仅解释为实体存在的化学、生物试剂。质谱鉴定试剂也包含质谱鉴定参数。当检测装置制备成适用于质谱鉴定时，还任选包含选自以下的任一项或其组合：色谱柱、胰蛋白酶、流动相、洗脱相、载剂等试剂或组件。
药物、药物组合物、药盒
在一些实施方案中，药物或药物组合物包含本申请的一种或多种靶向试剂。
药物组合物表示含有一种或多种本文所述的活性成分与其他化学组分的混合物，例如所述其他组分是生理学/药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体指制剂中与活性成分不同的且对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
本申请的靶向试剂、药物或药物组合物可方便地以单位剂量呈现。技术人员理解，过大或过小的单位剂量导致临床操作不便。因此，当本申请的靶向试剂、药物或药物组合物注射施用于人类个体时，单位剂量优选在0.5ml至1.0ml范围内。当本申请的组合物静脉注射于人类个体时，单位剂量优选在30.0ml至100.0ml范围内。此处应当理解的是，单位剂量虽然以体积进行表示，但是这并不意味着本申请的靶向试剂、药物或药物组合物只能是液体形式。当本申请的靶向试剂、药物或药物组合物制备成固体(干粉或冻干粉)时，单位剂量的体积是指干粉或冻干粉重新配制后的体积。
在一些实施方案中，本申请的靶向试剂、药物或药物组合物可以包含明胶、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚山梨醇酯20、甘露醇聚乙二醇、人血白蛋白、重组白蛋白、辛酸钠、尿素、氢氧化铝、酚红、氯化镁、氯化钾、氯化钠、硫代硫酸钠、磷酸二氢钾、抗坏血酸、三氯甲烷、苯酚、硫柳汞中的一种或上述物质的组合，以到达稳定活性成分的目的。
在一些实施方案中，本申请的靶向试剂、药物或药物组合物还可以包含生理上可接受的缓冲液，选自：乙酸盐、三羟甲基氨基甲烷、碳酸氢盐、碳酸盐、磷酸盐缓冲液。适用于本申请靶向试剂、药物或药物组合物的缓冲液pH值选自：6.50、6.60、6.70、6.80、6.90、7.00、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.30、7.35、7.40、7.45、7.50、7.55、7.60、7.65、7.70、7.75、7.80、7.85、7.90、7.95、8.00以及上述任意两点之间的范围。
本申请的靶向试剂、药物或药物组合物可被制备成为干粉、液态溶液(例如，可注射型溶液、生理盐水溶液，或悬浮液、乳剂、凝胶、糖浆)、片剂、包衣片剂、颗粒、糖衣锭、胶囊。优选，本申请的靶向试剂、药物或药物组合物被制备成为可注射型溶液。
在一些实施方案中，本申请的靶向试剂、药物或药物组合物尤其制备成静脉注射液或瘤周注射液。
在一些实施方案中，本申请的靶向试剂、药物或药物组合物配制于无菌液体内，并且装在无菌容器(如管、瓶、安瓿、注射器)内。
在另一些实施方案中，本申请的靶向试剂、药物或药物组合物以干粉或冻干粉的形式装在容器内。临用前，配制成液体形式。
在一些实施方案中，药盒包含至少一个容器，容器中分别包含本申请的一种或多种靶向试剂、药物或药物组合物。
在一些实施方案中，本申请的药盒还包含选自以下的一项或其组合：针头、注射用水、使用说明书。
预防或治疗方法
根据一些实施方案，提供一种预防或治疗胰腺癌的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请的靶向试剂、药物或药物组合物。
“施用”意指向受试者提供本申请的靶向试剂、药物或药物组合物。所述受试者具有一种或多种胰腺癌的症状。通常，在受治疗受试者或受试者群体中以有效缓解一种或多种胰腺癌症状的量施用靶向试剂、药物或药物组合物。
有效缓解任何胰腺癌症状的治疗剂的量(称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价胰腺癌的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价胰腺癌是否已被减轻。
具体实施方案中的有效量，可以从来源于动物模型测试系统的剂量-应答曲线而得到，并允许根据医生的判断和每位受试者的情况来决定。其中，动物和人的用药量的相互关系描述于Freireich等人1966，Cancer Chemother Rep 50：219，且人体表面积可以近似地由患者的身高和体重确定。
在一些具体的实施方案中，提供了一种胰腺癌的预防或治疗方法，其包括步骤：使受试者接触有效量的本申请的一种或多种靶向试剂、药物或药物组合物。
在一些实施方案中，施用是系统性的(也作全身性)或局部的。在一些实施方案中，通过胃肠道外(如肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、皮内、瘤内、瘤周注射)注射来施用本申请的靶向试剂、药物或药物组合物。在其它实施方案中，本申请的靶向试剂、药物或药物组合物是以注射以外的方式(例如不以机械装置来破坏上皮细胞障壁的方式)经皮内传输。在另一些实施方案中，本申请的靶向试剂、药物或药物组合物是通过直肠、阴道、鼻、口、舌下、呼吸道、眼、或透皮的途径而施用。
在一些实施方案中，按照选自以下的频率向个体施用本申请的靶向试剂、药物或药物组合物：两个月3次、两个月4次、两个月5次、两个月6次、一个月1次、一个月2次、一个月3次、一个月4次、一个月5次、三周1次、三周2次、三周3次、三周4次、三周5次、三周6次、每周1次、每周2次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每周7次、两天1次、每天1次。
确定免疫逃逸状态的方法
在一些实施方案中，提供了一种用于确定胰腺导管腺癌中癌细胞的免疫逃逸状态的方法，包括步骤：
1)提供来自对照样本或受试者的样本；
2)使样本(例如分别)接触有效量的可溶性CD58的定量试剂和膜型CD58的定量试剂；
3)确定样本中可溶性CD58/膜型CD58的比值；
4)将样本中可溶性CD58/膜型CD58的比值和对照样本中可溶性CD58/膜型CD58的比值(或参照水平)进行比较；
5)根据步骤4)的比较结果，判定受试者受试者中胰腺癌细胞发生免疫逃逸的状态。
有效量是指足以确定靶标表达水平的量。这样的量是技术人员根据药物的类型、检测原理、样本类型、样本量、检测标记(如底物、荧光类型)、定量试剂的剂型等因素而确定的。
受试者可以是已患有、疑似患有、易感于胰腺癌的受试者。
“已患有”应当做最广泛地理解，也包括在设定的显著水平处患有所述疾病的概率在统计学上显著高于对照。
“样本”可以是可以从受试者获取的样本。这样的样本允许确定本申请的生物标志物的表达水平。因此，样本的性质将因此取决于肿瘤/癌症的性质、状态。
在一些实施方案中，样本包括血液、血浆、血清、淋巴液、间质液、组织液、肿瘤组织的分泌上清。
在一些实施方案中，样本是肿瘤组织。
参照样本、对照样本、对照可互换使用。在一个实施方案中，对照来自健康和/或无目标疾病的个体。
受试者中靶标的比值相对于对照样本中靶标的比值(可称为“对照水平”或“参照水平”)进行比较或测量。作为一个示例，“对照水平”是指在对照样本中测量的sCD58/mCD58比值；对照样本通常为无疾病或无癌症个体的样本、健康个体的样本、或者虽然患有其他疾病但未患胰腺导管腺癌的个体的样本。
例如，对照水平可以是采取各种形式的预定值。对照水平可以是单个截断值(如中位数或平均值)，可以是参考区间。对照水平可以根据患者的特定亚群而变化。因此，例如，同样的癌症，老年人可能具有与年轻人不同参考区间；以及同样的癌症，女性可能具有与男性不同的参考水平。预定值可以被设定，例如，将测试的群平均(或不平均)分成组，如低风险组、中等风险组、高风险组；或者按照疾病的分期进行分组。
显然，未患导管腺癌的群与患有导管腺癌的群具有不同的靶标比值的范围。所选择的预定值可以考虑群体的类别。本领域普通技术人员可以选择合适的范围和类别。“更高“、“升高”、“增加”、“提高”、“高于”是指，在设定的统计学显著水平上，相对于所选择的对照水平是高的。
在一些实施方案中，受试者中靶标的比值是对照样本中靶标的比值的1倍以上，例如但不限于至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70倍、以及更高。
在另一些实施方案中，受试者中靶标的比值相对于对照样本中靶标的比值，存在统计学上的显著差异，p设置为例如0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、甚至更低。例如，当两个个体或群体测量的比值，所得p值小于特定p值水平时，则认为两个个体或群体存在统计学上的显著差异。
本说明书中，当描述数值范围时，所用的表述“…至…”、“范围之内”或“范围之间”包含端点值。
“任选”意味着随后所描述地特征可以但不必发生，将指明包括该特征发生或不发生的场合。
“包括”、“包含”、“含有”是指：除了列出的特征要素以外，还可以有其他特征要素。
说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。
实施例
材料：对于免疫组化染色和Western blot实验，所用CD58抗体为abcam公司的货号ab196648(EP15041)，免疫原为CD58蛋白胞外段。对于胰腺癌细胞表面CD58的流式细胞术，针对膜型CD58(GPI+跨膜)的抗体为Biolegend公司的货号330917(TS2/9)。检测细胞培养液上清和血清中的sCD58，所用CD58抗体是货号MM-1518H1(EPR24012-147)，免疫原为CD58蛋白胞外段29-215aa。
实施例1.PDAC细胞膜表面CD58、上清可溶性CD58与TGF-β1的关系
对七种PDAC细胞系(即HPNE、Panc-1、AsPC-1、BxPC-3、Mia Paca-2、SW1990以及CFPAC-1)利用qRT-PCR在mRNA水平上检测TGF-β1和CD58的表达，发现两者呈显著正相关(P＝0.0161，图1)。从一定程度上证实了生物信息学分析中两者的相关性。然而，在TGF-β/smad2/3激活后，却检测到细胞膜上CD58(文中简称mCD58，跨膜+GPI锚定亚型)在蛋白表达水平的降低。
除了细胞膜上表达的CD58外，发现血清、尿液和体外细胞培养上清液中还存在一种可溶性CD58(sCD58)。利用流式细胞术和ELISA分别检测了PDAC细胞系的膜表面CD58(mCD58)的平均荧光强度(MFI)和培养液上清中sCD58的含量(ng/ml/106细胞)。结果发现，相比于永生化正常胰腺导管上皮细胞HPNE，PDAC细胞系中mCD58均显著升高(图2)，sCD58在Panc-1和SW1990细胞上清中显著升高(图3)。发现上清中的sCD58与TGF-β1呈显著正相关(P＝0.0029，图4)。同时，发现细胞膜表面的mCD58与上清中的TGF-β1具有负相关的倾向(图5)。
与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)间接共培养后，检测了PDAC细胞膜表面mCD58的表达和上清中的sCD58的含量，发现mCD58表达显著降低(图6A和图6B)，而sCD58含量明显升高(图7)。这种膜表面成分降低，而上清可溶性成分升高的现象，本申请首次将其称之为“表达分离”(Expressional separation，ES)。
为进一步明确该现象，利用具有生物学活性的重组人TGF-β1和SB431542(TGF-β/smad2/3通路阻滞剂)加入共培养体系的培养基中，分别刺激和阻滞PDAC细胞内TGF-β/smad2/3信号通路(图8A和图8B)。观察细胞膜表面mCD58的表达和培养液上清中sCD58的含量。结果发现，利用SB431542阻滞TGF-β/smad2/3信号通路后，PDAC细胞膜表面mCD58明显升高(图9A和图9B)，而培养液上清中sCD58的含量显著降低(图10)，即抑制了CD58的“表达分离”。
利用rTGF-β1刺激TGF-β/smad2/3信号通路后，PDAC细胞膜表面mCD58明显降低(图9A和图9B)，而培养液上清中sCD58的含量显著升高(图10)，即促进了CD58的“表达分离”。
最后，发明人利用si-smad2/3敲减设计了挽救实验(Rescue experiment)，更进一步地证实了上述结论。
发现转化生长因子TGF-β1能够促进胰腺癌细胞上清中sCD58的产生，同时伴随着膜型mCD58的降低。这提示TGF-β1通过Smad2/3信号通路诱导“CD58表达分离”(即mCD58表达减少，sCD58产生增多)，mCD58表达减少可以降低PDAC肿瘤细胞与T/NK细胞之间的黏附识别，促进免疫逃逸；而局部高浓度的sCD58积聚则可能抑制PDAC细胞和T/NK细胞之间的免疫应答过程，在微环境中发挥免疫抑制功能。
在整个肿瘤病灶所有细胞中，免疫炎性细胞占据相当比例，其中TAM是TME中最丰富的基质成分之一。TAM是促肿瘤炎症的重要驱动因素之一，这种促肿瘤炎症被认为是抑制抗肿瘤免疫应答和促进癌症进展的重要因素。从机制上讲，TAM可以重塑ECM结构，ECM通过TME促进癌细胞的侵袭和迁移，并通过分泌细胞因子、生长因子、趋化因子等与癌细胞或其他基质细胞进行相互作用。巨噬细胞是一种具有可塑性和多能性的细胞群体，在特定微环境中，静息巨噬细胞M0通常可极化为两种主要表型：M1型，即经典活化的促炎型(Classically activated macrophage)(M1；IFN-γ/LPS依赖性)；M2型，即替代性活化的抗炎型(Alternatively activated macrophage)(M2；IL-4/IL-13/IL-10依赖性)。M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能。M2型巨噬细胞仅有较弱抗原提呈能力，并通过分泌抑制性细胞因子IL-10或TGF-β等下调免疫应答，在免疫调节中发挥重要作用。M1和M2极化的TAM是一系列功能作用中连续体的两个极端，大多数TAM是M1和M2之间连续体中的可变状态。
进一步利用PDAC和M0共培养，发现经PDAC诱导的TAM中M2型标志物CD163和CD206显著上调；同时，TAM表达更少的M1型标志物(IFN-γ和iNOS)；而表达更多的M2型标志物(Arg-1和TGF-β1)。这证明PDAC能够诱导幼稚巨噬细胞M0向负性免疫和促瘤性的M2型方向转化，进而促进PDAC自身的恶性进展。
在本实施例中，发明人发现转化生长因子TGF-β1能够促进胰腺癌细胞上清汇总sCD58的产生，同时伴随着膜型mCD58的降低。除了CD58的表达水平，活化状态、分泌活性和内源性蛋白脱落酶水平可能是sCD58产生细胞依赖性差异的主要原因。
在T/NK细胞介导的靶细胞裂解中，T/NK细胞和靶细胞之间的黏附是随后活化和杀伤的必要先决条件。在抗原呈递过程方面，细胞膜表面mCD58为T淋巴细胞提供了第二信号，从而补充和优化了对TCR/CD3介导刺激的增殖反应。CD2是mCD58的天然配体，局限表达于T/NK细胞，并以高亲和力与靶细胞上的mCD58结合。CD2-mCD58相互作用是T细胞与靶细胞的主要黏附途径，同时也是T/NK细胞活化的关键共刺激通路。在高浓度下，sCD58可与CD2+T细胞结合，有效阻断细胞间黏附和T/NK细胞活化,并抑制人T/NK细胞毒性。
因而，转化生长因子TGF-β1通过Smad2/3信号通路诱导“CD58表达分离”，即mCD58表达减少，sCD58产生增多；mCD58表达减少可以降低PDAC肿瘤细胞与T/NK细胞之间的黏附识别，促进免疫逃逸；而局部高浓度的sCD58积聚则可能抑制PDAC细胞和T/NK细胞之间的免疫应答过程，在微环境中发挥免疫抑制功能。
实施例2.胰腺癌患者血清中的sCD58表达水平
结合实施例1的发现，发明人进一步验证肿瘤组织内积聚的高浓度sCD58是否通过肿瘤微环境新生血管释放入血(全血、血浆、血清)。
收集患者外周血血样，累计入组537例外周血血清样本。疾病类型包括：PDAC、非PDAC(胰腺低度恶性肿瘤、胰腺良性疾病、其他恶性肿瘤、以及健康对照)。
1.通过ELISA检测发现，sCD58存在于人血清中。在健康对照组，sCD58血清含量在277.04至363.59ng/ml之间，TGF-β1血清含量于833.57至1101.84pg/ml之间。在PDAC患者组，sCD58血清含量于224.49至405.52ng/ml之间，TGF-β1血清含量于726.49至1276.54pg/ml之间。
通过对PDAC患者和健康对照组血清比较，发现PDAC患者血清中sCD58和TGF-β1的含量均高于健康对照组(图11A和图11B)。血清sCD58在PDAC患者组和健康对照组分别为331.09ng/ml和318.01ng/ml；血清TGF-β1在PDAC患者组和健康对照组分别为，955.82pg/ml和1040.16pg/ml。
2.为了探究血清中sCD58和TGF-β1是否在PDAC的早期就已经升高，对PDAC患者临床病理分期中I期和II期(AJCC分期第八版)分别与健康对照血清进行对比。
结果表明，sCD58在I期中血清水平和健康对照组未见明显统计学差异，而在II期患者血清中sCD58出现升高；TGF-β1在I期中血清水平就显著上升，而在II期患者血清中TGF-β1依然维持在较高水平(图12)。此外，还比较了临床常用肿瘤标志物(包括CA199、CEA、CA125、CA153以及AFP)在PDAC患者血清中的水平。结果显示，PDAC患者血清中CA199、CEA以及CA125均显著升高，CA153未见明显统计学差异，而AFP明显降低(图13A至图13E)。
实施例3.sCD58抑制T/NK细胞的免疫杀伤
1.小鼠T/NK细胞CD2阳性率
在前述研究结果之上，推测sCD58可能作为假性分子通过竞争性抑制的方式与T/NK细胞表面CD2结合，造成T/NK细胞无法通过CD2-CD58轴对肿瘤细胞进行有效的免疫黏附和识别，进而使肿瘤细胞能够逃避T/NK细胞的免疫杀伤。
为验证前述推测，发明人首先分别利用T细胞和NK细胞试剂盒提取C57BL/6小鼠脾脏中的CD3+CD8+T细胞和CD3-NKp46+NK细胞。利用流式细胞分析T/NK细胞中CD2表达的阳性率。结果表明，T细胞和NK细胞CD2阳性率均近乎100％(数据未显示)。
2.胰腺癌细胞系Panc02和KPC稳转过表达CD58细胞的建立
通过慢病毒稳转过表达CD58载体(简称lv-cd58)，并利用终浓度2μg/ml嘌呤霉素筛选2-4周，获得了稳定过表达CD58的小鼠胰腺癌Panc02细胞和KPC细胞。
为了验证转染效果，分别利用荧光显微镜GFP观察、CD58免疫荧光染色共聚焦成像、流式细胞术检测膜表面CD58以及Western印记检测CD58蛋白表达情况，均提示CD58稳转成功(数据未显示)。
3.体外实验探究sCD58对T细胞毒性的影响
利用反复高温(60℃)灭活小鼠PDAC细胞Panc02和KPC，再将灭活后的PDAC细胞联合弗氏完全/不完全佐剂进行C57BL/6小鼠腹部皮下注射，每周一次，连续三周，从而获得对PDAC肿瘤细胞免疫记忆的小鼠。
提取小鼠脾脏T细胞，利用CD3/CD28磁珠联合IL-2刺激激活小鼠T淋巴细胞。激活的T细胞和小鼠PDAC细胞Panc02和KPC直接共培养24h，而后检测T细胞毒性和活化程度。利用小鼠PDAC细胞贴壁而T细胞为悬浮生长的特性很容易对两者进行分离。更进一步地，通过流式圈门策略获得GFP-CD8+T细胞群体进行分析。在显微镜下可以观察到直接共培养皿中T细胞对小鼠PDAC细胞Panc02和KPC的杀伤，即凋亡的PDAC细胞周围T细胞的聚集(数据未显示)。
利用重组小鼠CD58(简称rm-cd58)模拟sCD58(5μg/ml)加入CTL细胞和PDAC直接共培养皿中，观察rm-cd58对CTL细胞毒性的影响。通过LDH释放实验，发现过表达CD58后的PDAC细胞更容易遭受CTL细胞的攻击，而rm-cd58的加入减弱了CTL细胞的细胞毒性(图14A和图14B)。
CD107a和穿孔素与CTL细胞毒活性直接相关，可反映CTL细胞杀伤活性水平，也是探究CTL细胞功能免疫学实验中常用的标志物。利用流式细胞术对CTL细胞内CD107a和穿孔素进行了检测。结果显示，过表达CD58后的PDAC细胞显著提升CTL细胞CD107a和穿孔素的水平，而rm-cd58减低了CTL细胞CD107a和穿孔素的表达。
这些结果表明，sCD58通过破坏CD2-CD58轴干扰T细胞对肿瘤细胞的黏附识别，从而减弱了CTL细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤。局部注射sCD58拮抗性抗体以降低肿瘤微环境中的sCD58，可挽救对肿瘤细胞的免疫杀伤(数据未显示)。
实施例4.免疫健全C57BL/6小鼠皮下荷瘤实验
利用建立的稳转CD58的小鼠胰腺癌细胞系Panc02和KPC，通过小鼠皮下荷瘤实验探究和验证实施例3的体外实验结论。
将小鼠分为阴性对照组(NC组)、CD58过表达组(简称lv-cd58组)、CD58过表达联合rm-cd58组(简称lv-cd58+rm-cd58组)，分别于小鼠右下腹股沟区皮下接种小鼠胰腺癌细胞悬液。其中，联合rm-cd58组每周两次于瘤块周围皮下局部注射rm-cd58溶液。同时，每周定期监测小鼠体重和皮下瘤块体积变化。四周后，在麻醉状态下，颈椎脱臼法处死小鼠，取下皮下瘤称重和留样。
在四周的监测过程中，各组间小鼠体重未见明显统计学差异(数据未显示)。但可以明显观察到NC组、lv-cd58组以及CD58过表达联合rm-cd58组组间明显的差异(图15A和图15B)。皮下瘤体积监测发现，CD58过表达组瘤块体积明显小于对照组，而联合了rm-cd58之后的lv-cd58+rm-cd58组，其瘤块体积明显增大(图16A和图16B)。瘤块称重后，发现过表达CD58组小鼠皮下瘤块明显重于阴性对照组，而lv-cd58+rm-cd58组瘤块质量明显重于lv-cd58组(图17A和图17B)。随后，将瘤块用胶原酶消化为单细胞后，利用流式细胞术再次检测和确认小鼠胰腺癌细胞的CD58阳性率。
出乎意料的是，尽管lv-cd58组和lv-cd58+rm-cd58组瘤块内CD58阳性率依然高于阴性对照组(图18A和图18B)，但和接种前相比，均出现了明显的下降(图18C)。
有趣的是，而lv-cd58+rm-cd58组CD58阳性率显著高于lv-cd58组(图18A至图18C)。同时，还对皮下瘤块进行了HE染色和免疫组化染色(图19A和图19B)，瘤块CD58的免疫组化染色也证实了上述发现(图19B)。这很可能因为过表达CD58后因CD2-CD58的相互作用更容易遭受T/NK细胞的攻击，而局部高浓度的rm-cd58通过干扰CD2-CD58轴影响T/NK细胞的免疫黏附识别，对胰腺癌细胞起到保护作用。
利用流式细胞术对瘤块内浸润T/NK细胞浸润激活状态进行了评估。定义活化NK细胞为CD45+CD3-CD49b+CD107a+和CD45+CD3-CD49b+NKG2D+；活化CTL细胞为CD45+CD3+CD8+CD107a+和CD45+CD3+CD8+穿孔素+。对于浸润的NK细胞，lv-cd58组中CD107a+和NKG2D+的NK细胞比例显著高于阴性对照组，而在联合rm-cd58后，CD107a+和NKG2D+的NK细胞比例出现了明显的下降(图20A至图20D)。类似地，对于浸润的CTL细胞，lv-cd58组中CD107a+和穿孔素+的NK细胞比例显著高于阴性对照组，而在联合rm-cd58后，CD107a+和穿孔素+的NK细胞比例出现了明显的降低(图20E至图20H)。
结果表明，CD58过表达后，T/NK细胞更好地通过CD2-CD58的相互作用对胰腺癌细胞进行免疫杀伤，而局部高浓度的rm-cd58通过破坏CD2-CD58轴干扰T/NK细胞对胰腺癌细胞的免疫黏附识别，降低了T/NK细胞活化比例，促进免疫逃逸。局部注射sCD58拮抗性抗体可挽救T/NK细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤(数据未显示)。
为了实验的严谨性，排除CD58过表达后小鼠胰腺癌细胞本身生存活性和增殖能力减弱所导致的lv-cd58组瘤块体积减小的情况。采用集落形成实验和CCK-8增殖实验分别评估过表达CD58后对小鼠胰腺癌细胞生存活性和增殖能力的影响。将胰腺癌细胞分为三组，即未转染组(Blank组)、空载转染组(Normal control，NC组)、CD58过表达组(lv-cd58组)，观察上述实验在三组间的差异。结果显示，Blank组、NC组以及lv-cd58组在集落形成实验和CCK-8增殖实验中均无显著统计学差异。
实施例5.免疫健全C57BL/6小鼠腹腔种植瘤模型
为了更进一步地验证上述结论，建立了免疫健全小鼠C57BL/6腹腔肿瘤种植模型。
将小鼠分为4组：PBS组、阴性对照组(NC组)、CD58过表达组(lv-cd58组)、CD58过表达联合rm-cd58(lv-cd58+rm-cd58组)。在注射小鼠胰腺癌细胞悬液两周后，颈椎脱臼发处死小鼠，进行腹腔灌洗，观察小鼠腹腔内肿瘤种植情况。同时，分别利用流式细胞术和ELISA分析和检测腹腔灌洗液中免疫炎性细胞浸润情况和免疫炎性因子含量，评估免疫细胞对小鼠胰腺癌细胞的杀伤情况。其中，lv-cd58+rm-cd8组是在注射过表达CD58胰腺癌细胞悬液之前30min，腹腔内注射rm-cd58溶液，5μg/只，充分弥漫腹腔。
结果显示，胰腺癌细胞成功在NC组小鼠腹腔内形成多处转移灶和广泛播散，主要集中于小鼠肠系膜、两侧腹股沟区以及肝胃周围；和NC组相比，lv-cd58组小鼠腹腔内胰腺癌细胞播散种植情况明显减轻；而在联合rm-cd58后，小鼠腹腔内种植播散情况又变得更为严重(图21A)。小鼠体重维持在24g左右，各组间均无明显统计学差异(图21B)。腹腔灌洗液流式分析发现，在注射肿瘤细胞悬液后，NC组CD3+淋巴细胞浸润比例明显升高；而过表达CD58后(lv-cd58组)淋巴细胞比例进一步升高；在联合rm-cd58后，淋巴细胞比例又显著降低(图21C至图21D)。
进一步利用流式细胞术对小鼠腹腔内浸润的T/NK细胞活化情况进行评估。对于NK细胞，NC组成功地提高了CD107a+和NKG2D+NK细胞比例，即NK细胞的活化比例；在过表达CD58后(lv-cd58组)进一步提高了NK细胞的活化比例；而在联合rm-cd58之后，小鼠腹腔内浸润的CD107a+和NKG2D+NK细胞比例显著降低(图22A至图22D)。类似地，对于CTL细胞，NC组成功地提高了CD107a+和穿孔素+CTL细胞比例，即CTL细胞的活化比例；在过表达CD58后(lv-cd58组)进一步提高了CTL细胞的活化比例；而在联合rm-cd58之后，小鼠腹腔内浸润的CD107a+和穿孔素+CTL细胞比例显著降低(图22E至图22H)。
利用ELISA对小鼠腹腔灌洗液中免疫炎性因子IFN-γ和TNF-α进行了检测。结果表明，相较于PBS组，NC组小鼠腹腔内IFN-γ和TNF-α含量均明显升高；过表达CD58后，小鼠腹腔内IFN-γ和TNF-α含量进一步提升；而在联合lv-cd58后，小鼠腹腔内IFN-γ和TNF-α含量明显下降(图23A和图23B)。腹腔内炎症反应越重，积聚于脾脏的炎性细胞就越多。因此，脾脏质量能够一定程度上反映腹腔炎症状态。对各组小鼠脾脏质量进行称重后发现，NC组小鼠脾脏质量明显高于PBS组；而lv-cd58组小鼠脾脏质量高于NC组；lv-cd58+rm-cd58组小鼠脾脏质量显著低于lv-cd58组(图23C)。
这些结果进一步支持了前面所得出的结论。胰腺癌细胞表面CD58过表达后，更加有利于T/NK细胞通过CD2-CD58的相互作用对胰腺癌细胞进行免疫黏附和免疫杀伤，而局部高浓度的sCD58通过破坏CD2-CD58轴干扰T/NK细胞对胰腺癌细胞的有效黏附和识别，降低了T/NK细胞的活化激活比例，抑制了T/NK细胞毒性的发挥，进而促进肿瘤细胞免疫逃逸。局部注射sCD58拮抗性抗体可挽救T/NK细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤(数据未显示)。
值得注意的现象是，在移植瘤之前，小鼠胰腺癌细胞悬液中CD58的阳性率在80％、甚至90％以上；而在皮下瘤接种4周后，胰腺癌细胞的阳性率急剧下降，只有不到20％，并没有依然维持CD58高阳性率和高表达。由于接种的细胞悬液为多克隆细胞群体，在接种至免疫健全小鼠皮下后，高表达CD58的胰腺癌细胞更容易遭受到T/NK细胞的攻击，使得CD58表达相对较低的甚至表达阴性能够存活。因而，最终导致胰腺癌细胞群体CD58阳性率积聚下降。在局部高浓度可溶性CD58通过竞争性抑制CD2-CD58的相互作用，干扰T/NK细胞的免疫黏附识别杀伤，在一定程度上保护了胰腺癌细胞。因而，最后lv-cd58+rm-cd58组要比CD58过表达组中胰腺癌细胞CD58阳性率更高。
实施例6.sCD58和TGF-β1的血清含量与PDAC患者临床病理学特点相关性
收集131例PDAC患者人口统计学和临床病理学特点(共15种)，利用SPSS软件，分别分析血清sCD58和TGF-β1与PDAC患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、糖尿病病史、高血压病史、肿瘤位置、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期(AJCC第八版)、神经浸润、血管浸润以及与临床标志物CA199的相关性。
统计学相关性分析结果发现，PDAC患者血清sCD58的水平与肿瘤大小(P＝0.041)、血管浸润(P＝0.029)具有显著相关性，而与其他13种人口统计学和临床病理学特点未见明显相关性。
表1.血清sCD58与PDAC患者临床病理特征的关系(N＝131)
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实施例7.sCD58和TGF-β1的血清含量对胰腺癌患者预后的影响
收集92例PDAC患者的完整随访数据。其中，死亡68例，24例存活。
通过X-tile软件获得生存时间最佳Cutoff值，324.0ng/ml。生存分析结果显示，血清中sCD58含量高低和胰腺癌患者总体生存时间(OS)虽然没有统计学差异，但具有一定趋势(图24A)。而TGF-β1血清含量高低对胰腺癌患者生存预后的影响未见明显差异(图24B)。
CA199以粘蛋白结合形式由胆汁和胆囊粘膜分泌，经胆汁排泄。因而，有报道慢性胰腺炎和良性胆道梗阻患者的血清CA199水平升高程度与早期胰腺癌患者相似。CA199不具有肿瘤类型特异性，其升高可在许多恶性肿瘤中观察到，包括起源于结直肠、胃、肺、乳腺和肝脏的恶性肿瘤。因此，CA199在其他疾病中假阳性率较高，使得诊断的总体准确性降低，在其他疾病中假阳性率较高。据文献报道，CA199在胰腺癌诊断中的中位敏感性为79％，中位特异性为82％。目前的研究发现，单一分子缺乏准确癌症检测的敏感性和特异性，因此本领域正试图将CA199与其他生物标志物结合，以提高CA199的诊断性能。发明人通过二元Logistic回归分析建立sCD58+TGF-β1+CA199三联模型，显著提高了CA199的在PDAC中的诊断敏感性(90.0％)，AUC为0.8731，具有较大临床诊断价值。
讨论
免疫黏附分子CD58作为T/NK细胞膜表面CD2的天然配体起到重要的免疫黏附和识别作用，是T/NK细胞免疫杀伤靶细胞的先决条件和至关重要的第一步。据此推断胰腺癌细胞CD58的“表达分离”在肿瘤免疫微环境中可能起到的作用：一方面，膜表面mCD58表达减少可以降低PDAC癌细胞与T/NK细胞之间的黏附识别，促进免疫逃逸；另一方面，PDAC肿瘤微环境中局部高浓度的sCD58则可能作为假性分子抑制PDAC细胞和T/NK细胞之间的有效免疫应答，在微环境中发挥免疫抑制功能。接下来，利用慢病毒稳转建立了稳转CD58小鼠胰腺癌细胞系，再通过提取反复小鼠肿瘤细胞抗原刺激的免疫健全小鼠脾脏T细胞，进行体外T细胞和胰腺癌细胞直接共培养，发现CD58的过表达能够显著增加T细胞的激活活化比例，增强T细胞毒性；而可溶性CD58的加入又明显抑制了T细胞的激活和细胞毒性。为了进一步证实该结论，分别用了免疫健全小鼠皮下荷瘤模型和腹腔种植瘤模型进行在体实验。充分说明了上述结论，即CD58的过表达能够通过CD2-CD58相互作用增强T/NK细胞的免疫黏附识别，刺激T/NK细胞激活，增强其细胞毒性和释放细胞杀伤因子，有利于免疫应答过程；而肿瘤微环境局部高浓度的sCD58能够通过作为假性分子竞争性结合T/NK细胞表面的CD2分子，破坏CD2-CD58轴，干扰T/NK细胞的有效黏附识别，阻碍T/NK细胞激活，减弱其细胞毒性和释放细胞杀伤因子，有利于肿瘤抑制性免疫微环境的建立，促进胰腺癌细胞的免疫逃逸(图25)。
Claims (10)
1.靶向可溶性CD58的试剂在制备药物中的用途，其中：
所述药物用于胰腺导管腺癌的治疗；
所述靶向可溶性CD58的试剂能够调节受试者肿瘤微环境中可溶性CD58的蛋白表达水平、活性或其下游通路；
所述调节是指选自以下的任一项：降低、减少、阻断、抑制、中和、失活；
所述试剂是特异于可溶性CD58的抗体或其抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的用途，其中：
所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体；
所述抗原结合片段选自以下的任一项或其组合：Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、单域抗体、单链Fab、双抗体、线性抗体、scFv、多特异性抗体。
3.根据权利要求1所述的用途，其中：
所述抗体是人源化抗体。
4.根据权利要求1所述的用途，其中：
所述胰腺导管腺癌的分期选自以下的任一项或组合：IIA、IIB、III、IV期。
5.可溶性CD58的定量试剂和膜型CD58的定量试剂的组合在制备检测装置中的用途，其中：
所述检测装置是选自以下的任一项或组合：试剂盒、孔板、芯片、试纸；
所述可溶性CD58的定量试剂和所述膜型CD58的定量试剂在相同或不同容器；或
所述可溶性CD58的定量试剂和所述膜型CD58的定量试剂包被在相同或不同的支持物上；
所述检测装置用于确定胰腺导管腺癌中癌细胞的免疫逃逸状态；
所述可溶性CD58是指肿瘤微环境中的可溶性CD58；
所述可溶性CD58的定量试剂能够确定受试者中可溶性CD58的表达水平，所述表达水平是蛋白水平；
所述膜型CD58的定量试剂能够确定受试者中膜型CD58的表达水平，所述表达水平是蛋白水平；
所述定量试剂是选自以下任一项：抗体、抗原结合片段、质谱鉴定试剂；
相较于对照样本的比值，当可溶性CD58表达水平/膜型CD58表达水平的比值更高，判定受试者中胰腺癌细胞发生免疫逃逸的风险增加、或判定受试者中肿瘤微环境的免疫抑制状态更显著；
所述对照样本来自未患胰腺导管腺癌的个体。
6.根据权利要求5所述的用途，其中：
所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体；
所述抗体源自：鼠、兔、马、禽、羊、骆驼科、犬、牛、灵长类、重组抗体。
7.根据权利要求5所述的用途，其中：
所述抗原结合片段选自以下的任一项或其组合：Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、单域抗体、单链Fab、双抗体、线性抗体、scFv、多特异性抗体。
8.根据权利要求5所述的用途，其中：
所述膜型CD58位于肿瘤组织表面；
所述膜型CD58选自以下的任一项或其组合：跨膜亚型CD58、GPI锚定亚型CD58。
9.根据权利要求5所述的用途，其中：
所述对照样本来自以下的任一项或其组合：胰腺低度恶性肿瘤的个体、胰腺良性疾病的个体、健康个体。
10.根据权利要求5所述的用途，其中：
所述胰腺导管腺癌的分期选自以下的任一项或组合：IIA、IIB、III、IV期。
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