CN114622017A - Isg15、isg15诱导的巨噬细胞及其分泌物在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ISG15、ISG15诱导的巨噬细胞及其分泌物在肿瘤治疗中的应用，本发明研究表明ISG15诱导巨噬细胞呈M2样表型，增强鼻咽癌细胞的迁移和致瘤性。且ISG15诱导的M2样表型与ISG15与ISG15受体LFA‑1的相互作用、SRC家族激酶(SFK)信号的参与以及随后CCL18的分泌相关。用小分子抑制剂阻断LFA‑1或SRC信号，或用抗ccl18抗体中和，均可抑制isg15处理的巨噬细胞中LFA‑1‑sfk‑ccl18通路的激活。临床上，ISG15⁺CD163⁺TAMs与患者生存受损及鼻咽癌晚期肿瘤分期相关。同时，还发现ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞抑制鼻咽癌中抗肿瘤CD8+细胞的反应。即肿瘤细胞分泌的ISG15充当肿瘤微环境因子，可诱导M2样表型，促进肿瘤进展并抑制细胞毒性T淋巴细胞的反应。为此，本发明提出ISG15、ISG15处理的巨噬细胞、ISG15处理的巨噬细胞的分泌物在肿瘤治疗上的应用。

Description

ISG15、ISG15诱导的巨噬细胞及其分泌物在肿瘤治疗中的 应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，更具体地，涉及一种ISG15、ISG15诱导的巨噬细胞及其分泌物在肿瘤治疗中的应用。

发明内容

第一部分：

【Tumor cell-secreted ISG15 promotes tumor cell migration and immunesuppression by inducing the macrophage M2-like phenotype

1、Abbreviations:CCL18:C-C motif chemokine ligand 18；CTL:cytotoxicleukocyte；CM:culture medium；DFS:disease-free survival；HLA-DR:Human LeukocyteAntigen-DR isotype；IFN:interferon；IHC:immunohistochemistry；IL-10，Interleukin10；ISG:Interferon-stimulated gene；LFA-1:leukocyte function-associatedantigen-1；NK:natural killer；NPC:nasopharyngeal carcinoma；OS:overall survival；PBMC:peripheral blood mononuclear cell；SFKs:SRC family kinases；TAM:tumor-associated macrophage；TGF-β:transforming growth factor beta；TMA，tissuemicroarray；TNF-α:tumor necrosis factor--α

2、Abstract:

Interferon-stimulated gene 15(ISG15)is known to be involved in tumorprogression.We previously reported that ISG15 expressed on nasopharyngealcarcinoma(NPC)cells and related to poor prognosis of patients with NPC.Wefurther observed that ISG15 can be secreted by NPC cell and expressed on themacrophages in situ.However，the role of ISG15 in tumor-associated macrophages(TAMs)remains poorly understood.In the present study，we found thatISG15treatment induces macrophages with M2-like phenotype，and the enhancementof NPC cell migration and tumorigenicity.Mechanically，ISG15-induced M2-likephenotype is dependent on the interaction with its receptor，LFA-1，andengagement of SRC family kinase(SFK)signal，and the subsequent secretion ofCCL18.Blocking LFA-1，or SRC signal with small molecular inhibitors，orneutralizing with anti-CCL18 antibody can impede the activation of LFA-1-SFK-CCL18 axis in ISG15-treated macrophages.Clinically,ISG15⁺CD163⁺TAMs related toimpaired survival of patients and advanced tumor stage of NPC.Furthermore,wefound ISG15⁺CD163⁺macrophages inhibited antitumor CD8⁺cells responses inNPC.Together,our findings suggested tumor cell-secreted ISG15,which acted asa tumor microenvironmental factor,induces M2-like phenotype,promoting tumorprogression and suppression of cytotoxic T lymphocyte response.

Interferon-stimulated gene 15(ISG15)is known to be involved in tumorprogression.We previously reported that ISG15 expressed on nasopharyngealcarcinoma(NPC)cells and related to poor prognosis of patients with NPC.Wefurther observed that ISG15 can be secreted by NPC cell and expressed on themacrophages in situ.However,the role of ISG15 in tumor-associated macrophages(TAMs)remains poorly understood.In the present study,we found thatISG15treatment induces macrophages with M2-like phenotype,and the enhancementof NPC cell migration and tumorigenicity.Mechanically,ISG15-induced M2-likephenotype is dependent on the interaction with its receptor,LFA-1,andengagement of SRC family kinase(SFK)signal,and the subsequent secretion ofCCL18.Blocking LFA-1,or SRC signal with small molecular inhibitors,orneutralizing with anti-CCL18 antibody can impede the activation of LFA-1-SFK-CCL18 axis in ISG15-treated macrophages.Clinically,ISG15+CD163+TAMs relatedto impaired survival of patients and advanced tumor stage of NPC.Furthermore,we found ISG15+CD163+macrophages inhibited antitumor CD8+cells responses inNPC.Together,our findings suggested tumor cell-secreted ISG15,which acted asa tumor microenvironmental factor,induces M2-like phenotype,promoting tumorprogression and suppression of cytotoxic T lymphocyte response.

3、Introduction：

The host innate immune system provides a frontline defense againstinvading pathogens,and the intensity of this early response can influence thecourse of disease progression.One of the earliest host responses to viralinfection is the production of type I interferons(IFN-αand-β)and thesubsequent upregulation of IFN-stimulated genes(ISGs)(1,2).These ISGsgenerate an antiviral state and play a central role in regulating the hostinnate and adaptive immune responses.Among these ISGs,ISG15 is one of themost strongly(3)and rapidly(4)induced genes.ISG15 encodes a small Ubiquitin-like protein of 15 kDa that forms covalent conjugates with cellular proteinsmediating robust antiviral responses(5).ISG15 exists in three differentforms:unconjugated,conjugated to the target proteins within the cell,andreleased into the serum(6).When ISG15 is secreted,free ISG15 can function asa cytokine that modulates the immune response.For example,free ISG15 canactivate natural killer(NK)cells and enhance lymphokine-activated killer-likeactivity,stimulate IFN-γproduction and induce dendritic cell maturation andneutrophil recruitment(7,8).However,ISG15 has not been investigated in thecontext of macrophage differentiation.

Microbial infection causally accounts for more than 20％ofmalignancies worldwide(9).EBV-encoded RNAs are detected exclusively in tumorcells but not in normal nasopharyngeal epithelium,suggesting that EBVactivation is necessary in the pathogenesis of NPC(10).Tumor initiation andprogression caused by viral infections reflect properties that are intrinsicto tumor cells,including expression of viral oncoproteins and nontranslatedviral RNAs that directly contribute to tumor growth(11),metastasis(12),andtreatment resistance(13).In addition,several soluble unregulated EBV factorsfavor the escape of lymphoma cells from antitumor immune responses whilepromoting the creation of niches in which tumor cells may find support fortheir growth and survival(14).Emerging evidence has indicated that persistentviral infections can foster chronic inflammatory microenvironments thatextrinsically promote malignant transformation,but their role in NPC is notwell established.

Macrophages are major producers of proinflammatory cytokines and arepivotal infiltrates into tumors.Macrophages in tumor tissues have beenreferred to as tumor-associated macrophages(TAMs),which usually harbor a M2polarization and confer a protumor phenotype(15).Mounting evidence hasindicated that TAMs have complicated dual functions in their interaction withneoplastic cells and are closely associated with poor prognosis in varioustumor types(16).TAMs are predominantly detected in both the stroma and tumorcell islets in NPC specimens and are significantly correlated with thesurvival of NPC patients(17).However,little is known about how macrophagesinfiltrated into the NPC microenvironment acquire protumor phenotype,andsubsequently affect tumor cells and contribute to the progression of NPC.Inaddition,the interaction between chronic EBV infection and the tumor-promoting inflammatory microenvironment in NPC remains elusive.

We had reported that ISG15 expressed on nasopharyngeal carcinoma(NPC)cell and relates to poor prognosis of patients with NPC(18).Further studyindicated ISG15 can be secreted by NPC cells and expressed on the macrophagesin NPC tissues,suggesting the regulatory role of ISG15 on tumor-associatedmacrophages.In this study,we showed that NPC cells released ISG15,whichactivates macrophages and subsequent CCL18 secretion through LFA-1 and SRCfamily kinases(SFKs).ISG15-treated macrophages promoted NPC cell migrationand were inhibited by a CCL18neutralizing antibody and LFA-1 or SFKinhibitors.Clinically,ISG15-expressing TAMs related to impaired prognosis inNPC patients.In addition,ISG15-treated macrophages impaired cytotoxic Tlymphocyte(CTL)response.These findings suggest that ISG15 might be amicroenvironmental(TME)factor linking chronic EBV infection and tumorprogression in NPC.

4、Materials and Methods

Compliance with ethical standards：Conflict of interest The authorsdeclare that they have no conflict of interest.Ethical approval and ethicalstandard All study protocols and donor consent documents were approved by theEthics Committee of Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-senUniversity.Informed consent Written informed consent was obtained from allindividual donors of biological samples for research use included in thisstudy.

(1)NPC specimens

The tissue microarray(TMA)of 90 NPC biopsy specimens betweenSeptember 2016 and November 2018 were obtained from the Department ofOtolaryngology,Head&Neck Surgery,Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-senUniversity.This cohort of NPC specimens was used for IHC double staining ofISG15 and CD163 to identify the prognostic prediction of ISG15 expressingTAMs in NPC.The informed consent was obtained from each patient prior tobiopsy and the study was approved from the Institute Research EthicsCommittee.The characteristics of the cohort of NPC patients were included inTable 1.

(2)Cell culture

The NPC cell lines(C666-1,HK1)were kindly provided by Prof.Qian Zhongat SYSUCC.The cells were cultured in RPMI 1640(Invitrogen)supplemented with10％fetal bovine serum(FBS；HyClone)in a humidified 5％CO2 incubator at 37℃.All the cells were tested for mycoplasma contamination and authenticatedwith STR profiling,which was described in Supplementary table1.Humanperipheral blood mononuclear cells(PBMCs)were isolated from the donatedanticoagulated peripheral blood by density gradient centrifugation.PBMC-derived monocytes/macrophages were obtained from the CD11bbright cells byusing magnetic cell sorting with CD11b microbeads(Miltenyi Biotec,catalogno.130-049-601).After culturing in RPMI1640(Invitrogen)at a concentration of1×106 cells/ml for 24 hours,the adherent cells were macrophages andcontinued to be cultured in RPMI 1640 supplemented with 10％fetal bovineserum(FBS；HyClone)and 40 ng/ml M-CSF(Novoprotein,catalog no.CB34)in ahumidified 5％CO2 incubator at 37℃for 5 days.At this point,the macrophagesare mature and used in subsequent experiments.The M1 phenotype was induced byculturing matured macrophages for2 days in the presence of 1×103 U/ml humanIFN-γ(Procell,catalog no.PCK062)prior to the treatment of 25 ng/ml LPS forthe last 24 h.The M2 phenotype was generated using 10 ng/ml IL-4(Novoprotein,catalog no.CD88)for 2 days.CD8 microbeads(Miltenyi Biotec,catalog no.130-045-201)were used for positive selective of human CD8⁺T cells from PBMCs.CD8⁺cellswere cultured in the pre-bound plate with 5 ng/ml anti-human CD3 SAFIREPurified(Biogems,Catalog no.05121-25-500)for 24 h,subsequently primed in thepresence of 5 ng/ml anti-human CD28 SAFIRE Purified(Biogems,Catalog no.10311-25-500)for 2 days,and then treated with conditional media of ISG15-treatedmacrophages for 24 h.Induced CD8+cells were activated with 10 ng/ml BFA for 6h prior to fluorescence activated cell sorting(FACS)analyses.Recombinant fulllength ISG15(Abcam,catalog no.ab78929)was added into the conditional media ofmacrophages at a dose with range from 0.1 to 0.5μg/ml.The concentration ofLPS in recombinant ISG15 is 0.56 EU/μg and less than requirement of 1 EU/μgin vitro cell experiment.Heat-inactivated recombinant ISG15 protein wasboiled within 100℃for 15 min and served as a control setting.

(3)Isolation of single cells from human NPC samples

Single tissue cells were isolated by using a previously reportedmethod with modification(19).Briefly,human NPC biopsy samples were carefullycleaned and cut into small pieces(<0.5 cm).The tissue fragments were digestedwith an enzyme mixture of 1 mg/ml collagenase D(Roche Diagnostic),100 ug/mlDNase I(Sigma-Aldrich),and 0.6 U/ml dispase(Roche Diagnostic)in complete DMEMcontaining 2％FBS for 60 min.Then,the fragments were filtered,counted andstained for flow cytometric analyses.

(4)Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)

Total RNA was extracted using TRIzol(Invitrogen)according to themanufacturer’s instructions.RT-PCR was performed with a Light Cycler 480system(Roche Diagnostics)using a SYBR Premix ExTaq kit(Takara).Theoligonucleotide sequences of qRT-PCR primers are listed below.

IFN-α:forward AACTCCCCTGATGAATGCGG,reverse AGTGTAAAGGTGCACATGACG；

IFN-β:forward GCGACACTGTTCGTGTTGTC,reverse GCCTCCCATTCAATTGCCAC；

IL-10:forward CGAGATGCCTTCAGCAGAGT,reverse GGCAACCCAGGTAACCCTTA；

TGF-β:forward CACGTGGAGCTGTACCAGAA,reverse AGTGAACCCGTTGATGTCCA；

iNOS:forward CGCATGACCTTGGTGTTTGG,reverse CATAGACCTTGGGCTTGCCA

(5)Western blot analysis

Protein extracts were resolved by 10％SDS–PAGE,transferred to PVDFmembranes(Roche),and probed with antibodies directed against human ISG15(1:1000；Abnova,catalog no.A155801),SRC(1:1000；CST,catalog no.9935T),andβ-actin(1:3000；Abcam,catalog no.ab69512).Peroxidase-conjugated secondary antibodies(1:3,000；CST)were used.

(6)Immunoprecipitation(IP)

The conditional culture medium(CM)of HK1 and C666-1 NPC cells wasfiltered with a 0.45μm syringe filter.An antibody against human ISG15(Abnova,catalog no.A155801)was added to the filtered CM at a ratio of 1μg:2 ml andshaken for 2 hours at 4℃.Protein A/G beads(Pierce protein A/G agarose)wereused to precipitate the anti-ISG15 complexes,which were centrifuged,denatured,and analyzed using Western blotting to determine ISG15 expression.

(7)Double immunostaining of NPC specimens

Core tissues that were 2 mm in diameter were obtained from therepresentative formalin-fixed paraffin-embedded NPC samples were sectioned at4-μm thickness.Antigen retrieval was performed using a pressure cooker for 30minutes in 0.01 mol/L citrate buffer(pH 6.0).The specimens were incubatedwith antibodies specific for CD163(1:200；Abcam,catalog no.ab182422)and ISG15(1:100；Novus,catalog no.NB600-891).Two independent pathologists(T-Z Zhang,LZhang)who were blind to the clinical status of the patients counted thestained numbers of CD163⁺,ISG15⁺,and ISG15⁺CD163⁺ cells in the intratumoralarea under a microscope.For immunofluorescence staining,the formalin-fixedparaffin-embedded specimens of NPC were incubated with antibodies specificfor CD163(1:100；Abcam,catalog no.ab182422)and ISG15(1:100；Novus,catalogno.NB600-891),or the macrophages slide were incubated with antibodiesspecific for ISG15(1:100；Novus,catalog no.NB600-891)and CD11+CD18(1:100；Abcam,catalog no.ab13219)overnight at 4℃,followed by incubation with AlexaFluor 555donkey anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(Life Technologies).Cells stained with the indicated antibody were imagedusing a confocal laser-scanning microscope(Carl Zeiss)with a core dataacquisition system.

(8)Flow cytometry staining

Macrophages with or without rISG15 treatment for 12 hours werestained with PE mouse anti-human CD163(BD Bioscience,catalog no.556018)andFITC mouse anti-human HLA-DR(BD Bioscience,catalog no.560944).After gatingthe macrophages,a two-parameter density blot was used to distinguish M2 andM1 cells by creating a plot on CD163(PE)and HLA-DR(FITC).For detecting theeffectors of CD8⁺cells,CD8⁺cells were stained with PE anti-human CD8a(Biolegend,catalog no.344705)prior to the intracellular staining with PE/Cyanine 7 anti-human IFN-γ(Biolegend,catalog no.502527),or FITC anti-human/mouse Granzyme B(Biolegend,catalog no.515403),or APC anti-human Perforin(Biolegend,catalog no.308111).The intracellular staining permeabilizationwash buffer(Biolegend,catalog no.421002)is used to permeabilize CD8⁺cells andfollowing fixation with fixation buffer(Biolegend,catalog no.420801).All datawere collected using a cytoFLEX flow cytometer(BD Biosciences,USA)andanalyzed using FlowJo software(BD Biosciences,USA).

(9)In vivo tumorigenesis and treatment

To determine the in vivo tumorigenicity of ISG15-treated macrophagesin NPC,we used a mixture of NPC cells and macrophages to develop a tumormodel.A total of 125μL of a mixture of RPMI 1640(Invitrogen)and basementmembrane matrix(at a ratio of 2:1,Matrigel；Corning,catalog no.354248)containing 1.5×10⁶ HK1 NPC cells and 0.5×106 human PBMC-derived macrophageswas injected subcutaneously into the flanks of female BALB/c mice(5-6 weeksold,Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd.).The treatmentprotocol followed the guidelines for animal experimentation adopted bySYSUCC,and meets the standards required by the UKCCCR guidelines(20).Theanimal experiments were approved by the Institutional Animal Care and UseCommittee at SYSUCC.Macrophages were induced with or without 295μM rISG15 for24 hours before inoculation.Mice were euthanized using Isoflurane(BatchNo.217150301,RWD Life Science.Co.Ltd,Shenzhen,China)inhalation in their homecages,followed by cervical dislocation to ensure death on two weeks aftertumor cell injection.Further information was described in Supplementary file.

(10)Cytokine array and cytokine detection

The supernatants of macrophages treated with or without rISG15 wereincubated with detection membranes at 4℃overnight.The procedure wasperformed according to the manufacturer’s protocol for the RayBio HumanCytokine Antibody Array(Raybiotech,catalog no.AAH-CYT-1000).The proteinlevels of M1-and M2-polarizing cytokine were detected by using Human TH1/TH2/TH17 Cytokine CBA Kit(BD Bioscience,Catalog no.560484),which contained acytokine panel of IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,TNF-α,and IFN-γ.The protein level ofCCL18 was measured by using Human CCL18/PARC DuoSet ELISA Kit(R&D,Catalogno.DY394-05).The procedures were performed according to the manufacturer’sprotocols.

(11)Statistical analysis

Student’s t-test was used to compare two independent groups ofdata.Survival distributions were estimated using the Kaplan–Meier method andthe relationship between survival and parameter was analyzed with the log-rank test.Cox proportional hazard regression analyses were performed toidentify predictors of prognosis,including factors with a p-value 0.15 inunivariate analyses.P<0.05 was considered significant.Statistical analyseswere performed using SPSS version 25.0(SPSS,Chicago,IL,USA)statisticalsoftware.

5、Results

(1)Nasopharyngeal carcinoma cells released ISG15 into theextracellular environment,and ISG15 has the potential to become amicroenvironment factor for NPC

We reported that ISG15 mRNA was upregulated in NPC tissue(18).ISG15induced the stemness phenotype in NPC cells and was associated with aninferior prognostic of NPC patients(18).As ISG15 is an antiviral protein andinduced by type I interferon,we measured the expression of IFN-αand IFN-βmRNAin NPC samples.The results showed that IFN-αand IFN-βmRNA were increased inNPC tissues and suggested that the upregulated ISG15 in NPC tissue may be aresponse to the increased level of type I IFN(Figure 1A).We further detectedthe ISG15 protein level in NPC cells treated with IFN-βand observed anincreased ISG15 in IFN-β-induced NPC cells(Figure 1B).ISG15 is a well-knownintracellular ubiquitin-like molecule involved in ISGylation.Moreover,freeISG15 can be released into the extracellular space and serves as acytokine.We detected ISG15 protein in the supernatants of HK1 and EBV+C666-1NPC cells.SDS-PAGE analysis of immunoprecipitation in the supernatantssuggested that ISG15 can be released by NPC cells(Figure 1C).Free ISG15 hasbeen reported to active NK cells(21)and T cells(22),but its effect onmacrophages is not known.In nasopharyngeal carcinoma tissues,the number ofISG15⁺CD163⁺macrophages were significantly higher than that of non-cancerousnasopharyngeal epithelium(Figure 1D),suggesting the infiltration of ISG15⁺CD163⁺macrophages relate to the development of NPC.Our results provideevidence for secreted ISG15 from NPC cells has potential to become amicroenvironmental factor and have a regulatory effect on macrophages.Next,westudy the role of secreted ISG15 on macrophages and acquisition of protumorphenotype.

(2)ISG15 induced M2-like phenotype and promoted the migration andtumorigenicity of NPC cells

Macrophages differentiate into two polarization,M1 and M2.In thetumor microenvironment,tumor-associated macrophages(TAMs)often exhibit the M2polarization and are associated with malignant transformation of tumor cellsand poor prognosis of patients.First,free recombinant ISG15 protein was addedinto the supernatant of human macrophages derived from peripheral bloodmononuclear cells(PBMCs).The surface markers of M2/M1 macrophages,the CD163/HLA-DR ratio,were measured by flow cytometry.Increased ratio of CD163/HLA-DRby human macrophages were observed with rISG15 treatment(Figure 2A),suggesting ISG15 treatment induces the M2-like phenotype.In addition,ISG15treatment significantly upregulated the mRNA expression of M2-relatedcytokines IL-10,TGF-β,but not the M1-related cytokine iNOs in humanmacrophages(Figure 2B).Accordingly,ISG15 treatment increased the secretion ofIL-4(the prototypical M2-polarizing cytokine),without any effector on M1-polarizing cytokines such as IL-6 and TNF-α(Figure 2C).Furthermore,thesupernatants from the macrophages treated with rISG15 markedly promoted themigration of HK1 NPC cells(Figure 2D).Moreover,enhanced tumorigenicity wasindicated within BALB/c mice through subcutaneous inoculation of a mixture ofNPC cells and ISG15-pretreated macrophages(Figure 2E).Taken together,ISG15-activated macrophage enhanced the migration and tumorigenicity of NPC cells.

(3)ISG15-treated macrophages promoted NPC cell migration throughCCL18 secretion

To determine how the ISG15-treated macrophages promote NPC cellmigration,the cytokine profile in the supernatants of macrophages treatedwith ISG15 was examined by using a cytokine array(Supplementary table 2,3).The results indicated that CCL18 is the cytokine with the highest increasein the supernatants of ISG15-treated macrophages compared with that of thecontrol(Figure 3A).We confirmed the increased secretion of CCL18 in ISG15-treated macrophages by ELISA(Figure 3B).These results suggested that secretedISG15 is a CCL18-inducing molecule in macrophages.CCL18 has been shown to beexclusively secreted by myeloid-derived cells and is one of the mostabundantly produced cytokines of TAMs(23,24).TAM-derived CCL18 has beenreported to promote cancer cell invasion by inducing the epithelial–mesenchymal transition(EMT)(23,25,26).Recently,CCL18 was confirmed to induceEMT in NPC(27).In our study,the enhanced migration of NPC cells induced bythe supernatants of ISG15-treated macrophages was abolished in the presenceof polyclonal anti-CCL18 antibodies(Figure 3C).Taken together,ISG15-treatedmacrophages promoted NPC cell migration through CCL18 secretion.

(4)ISG15-induced CCL18 secretion by macrophages was dependent on theISG15 receptor,leukocyte function-associated antigen-1(LFA-1),and SRC familykinase signaling

CD11a(αL integrin)forms a heterodimeric complex with CD18(β2integrin)to form the leukocyte function-associated antigen-1(LFA-1)integrinreceptor.In NK cells,LFA-1 has been reported to be the receptor for ISG15 andthat theαl domain of CD11a contains the binding site for ISG15(21).Wedetermined whether LFA-1 is the same receptor for ISG15 in macrophages.LFA-1expression was detected on the membranes of human macrophages treated withISG15(Figure 4A).A small molecular inhibitor of LFA-1,A286982,inhibited CCL18secretion by macrophages(Figure 4B).These results verified that the ISG15-induced CCL18 secretion by macrophages was dependent on LFA-1,the receptorfor ISG15.As ISG15 treatment increased the IL-10 secretion of NK cells by SRCsignaling(21),we examined whether ISG15-treated macrophages consistentlyactivate SRC signaling.We observed small molecular inhibitors of LFA-1 andSRC,A286982 and PP2,hindered the activation of ISG15-induced SRC signaling(Figure 4C).The activation of SRC signaling by phosphorylation of Tyr416 in atime-dependent manner in ISG15-treated macrophages(Supplementary figure 1A).Moreover,PP2 reduced the CCL18 secretion by ISG15-treated macrophages in adose-dependent manner(Figure 4D).Taken together,the ISG15-induced CCL18secretion by macrophages was dependent on the ISG15 receptor LFA-1 and SRCsignaling.In addition,the enhanced migration of NPC cells induced by thesupernatants of ISG15-treated macrophages was impeded in the present of LFA-1inhibitor(Supplementary figure 1B).These observations suggested ISG15-treatedmacrophages promote NPC cell migration depend on the LFA-1-SRC-CCL18 axis.

(5)ISG15-treated macrophages exhibited increased intracellular ISG15expression and ISG15⁺CD163⁺TAMs predicted poor survival of NPC patients

We were intrigued whether extracellular ISG15 may upregulateintracellular ISG15 expression in macrophages.The results revealed thatintracellular expression of ISG15 increased with the treatment of rISG15(Figure 5A).Furthermore,the increased intracellular ISG15 was mainly in freeISG15 manner,rather than conjugated ISG15,and ISG15 treatment did notactivate ISGytion by upregulating E1 activating enzyme(UBE1L1)and E2 enzyme(UBE2L2)in macrophages(Figure 5A).Thus,secreted ISG15 treatment upregulatedintracellular free ISG15 expression in macrophages.

Immunohistochemistry(IHC)was performed in an independent formalinfixed,paraffin-embedded-based(FFPE-based)tissue microarray(TMA)consisting of90 NPC biopsy samples.The included NPC patients were diagnosed at Sun Yat-senMemorial Hospital of Sun Yat-sen University between September 2016 toNovember 2018 with complete follow-up until February 2020.Sixty-nine(76.7％)patients were alive at last follow-up.The median OS for all patients fromdiagnosis was 31 months(range,8-49 months).The median DFS for all patientswas31 months(range,8-49 months).The OS and DFS curves of all NPC patientswere presented in Figure 5B.The 2-,3-year OS rates are 91.6％and 76.9％,respectively；the 2-,3-year DFS rates are88.1％and 74％,respectively.

CD163 is a specific marker for TAMs(16,28).We performed doubleimmunostaining of ISG15 and CD163 in the cohort of NPC biopsy samples foranalyzing the correlation between numbers of ISG15⁺TAM and NPC patients’prognosis.Out of 90 NPC cases,87 specimens(96.6％)expressed CD163⁺cells,57specimens(63.3％)stained ISG15 mainly in tumor cells and infiltrating immunecells,and 49 specimens(54.4％)expressed ISG15⁺CD163⁺cells,which suspected tobe macrophages based on their morphology as well(Figure 5C).The median numberof CD163⁺,ISG15⁺,ISG15⁺CD163⁺cells per 1mm² were 132.5(range 0-506),6(range 0-95),2.5(range 0-78),respectively.

The median number was used as cutoff to divide specimens into highand low expression groups.As shown in Table 1,patients with high ISG15⁺cellsor high ISG15⁺CD163⁺TAMs showed a significant worse overall survival(OS)inunivariant analysis(p＝0.032；p＝0.021,respectively),and patients with highCD163⁺TAMs tended to have an impaired OS(p＝0.058).In addition,increasedCD163⁺,ISG15⁺,and ISG15⁺CD163⁺cells were associated with worse disease-freesurvival(DFS)in univariant analysis(p＝0.033；p＝0.02；p＝0.011,respectively).Further analysis with a Cox proportional hazards model was performed todetermine whether ISG15⁺CD163⁺TAMs could serve as an independent prognosticpredictor.A series of predictive factors,including T classification,Nclassification,distant metastasis,expression level of CD163⁺,ISG15⁺and ISG15⁺CD163⁺cells,were included in the multivariate Cox regression analysis.Themultivariate analysis model showed that ISG15⁺CD163⁺cells were the predominantindependent predictors of OS(Hazards ratio,4.5；p＝0.034)and DFS(Hazardsratio,5.9；p＝0.015)(Figure 5D).Other survival predictors were summarized inTable 1.

The number of ISG15⁺CD163⁺TAMs was significantly associated withadvanced clinical stage,IV stage of NPC as compared with I-III stage(p＝0.016).However,there were no evident correlations with tumoral(T)stage,lymphnodal(N)stage and distant metastasis(M)stage(p>0.05)(Supplementary figure 2).

(6)Higher expression of ISG15⁺CD163⁺macrophages in NPC inhibitedantitumor CD8⁺cells responses

Accumulation of macrophages in many types of tumors are thought toregulate every step of tumor development,including antitumor T cellresponses.Since cytotoxic CD8⁺T cell has cytotoxic activity against tumorcells,we determined whether ISG15⁺TAMs may impair the intrinsic functionalityof CTLs.The total frequency of ISG15⁺CD163⁺cells in suspension of NPC tissuesvaried from 1％to 9.7％among all live cells in the tumor microenvironment.Weused the median frequency of ISG15⁺CD163⁺cells as cut-off value to divide NPCtissues into high or low expression of ISG15⁺TAMs groups(Figure 6A).We foundthat the production of IFN-γ,perforin,and Granzyme B by CD8⁺T cell issignificantly lower in high ISG15⁺TAMs group as compared with low ISG15⁺TAMsgroup(Figure 6B).This result suggests ISG15⁺TAMs infiltrated in themicroenvironment of NPC could inhibit the antitumor responses of cytotoxicCD8⁺cells.Next,we determined the effect of ISG15-treated macrophages on theproduction of IFN-γ,perforin and Granzyme B by CD8⁺T cells derived fromPBMCs after stimulating with plate-bound anti-CD3 and anti-CD28 antibodiesfor 24 hours.We found that the production of IFN-γ,perforin and Granzyme Bby CD8⁺T cells was markedly reduced in the settings of conditional culturemedium of ISG15-treated macrophages as compared with non-ISG15-treatedmacrophages,indicating impaired effector differentiation(Figure 6C andSupplementary figure 3).Together,our phenotypic analysis demonstrated thatISG15⁺TAMs in NPC inhibited the antitumor CTL responses.

6、Discussion

ISG15 is released by fibroblasts,monocytes,lymphocytes andneutrophils,and in some of these cell types,secretion may be induced in anIFN-α/β-dependent or IFN-α/β-independent manner(29).Human ISG15-induced PBMCssecrete substantial amounts of IFN-γ,IL-2 and IL-12(7)and are considered tohave cytokine-inducing activity.Moreover,human ISG15 enhances theproliferation and lytic capability of NK cells(7).These findings suggest thatISG15 has extracellular immunomodulating activity.Recently,individuals withISG15 deficiency have been identified(29,30).Contrary to expectations,noparticular susceptibility to viral infections was observed in these ISG15-deficient patients.The lack of secreted free ISG15 resulted in lower levelsof lymphocyte IFN-γproduction(29),and the impaired IFN-γproduction by bloodleukocytes from ISG15-deficient patients leads to susceptibility toenvironmental mycobacteria(30).These findings suggested that ISG15 is asecreted molecule with a functional role in immunity.

ISG15 can be released as an extracellular molecule in response totype I IFN(7).In this study,NPC cells released ISG15 into the extracellularenvironment.The mechanism of free ISG15release or secretion has not beenfully elucidated.We observed increased free ISG15 protein in IFN-β-inducedNPC cells,possibly suggesting the NPC cells that secreted ISG15 may respondto the increased free intracellular ISG15 under the induction of type IIFN.Furthermore,Sainz and colleagues observed macrophages increase theexpression and secretion of ISG15 when cocultured with cancer stem cells(31).This observation indicated that beyond the tumor cells,infiltratedmacrophages within cancer microenvironment may release ISG15.

TAMs participate in the initiation and progression of tumors.TAMssecrete ISG15,which contributes to the formation of cancer stem cells ofpancreatic ductal adenocarcinoma(31).However,the function of ISG15 inmacrophages is not well understood.In this study,secreted ISG15 upregulatedintracellular ISG15 expression in macrophages.This phenomenon indicatesISG15-labeled macrophages can be served as a biomarker for further study theclinical implication that ISG15 acts on macrophages.We observed that ISG15-expressing TAMs related to poor prognosis and more advanced stage in NPCpatients.In vitro studies revealed that ISG15 switches the HLA-DR/CD163 ratioand increases the expression of TAM-like cytokines.These results suggestedthe functional role of human ISG15 on macrophages.Furthermore,ISG15-treatedmacrophages promoted the migration and tumorigenicity of NPC cells,either invitro or in vivo.These findings confirmed the malignant phenotype of ISG15-treated macrophages.

It has been previously delineated that ISG15 is an alarmin thatinduces tissue alert by extracellular matrix remodeling,myeloid cellinfiltration,and inflammation in mice.ISG15produced at the vaccination sitepromoted the vaccine-specific CTL response by enhancing expansion,short-livedeffector and effector/memory differentiation of CD8⁺T cells(32).Another invivo study indicates that ISG15 encoded by a DNA vaccine can promote the CTLresponse in mice(33).In our observation,free ISG15 acts on macrophagesubsequently results in a diverse effect on CTL response.ISG15 expressingTAMs impaired antitumor CTL response according to effector production by thedigested live cells from tumor samples and in vitro activated CD8⁺cellstreated with ISG15-treated macrophages,suggesting ISG15-treated macrophagesmay contribute to malignant transformation through suppressive regulation onCTL response to tumor.

Cytokines are canonical signals that directly link immune cells andtumor cells.In this study,a cytokine array demonstrated that CCL18 was thecardinal secreted molecule in the medium of ISG15-treated macrophages.CCL18from TAMs promoted tumor cell EMT and functioned as a crucialmicroenvironmental factor involved tumor progression(23,25).Our workreinforced the protumor role of CCL18 on NPC cell migration.This result wasconsistent with the findings established by Huang et al(27).CCL18 closelycorrelated with serum EBV infection titers and tumor progression in twocohorts of NPC patients.EBV+NPC cell lines exhibited superior capacity toattract monocytes and skew them to differentiate to a M2 macrophage(27).Thesefindings demonstrated a link between tumor cell migration and EBV-inducedchronic infection.Given the antiviral nature of ISG15,it is presumed to be apredominant microenvironmental factor that links EBV-induced chronicinfection and TAMs.Moreover,CCL18 from ISG15-treated TAMs may establish aloop between viral infection,TAMs and tumor progression.

LFA-1 has been recently determined as the membrane receptor of ISG15in NK cells(21).Our work demonstrated the expression of LFA-1 on macrophages,and the inhibition of LFA-1 abolished CCL18 secretion from ISG15-treatedmacrophages.These results identified that ISG15 functions on macrophagessimilarly via the surface receptor LFA-1.Furthermore,ISG15 engagement of LFA-1 led to the activation of SRC family kinases(SFKs)(21).In our study,ISG15induced the activation of SRC signaling by phosphorylation of Tyr416 in atime-dependent manner.In addition,the SFK-blocking agent inhibited CCL18secretion by ISG15-treated macrophages.These findings revealed that LFA-1-SFKsignaling is the pathway by which ISG15 functions in TAMs and inducessubsequent CCL18 secretion.

In summary,chronic infection with EBV and increased expression ofIFN-αand IFN-βmay contribute to the upregulation of ISG15 in NPC cells.NPCcells can release ISG15 in an autocrine manner,which promotes the M2-likephenotype.ISG15-treated macrophages secrete CCL18,which promotes themigration of NPC cells.Tumor cells secrete ISG15,and ISG15-activated TAMspromote cancer cell migration which develops a feed-forward loop between NPCcells and TAMs.These findings show a potential link between chronic viralinfection and tumor progression.

Chronic EBV infection is a specific feature of nasopharyngealcarcinoma(NPC).ISG15 is first identified as an antivirus protein andattracted attention due to its immunomodulatory effect recently.Ourobservation suggested tumor cell-secreted ISG15 acts on macrophages andresults in M2 differentiation.ISG15-induced macrophages secret CCL18,whichpromotes NPC cell migration through ISG15-receptor,LFA-1,and the engagementof SRC family kinases.Moreover,ISG15-induced macrophages hinder CTL responseto NPC.Our findings suggest secreted ISG15 acting on macrophages is a newimmunoregulatory pathway of IFN-stimulated genes.

7、Legends

Figure 1.ISG15 is released from nasopharyngeal carcinoma(NPC)cellsand functions as a cytokine for macrophages in NPC.A,Upregulated interferon(IFN)-αandβmRNA were detected in NPC biopsy tissues.B,Increased ISG15 proteinwas determined in HK1 and C666-1 NPC cells treated with IFN-β.C,SDS-PAGEanalysis of immunoprecipitated free ISG15 protein from conditional media(CM)of NPC cells.Control as RPMI-1640 CM,and HK1-IFN-βas HK1 cells treated with50 unit/ml IFN-βfor 16h,and C666-1 as EBV-positive NPC cells.D,Representativeconfocal images showing double staining of ISG15 and CD163+in NPC and non-cancerous nasopharyngeal epithelium(NPE)sample(left panel).Scale bars,20μm in40X or 10μm in 100X.The quantification of the number of ISG15+CD163+cells inNPC(n＝6)and in NPE(n＝3)(right panel).Data are expressed as mean±SD.Statistical significance was calculated using two-tailed Student’s t testand is indicated by*p<0.05,**p<0.01,and***p<0.001.

Figure 2.ISG15 induced the M2-like phenotype and promoted NPC cellmigration and tumorigenicity.A and B,Human PBMC-derived macrophages treatedwith 59 nM and 295 nM rISG15 for 24 h,and then were detached for fluorescenceactivated cell sorting(FACS)analysis,or were extracted mRNA for qPCRanalysis.A,Representative data of the switched surface markers profile of M2(CD163)/M1(HLA-DR)in ISG15-treated macrophages measured by FACS.B,rISG15induced macrophage mRNA expression of M2 cytokines,such as IL-10 and TGF-β,but not of M1 cytokines,such as iNOS,by qPCR analysis.IFN-γ/LPS and IL-4served as positive control for M1 and M2 polarization.Heat-inactivatedrecombinant ISG15(HI ISG15)protein was boiled within 100℃for 15 min.C,Cytokine panel indicated the increased secretion of M2-polarizing cytokineIL-4 in culture supernatants of ISG15-treated macrophages,but not of M1-polarizing cytokine IL-6 and TNF-α.The culture supernatants were harvestedfrom the macrophages upon rISG15 treatment at indicated dose for 24 h andreplaced with serum-free culture for 24 h.D,Representative photography oftranswell filters in HK1 NPC cells cultured with the CM ofmacrophages.Quantification analysis revealed the increased number oftranswell cell in the presence of ISG15 treatment.Data are expressed as mean±SD of three independent experiments.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,and****p<0.0001.E,Photographic illustration of the grow tumors established by a tumormodel within BALB-c mice through subcutaneous inoculation with a mixture ofhuman HK1 NPC cells and PBMC-derived macrophages(at ratio of 3:1)with orwithout rISG15 pre-treatment.All(10 in 10)mice with ISG15 treatment had tumorgrow,but only8 of 10 mice in the control group had tumor grow.The growthcurve showed a significant larger tumor volume in the ISG15 treatment groupcompared with that of the control.

Figure 3.ISG15-treated macrophages promoted NPC cell migrationthrough CCL18 secretion.A,Cytokine array of the CM of macrophages inducedwith rISG15 at the indicated doses for 24 h.The lower table summarizing therelative signal intensity of the indicated cytokines is presented.The redmarker box indicates the site of CCL18.B,Increased level of CCL18 in thesupernatant of ISG15-treated macrophages was confirmed by ELISA.Macrophageswere treated with the indicated dose of rISG15 for 24h.The CCL18-inducingeffect of ISG15 was blocked by pretreatment with a CCL18 neutralizingantibody,and was not observed in heat-inactivated rISG15.C,The increasednumber of infiltrated NPC cells,as measured by transwell assay,in thepresence of CM from ISG15-treated macrophages.The enhancement was abolishedby anti-CCL18 antibody.Data are expressed as mean±SD of three independentexperiments.*p<0.05,**p<0.01,and***p<0.001.

Figure 4.ISG15-induced CCL18 secretion by macrophages was dependenton the ISG15 receptor,leukocyte function-associated antigen-1(LFA-1),and SRCfamily kinase(SFK)signaling.A,Immunofluorescence demonstrated that the ISG15receptor CD11a/CD18,also called LFA-1,was expressed on the membranes of humanmacrophages.Macrophages were treated with 295nM rISG15 for 24h.Scale bars,10μm.B,ELISA results showed small molecular inhibitors of LFA-1,A286982,inhibited CCL18 secretion by macrophages.C,Small molecular inhibitors of LFA-1and SRC，A286982and PP2，hindered the ISG15-induced activation of SFKsignaling.D，PP2 reduced the CCL18secretion by ISG15-treated macrophages in adose-dependent manner，as determined by ELISA.

Figure 5.Clinical implication of tumor-associated macrophages(TAMs)and ISG15-expressing TAMs in NPC.A，Intracellular free and conjugated ISG15，and ISGytion E1enzyme(UBE 1L)and E2 enzymes(UBE2E2)were assessed by Westernblotting on total cell lysates of rISG15 treated macrophages.B，Kaplan-Meiersurvival curve of overall survival(OS)and disease-free survival(DFS)in theTMA contained 90NPC biopsy specimens.C，Representative immunohistochemistrydata with double staining of CD163(in wine red)and ISG15(in brown)in early(T1N0M0)and advanced(T3N2M1)Tumor Node Metastasis(TNM)stage in NPCsamples.Scale bars，50μm.D，Kaplan-Meier survival curve of OS and DFS in NPCpatients with distinct ISG15⁺CD163⁺TAMs count.

Figure 6.ISG15⁺CD163⁺TAMs suppressed cytotoxic leukocyte(CTL)responsein NPC.A，Single cell suspensions from NPC tissues(n＝9)were stained withantibodies for ISG15-PE and CD163-APC.Total frequency of ISG15⁺CD163⁺cellswere determined by FACS analysis and were indicated as percentage in upperright quadrant.Left penal showed single cell suspensions of NPC tissue weregated.Right panel showed representative FACS photograph of low or high CD163⁺ISG15⁺cells.B，Representative FACS analysis and quantification of thepercentage of IFN-γ⁺，perforin⁺，and Granzyme B⁺cells within CD8⁺T cellsbetween high and low CD163⁺ISG15⁺cells groups in NPC tissue suspensions.C.Flowcytometric quantification of the percentage ofIFN-γ⁺，perforin⁺，and Granzyme B⁺cells within CD8⁺T cells in vitro cocultured with or without the conditionalmedia from ISG15-treated macrophages over the indicated time.】即：

肿瘤细胞分泌的ISG15通过诱导巨噬细胞M2样表型，促进肿瘤细胞迁移和免疫抑制

1、缩写：CCL18：C-C基序趋化因子配体18；CTL：细胞毒性白细胞；CM：培养基；DFS：无病生存；HLA-DR：人类白细胞抗原-DR同型；IFN：干扰素；IHC：免疫组织化学；IL-10：白介素10；ISG：干扰素刺激基因；LFA-1：白细胞功能相关抗原-1；NK：自然杀伤细胞；NPC：鼻咽癌；OS：总体存活率；PBMC：外周血单核细胞；SFKs：SRC家族激酶；TAM：肿瘤相关巨噬细胞；TGF-β：转化生长因子β；TMA：组织微阵列；TNF-α：肿瘤坏死因子-α

2、摘要

干扰素刺激基因15(ISG15)被认为参与了肿瘤进展。我们之前报道过ISG15在鼻咽癌(NPC)细胞上表达，与鼻咽癌患者预后不良有关。我们进一步观察到ISG15可以被NPC细胞分泌并在巨噬细胞上原位表达。然而，ISG15在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中的作用尚不清楚。在本研究中，我们发现ISG15诱导巨噬细胞呈M2样表型，增强鼻咽癌细胞的迁移和致瘤性。从机制上讲，ISG15诱导的M2样表型依赖于其与其受体LFA-1的相互作用、SRC家族激酶(SFK)信号的参与以及随后CCL18的分泌。用小分子抑制剂阻断LFA-1或SRC信号，或用抗ccl18抗体中和，均可抑制isg15处理的巨噬细胞中LFA-1-sfk-ccl18通路的激活。临床上，ISG15⁺CD163⁺TAMs与患者生存受损及鼻咽癌晚期肿瘤分期相关。此外，我们发现ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞抑制鼻咽癌中抗肿瘤CD8⁺细胞的反应。综上所述，我们的研究结果表明，肿瘤细胞分泌的ISG15充当肿瘤微环境因子，可诱导M2样表型，促进肿瘤进展并抑制细胞毒性T淋巴细胞的反应。

已知干扰素刺激基因15(ISG15)与肿瘤进展有关。我们以前曾报道过ISG15在鼻咽癌(NPC)细胞上表达，并且与NPC患者的预后不良有关。我们进一步观察到ISG15可以被NPC细胞分泌并在巨噬细胞上原位表达。但是，ISG15在肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中的作用仍然知之甚少。在本研究中，我们发现ISG15治疗可诱导具有M2类表型的巨噬细胞，并增强NPC细胞迁移和致瘤性。从机制上讲，ISG15诱导的M2样表型取决于与其受体，LFA-1的相互作用以及SRC家族激酶(SFK)信号的参与以及随后CCL18的分泌。用小分子抑制剂阻断LFA-1或SRC信号，或用抗CCL18抗体中和可阻碍ISG15处理的巨噬细胞中LFA-1-SFK-CCL18通路的激活。在临床上，ISG15+CD163+TAM与患者生存受损和NPC的晚期肿瘤有关。此外，我们发现ISG15+CD163+巨噬细胞抑制了NPC中的抗肿瘤CD8+细胞反应。总之，我们的发现表明，肿瘤细胞分泌的ISG15充当肿瘤微环境因子，可诱导M2样表型，促进肿瘤进展并抑制细胞毒性T淋巴细胞反应。

3、介绍

宿主的先天免疫系统为入侵的病原体提供了一线防御，而这种早期反应的强度可以影响疾病进展的进程。宿主对病毒感染最早的反应之一是I型干扰素(IFN-α和-β)的产生以及随后IFN刺激基因(ISG)的上调。这些ISGs产生抗病毒状态，并在调节宿主先天免疫和适应性免疫反应中发挥核心作用。在这些ISGs中，ISG15是诱导最强(3)和最快(4)的基因之一。ISG15编码一个15kDa的小泛素样蛋白，它与细胞蛋白形成共价偶联，介导强效抗病毒反应(5)。ISG15以三种不同的形式存在：未偶联、偶联到细胞内的靶蛋白上以及释放到血清中(6)。当ISG15被分泌时，游离的ISG15可以作为细胞因子调节免疫反应。例如，游离的ISG15可以激活自然杀伤(NK)细胞，增强淋巴细胞激活的杀伤样活性，刺激IFN-γ的产生，诱导树突状细胞成熟和中性粒细胞募集(7，8)。然而，尚未在巨噬细胞分化的背景下研究ISG15。

微生物感染导致的恶性肿瘤占全球恶性肿瘤的20％以上(9)。EBV编码的rna只在肿瘤细胞中被检测到，而在正常的鼻咽上皮中却没有，这表明EBV的激活在鼻咽癌的发病过程中是必要的(10)。由病毒感染引起的肿瘤启动和进展反映了肿瘤细胞固有的特性，包括直接导致肿瘤生长(11)、转移(12)和治疗耐药(13)的病毒癌蛋白和非翻译病毒rna的表达。此外，几种可溶的不受调控的EBV因子有利于淋巴瘤细胞逃脱抗肿瘤免疫反应，同时促进肿瘤细胞生长和存活支持的生态位的产生(14)。不断出现的证据表明，持续的病毒感染可以促进慢性炎症微环境，在外部促进恶性转化，但它们在鼻咽癌中的作用尚不明确。

巨噬细胞是促炎细胞因子的主要产生者，也是肿瘤浸润的关键。肿瘤组织中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，通常具有M2极化，并具有促癌表型(15)。越来越多的证据表明，TAMs在与肿瘤细胞相互作用方面具有复杂的双重功能，并且在各种类型的肿瘤中与不良预后密切相关(16)。TAMs主要在鼻咽癌标本的间质和肿瘤细胞胰岛中检测到，并且与鼻咽癌患者的生存显著相关(17)。然而，巨噬细胞是如何浸润到鼻咽癌微环境中并获得促癌表型，进而影响肿瘤细胞并促进鼻咽癌的进展，目前尚不清楚。此外，慢性EBV感染与鼻咽癌促肿瘤炎性微环境之间的相互作用尚不清楚。

我们报道了ISG15在鼻咽癌(NPC)细胞上表达，并与鼻咽癌患者的不良预后有关(18)。进一步研究发现，鼻咽癌细胞可分泌ISG15，并在鼻咽癌组织中的巨噬细胞上表达，提示ISG15对肿瘤相关巨噬细胞具有调节作用。在本研究中，我们发现鼻咽癌细胞释放ISG15，该ISG15通过LFA-1和SRC家族激酶(SFKs)激活巨噬细胞和随后的CCL18分泌。isg15处理的巨噬细胞促进鼻咽癌细胞迁移，并被CCL18中和抗体和LFA-1或SFK抑制剂抑制。临床上，表达isg15的TAMs与鼻咽癌患者预后受损有关。此外，经ISG15处理的巨噬细胞还会损害细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的反应。这些发现提示ISG15可能是鼻咽癌慢性EBV感染和肿瘤进展联系在一起的微环境(TME)因素。

4、材料和方法

符合道德标准：利益冲突作者声明他们没有利益冲突。伦理批准和伦理标准所有研究方案和捐赠者的同意文件均经中山大学中山纪念医院伦理委员会批准。知情同意书本研究中包括所有供研究用的生物学样品的个体捐赠者的书面知情同意书。

(1)NPC标本

2016年9月至2018年11月期间90例NPC活检标本的组织微阵列(TMA)从中山大学孙逸仙纪念医院头颈外科耳鼻咽喉科获得。这组NPC标本用于ISG ISG15和CD163的IHC双重染色，以鉴定NPC中表达ISG15的TAM的预后预测。在进行活检之前，已从每位患者获得知情同意书，并且该研究已获得协会研究伦理委员会的批准。NPC患者队列的特征包括在表1中。

(2)细胞培养

鼻咽癌细胞系(C666-1，HK1)由SYSUCC的钟谦教授提供。将细胞培养在RPMI 1640(Invitrogen)中，加入10％胎牛血清(FBS；(HyClone)置于37℃加湿5％CO2培养箱中。所有细胞都进行了支原体污染检测，并通过STR谱分析进行了验证，详见补充表1。用密度梯度离心法从捐赠的抗凝外周血中分离出人外周血单核细胞。利用CD11b微珠(Miltenyi Biotec，目录号：130-049-601)进行磁性细胞分选，从CD11b^bright细胞中获得PBMC衍生的单核/巨噬细胞。在RPMI 1640(Invitrogen)中以1×10⁶细胞/ml的浓度培养24小时后，粘附细胞为巨噬细胞，继续在RPMI 1640培养基中补充加入10％胎牛血清((FBS；HyClone))培养和40ng/ml M-CSF(Novoprotein，目录号：CB34)置于加湿的5％CO2培养箱，37℃，5天。此时，巨噬细胞成熟并用于后续实验。通过在1×10³U/m1人IFN-γ(Procell，目录号PCK062)存在下培养成熟的巨噬细胞2天来诱导M1表型，然后在最后24小时处理25ng/ml LPS。使用10ng/ml IL-4(Novoprotein，目录号no.CD88)两天而产生M2表型。CD8微珠(Miltenyi Biotec，目录号：(130-045-201)用于阳性选择PBMCs中的人CD8⁺T细胞。将CD8⁺细胞在预先结合的板中用5ng/ml抗人CD3 SAFIRE纯化试剂盒(Biogems，目录号05121-25-500)培养24h，随后在5ng/ml纯化的抗人CD28 SAFIRE中启动(Biogems，目录号：10311-25-500)，2天，然后用isg15处理巨噬细胞的条件培养基处理24小时。在荧光激活细胞分选(FACS)分析之前，将诱导的CD8+细胞用10ng/ml BFA激活6h。将重组全长ISG15(Abcam，目录号ab78929)以0.1至0.5μg/ml的剂量加入巨噬细胞的条件培养基中。重组ISG15中LPS的浓度为0.56EU/μg，低于体外细胞实验所需的1EU/μg。将热灭活的重组ISG15蛋白在100℃下煮沸15分钟，并作为对照。

(3)从人NPC样品中分离单细胞

使用先前报道的改良方法分离单个组织细胞(19)。简要地，将人NPC活检样品仔细清洗并切成小块(＜0.5cm)。将组织片段用1mg/ml胶原酶D(Roche Diagnostic)，100ug/mlDNase I(Sigma-Aldrich)和0.6U/ml dispase(Roche Diagnostic)酶混合液在含2％胎牛血清的完整DMEM中消化60分钟。60分钟然后，将片段过滤，计数并染色以进行流式细胞术分析。

(4)实时定量PCR(qRT-PCR)

根据制造商的说明，使用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA。使用SYBR PremixExTaq试剂盒(Takara)，通过Light Cycler 480系统(Roche Diagnostics)进行RT-PCR。qRT-PCR引物的寡核苷酸序列在下面列出。

IFN-α：正向AACTCCCCTGATGAATGCGG，反向AGTGTAAAGGTGCACATGACG；

IFN-β：正向GCGACACTGTTCGTGTTGTC，反向GCCTCCCATTCAATTGCCAC；

IL-10：正向CGAGATGCCTTCAGCAGAGT，反向GGCAACCCAGGTAACCCTTA；

TGF-β：正向CACGTGGAGCTGTACCAGAA，反向AGTGAACCCGTTGATGTCCA；

iNOS：正向CGCATGACCTTGGTGTTTGG，反向CATAGACCTTGGGCTTGCCA

(5)蛋白质印迹分析

蛋白提取物通过10％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(Roche)，并用针对人ISG15的抗体(1∶1000；Abnova，目录号A155801)，SRC(1∶1000；CST，目录号9935T)和β-actin(1∶3000；Abcam，目录号ab69512)检测。过氧化物酶偶联二抗(1∶3,000；CST)。

(6)免疫沉淀(IP)

HK1和C666-1 NPC细胞的条件培养基(CM)用0.45μm注射器过滤器过滤。将抗人ISG15的抗体(Abnova，目录号A155801)以1μg∶2ml的比例加入到过滤的CM中，并在4℃下摇动2小时。用蛋白A/G珠(Pierce Protein A/G琼脂糖)沉淀抗ISG15复合物，将其离心，变性并使用Western印迹进行分析以确定ISG15表达。

(7)鼻咽癌标本的双重免疫染色

从代表性的福尔马林固定石蜡包埋的NPC样品中获得直径为2mm的核心组织，将其切成4μm的厚度。使用高压锅在0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原提取30分钟。将标本与对CD163(1∶200；Abcam，目录号ab182422)和ISG15(1∶100；Novus，目录号NB600-891)有特异性的抗体一起孵育。两名对患者临床状况不了解的独立病理学家(张TZ，张L)在显微镜下计数肿瘤内区域CD163⁺，ISG15⁺和ISG15⁺CD163⁺细胞的染色数。为了进行免疫荧光染色，将福尔马林固定的石蜡包埋的NPC标本与对CD163(1∶100；Abcam，目录号ab182422)和ISG15(1∶100；Novus，目录号NB600-891)有特异性的抗体孵育，或将巨噬细胞载玻片与对ISG15(1∶100；Novus，货号NB600-891)和CD11+CD18(1∶100；Abcam，货号ab13219)有特异性的抗体在4℃孵育过夜，然后使用Alexa Fluor 555驴抗兔IgG和AlexaFluor 488驴抗小鼠IgG(Life Technologies)孵育。使用带有核心数据采集系统的共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss)对抗体染色的细胞进行成像。

(8)流式细胞仪染色

用PE小鼠抗人CD163(BD Bioscience，目录号556018)和FITC小鼠抗人HLA-DR(BDBioscience，目录号560944)将经过或未经过rISG15处理12小时的巨噬细胞染色。在巨噬细胞门控后，通过创建CD163(PE)和HLA-DR(FITC)的图谱，使用双参数密度印迹法来区分M2和M1细胞。为了检测CD8+细胞的效应子，在用PE/花菁7抗人IFN-γ进行细胞内染色之前，先用PE抗人CD8a(Biolegend，目录号344705)或FITC抗人/小鼠颗粒酶B(Biolegend，目录号515403)或APC抗人Perforin(Biolegend，目录号308111)对CD8+细胞进行染色。细胞内染色通透性洗涤缓冲液(Biolegend，目录号421002)用于通透CD8+细胞，并用固定缓冲液(Biolegend，目录号420801)固定。所有数据均使用cytoFLEX流式细胞仪(BD Biosciences，美国)收集，并使用FlowJo软件(BD Biosciences，美国)进行分析。

(9)体内肿瘤的发生和治疗

为了确定经isg15处理的巨噬细胞在鼻咽癌中的致瘤性，我们使用鼻咽癌细胞和巨噬细胞的混合物来建立肿瘤模型。总共125μLRPMI 1640(Invitrogen)和基底膜基质的混合物(比例为2∶1，Matrigel；Corning，目录号354248)，其中包含1.5×10⁶HK1 NPC细胞和0.5×10⁶人PBMC来源的巨噬细胞，皮下注射到雌性BALB/c小鼠(5-6周大，北京生命河实验动物技术有限公司)的腹侧。处理方案遵循SYSUCC采用的动物实验指南，符合UKCCCR指南(20)的要求。动物实验得到了SYSUCC动物护理和使用委员会的批准。接种前24小时，用或不使用295μM rISG15诱导巨噬细胞。使用异氟醚(批号217150301，RWD Life Science)对小鼠实施安乐死。然后颈椎脱位，确保肿瘤细胞注射两周后死亡。补充文件中描述了进一步的信息。

(10)细胞因子阵列和细胞因子检测

将经或未经rISG15处理的巨噬细胞上清液与检测膜在4℃孵育过夜。该程序是根据制造商针对RayBio人细胞因子抗体阵列的协议(Raybiotech，目录号AAH-CYT-1000)执行的。通过使用人TH1/TH2/TH17细胞因子CBA试剂盒(BD Bioscience，目录号560484)检测M1和M2极化细胞因子的蛋白水平，该试剂盒包含IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α和IFN-γ。使用人CCL18/PARC DuoSetELISA试剂盒(R&D，目录号DY394-05)测量CCL18的蛋白水平。程序是按照制造商的规程执行的。

(11)统计分析

用学生t检验比较两组独立的数据。采用Kaplan-Meier法估计生存分布，log-rank检验分析生存与参数之间的关系。采用Cox比例风险回归分析来确定预后的预测因素，包括单变量分析中p值为0.15的因素。P＜0.05被认为是显著的。采用SPSS 25.0版本(SPSS，美国伊利诺伊州芝加哥)统计软件进行统计分析。

5、结果

(1)鼻咽癌细胞将ISG15释放到细胞外环境中，ISG15有可能成为NPC的微环境因子

我们报道了鼻咽癌组织中ISG15 mRNA表达上调(18)。ISG15诱导鼻咽癌细胞的干性表型，并与鼻咽癌患者预后不良相关(18)。由于ISG15是抗病毒蛋白，并受I型干扰素诱导，因此我们测量了NPC样品中IFN-α和IFN-βmRNA的表达。结果表明，NPC组织中的IFN-α和IFN-βmRNA均升高，表明NPC组织中ISG15的上调可能是对I型IFN水平升高的反应(图1A)。我们进一步检测了用IFN-β处理的NPC细胞中的ISG15蛋白水平，并观察到了IFN-β诱导的NPC细胞中ISG15的增加(图1B)。ISG15是参与ISGylation的众所周知的细胞内泛素样分子。此外，游离的ISG15可以释放到细胞外空间，并作为细胞因子。我们在HK1和EBV⁺C666-1 NPC细胞的上清液中检测到ISG15蛋白。SDS-PAGE分析上清液中的免疫沉淀表明NPC细胞可以释放ISG15(图1C)。据报道，游离的ISG15可作用于活跃的NK细胞(21)和T细胞(22)，但其对巨噬细胞的作用尚不清楚。在鼻咽癌组织中，ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞的数量显着高于非癌性鼻咽上皮(图1D)，这表明ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞的浸润与NPC的发生有关。我们的结果提供了证据，表明NPC细胞分泌的ISG15可能成为微环境因子，并对巨噬细胞具有调节作用。接下来，我们研究了分泌的ISG15在巨噬细胞和获得促进肿瘤表型中的作用。

(2)ISG15诱导M2样表型并促进NPC细胞的迁移和致瘤性

巨噬细胞分为两个极化，M1和M2。在肿瘤微环境中，肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)通常表现出M2极化，并与肿瘤细胞的恶性转化和患者预后不良有关。首先，将游离的重组ISG15蛋白添加到来源于外周血单核细胞(PBMC)的人巨噬细胞的上清液中。通过流式细胞术测量M2/M1巨噬细胞的表面标志物CD163/HLA-DR比。用rISG15处理观察到人巨噬细胞CD163/HLA-DR的比例增加(图2A)，表明ISG15处理可诱导M2样表型。此外，ISG15处理可显着上调人类巨噬细胞中M2相关细胞因子IL-10，TGF-β的mRNA表达，但不上调M1相关细胞因子iNOs的mRNA表达(图2B)。因此，ISG15处理增加了IL-4(典型的M2极化细胞因子)的分泌，而对M1极化细胞因子(如IL-6和TNF-α)没有任何影响(图2C)。此外，用rISG15处理的巨噬细胞的上清液显着促进了HK1 NPC细胞的迁移(图2D)。此外，通过皮下接种NPC细胞和ISG15预处理的巨噬细胞混合物，表明BALB/c小鼠体内的致瘤性增强(图2E)。总之，ISG15激活的巨噬细胞增强了NPC细胞的迁移和致瘤性。

(3)ISG15处理的巨噬细胞通过CCL18分泌促进NPC细胞迁移

为了确定ISG15处理的巨噬细胞如何促进NPC细胞迁移，通过使用细胞因子阵列检查了用ISG15处理的巨噬细胞上清液中的细胞因子谱(补充表2、3)。结果表明，与对照相比，CCL18是ISG15处理的巨噬细胞上清液中增加最多的细胞因子(图3A)。我们通过ELISA证实了ISG15处理的巨噬细胞中CCL18的分泌增加(图3B)。这些结果表明，分泌的ISG15是巨噬细胞中诱导CCL18的分子。已显示CCL18仅由髓样来源的细胞分泌，并且是TAM产生最多的细胞因子之一(23，24)。据报道，TAM衍生的CCL18通过诱导上皮-间质转化(EMT)促进癌细胞侵袭(23，25，26)。最近，已证实CCL18在NPC中诱导EMT(27)。在我们的研究中，在抗ccl18多克隆抗体的作用下，经isg15处理的巨噬细胞上清液诱导的鼻咽癌细胞增强迁移作用被消除(图3C)。综上所述，isg15处理的巨噬细胞通过分泌CCL18促进鼻咽癌细胞迁移。

(4)ISG15诱导巨噬细胞分泌CCL18取决于ISG15受体，白细胞功能相关抗原1(LFA-1)和SRC家族激酶信号传导

CD11a(αL整合素)与CD18(β2整合素)形成异源二聚体复合物，形成与白细胞功能相关的抗原1(LFA-1)整合素受体。在NK细胞中，据报道LFA-1是ISG15的受体，并且CD11a的α1结构域含有ISG15的结合位点(21)。我们确定LFA-1是否在巨噬细胞中是ISG15的同一受体。在用ISG15处理的人巨噬细胞的膜上检测到LFA-1表达(图4A)。LFA-1的小分子抑制剂A286982抑制巨噬细胞分泌CCL18(图4B)。这些结果证实了ISG15诱导的巨噬细胞分泌CCL18依赖于ISG15的受体LFA-1。由于ISG15处理增加了NK细胞通过SRC信号的IL-10分泌(21)，我们检测了ISG15处理的巨噬细胞是否持续激活SRC信号。我们观察到LFA-1和SRC的小分子抑制剂A286982和PP2阻碍了isg15诱导的SRC信号的激活(图4C)。在ISG15处理的巨噬细胞中，Tyr416的磷酸化以时间依赖性方式激活SRC信号传导(补充图1A)。此外，PP2以剂量依赖性方式减少了ISG15处理的巨噬细胞的CCL18分泌(图4D)。总之，ISG15诱导的巨噬细胞分泌CCL18依赖于ISG15受体LFA-1和SRC信号传导。此外，在LFA-1抑制剂的存在下，由ISG15处理的巨噬细胞的上清液诱导的NPC细胞迁移增强受到了阻碍(见补充图1B，即图7B)。这些观察结果表明，isg15处理的巨噬细胞促进鼻咽癌细胞迁移依赖于LFA-1-SRC-CCL18通路。

(5)ISG15处理的巨噬细胞表现出增加的细胞内ISG15表达，而ISG15⁺CD163⁺TAMs预测NPC患者的生存期较差

我们对细胞外ISG15是否可能上调巨噬细胞中细胞内ISG15的表达很感兴趣。结果表明，随着rISG15的处理，ISG15的细胞内表达增加(图5A)。此外，增加的细胞内ISG15主要是以游离ISG15的方式，而不是缀合的ISG15，并且ISG15处理并没有通过上调巨噬细胞E1活化酶(UBE1L1)和E2酶(UBE2L2)来激活ISGytion(图5A)。因此，分泌ISG15的处理上调了巨噬细胞细胞内游离ISG15的表达。

免疫组化(IHC)在独立的福尔马林固定、基于石蜡包埋(FFPE-based)组织芯片(TMA)中进行，其中包括90份鼻咽癌活检样本。纳入的鼻咽癌患者于2016年9月至2018年11月在中山大学中山纪念医院确诊，随访至2020年2月。在最后一次随访时69例患者(76.7％)存活。所有患者确诊后的中位OS为31个月(范围为8-49个月)。所有患者的中位DFS为31个月(范围8-49个月)。所有鼻咽癌患者的OS和DFS曲线见图5B。2年、3年的OS利率分别为91.6％和76.9％；2年期、3年期的DFS利率分别为88.1％和74％。

CD163是TAM的特异性标记(16，28)。我们在NPC活检样本中对ISG15和CD163进行了双重免疫染色，以分析ISG15⁺TAM数量与NPC患者预后之间的相关性。在90例NPC病例中，有87个样本(96.6％)表达了CD163+细胞，有57个样本(63.3％)染色了ISG15，主要是在肿瘤细胞和浸润的免疫细胞中，还有49个样本(54.4％)表达了ISG15⁺CD163⁺细胞，，从形态上推测为巨噬细胞(图5C)。每1mm²中CD163⁺、ISG15⁺、ISG15⁺CD163⁺细胞数分别为132.5(0-506)、6(0-95)、2.5(0-78)。

中位数用作临界值，将标本分为高表达组和低表达组。如表1所示，在单变量分析中，具有高ISG15⁺细胞或高ISG15⁺CD163⁺TAM的患者表现出明显较差的总体生存率(OS)(分别为p＝0.032；p＝0.021)，而CD163⁺TAMs高的患者OS倾向于受损(p＝0.058)。此外，在单变量分析中，CD163⁺、ISG15⁺和ISG15⁺CD163⁺细胞增加与无病生存(DFS)变差相关(分别为p＝0.033；p＝0.02；p＝0.011)。采用Cox比例风险模型进行进一步分析，以确定ISG15⁺CD163⁺TAMs是否可以作为独立的预后预测因子。多因素Cox回归分析T分型、N分型、远处转移、CD163⁺、ISG15⁺、ISG15⁺CD163⁺细胞表达水平等一系列预测因素。多因素分析模型显示，ISG15⁺CD163⁺细胞是OS(危险比4.5；(p＝0.034)和DFS(危害比，5.9；p＝0.015)的的主要独立预测因子(图5d)。其他生存预测因子见表1。

与I-III期相比，ISG15⁺CD163⁺TAM的数量与NPC的临床晚期，IV期显着相关(p＝0.016)。但是，与肿瘤(T)期，淋巴结转移(N)期和远处转移(M)期无明显相关性(p＞0.05)(如补充图2，即图8所示)。

(6)鼻咽癌中ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞的高表达抑制了抗肿瘤CD8⁺细胞的反应

人们认为巨噬细胞在许多类型的肿瘤中的积累可调节肿瘤发展的每个步骤，包括抗肿瘤T细胞反应。由于细胞毒性CD8+T细胞具有针对肿瘤细胞的细胞毒活性，因此我们确定ISG15⁺TAM是否可能损害CTL的固有功能。在肿瘤微环境中所有活细胞中，NPC组织悬浮液中ISG15⁺CD163⁺细胞的总频率从1％到9.7％不等。我们使用ISG15⁺CD163⁺细胞的中位频率作为临界值，将NPC组织分为ISG15⁺TAMs组的高表达或低表达(图6A)。我们发现与低ISG15⁺TAM组相比，高ISG15⁺TAM组中CD8⁺T细胞产生的IFN-γ，穿孔素和颗粒酶B明显较低(图6B)。该结果表明，在NPC微环境中浸润的ISG15⁺TAMs可以抑制细胞毒性CD8⁺细胞的抗肿瘤反应。接下来，在用板结合的抗CD3和抗CD28抗体刺激24小时后，我们确定了ISG15处理的巨噬细胞对PBMC衍生的CD8⁺T细胞产生IFN-γ，穿孔素和颗粒酶B的影响。我们发现，与未用ISG15处理的巨噬细胞相比，在用ISG15处理的巨噬细胞的条件培养基中，CD8⁺T细胞产生的IFN-γ，穿孔素和颗粒酶B明显减少，表明效应子分化受损(图6C和补充图3，补充图3即图9)。总之，我们的表型分析表明，NPC中的ISG15⁺TAM抑制了抗肿瘤CTL反应。

6、讨论区

ISG15由成纤维细胞，单核细胞，淋巴细胞和嗜中性粒细胞释放，在其中一些细胞类型中，分泌可能以IFN-α/β依赖性或IFN-α/β非依赖性方式被诱导(29)。人ISG15诱导的PBMC分泌大量IFN-γ，IL-2和IL-12(7)，并被认为具有细胞因子诱导活性。而且，人ISG15增强了NK细胞的增殖和裂解能力(7)。这些发现表明ISG15具有细胞外免疫调节活性。最近，已经鉴定出患有ISG15缺乏症的个体(29、30)。与预期相反，在这些ISG15缺陷患者中未观察到对病毒感染的特殊易感性。缺乏分泌的游离ISG15导致淋巴细胞IFN-γ产生水平降低(29)，而ISG15缺陷患者的血白细胞产生的IFN-γ受损导致对环境分枝杆菌的易感性(30)。这些发现表明ISG15是在免疫中具有功能性作用的分泌分子。

ISG15可以作为一种细胞外分子被释放以响应I型IFN(7)。在这项研究中，NPC细胞将ISG15释放到细胞外环境中。ISG15自由释放或分泌的机制尚未完全阐明。我们观察到IFN-β诱导的NPC细胞中游离ISG15蛋白增加，这可能暗示分泌ISG15的NPC细胞可能在I型IFN诱导下对增加的游离细胞内ISG15作出反应。此外，Sainz及其同事观察到巨噬细胞与癌症干细胞共培养时会增加ISG15的表达和分泌(31)。该观察表明，在肿瘤细胞之外，癌微环境内浸润的巨噬细胞可能释放ISG15。

TAM参与肿瘤的发生和发展。TAM分泌ISG15，这有助于胰腺导管腺癌癌干细胞的形成(31)。但是，ISG15在巨噬细胞中的功能尚不清楚。在这项研究中，分泌的ISG15上调了巨噬细胞中细胞内ISG15的表达。此现象表明ISG15标记的巨噬细胞可以用作生物标记，以进一步研究ISG15作用于巨噬细胞的临床意义。我们观察到表达ISG15的TAM与NPC患者的不良预后和更晚期有关。体外研究表明，ISG15改变了HLA-DR/CD163的比率并增加了TAM样细胞因子的表达。这些结果表明人ISG15在巨噬细胞上的功能作用。此外，在体外或体内，经ISG15处理的巨噬细胞均能促进NPC细胞的迁移和致瘤性。这些发现证实了经ISG15处理的巨噬细胞的恶性表型。

先前已经描述过，ISG15是一种警报蛋白，通过细胞外基质重塑、骨髓细胞浸润和小鼠炎症引起组织警报。免疫部位产生的ISG15通过增强CD8+T细胞的扩增、短暂的效应子和效应子/记忆分化而促进了疫苗特异的CTL反应(32)。另一项体内研究表明，DNA疫苗编码的ISG15可以促进小鼠的CTL反应(33)。在我们的观察中，游离的ISG15作用于巨噬细胞，随后对CTL反应产生不同的影响。根据肿瘤标本消化活细胞和ISG15处理的巨噬细胞体外活化CD8+细胞产生效应物的结果，得知表达ISG15的TAM会削弱抗肿瘤CTL反应，提示经过ISG15处理的巨噬细胞可能通过抑制CTL对肿瘤的反应而参与恶性转化。

细胞因子是直接连接免疫细胞和肿瘤细胞的典型信号。在本研究中，细胞因子阵列显示CCL18是isg15处理的巨噬细胞培养基中的主要分泌分子。TAMs中的CCL18促进肿瘤细胞EMT，是参与肿瘤进展的重要微环境因子(23，25)。我们的工作发现CCL18在加强鼻咽癌细胞迁移中的作用。这一结果与Huang等(27)的研究结果一致。在两组鼻咽癌患者中，CCL18与血清EBV感染滴度和肿瘤进展密切相关。EBV⁺鼻咽癌细胞系在吸引单核细胞并使其向M2巨噬细胞分化方面表现出卓越的能力(27)。这些发现表明了肿瘤细胞迁移与eb病毒诱导的慢性感染之间的联系。鉴于ISG15的抗病毒性质，推测它是将EBV诱导的慢性感染与TAMs联系起来的主要微环境因素。此外，由ISG15处理的TAM产生的CCL18可能会在病毒感染，TAM和肿瘤进展之间形成循环。

最近，LFA-1被确定为NK细胞中ISG15的膜受体(21)。我们的工作证明了LFA-1在巨噬细胞上的表达，对LFA-1的抑制消除了ISG15处理的巨噬细胞CCL18的分泌。这些结果表明，ISG15通过表面受体LFA-1在巨噬细胞上发挥类似的功能。此外，LFA-1的ISG15参与导致SRC家族激酶(SFKs)的激活(21)。在我们的研究中，ISG15通过Tyr416的磷酸化以时间依赖的方式诱导SRC信号的激活。此外，SFK阻断剂抑制了ISG15处理的巨噬细胞分泌的CCL18。这些发现表明，LFA-1-SFK信号传导是ISG15在TAM中起作用并诱导随后CCL18分泌的途径。

总之，EBV的慢性感染以及IFN-α和IFN-β的表达增加可能有助于NPC细胞中ISG15的上调。NPC细胞可以自分泌方式释放ISG15，从而促进M2样表型。经过ISG15处理的巨噬细胞分泌CCL18，从而促进NPC细胞的迁移。肿瘤细胞分泌ISG15，ISG15激活的TAM促进癌细胞迁移，从而在NPC细胞和TAM之间形成前馈环。这些发现表明，慢性病毒感染与肿瘤进展之间存在潜在的联系。本发明研究结果如图10所示。

慢性EBV感染是鼻咽癌(NPC)的特定特征。ISG15最先被鉴定为抗病毒蛋白，最近由于其免疫调节作用而受到关注。我们的观察表明，肿瘤细胞分泌的ISG15作用于巨噬细胞并导致M2分化。ISG15诱导的巨噬细胞分泌CCL18，它通过ISG15受体LFA-1和SRC家族激酶参与促进NPC细胞迁移。此外，ISG15诱导的巨噬细胞阻碍了CTL对NPC的反应。我们的发现表明，分泌的ISG15作用于巨噬细胞是IFN刺激基因的新免疫调节途径。

7、说明

图1.ISG15从鼻咽癌(NPC)细胞释放，并充当NPC中巨噬细胞的细胞因子。A，在NPC活检组织中检测到干扰素(IFN)-α和βmRNA上调。B，在用IFN-β处理的HK1和C666-1 NPC细胞中确定ISG15蛋白增加。C，来自NPC细胞的条件培养基(CM)的免疫沉淀的游离ISG15蛋白的SDS-PAGE分析。对照为RPMI-1640CM，HK1-IFN-β为HK1细胞，用50单位/ml IFN-β处理16h，C666-1为EBV阳性NPC细胞。D，代表性共聚焦图像，显示NPC和非癌性鼻咽上皮(NPE)样品中ISG15和CD163⁺双重染色(左图)。比例尺：40X中20μm或100X中10μm。NPC(n＝6)和NPE(n＝3)中ISG15+CD163+细胞的数量的量化(右图)。数据表示为平均值±SD。统计显着性是使用两尾学生t检验计算的，并以*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001表示。

图2.ISG15诱导了M2样表型并促进了NPC细胞迁移和致瘤性。A和B：分别用59nM和295nM rISG15处理的人PBMC衍生的巨噬细胞24小时，然后拆下进行荧光激活细胞分选(FACS)分析，或提取mRNA进行qPCR分析。A，流式细胞仪测定的isg15处理巨噬细胞M2(CD163)/M1(HLA-DR)表面标记物切换谱的代表性数据。B，通过qPCR分析，rISG15诱导M2细胞因子如IL-10和TGF-β的巨噬细胞mRNA表达，但不诱导M1细胞因子如iNOS的巨噬细胞mRNA表达。IFN-γ/LPS和IL-4充当M1和M2极化的阳性对照。将热灭活的重组ISG15(HI ISG15)蛋白在100℃下煮沸15分钟。C，细胞因子组指示在ISG15处理的巨噬细胞的培养上清液中M2极化细胞因子IL-4的分泌增加，但是M1极化细胞因子IL-6和TNF-α没有增加。经rISG15按规定剂量处理24小时后，从巨噬细胞中提取培养上清，代之以无血清培养24小时。D，用巨噬细胞CM培养的HK1鼻咽癌细胞的transwell过滤器的代表性照片。定量分析显示，在存在ISG15处理的情况下，transwell细胞的数量增加了。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001和****p＜0.0001。E，由BALB-c小鼠中的肿瘤模型通过用人HK1 NPC细胞和PBMC衍生的巨噬细胞(比例为3：1)的混合物皮下接种(有或没有rISG15预处理)建立的生长肿瘤的摄影插图。接受ISG15处理的所有小鼠(十分之十)都有肿瘤生长，但对照组的十只小鼠中只有八只具有肿瘤生长。与对照组相比，ISG15处理组的生长曲线显示出明显更大的肿瘤体积。

图3.isg15处理的巨噬细胞通过分泌CCL18促进鼻咽癌细胞迁移。A，指示剂量下rISG15诱导24小时巨噬细胞CM的细胞因子阵列。下表总结了指示细胞因子的相对信号强度。红色标记框表示CCL18的位置。B，ELISA证实isg15处理的巨噬细胞上清中CCL18水平升高。用规定剂量的rISG15治疗巨噬细胞24小时，用CCL18中和抗体预处理可以阻断ISG15诱导CCL18的作用，在热灭活性rISG15中未观察到。C，在isg15处理巨噬细胞的CM存在下，transwell法检测到鼻咽癌浸润细胞数量增加。抗ccl18抗体抑制了这种增强作用。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

图4.ISG15诱导巨噬细胞分泌CCL18取决于ISG15受体，白细胞功能相关抗原1(LFA-1)和SRC家族激酶(SFK)信号传导。A，免疫荧光证明ISG15受体CD11a/CD18，也称为LFA-1，在人巨噬细胞的膜上表达。巨噬细胞用295nM rISG15处理24小时。比例尺，10μm。B，ELISA结果显示LFA-1的小分子抑制剂A286982抑制巨噬细胞分泌CCL18。C，LFA-1和SRC的小分子抑制剂，A286982和PP2，阻碍了ISG15诱导的SFK信号转导。D，如通过ELISA确定的，PP2以剂量依赖性方式减少了ISG15处理的巨噬细胞的CCL18分泌。

图5.肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和表达isg15的TAMs在鼻咽癌中的临床意义。A，通过Western blotting对rISG15处理的巨噬细胞的总细胞裂解物评估细胞内游离和结合的ISG15，以及ISGytion E1酶(UBE1L)和E2酶(UBE2E2)。B，TMA中的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的Kaplan-Meier生存曲线包含90个NPC活检标本。C，鼻咽癌早期(T1N0M0)和晚期(T3N2M1)肿瘤淋巴结转移(TNM)分期有代表性的免疫组化数据，CD163(酒红色)和ISG15(棕色)双染色。比例尺，50μm。D，具有不同ISG15⁺CD163⁺TAM计数的NPC患者OS和DFS的Kaplan-Meier生存曲线。

图6。ISG15⁺CD163⁺TAMs抑制鼻咽癌细胞毒性白细胞(CTL)反应。用ISG15-PE和CD163-APC抗体对鼻咽癌组织的单细胞悬液(n＝9)进行染色。流式细胞仪检测ISG15⁺CD163⁺细胞总频率，以右上象限百分比表示。左侧显示鼻咽癌组织单细胞悬浮液被门控。右图为具有代表性的低、高CD163⁺ISG15⁺细胞流式细胞仪照片。B，代表性的FACS分析和NPC组织悬浮液中高和低CD163⁺ISG15⁺细胞组之间CD8⁺T细胞内IFN-γ⁺，穿孔素⁺和颗粒酶B⁺细胞百分比的定量。C.在指定的时间内在有或没有ISG15处理的巨噬细胞的条件培养基下体外共培养的CD8⁺T细胞中IFN-γ⁺，穿孔素⁺和颗粒酶B⁺细胞百分比的流式细胞术定量。第二部分：ISG15促鼻咽癌肿瘤相关巨噬细胞分化的作用和机制研究

一、简要：

(一)研究背景与目的：

鼻咽癌在我国华南地区占头颈部恶性肿瘤之首，发病率高居全球首位^[1]。EB病毒持续感染、个体基因易感性和环境因素与鼻咽癌发病生密切相关^[2]。随着放疗技术的发展及同步放化疗方案的应用，鼻咽癌患者五年生存率和局控率有所提高，但晚期患者预后仍较差。局部复发和远处转移仍是治疗失败及导致患者死亡的主要原因^[2]。因此，阐明鼻咽癌进展的分子机制，发现有诊治意义的分子靶标，是降低鼻咽癌死亡率的关键。

课题组前期在鼻咽癌患者组织中进行转录组测序和生物信息数据分析，发现干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15，ISG15)在鼻咽癌组织中高表达。高表达ISG15的鼻咽癌患者局部复发增多，生存时间缩短，是鼻咽癌预后不良因素；实验发现ISG15可促进鼻咽癌干细胞潜能，增强放化疗抵抗^[3]。ISG15是一种I型干扰素(interferon，IFN)诱导基因，其编码的蛋白既可以结合的底物蛋白进行翻译后修饰，又可以以单体形式分泌至胞外作为细胞因子发挥生物学效应。近年来的研究表明ISG15与乳腺癌、口腔癌、前列腺癌、鼻咽癌等多种肿瘤发生发展密切相关^[4-6]，更应值得注意的是，除肿瘤细胞以为，肿瘤微环境中的免疫细胞(肿瘤细胞、巨噬细胞、T细胞等)也可分泌ISG15^[7，8]。肿瘤细胞分泌ISG15，可诱导树突细胞(DC)表达E-caherin，减弱其移动能力，抑制抗原提呈，介导免疫逃逸^[9]。同时，肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)分泌ISG15，增强胰腺癌的增殖、迁移和肿瘤干细胞潜能^[10]。然而，目前尚未发现有关ISG15在鼻咽癌微环境中的研究。因此，从肿瘤微环境调控方向探讨ISG15对鼻咽癌细胞恶性转化的作用及机制，具有重要的科学意义。

本研究目的在于：1)阐明ISG15是鼻咽癌肿瘤微环境中重要的调控因子，ISG15阳性的巨噬细胞与鼻咽癌不良预后相关；2)证实ISG15诱导TAMs分化并促进鼻咽癌细胞迁移和成瘤的作用；3)探讨ISG15诱导TAMs分化并促进鼻咽癌迁移的机制。为阐明鼻咽癌的发病机制，防治肿瘤复发转移，提高患者生存率，提供新的靶标和科学依据。

(二)研究方法：

分子表达的检测方法：采用Real-time PCR检测ISG15、IFN、IL-10、TGF-βmRNA的表达水平，采用SDS PAGE-Western blot检测鼻咽癌细胞株和鼻咽永生化上皮细胞株中ISG15蛋白的表达。通过免疫荧光实验观察ISG15在鼻咽癌组织冰冻切片中巨噬细胞上的表达和分布情况。免疫组化标记鼻咽癌活检组织芯片中CD68⁺巨噬细胞和ISG15⁺CD163⁺的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，通过生存分析，研究巨噬细胞表达与鼻咽癌预后及临床分期的相关性。采用免疫沉淀-Westernblot检测鼻咽癌培养上清中分泌型ISG15蛋白的表达水平。运用酶联免疫吸附实验法(ELISA)，检测细胞培养上清中CCL18蛋白含量。

肿瘤相关巨噬细胞表型的体外体内实验方法：用重组人ISG15蛋白诱导人外周血来源巨噬细胞，通过流式细胞分选术观察M1表型表面标记物HLA-DR和M2表型表面标记物CD163的表达；采用Real-time PCR检测M1类细胞因子(iNOS)和M2类细胞因子(IL-10、TGF-β)mRNA的表达水平，观察ISG15对巨噬细胞M2表型分化的调控作用。收集ISG15诱导的巨噬细胞上清，通过Transwell小室与鼻咽癌细胞株HK1共培养，观察ISG15诱导的巨噬细胞对鼻咽癌细胞迁移能力的影响。将ISG15诱导后巨噬细胞与鼻咽癌细胞株HK1混合悬液种植在裸鼠皮下，观察肿瘤生长曲线，观察ISG15诱导的巨噬细胞对鼻咽癌成瘤能力的影响。

ISG15诱导的肿瘤相关巨噬细胞促进鼻咽癌细胞迁移的分子机制研究方法：通过细胞因子表达谱检测，筛查ISG15诱导的肿瘤相关巨噬细胞上清中差异表达的细胞因子，并通过ELISA验证。通过中和抗体和小分子抑制剂阻断实验及功能实验，证实ISG15促进肿瘤相关巨噬细胞分化，继而促鼻咽癌细胞迁移的调控机制。

统计学方法：应用SPSS25.0软件对数据进行统计学分析。定量资料的描述采用均数和标准差，定性资料的描述采用频数和百分比。两组独立样本定量资料的组间差异比较采用t检验，定性资料采用χ²检验。使用ROC曲线分析来确定CD68高低表达分层的截断值。患者预后分析采用Kaplan-Meier生存分析法，Log-rank检验比较不同组别患者的中位生存时间。应用Pearson相关分析确定ISG15⁺CD163⁺表达与临床分期之间的关系。利用单因素Cox风险回归模型筛选预后的预判指标，将p＜0.05的指标纳入多因素Cox回归分析，校正不同指标对预后的影响。检验水准a＝0.05。*p＜0.05为具有统计学意义，**p＜0.01、***p＜0.001为具有显著统计学差异。使用GraphPadPrism 5.0软件进行图表制作。

(三)实验结果：

1、鼻咽癌细胞可分泌ISG15，后者可作为鼻咽癌微环境因子，作用于巨噬细胞，发挥免疫调控作用

Real-time PCR结果显示鼻咽癌组织中的IFN-α和IFN-βmRNA水平较非癌鼻咽组织上调。Westernblot结果显示IFN-β诱导的鼻咽癌细胞中ISG15表达水平明显增加，表明鼻咽癌组织中ISG15的上调可能是EB病毒感染后鼻咽癌细胞IFN-β表达上调的级联反应。继而通过免疫沉淀-Western blot分析，检测到鼻咽癌细胞HK1、C666细胞上清液中表达ISG15蛋白，且IFN-β处理可上调鼻咽癌细胞释放ISG15蛋白，提示鼻咽癌细胞表达并分泌ISG15，后者可能作为鼻咽癌微环境因子，参与肿瘤免疫调控。通过共聚焦显微镜，发现ISG15在鼻咽癌组织的T细胞和巨噬细胞中表达，且在巨噬细胞的表达更强。提示ISG15可能作用在鼻咽癌微环境中的巨噬细胞，进而发挥其促癌作用。

2、ISG15⁺肿瘤相关巨噬细胞与鼻咽癌不良预后相关

通过对鼻咽癌患者活检组织的免疫组化及临床资料进行分析发现，与低表达CD68⁺巨噬细胞的患者相比，高表达CD68⁺细胞的患者总体生存期(OS)更短(39.7±8.3个月vs.160±7.2个月，p＜0.001)；CD68⁺的表达水平、T分期、N分期、临床分期、远处转移均与鼻咽癌患者的预后相关(p＜0.05)；CD68⁺高表达(危险比＝3.303；95％可信区间为1.681-6.493；p＝0.001)和临床分期(危险比＝-2.316；95％可信区间为1.701-3.154；p＜0.001)是OS主要独立预测因子。为进一步明确ISG15⁺CD163⁺亚群的巨噬细胞与NPC患者临床预后的关系。我们收集了90例NPC患者活检组织及临床资料，该组鼻咽癌患者的2年、3年总生存率分别为91.6％和76.9％，2年、3年无病生存率分别为88.1％和77.4％。ISG15和CD163双重标记免疫组化染色结果显示在54.4％(49/90)的NPC的瘤内基质(intratumor)中检测到ISG15⁺CD163⁺细胞。ISG15⁺CD163⁺肿瘤相关巨噬细胞(tumor-assocaited macrophages，TAMs)高表达患者的OS(35.4±1.3vs 42.1±2.3，p＝0.021)和无病生存期(DFS)(34.1±1.5vs42.1±2.3，p＝0.011)均缩短。多因素风险回归模型显示N分期(危险比＝2.159；95％可信区间为1.195-3.901；p＝0.011)和ISG15⁺CD163⁺表达水平(危险比＝2.812；95％可信区间为1.083-7.301；p＝0.034)可以作为NPC患者OS总生存期的独立预判因素，同时N分期(危险比＝2.576；95％可信区间为1.388-4.78；p＝0.003)和ISG15⁺CD163⁺表达水平(危险比＝3.244；95％可信区间为1.253-8.398；p＝0.015)可以作为NPC患者DFS的独立预判因素。Spearman秩相关系数法分析结果显示，NPC组织中ISG15⁺CD163⁺细胞的数量与IV期临床病例显着正相关(Spearmen r＝0.253，p＝0.016)。而ISG15⁺CD163⁺细胞的数量与肿瘤T分期(Spearme r＝0.173，p＝0.103)、淋巴结分期(Spearme r＝0.130，p＝0.223)和远处转移(Spearme r＝0.056，p＝0.599)之间存在正相关，但相关性不显着区间为1.253-8.398；p＝0.015)可以作为NPC患者DFS的独立预判因素。上述结果表明，ISG15⁺CD163⁺细胞在鼻咽癌晚期患者中表达增加，且与患者预后不良相关。

3、ISG15促巨噬细胞M2表型分化的调控作用

为了明确ISG15能否调控巨噬细胞分化，我们用rISG15(重组人ISG15蛋白)处理人外周血来源的巨噬细胞，发现其ISG15和M2表型细胞因子(TGF-β、IL-10、CCL-18)mRNA的表达上调，提示ISG15可诱导人单核巨噬细胞M2表型。这提示分泌型ISG15可上调巨噬细胞细胞中ISG15的表达并诱导巨噬细胞细胞的M2表型。接下来，我们用rISG15处理人单核细胞诱导的巨噬细胞，发现诱导后的巨噬细胞表达较低的HLA-DR和较高的CD163，且检测到M2表型细胞因子(如IL-10和TGF-β)mRNA的表达上调。同时，rISG15处理后的巨噬细胞，其上清液可促使更多的鼻咽癌细胞穿过小室；而鼻咽癌细胞和rISG15诱导的巨噬细胞混合后接种于裸鼠皮下，可促使肿瘤生长更快、体积更大。这表明ISG15可诱导巨噬细胞的M2表型并增强了鼻咽癌细胞的致瘤性和迁移能力。

4、ISG15促巨噬细胞M2表型分化的分子机制

为了明确ISG15诱导的巨噬细胞的上清如何促进鼻咽癌细胞迁移，我们检测并分析了该上清液细胞因子表达情况，发现rISG15诱导的巨噬细胞上清中CCL18的分泌增加最明显(5.86倍)；而用多克隆抗体拮抗CCL18后，rISG15诱导的巨噬细胞的上清液所致的鼻咽癌细胞穿过小室的数目明显减少。上述结果表明，ISG15可激活巨噬细胞的M2型极化，并通过分泌CCL18促进鼻咽癌细胞的恶性表型。接着，我们在rISG15处理后的人巨噬细胞和THP1细胞的细胞膜上检测到ISG15的受体LFA-1的表达，而LFA-1的小分子抑制剂A286982可抑制rISG15诱导的人巨噬细胞和THP1细胞CCL18的分泌。这些结果表明ISG15结合巨噬细胞表明的LFA-1诱导巨噬细胞的M2型分化进而促进CCL18的分泌。此外，我们还发现在rISG15诱导巨噬细胞的检测Src信号通路发现，Tyr416位点的磷酸化以时间依赖方式激活了Src信号。而LFA-1和Src抑制剂均可阻碍rISG15诱导的Src信号的激活。上述结果表明，ISG15诱导巨噬细胞分泌的CCL18依赖于ISG15受体LFA-1和Src信号通路。

(四)结论：

①鼻咽癌细胞分泌ISG15到胞外，IS15作为鼻咽癌微环境因子参与肿瘤调控；

②表达ISG15的肿瘤相关巨噬细胞与鼻咽癌患者不良预后相关；

③ISG15诱导TAMs表型并促进鼻咽癌细胞迁移和体内成瘤；

④ISG15诱导的巨噬细胞分泌CCL18，从而促进鼻咽癌细胞迁移；该调控作用依赖于ISG15表面受体LFA-1(CD11a/CD18)和Src家族激酶(SFK)的参与。

即：

【The Role and Mechanism of ISG15in Promoting Differentiation ofTumor-Associated Macrophages in Nasopharyngeal Carcinoma

一，ABSTRACT

(一)Background and Objective:

Nasopharyngeal carcinoma occupies the top of head and neck cancer inSouth China，with the highest incidence in the world^[1].Persistent EB virusinfection，individual genetic susceptibility，and environmental factors areclosely related to the incidence of nasopharyngeal carcinoma^[2].With thedevelopment of radiotherapy technology and the application of concurrentradiochemotherapy，the five-year survival rate and local control rate ofpatients with nasopharyngeal carcinoma have improved，but the prognosis ofpatients with advanced stage is still poor.Local recurrence and distantmetastasis are still the main causes of treatment failure and death ofpatients^[2].Therefore，elucidating the molecular mechanism of nasopharyngealcarcinoma progression and finding molecular targets with diagnosticsignificance are the key to reducing the mortality of nasopharyngealcarcinoma.

Our previous research performed deep sequencing of the transcriptomeand analysis of bioinformatics data in the tissues of patients withnasopharyngeal carcinoma，and found that interferon-stimulated gene 15，ISG15，is highly expressed in nasopharyngeal carcinoma and is associated withEpstein-Barr virus(EBV).Infection related.ISG 15is a type I interferon(IFN)inducible gene.The protein encoded by it can not only post-translationallymodify the bound substrate protein，but also can be secreted to the outside asa cytokine to exert biological effects.Recent studies have shown that ISG15is closely related to the occurrence and development of breast cancer，oralcancer，and prostate cancer^[3-5].It should be noted that in addition to tumorcells，tumor microenvironment Immune cells(tumor cells，macrophages，T cells，etc.)can also secrete ISG15^[6，7].Tumor cells secrete ISG15，which can inducedendritic cells(DC)to express E-caherin，reduce their ability to move，inhibitantigen presentation，and mediate immune escape^[8].At the same time，tumor-associated macrophages(TAMs)secrete ISG15，which enhances pancreatic cancerproliferation，migration，and tumor stem cell potential^[9].However，no studieshave been found on ISG15 in the nasopharyngeal carcinomamicroenvironment.Therefore,it is of great scientific significance andclinical value to explore the role and mechanism of ISG15 on the malignanttransformation of nasopharyngeal carcinoma cells from the direction of tumormicroenvironment regulation.

The purpose of this study were to:1)clarify that ISG15 is animportant regulatory factor in nasopharyngeal carcinoma tumormicroenvironment,that ISG15-positive macrophages are associated with poorprognosis of nasopharyngeal carcinoma；2)confirm that ISG15 induces TAMsdifferentiation and promotes nasopharyngeal carcinoma cell migration 3)explore the mechanism of ISG15 inducing TAMs differentiation and promotingmetastasis of nasopharyngeal carcinoma.It will provide new target andscientific basis to elucidate the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma,prevent tumor recurrence and metastasis and improve patient survival rate.

(二)Methods:

1.Detection of molecular expression:Real-time PCR was used to detectthe expression levels of ISG15,IFN,IL-10,and TGF-βmRNA,and SDS PAGE-Westernblot was used to detect nasopharyngeal carcinoma cell lines andnasopharyngeal immortalized epithelial cell lines.ISG15 proteinexpression.The expression and distribution of ISG15 on macrophages in frozensections of nasopharyngeal carcinoma tissues were observed byimmunofluorescence experiments.

Immunohistochemically labeled CD68 macrophages and ISG15 CD163 tumor-associated macrophages(TAMs)in the nasopharyngeal carcinoma biopsy tissuechip.The correlation between macrophage expression and prognosis and clinicalstage of nasopharyngeal carcinoma was studied by survivalanalysis.Immunoprecipitation-Western blot was used to detect the expressionlevel of secreted ISG15 protein in the culture supernatant of nasopharyngealcarcinoma.The enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect theCCL18 protein content in the cell culture supernatant.

2.Tumor-associated macrophage phenotype in vitro and in vivo:Humanperipheral blood-derived macrophages were induced with recombinant humanISG15 protein,and the M1 phenotype surface markers HLA-DR and M2 phenotypeswere observed by flow cytometry.Expression of surface marker CD163；Real-timePCR was used to detect the expression levels of M1 cytokines(iNOS)and M2cytokines(IL-10,TGF-β)mRNA,and to observe the effect of ISG15 on the M2phenotype differentiation of macrophages.Regulation.The supernatant ofmacrophages induced by ISG15 was collected and co-cultured withnasopharyngeal carcinoma cell line HK1 through the Transwell chamber.Theeffects of macrophages induced by ISG15 on the migration ability ofnasopharyngeal carcinoma cells were observed.Amixed suspension of macrophagesinduced by ISG15 and nasopharyngeal carcinoma cell line HK1 was planted underthe skin of nude mice to observe the tumor growth curve and the effect ofmacrophages induced by ISG15 on the tumorigenicity of nasopharyngealcarcinoma.

3.The molecular mechanism of ISG15-induced tumor-associatedmacrophages to promote the migration of nasopharyngeal carcinoma cells:Through cytokine expression profiling,screening differentially expressedcytokines in the supernatant of tumor-associated macrophages induced by ISG15ELISA validation.Through the neutralization antibody and small moleculeinhibitor blocking experiments and functional experiments,it was confirmedthat ISG15 promotes the regulation mechanism of tumor-associated macrophagesand then promotes the migration of nasopharyngeal cancer cells.

4.Statistical methods:SPSS 25.0 software was used for statisticalanalysis of the data.Quantitative data are described using mean and standarddeviation,and qualitative data are described using frequency andpercentage.Differences between the two groups of independent samplequantitative data were compared by t test,and qualitative data were analyzedbyχ2 test.ROC curve analysis was used to determine the cut-off value for CD68high and low expression stratification.Patient prognosis was analyzed byKaplan-Meier survival analysis and Log-rank test was used to compare themedian survival time of patients in different groups.Pearson correlationanalysis was used to determine the relationship between ISG15+CD163+expression and clinical stage.A single-factor Cox risk regression model wasused to screen predictive indicators for prognosis,and indicators with P<0.05were included in multi-factor Cox regression analysis to correct the impactof different indicators on prognosis.Inspection level a＝0.05.*P<0.05 isstatistically significant,**P<0.01,***P<0.001 is statistically significant.GraphPadPrism5.0software was used for chart production.

(三)Results:

1.Nasopharyngeal carcinoma cells can secrete ISG15,which can be usedas a microenvironmental factor of nasopharyngeal carcinoma,acting onmacrophages and exerting immune regulation.

Real-time PCR results showed that IFN-αand IFN-βmRNA levels innasopharyngeal carcinoma tissues were up-regulated compared with non-cancernasopharyngeal tissues.Western blot results showed that the expression ofISG15 in nasopharyngeal carcinoma cells induced by IFN-βincreasedsignificantly,indicating that the up-regulation of ISG15 in nasopharyngealcarcinoma tissues may be a cascade response of IFN-βexpression ofnasopharyngeal carcinoma cells after EB virus infection.Then byimmunoprecipitation-Western blot analysis,the expression of ISG15 protein wasdetected in the supernatant of nasopharyngeal carcinoma cells HK1 and C666cells,and IFN-βtreatment can up-regulate the release of ISG15 protein bynasopharyngeal carcinoma cells,suggesting that nasopharyngeal carcinoma cellsexpress and secrete ISG15,which may serve as a microenvironmental factor fornasopharyngeal carcinoma,is involved in tumor immune regulation.Throughconfocal microscopy,ISG15 was found to be expressed in T cells andmacrophages of nasopharyngeal carcinoma tissues,and stronger inmacrophages.It is suggested that ISG15 may act on macrophages in themicroenvironment of nasopharyngeal carcinoma,and then play its role inpromoting cancer.

2.ISG15⁺tumor-associated macrophages are associated with poorprognosis of nasopharyngeal carcinoma.

By analyzing the immunohistochemical results and clinical data ofnasopharyngeal cancer patients'biopsies,it was found that patients with highexpression of CD68⁺cells had shorter overall survival compared with patientswith low expression of CD68⁺macrophages(39.7±8.3 months vs160±7.2 months,p<0.001)；CD68⁺expression level,T staging,N staging,clinical staging,and distantmetastasis were related to the prognosis of patients with nasopharyngealcarcinoma(p<0.05)；CD68⁺high expression(hazard ratio＝6.75；p＝0.009)andclinical stage(hazard ratio＝7.75；p＝0.005)were the main independentpredictors of overall survival.

To further clarify the relationship between macrophages of ISG15+CD163+subpopulations and clinical prognosis of NPC patients.We collectedbiopsies and clinical data from 90 NPC patients.Analysis showed that the 2-year and 3-year OS rates of all patients were 91.6％and 76.9％,and the 2-yearand 3-year DFS rates were 88.1％and 77.4％,respectively.OS rate and DFS ratewere significantly correlated with N staging(p-values were 0.011 and 0.003,p<0.05).Further ISG15 and CD163 double-labeled immunohistochemical stainingshowed that ISG15⁺CD163⁺cells were detected in 54.4％(49/90)NPC matrix.OS andDFS were shortened in patients with high expression of ISG15⁺CD163⁺TAMs(p-values were 0.034 and 0.015,respectively).Univariate regression analysisshowed that N stage,distant metastasis,and expression levels of ISG15⁺,CD163⁺,and ISG15⁺CD163⁺were correlated with the prognosis of NPCs(p<0.05)；thesefactors were then substituted into a multivariate risk regression model,andthe results showed that N stage(Hazard ratio＝2.159；95％confidence intervalis 1.195-3.901；p＝0.011)and ISG15⁺CD163⁺expression level(hazard ratio＝2.812；95％confidence interval is 1.083-7.301；p＝0.034)can be used as the total OSof NPC patients Independent predictors of survival,with N stage(hazard ratio＝2.576；95％confidence interval is 1.388-4.78；p＝0.003)and ISG15⁺CD163⁺expression level(hazard ratio＝3.244；95％confidence interval is 1.253-8.398；p＝0.015)can be used as an independent predictor of DFS in NPCpatients.Spearman rank correlation coefficient analysis showed that thenumber of ISG15⁺CD163⁺cells in NPC tissues was significantly positivelycorrelated with its advanced clinical stage(TNM,stage IV)(Spearmen r＝0.253,p＝0.016).The number of ISG15⁺CD163⁺cells was between tumor T stage(Spearme r＝0.173,p＝0.103),lymph node stage(Spearme r＝0.130,p＝0.223),and distantmetastasis(Spearme r＝0.056,p＝0.599).Positive correlation,but theinsignificant correlation range is 1.253-8.398；p＝0.015)can be used as anindependent predictor of DFS in NPC patients.The above results indicate thatthe expression of ISG15⁺CD163⁺cells is increased in patients with advancednasopharyngeal carcinoma and is associated with poor prognosis.

3.ISG15 promotes the regulation of M2 phenotype differentiation ofmacrophages.

In order to determine whether ISG15 can regulate macrophagedifferentiation,we treated human peripheral blood-derived macrophages withrISG15(recombinant human ISG15 protein)and found that their ISG15 and M2phenotype cytokines(TGF-β,IL-10,CCL-18)mRNA expression is up-regulated,suggesting that ISG15 can induce the M2 phenotype of human monocytes.Thissuggests that secreted ISG15 up-regulates the expression of ISG15 inmacrophage cells and induces the M2 phenotype of macrophage cells.Next,wetreated human monocyte-induced macrophages with rISG15 and found that theinduced macrophages expressed lower HLA-DR and higher CD163,and detected M2phenotype cytokines(such as IL-10 and TGF-β)mRNA expression is up-regulated.At the same time,the supernatant of rISG15-treated macrophagescould promote more nasopharyngeal cancer cells to pass through thecompartment；while nasopharyngeal carcinoma cells and rISG15-inducedmacrophages were mixed and seeded under the skin of nude mice,which couldpromote tumor Grow faster and larger.This indicates that ISG15 can induce theM2 phenotype of macrophages and enhance the tumorigenicity and migrationability of nasopharyngeal carcinoma cells.

4.The molecular mechanism of ISG15 promoting macrophage M2 phenotypicdifferentiation.

In order to clarify how the supernatant of macrophages induced byISG15 promoted the migration of nasopharyngeal carcinoma cells,we examinedand analyzed the expression of cytokines in the supernatant and found thatthe increase of CCL18 secretion in the supernatant of macrophages induced byrISG15 was the most significant；After polyclonal antibodies were used toantagonize CCL18,the number of nasopharyngeal carcinoma cells caused by thesupernatant of rISG15-induced macrophages decreased significantly.The aboveresults indicate that ISG15 can activate M2 type polarization of macrophagesand promote the malignant phenotype of nasopharyngeal carcinoma cells bysecreting CCL18.Next,we detected the expression of ISG15receptor LFA-1 on thecell membranes of human macrophages and THP1 cells treated with rISG15,andA286982,a small molecule inhibitor of LFA-1,could inhibit rISG15-inducedhuman macrophages and CCL18 secretion from THP1 cells.These results indicatethat the binding of ISG15 to macrophages indicates that LFA-1 induces M2 typedifferentiation of macrophages and thus promotes CCL18 secretion.In addition,we also found that detection of Src signaling pathways in rISG15-inducedmacrophages revealed that phosphorylation of the Tyr416 site activated SRCsignals in a time-dependent manner.Both LFA-1 and Src inhibitors can inhibitthe activation of rISG15-induced Src signals.The above results indicate thatCCL18 secreted by ISG15-induced macrophages depends on the ISG15 receptorLFA-1and Src signaling pathways.

(四)Conclusions:

1.ISG15was secreted extracellularly by NPC cell and regulated NPC asa tumor microenvironment cytokine；

2.Tumor-associated macrophages expressing ISG 15were associated withpoor prognosis inpatients with nasopharyngeal carcinoma；

3.ISG 15induced the phenotype of TAMs and promoted the migration andtumorigenicity of nasopharyngeal carcinoma cells；

4.ISG15 induced macrophages to secrete CCL18 to promoted themigration of nasopharyngeal cancer cells which depended on the participationof ISG15 surface receptor LFA-1(CD11a/CD18)and SRC family kinases(SFK).】

二、前言

鼻咽癌是我国华南地区常见的恶性致命性肿瘤，由于其独特的地域分布特点和种族差异，又称为“广东癌”。根据国际癌症研究机构的数据，2018年，全球新增约有129000例鼻咽癌病例，近一半发生在我国，其中华南地区的发病率高居全球首位，其男性发病率约是女性的2.5倍^[1]。病理检查是鼻咽癌诊断的金标准，根据癌细胞分化程度不同，鼻咽癌可分为角化性癌和非角化性癌(WHO分型，2005年版)，而后者占比可高达95％^[2]。

随着放化疗技术的发展，鼻咽癌患者的5年生存率得以提高，但由于约60％的患者在初次就诊时已是癌症晚期，即使采用最新的同期放化疗+辅助/诱导化疗，预后仍较差，且局部复发和远处转移仍是导致患者死亡的主要原因^[2，11]。鼻咽癌发生发展及转移主要受环境因素，遗传因素，原癌基因和抑癌基因的突变以及病毒感染影响^[12]。因此，探究鼻咽癌差异表达基因，阐明鼻咽癌进展的分子机制，发现有诊治意义的分子靶标，是降低鼻咽癌死亡率的关键，也是新时代靶向防治鼻咽癌亟待解决的问题。

课题组前期发现LMP2A、Id-1、RRM2等基因在鼻咽癌中异常表达，并与鼻咽癌肿瘤干细胞、及侵袭转移相关^[13-16]。而鼻咽癌干细胞与患者放化疗抵抗及不良预后相关^[14]。为了找到更好的治疗靶点，课题组在鼻咽癌患者组织中进行转录组测序和生物信息数据分析，发现干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15，ISG15)在鼻咽癌组织中高表达，且与EB病毒(EBV)感染相关。我们前期研究发现高表达ISG15的鼻咽癌病例局部复发几率升高，生存时间缩短，是鼻咽癌预后的独立预判因子；体内外实验发现ISG15可促进鼻咽癌干细胞潜能，增强放化疗耐受性^[3]。这提示ISG15在鼻咽癌中发挥促癌作用，但机制仍不清，需要进一步研究。

1、ISG15

1.1ISG15及其生物学功能

ISG15是干扰素(IFN)刺激基因15的产物，含有175个氨基酸，分子量约18KDa大小。ISG15结构上与泛素相似，具有相同的β-抓握折叠构象，是第一个被报道的类泛素化蛋白，其C端和N端都有一个泛素样结构域，与泛素同源性分别为31％和29％^[17]。不同于某些泛素化蛋白的本能表达，ISG15和催化ISG15共轭结合的酶(ISGylation)是由I型干扰素、病毒和细菌感染^[17]、脂多糖(LPS)^[18]、视黄酸^[19]或遗传毒性压力诱导剂^[20]诱导产生的，这表明ISGylation是一个严格调控的过程。令人惊讶地，ISG15也以未结合的细胞内或细胞外形式存在。目前对游离ISG15的作用尚未完全了解，但有人认为，细胞外游离的ISG15可作为细胞因子来调节免疫应答^[21，8]。另有报道，细胞内游离的ISG15与细胞内底物蛋白质共轭结合，对其进行翻译后修饰，改变底物蛋白的稳定性、活性及功能，发挥其生物功能^[22](图3)。ISG15最早被认为是抗病毒蛋白，单纯疱疹病毒(HSV)感染三叉神经节神经元后促进了形成ISG15和p62修饰的自噬小体的形成，起到抗病毒作用^[23]。在RNA病毒感染后，ISG15通过调节自噬，调控RIG-I的抗病毒作用^[24]。此外，HPV感染刺激ISG15分泌，而ISG15可以抑制肿瘤免疫，促进人乳头瘤病毒(HPV)致癌性^[25]。ISG15作用机制示意图如图11所示。

1.2ISG15与肿瘤

ISG15是细胞功能的关键调节者，参与细胞增殖，凋亡和DNA修复等过程，且与癌症的发生发展密切相关^[26]。研究发现ISG15在乳腺癌^[27]、卵巢癌(HGSOC)^[28]、HBV相关肝癌^[29]、结肠癌^[30]、食管鳞状细胞癌(ESCC)^[31]、胃癌^[32]、胰腺癌^[10]等多种肿瘤中高表达，且预后不良相关。

已经证明，在三阴性乳腺癌(TNBCs)中，ISG15表达升高，内皮脂肪酶(LIPG)通过调节DTX3L(类DTX-3-泛素E3连接酶)-ISG15信号，进而通过ISGylation调节蛋白质的功能和稳定性，促进肿瘤的发生发展和转移^[27，33]。此外，乳腺癌细胞中的ISG15和ISGylation抑制了Ki-Ras的降解以及促进纤连蛋白结合整合素，从而促进了癌细胞增殖、迁移、上皮间质转化(EMT)和侵袭^[33，34]。胰腺导管腺癌(PDAC)细胞产生的I型干扰素，诱导肿瘤相关巨噬细胞(TAM)分泌ISG15到肿瘤微环境中，从而抑制抗肿瘤免疫，进而加速了肿瘤干细胞的自我更新，增强了肿瘤的侵袭能力和致瘤潜力^[10]。

此外，ISG15通过外泌体，以旁分泌或自分泌形式调控STAT1、OAS1和MX1，驱动乳腺癌细胞的放化疗抵抗^[35]。ISG15上调促进胰腺癌的吉西他滨耐药有关，但提高伊立替康对胃癌的敏感性^[26]。最近，还显示出，DNA损伤诱导化学治疗剂可诱导p53的ISG15化，从而增强p53与其靶基因如CDKN1和BAX及其自身基因的启动子的结合，从而导致抑制细胞生长和结直肠癌发生^[36]。此外，已显示在通过DNA脱甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)处理的结直肠癌细胞中，ISG15被上调，并发挥抑癌作用^[37]。ISG15不仅可以促进肿瘤治疗抵抗，还可增强肿瘤治疗的敏感性。

综上所述，ISG15可通过胞内和胞外两条途径，参与肿瘤的发生发展。ISG15在胞内主要通过ISG化修饰癌蛋白，参与癌症发生发展。分泌型ISG15可作为细胞因子，直接作用于肿瘤细胞，调控肿瘤细胞的增殖、迁移；同时，也可作用于免疫细胞，参与肿瘤免疫应答的调控。而我们在鼻咽癌组织冰冻切片中也发现，ISG15在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和浸润的T淋巴细胞中表达上调。由此，我们猜想ISG15可能通过肿瘤微环境参与鼻咽癌的发生发展。

2、鼻咽癌微环境

鼻咽癌微环境是指鼻咽癌细胞所处的周围环境，其主要特征之一是在鼻咽癌原发肿瘤的基质中存在大量白细胞浸润，而在转移瘤中少见^[38，39]。这提示浸润性白细胞的存在是原发性鼻咽癌的发生发展的关键所在。NPC活检发现T淋巴细胞是主要的浸润性白血病，其中CD4+和CD8+T细胞的比例在不用NPC标本中有所不同，但它们总体上占浸润性淋巴细胞的50％以上^[40]。此外，在NPC的TME也发现B淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞，自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞的浸润^[38，40]。研究还发现NPC患者和活检组织中白介素(IL)-6，IL-8，IL-10和干扰素(IFN)-γ的水平升高和IL-2的水平降低，这提示TME中不同细胞因子和趋化因子的浓度与浸润性白细胞的募集和活性密切相关^[41，42]。在NPC中，浸润性白细胞发挥促癌还是抗癌作用，取决于肿瘤微环境中细胞因子/趋化因子谱的实时的成分和平衡状态以及不同免疫细胞的比例^[42]。

EBV感染是鼻咽癌的一大特征，潜伏在鼻咽癌细胞中的EBV，通过肿瘤微环境(TME)和改变细胞信号传导及产物来促进肿瘤发生发展、复发与转移^[42，43]。EBV可通过编码EBV核抗原-1(EBNA-1)、潜伏膜蛋白-1(LMP1)、LMP2和EBV早期小RNA(EBER)、lncRNAs及miRNAs，直接调控肿瘤细胞的上皮间质转化(EMT)、干细胞潜能和免疫调节等，参与鼻咽癌的发生发展^[43-45]，同时，EBV还可通过构建局部微环境慢性炎症，分泌IL-1β、TNF-α、IL-10等细胞因子，间接地促进癌症的发生发展^[46，47]。目前，在鼻咽癌患者的血清中已检测到含有LMP1的外泌体，LMP1可以强烈抑制肿瘤杀伤性T淋巴细胞亚群(包括CD8+CTL)和自然杀伤(NK)细胞的活化，导致肿瘤细胞存活并逃避免疫监视^[43，48]。EBER可上调NF-κB和MAPK信号通路，增加M-CSF和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的分泌，诱导TAMs的生成^[49]。EBV、EBV裂解激活因子Zta可以通过上调TAMs表达吲哚胺-(2，3)-双加氧酶(IDO)，或激活GM-CSF和COX2-PGE2，促进TNF-α、IL-6、IL-10的分泌，从而抑制效应性T细胞的生成或促进效应性T细胞凋亡，进而促进EBV感染的NPC细胞的存活^[46，47]。研究还发现EBV相关肿瘤中，通过激活STAT3，AP-1和NF-κB等信号传导来介导PD-L1的上调^[50]，后者抑制T细胞的增殖，导致T细胞消耗殆尽(T-cell exhaustion)，从而介导肿瘤细胞的免疫逃逸^[51]。

巨噬细胞是促炎症因子主要的生产者，也是肿瘤组织中主要的浸润细胞，肿瘤组织中浸润的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)^[52]，常表现为选择性激活的M2表型，具有免疫抑制作用^[53]，能促进肿瘤的增殖、转移和干细胞潜能，与肿瘤患者的不良预后相关^[54，55]。鼻咽癌组织中常见大量的T淋巴细胞浸润，而肿瘤细胞及TAMs可高表达PD-1并与T细胞表达的PD-L1结合，抑制T细胞的增殖和活性，从而介导肿瘤细胞的免疫逃逸^[50，51]。文献报道调节性T淋巴细胞(Treg)浸润是鼻咽癌免疫抑制的重要原因^[56]。近几年，TAMs在鼻咽癌中的作用越来越被重视。研究发现，78.3％的鼻咽癌组织中有巨噬细胞浸润，其分布密度高于非癌鼻咽组织；而且，高密度TAMs浸润的病例生存时间明显缩短^[57]。EBER可上调NF-κB和MAPK信号通路，增加M-CSF和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的分泌，诱导微环境中TAMs的生成^[49]。TAMs分泌的IL-10、TGF-β、iNOS等参与Treg的调控^[57，58]，是启动鼻咽癌免疫逃逸的重要一环。此外，研究表明T reg细胞很可能可以产生RANK配体，以通过RANK-RANKL信号促进原代NPC细胞的转移^[42]。NPC细胞还可以产生VEGF和GM-CSF，并诱导TAMs活化。活化后的TAMs通过产生CCL18增强NPC细胞中的NF-κB信号传导，增加VEGF和GM-CSF的释放并诱导EMT，形成正反馈以驱动NPC转移^[59]。

综上所述，EBV持续潜伏感染和白细胞浸润是鼻咽癌肿瘤微环境中特征性的病理改变，EBV编码潜伏期蛋白可诱导TNF-α、IL-6、IL-10、M-CSF等细胞因子的分泌，诱导TAMs的生成，抑制T细胞免疫应答，参与鼻咽癌免疫逃逸，促进鼻咽癌的发生发展。

3、肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤

肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是广泛浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞，是肿瘤微环境中最常见的免疫细胞^[60]。长期以来，它们被认为是抗肿瘤免疫的指标，然而近期研究发现，TAM的高表达通常与大多数人类癌症的预后不良有关^[61]。已根据微环境中巨噬细胞的功能极化状态，分为经典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型主要出现在癌症初期，参与慢性炎症反应和杀伤肿瘤细胞的过程；而M2型可促进肿瘤生长和血管生成，组织重塑以及抑制抗肿瘤免疫力，在癌症发生发展中起促癌作用^[62]。在大多数肿瘤中，TAMs主要发挥促癌作用与M2型巨噬细胞的作用相似^[62]，因此，通常说的TAMs就是M2型巨噬细胞。

现在公认的是，IFN-γ单独或与LPS或细胞因子(如TNF和GM-CSF)一起诱导经典活化的M1型巨噬细胞，而IL-4，IL-6，IL-10，IL-13，IL-21，IL-33和Notch可以引发M2型的巨噬细胞活化^[63，64]。然而，TAMs的激活是可逆的，已有报道，IFN-γ刺激下，M2型巨噬细胞可向M1型细胞还原，进而降低M2型巨噬细胞的免疫抑制作用^[65]。

研究发现肿瘤相关巨噬细胞与乳腺癌、肺癌、肾癌、基底细胞癌等多种癌症的发生发展及预后不良相关^[66](图2)。TAMs参与肿瘤血管及淋巴管生成，促进肿瘤的生长及转移^[66]，TAMs与肿瘤干细胞相互作用，促进肿瘤的致癌性和治疗抵抗^[67]，TAMs介导肿瘤免疫逃逸促进肿瘤发生^[68]，TAMs通过促进上皮间质转化(EMT)促进肿瘤的侵袭及转移^[69]。TAMs参与肿瘤治疗抵抗，并涉及多种机制：(1)化疗(紫杉醇)或放疗上调集落刺激因子1(CSF1)，IL-34和趋化因子(CC基序)配体2(CCL2)，导致免疫抑制性TAMs募集增加，CD8 T细胞的抗肿瘤反应受到抑制^[70]；(2)化疗(即顺铂和卡铂)增加了肿瘤细胞的效力诱导产生IL-10的M2巨噬细胞^[71]，而巨噬细胞来源的IL-10抑制树突状细胞中IL-12的表达，从而阻断有效地免疫应答^[72]；(3)TAMs增强了癌症干细胞(CSCs)的肿瘤起始能力，并保护CSCs免受化学疗法的侵害，从而促进了治疗耐药性^[67]；(4)TAMs提供的组织蛋白酶可能会钝化癌细胞的化学治疗反应^[73]；(5)TAMs诱导胞苷脱氨酶上调，胞苷脱氨酶在药物转运到癌细胞后会代谢，从而介导获得性对化疗的耐药性^[74]。最近研究发现，实现肿瘤组织中M2型向M1型巨噬细胞的转变，可达到抗肿瘤的作用^[75]。如图12所示，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)通过与癌细胞及不同分子间特殊作用，参与癌症进展。

三、ISG15作为鼻咽癌微环境因子，ISG15阳性巨噬细胞与鼻咽癌不良预后相关

引言：

ISG15是细胞功能的关键调节者，它由I型干扰素、病毒和细菌感染等诱导产生。ISG15单体主要通过在胞内结合底物蛋白(ISG化)和分泌到胞外两种方式发挥生物学作用^[17]。本课题组前期研究发现ISG15在鼻咽癌组织和细胞中高表达。ISG15诱导鼻咽癌细胞的干性表型，并与鼻咽癌患者的预后不良相关^[3]。但ISG15在鼻咽癌微环境中的表达情况和与鼻咽癌进展的关系未知。

因此，本研究首先采用Real-time PCR、Western Blot等方法明确鼻咽癌组织中IFN-α、IFN-β的表达水平和对ISG15分泌的诱导作用；然后，通过免疫荧光和免疫沉淀的SDS-PAGE Western Blot方法明确ISG15在鼻咽癌微环境中的表达水平；进而通过对组织芯片-免疫组化结果分析鼻咽癌微环境中巨噬细胞，尤其是ISG15⁺巨噬细胞与鼻咽癌临床分期及预后的关系。探讨ISG15⁺巨噬细胞是否可以作为鼻咽癌预后的预判指标，明确微环境中ISG15⁺巨噬细胞在鼻咽癌发生发展中的作用和临床意义。

(一)材料

1、临床资料及标本收集

本研究中首个鼻咽癌组织芯片标本源自于中山大学附属肿瘤医院和广东省人民医院病理科，在1990年1月至2000年8月间初次确诊的鼻咽癌患者鼻咽活检组织，共209例。其中女性59例，男性150例，平均年龄45岁，临床早期病例(I+II期)65例，临床晚期病例(III+IV期)144例，平均随访时间75个月(6个月-236个月)。本研究中第二个鼻咽癌组织芯片标本来源于中山大学孙逸仙纪念医院耳鼻咽喉科，在2016年1月至2018年10月间初次确诊的鼻咽癌患者鼻咽活检组织，共90例，其中女性21例，男性69例，平均年龄46岁，临床早期病例(I-III期)71例，临床晚期病例(IV期)19例，平均随访时间26个月(12个月-48个月)。病例入排标准：①病理确诊为鼻咽非角化性癌(2005年版WHO II型)，②标本足够用于制作组织芯片，③排除其他恶性肿瘤病史，④无放化疗史，⑤临床病理资料及随访记录完整。剔除临床病理资料和随访记录不完整及标本过小者的病例。本研究Real-time PCR标本来源于中山大学孙逸仙纪念医院和中山大学附属肿瘤医院2018年3月至2018年12月初次确诊的鼻咽癌患者新鲜组织35例，女性11例，其中男性24例，平均年龄46岁；均为病理确诊的鼻咽非角化性癌初诊未治病例，另外还有13例鼻咽慢性炎症组织标本作为对照组。

2、细胞系

人单核细胞株THP1用RPMI 1640(含10％FBS)培养基培养；鼻咽癌细胞株HK1、C666、HONE1、CNE1、HNE1、HNE1-EBV、CNE2、CNE2-EBV用RPMI 1640(含5％FBS)培养基培养；以上细胞株均由中山大学附属肿瘤医院930实验室保存。

3、主要试剂和耗材

4、主要仪器

5、Real-time PCR引物

6、主要溶液的配制

①10×TBS的配制(4L)

320g NaCl+96g Tris base，加3L双蒸水溶解，然后用浓盐酸调节pH至7.6，最终加双蒸水定容至4L；

WB实验时，取400ml 10×TBS，加入3.6L双蒸水，然后加入4ml Tween-20；

②10×solutionA的配制(1L)

取700ml超纯水溶解后，用10N NaOH调PH至7.6，最后定容至1L，然后用0.22μm滤器过滤后分装成50ml每管，-20℃冰箱保存；

使用时，用灭菌注射用水450ml稀释50ml 10×solution A即可；

③10×电泳液(Running Buffer)的配制(4L)

称取20g SDS+288g甘氨酸+60g Tris base，加双蒸水定容至4L；

WB实验时，取100ml 10×Running Buffer，加入900ml双蒸水，配成1×RunningBuffer；④10×转膜液(Transfer Buffer)的配制(4L)

称取580g甘氨酸+116g Tris base；加双蒸水定容至4L；

WB实验时，取100ml 10×Transfer Buffer，加入900ml双蒸水，配成1×TransferBuffer；⑤4×Upper Tris(PH 6.8)

Tris base 24.24g

10％SDS 16ml

加入300ml超纯水溶解，然后用浓盐酸(约16ml)调节PH至6.8，定容至400ml；

⑥4×Lower Tris(PH 8.8)

Tris base 90.83g

10％SDS 20ml

加入400ml超纯水溶解，然后用浓盐酸(约12ml)调节PH至8.8，定容至500ml；

⑦2×Sample Buffer

当需要使用1×Sample Buffer时，取25ml 2×Sample Buffer和25ml超纯水混合；

⑧1×上样缓冲液(Loading Buffer)

取1ml 1×Sample Buffer，加入50ulβ-巯基乙醇(加入溴酚蓝)后即可使用；

⑨封闭液

WB实验PVDF膜封闭液有两种，即5％脱脂奶粉和5％BSA，均用1×TBST配置，即称取2.5g脱脂奶粉或BSA，然后用50ml 1×TBST溶解即可；

⑩一抗稀释液

配置50ml 5％BSA(1×TBST配制)，加入1ml储存浓度为10％的叠氮纳(NaN₃)，4℃冰箱保存；

DEPC-H₂O(0.1％DEPC)

0.5ml DEPC加入500ml超纯水中，37℃摇床过夜，然后在高压灭菌后分装使用；

50×TAE

Tris-Base 242g

冰乙酸 57.1ml

EDTA(0.5M，PH 8.0) 100ml

加入超纯水定容至1L；

使用时，取20ml 50×TAE，用单蒸水定容至1L即可进行琼脂糖凝胶实验；

Lysis Buffer(IP/co-IP用)

(二)方法

1、组织总RNA和DNA提取

将收集的鼻咽癌及鼻咽炎症组织标本，置于1ml RNA later的EP管中，4℃浸泡过夜后，吸净RNA later，并将标本冻存在-80℃冰箱中；成批提取组织总RNA和DNA，具体步骤如下：

①组织研磨

研磨组织使用机器研磨仪，首先使用液氮预冷机器至4℃；然后将20-30mg的组织加入500ul的GTC Lysis Buffer，转入2ml EP管中，然后加入6粒珠子，转至研磨仪架子上，研磨30s，共研磨2次，研磨后用10ml的一次性注射器反复抽打，使组织更好的裂解；13000rpm室温离心5分钟，将上清移至已经插入2mlEP管中收集管的HiBindTM DNA Column中，13000rpm离心1分钟；将收集管里的液体分别移到1.5ml的EP管中，此步骤之后DNA和RNA就分开提取。

②RNA提取：

加入与1.5ml EP管中0.5倍体积无水乙醇(约250ul)，此时可看到白色沉淀，上下颠倒几次后，然后使用用震荡器剧烈震荡15sec以上；将液体转移至HiBind^TM RNA分离柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中离心出来的液体；向HiBind^TMRNA分离柱中加入500ulRNA Wash BufferI，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中离心出来的液体；向HiBind^TM RNA分离柱中加入500ul RNAWash BufferII，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中离心出来的液体；重复第d)的步骤；将空的HiBind^TMRNA分离柱，13000rpm离心2分钟；丢掉上一步所用的收集管，将HiBind^TM RNA分离柱放入新的1.5ml EP管中，向HiBind^TM RNA分离柱中心滴加50ul的DEPC水，室温孵育3分钟后13000rpm离心2分钟。离心下来的为RNA，分装后放入-80℃中保存。

③DNA提取：

将HiBind^TM DNA分离柱插入新的2ml的收集管中；向HiBind^TM DNA分离柱中加入500ul的HB Buffer，13000rpm离心1分钟，弃去收集管里的液体；向HiBind^TM DNA分离柱中加入500ul DNA Wash Buffer，13000rpm离心1分钟，弃去收集管里的液体；将空的HiBind^TMDNA分离柱中，13000rpm离心2分钟；将HiBind^TM DNA分离柱放入新的1.5ml EP管中，向每个HiBindTM DNA分离柱中心滴加100ul Elution Buffer。室温孵育3分钟后，13000rpm离心2分钟。提取的DNA分装后放在-80℃保存。

2、细胞复苏

将细胞从-80℃或液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中，使之快速融化，800x rpm离心5min，弃上清，加入新鲜培养基，转入细胞培养瓶中，摇匀，置于细胞培养箱中培养。

3、细胞传代

提前打开生物安全柜的紫外灯，紫外灭菌30min；将台面和培养瓶瓶口用75％乙醇消毒；待细胞生长至90％，予传代。吸弃旧培养基，1x SolutionA润洗细胞，吸弃洗液；加入约0.8ml胰酶，37℃温箱孵育1-5min(视具体细胞而定)；镜下观察细胞变圆、细胞间接触消失、单个细胞脱落时加入含血清的新鲜培养基终止(若是无血清培养基培养的细胞，用1xTI终止)；将细胞转入15mL离心管中，800x rpm离心5min；弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞，按1∶2至1∶10比例将细胞加入新培养瓶中，加入新鲜培养基至5ml置于细胞培养箱中培养。

4、细胞冻存

当细胞传代进行到上述步骤中的第2.2.6步，按培养基∶FBS∶DMSO比例为6∶3∶1的比例加入1ml混合液，重悬细胞后加入冻存管中，放入冻存盒中，放入-20℃冰箱2小时后，转入-80℃冰箱中，待过夜后，转入液氮罐中长期保存

5、细胞RNA提取

将细胞用1×PBS洗涤3次后，吸弃液体；加入1ml Trizol至细胞中，冰上裂解10分钟；将裂解液转入1ml EP管中，-80℃保存或立即提取；往裂解液中加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀后室温静置5分钟；13000rpm 4℃离心15分钟；可见液体分为三层，小心将上层水相吸至一新RNase-Free EP管中(注意宁少勿多)；加入500ul异丙醇，上下颠倒充分混匀后，静置5分钟，13000rpm 4℃离心15分钟；小心吸弃上清，加入1ml-30℃预冷75％乙醇(DEPC-H2O配制)；13000rpm 4℃离心10分钟，重复h-i共洗涤RNA两次；将上清吸尽，通风橱中晾干5分钟左右，加入20ul DEPC-H2O，冰上溶解；用NanoDrop 2000测RNA浓度及260/280比值分析RNA质量；将RNA分装后冻于-80℃保存；

6、总RNA的逆转录

a.将测好浓度的RNA计算出1μg RNA所需的体积，按以下体系配制

Oligo(dT)或random 1ul

RNA 1μg

DEPC-H2O to 5ul

将上述试剂依次加入PCR管中，70℃孵育5分钟，4℃最少5分钟；

b.按下列体系配制第二步反应体系

将上述体系加入第一步反应体系中，按下述程序反应：25℃5分钟，42℃60分钟，75℃15分钟，4℃forever，反应结束后将产物放入-30℃冰箱保存；

7、Real-time RT-PCR检测(SYBR Green I法)及结果分析

我们实验室使用Roche

480SYBR Green I Master进行Real-timeRT-PCR反应。10ul反应体系如下：

480SYBR Green I Master 5ul

2.5μM上下游引物的混合物 1ul

cDNA(20倍稀释) 4ul

扩增程序：1)95℃预变性5分钟；2)95℃变性15s，60℃退火15s，延伸15s，重复第2)步40个循环。溶解曲线程序：95℃15s，60℃15s，95℃15s。溶解曲线用于观察扩增产物的特异性。

Real-time RT-PCR结果分析：目的基因在mRNA水平的表达量用用ΔCt值方法计算，ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因的Ct值均数，目的基因的相对表达量(relativeexpression)＝2^-ΔCt。根据目的基因的相对表达量数值使用GraphPad进行绘制柱状图/散点图并进行统计学分析。

8、组织芯片-免疫组化

①组织芯片的制作：取病理确诊的鼻咽癌组织蜡块，标记好取样位置，用打孔机在标记好的靶点上打孔(孔直径600μm)，并将组织芯转入蜡块孔中，重复取样制成组织芯片蜡块。再用切片机切片，固定于防脱载玻片上，封蜡保存备用。

②免疫组化步骤：

脱蜡：石蜡切片置65℃恒温烤箱中烘烤2h，浸入二甲苯中20min，更换二甲苯后再次浸泡20min(视脱蜡效果，必要时再次二甲苯浸泡)。水化：先后置于第一次100％、第二次100％、95％、75％、60％的梯度酒精溶液中浸泡，前三槽各10分钟，后两槽各5min，最后浸入单蒸水中5min×2次。PBS洗3次，每次5min。抗原修复：柠檬酸钠抗原修复液(pH9.0)，高压锅加热抗原修复，煮沸1.5min。自然冷却至室温后，PBS洗2-3次每次5min，3％过氧化氢(易分解，现用现配)封闭内源性过氧化物酶，室温10min。保持组织表面湿润，组织周围用免疫组化笔画圈，圈距离组织0.5cm，滴加山羊血清封闭液4℃封闭30min。用一抗稀释液按1∶200浓度稀释兔抗人ISG15抗体/鼠抗人CD68/兔抗人CD163并滴加到切片组织，置入4℃冷库过夜孵育。次日取出于室温复温30min，PBS洗3次每次5min。滴加耦联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔二抗(1∶1000，中杉金桥)，37℃箱中1h孵育。PBS洗涤3次每次5min。DAB(1∶100，中杉金桥)显色3min，于普通光学显微镜实时观察染色反应(约1min)，并及时置入自来水中止染色。苏木精染色2min，自来水冲洗，然后转入1％的盐酸酒精1sec并迅速抽离。浸入自来水冲洗流水冲洗3h后，取出玻片置65℃恒温烤箱中烘烤2h。脱水：先后浸泡于蒸馏水5min，60％酒精5min，75％酒精5min，95％酒精5min，100％酒精5min。透明：二甲苯第一次5min，二甲苯第二次5min。通风橱中凉干，滴加中性树胶，加载盖玻片封片、于光学显微镜下观察并拍照，切片常温保存。

9、Western blot

收集蛋白裂解液：PBS洗细胞两次，加入适量SDS裂解液冰上裂解10分钟；使用

BCAProteinAssay Kit检测蛋白质浓度；蛋白质变性：蛋白质中添加5％的β-巯基乙醇，100℃金属浴加热变性5分钟，立即置于冰上冷却后短暂离心；一定量的蛋白质进行SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜，5％BSA室温封闭1小时，4℃孵育一抗过夜，HRP-conjugated二抗室温孵育45分钟；ECL显色、X光胶片压片显影、定影；或者化学发光显影。

10、免疫荧光

①细胞免疫荧光：

从12孔板中，取出种好细胞的玻片，PBS洗，5min x3次；4％多聚甲醛(PFA)500ul/12孔板固定10min，PBS洗，5min x3次，1％BSA 800ul/孔封闭30min，用1％BSA稀释一抗(双标：anti-CD11a+CD18，1∶100，ab13219，二抗为鼠；用anti-ISG15，1∶100，ab227541，二抗为兔)400ul/孔，4℃摇床过夜。次日吸除一抗，用PBST(含0.1％吐温)洗，5min x3次；1％BAS 1∶1000稀释二抗，室温避光孵育1h(400ul/孔)，PBST洗，5min x3次；DAPI室温染核5min避光(1∶4000，PBS，700ul/孔)，PBST洗，5min x3次；准备载玻片，取出玻片，背面吹干后，加入1ulanti-fade封片，避光保存，3天内拍照。

②组织切片免疫荧光：

从低温冰箱中取出切好的冰冻切片，室温干燥，待水汽蒸发。用预冷的丙酮固定(4℃)，30min。用湿盒风干丙酮。PBS洗，5min x3次；5％BSA室温封闭30min。孵育一抗4℃过夜。PBS洗，5min x3次；二抗孵育30-40min。绿色Invitrogen488；红色Cy3(1∶500)注意避光。PBS洗5min x3次，DAPI(1∶4000)室温5min避光。PBS洗5min x1次，室温干燥后用anti-fade封片，避光保存，3天内拍照。

11、免疫沉淀(IP)

实验分组：对照组(1640)，实验组(细胞培养上清)。用六孔板培养细胞，等细胞长到60％-70％，细胞状态良好，更换为无血清1640。24h后收上清(2ml)，上清用0.45nm的过滤子过滤。用proteinA/G preclear(20ul/ml，4℃摇床，30min)。离心，将上清移入15ml管，去沉淀(内有proteinA/G)；将anti-ISG15加入上清中，5ul/ml抗体，4℃摇床过夜。次日将protein A/G，20ul/ml，加入上清中，4℃摇床，2h。离心，收集beads，lysis buffer洗三遍。加入5×SB，100℃变性5min，进行WB实验

12、统计学方法：

应用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析。定量资料的描述采用均数和标准差，定性资料的描述采用频数和百分比。两组独立样本定量资料的组间差异比较采用t检验，定性资料采用χ²检验。使用ROC曲线分析来确定CD68高低表达分层的截断值。患者预后分析采用Kaplan-Meier生存分析法，Log-rank检验比较不同组别患者的中位生存时间。应用Pearson相关分析确定ISG15⁺CD163⁺表达与临床分期之间的关系。利用单因素Cox风险回归模型筛选预后的预判指标，将P＜0.05的指标纳入多因素Cox回归分析，校正不同指标对预后的影响。检验水准a＝0.05。*P＜0.05为具有统计学意义，**P＜0.01、***P＜0.001为具有显著统计学差异。使用GraphPadPrism5.0软件进行图表制作。

(三)结果

1、鼻咽癌细胞中ISG15的表达上调，与EBV感染、IFN-α和β分泌增多相关

本课题组前期研究发现ISG15在鼻咽癌细胞和组织中高表达，且与鼻咽癌发生发展及预后不良相关^[3]，但机制仍然不清楚。由于ISG15是受I型干扰素(主要为IFN-α和β)诱导的，具有类泛素化功能的一种干扰素(IFN)效应蛋白^[8]。为了验证鼻咽癌组织中是否释放IFN-α和β，进而诱导ISG15的分泌，我们检测了35例新鲜鼻咽癌组织和13例新鲜鼻咽慢性炎症组织中IFN-α和β的表达水平，Real-time PCR结果显示鼻咽癌组织中IFN-α和β的mRNA表达水平明显高于正常鼻咽上皮(图13A)；EBV与鼻咽癌发病密切相关，病毒可上调ISG15的表达^[8]，我们发现导入EBV的鼻咽癌细胞株，其ISG15的表达显著上调(图13B)；表明鼻咽癌组织中ISG15的上调可能是对I型IFN水平升高的反应。为进一步验证I型IFN可诱导上调鼻咽癌ISG15的表达，我们使用不同浓度的IFN-β(0、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml)处理鼻咽癌细胞株HK1和C666，结果发现较低浓度的IFN-β就可以诱导鼻咽癌细胞ISG15的表达增加(图13C)。上述结果仅证明鼻咽癌细胞ISG15表达上调可能与EBV和IFN相关。提示鼻咽癌肿瘤微环境中EBV感染和IFN-β分泌增多，均可导致ISG15的表达上调，ISG15可能是鼻咽癌肿瘤微环境的重要蛋白因子。如图13所示，鼻咽癌细胞中ISG15的表达上调，与EBV感染、IFN-α和β分泌增多相关(A.Real-time PCR结果显示：鼻咽癌组织(NPC)中IFN-α和β的mRNA表达水平较癌旁正常鼻咽组织(NPN)高(**P＜0.01，***P＜0.001)；B.Western Blot结果显示：EBV阳性的鼻咽癌细胞株中单体ISG15蛋白表达上调；C.Western Blot结果显示：用IFN-β处理后，鼻咽癌细胞株HK1和C666中，单体ISG15蛋白表达上调)。

2、ISG15可分泌细胞外并上调巨噬细胞ISG15的分泌

众所周知，ISG15是启动ISGylation的细胞内泛素样分子，而游离的ISG15可以被释放到细胞外并作为细胞因子发挥作用。我们在鼻咽癌细胞株HK1、C666(EBV⁺)和IFN-β诱导后的HK1的上清液中检测到ISG15蛋白，免疫沉淀后的SDS-PAGE和Western Blot分析表明ISG15可以被鼻咽癌细胞释放到细胞外，且IFN-β诱导后鼻咽癌细胞HK1释放到上清中的ISG15增多(图14)。同时，我们发现将鼻咽癌细胞株C666(EBV⁺)、HNE1(高表达ISG15)和CNE1(低表达ISG15)的培养基上清加入人单核细胞株THP1诱导的巨噬细胞的培养基中共培养，然后检测巨噬细胞无血清培养基中的ISG15蛋白。免疫沉淀后的SDS-PAGE和Western Blot分析发现EBV阳性的C666和高表达ISG15的HNE1细胞培养上清均可上调巨噬细胞分泌ISG15，而低表达ISG15的CNE1细胞株未能明显上调巨噬细胞分泌ISG15(图14B)，提示鼻咽癌细胞感染EBV和表达ISG15均可上调巨噬细胞分泌ISG15，而鼻咽癌细胞可旁分泌ISG15，参与肿瘤微环境的调控。如图14所示，ISG15可分泌细胞外并上调巨噬细胞ISG15的分泌(A.来自鼻咽癌细胞培养基上清(CM)的免疫沉淀检测游离ISG15蛋白发现，病毒潜伏感染和INF-β可增强鼻咽细胞癌分泌ISG15；B.EBV阳性的鼻咽癌细胞株C666和高表达ISG15的鼻咽癌细胞株HNE1培养基上清可上调THP1诱导的巨噬细胞分泌ISG15；C.Westem Blot结果显示，鼻咽癌细胞株HNE1中ISG15单体的表达较高)。由于巨噬细胞和T细胞是肿瘤微环境的主要参与者，因此我们接下来将进行免疫荧光实验，明确ISG15是否在巨噬细胞和T细胞上表达。

3、鼻咽癌微环境的巨噬细胞和T淋巴细胞可表达ISG15

巨噬细胞和T淋巴细胞作为肿瘤微环境中主要的免疫细胞，与肿瘤发生发展密切相关。为明确ISG15在这两种细胞中的表达情况，我们通过免疫荧光实验，在荧光共聚焦显微镜下发现鼻咽癌组织冰冻切片中巨噬细胞(CD68⁺)和T淋巴细胞(CD3⁺)可表达ISG15，且定位于细胞质和细胞膜，其中又以巨噬细胞的上调更明显(图15)。如图15所示，鼻咽癌微环境的巨噬细胞和T淋巴细胞可表达ISG15(鼻咽癌组织切片中CD68⁺巨噬细胞(红色)和CD3⁺T细胞(红色)中ISG15(绿色)在细胞质和细胞膜上表达，且巨噬细胞中表达更强)。提示ISG15可能通过微环境中的免疫细胞参与鼻咽癌的免疫调节。因此，我们接下来研究鼻咽癌微环境中的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)及其分泌的ISG15是否与临床上鼻咽癌的进展有关。

4、巨噬细胞浸润增加与鼻咽癌患者的不良预后相关

为了确定巨噬细胞在鼻咽癌中的临床意义，我们收集了209例鼻咽癌患者活检样本，通过福尔马林浸泡固定，石蜡包埋并制备成组织芯片，进行免疫组织化学(IHC)染色。结果发现，其中206例(98.6％)表达CD68⁺巨噬细胞。用ROC分析确定CD68⁺细胞数量的临界值为199.25，并以此来划分巨噬细胞的高表达和低表达(图16A)。Kaplan-Meier生存分析法分析了CD68表达对206例鼻咽癌患者预后的影响，并使用Log-rank检验比较高表达CD68和低表达CD68两组患者的生存时间。Log-rank检验结果显示，与低表达CD68⁺巨噬细胞的患者相比，高表达CD68⁺细胞的患者总体生存期(OS)更短(39.7±8.3个月vs.160±7.2个月，p＝0.000；图16B)。如图16所示，巨噬细胞浸润与鼻咽癌患者的不良生存相关(A.NPC标本中CD68高表达和低表达的代表性免疫组织化学数据；B.高和低表达CD68的NPC患者OS的Kaplan-Meier生存曲线，高表达CD68患者总生存期缩短)。用Cox比例风险模型进行进一步分析，以确定CD68⁺巨噬细胞是否可以作为鼻咽癌患者的独立预后指标。我们首先将单因素预后分析p值小于0.20的潜在风险因子纳入风险回归模型，这些因素包括：年龄、T分期、N分期、临床分期、远处转移和CD68⁺的表达水平。单因素回归分析显示T分期、N分期、临床分期、远处转移和CD68⁺的表达水平均与鼻咽癌患者的预后相关(P＜0.05)。随后，我们将这些相关因素进行多因素分析，结果显示CD68⁺高表达(危险比为＝6.75；p＝0.009)和临床分期(危险比＝7.75；p＝0.005)是鼻咽癌患者OS的主要独立预测因子(如表1-1所示)。提示巨噬细胞浸润可作为鼻咽癌患者不良生存的独立预后因素。

表1-1. 206例CD68⁺鼻咽癌患者预后的单因素和多因素分析结果

5 ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞浸润增加与鼻咽癌患者临床晚期、年龄及预后不良相关

CD163是肿瘤相关巨噬细胞M2表型的标记物^[69]，因此我们采用ISG15和CD163双重标记ISG15⁺的M2表型的巨噬细胞，并进一步明确ISG15⁺CD163⁺亚群的巨噬细胞与鼻咽癌患者临床预后的关系。我们收集了90例鼻咽癌患者活检样本，通过福尔马林浸泡固定，石蜡包埋并制备成组织芯片，进行IHC染色。结果显示，在90例NPC标本中，57例(63.3％)标本表达ISG15⁺细胞(主要在肿瘤细胞和浸润性免疫细胞中)、87例(96.6％)标本表达CD163⁺细胞、49例(54.4％)标本表达ISG15⁺CD163⁺细胞。根据细胞显微镜下染色及形态判断为巨噬细胞(图17A、B)。90例鼻咽癌患者的中位总体生存期(OS)为31个月(范围8-49个月)、中位无病生存期(DFS)为31个月(范围8-49个月)。截止至最后随访时间，有69名(76.7％)患者仍存活。我们通过Kaplan-Meier生存分析法分析了90例鼻咽癌患者的OS率和DFS率，Log-rank检验结果显示，所有患者的2年、3年OS率分别为91.6％和76.9％，2年、3年DFS率分别为88.1％和77.4％(图17C、D)。随后，我们分析了T分期、N分期、TNM分期及远处转移对鼻咽癌患者预后的影响，Log-rank检验结果显示，鼻咽癌患者OS率和DFS率与N分期显著相关(p值分别为0.011和0.003，p＜0.05)(图17E、F)。如图17所示，ISG15⁺、CD163⁺的表达及鼻咽癌患者预后分析(A.免疫组织化提示，ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞在早期(T1N0M0)鼻咽癌组织中低表达；B.免疫组织化提示，ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞在晚期(T3N2M1)鼻咽癌组织中高表达；(CD163为酒红色，ISG15为棕色)；C.90例鼻咽癌患者的OS率；D.90例鼻咽癌患者的DFS率；E.鼻咽癌患者的OS率与N分期显著相关(p＝0.011，p＜0.05)；F.鼻咽癌患者的DFS率与N分期显著相关(p＝0.003，p＜0.05))。

为探讨CD163⁺ISG15⁺巨噬细与鼻咽癌预后的关系，我们首先通过统计显微镜下细胞数(cells/mm²)，计算出CD163⁺、ISG15⁺和ISG15⁺CD163⁺细胞的中位数分别为132.5(范围0-506)、6(范围0-95)和2.5(范围0-78)。使用中位数作为临界值，将标本分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier生存分析法分析了ISG15⁺CD163⁺表达对49例鼻咽癌患者预后的影响，并使用Log-rank检验比较高表达ISG15⁺CD163⁺和低表达SG15⁺CD163⁺两组患者的生存时间。Log-rank检验结果显示，ISG15⁺CD163⁺TAMs高表达患者的OS和DFS均缩短(p值分别为0.034和0.015)(图18A、B)。Log-rank检验显示ISG15⁺CD163⁺表达与鼻咽癌患者的不良预后相关，因此我们使用Cox风险回归模型探讨ISG15⁺CD163⁺是否可以作为鼻咽癌患者预后的预判指标。首先将本研究中可能影响鼻咽癌患者预后的临床分期因素纳入单因素风险回归分析，这些指标包括：性别、年龄、T分期、N分期、临床分期、远处转移、ISG15⁺、CD163⁺和ISG15⁺CD163⁺的表达水平。单因素回归分析显示N分期、远处转移及ISG15⁺、CD163⁺和ISG15⁺CD163⁺的表达水平均与鼻咽癌患者的预后相关(P＜0.05)；再将这些因素代入多因素风险回归模型，结果显示N分期(危险比＝2.159；95％可信区间为1.195-3.901；p＝0.011)和ISG15⁺CD163⁺表达水平(危险比＝2.812；95％可信区间为1.083-7.301；p＝0.034)可以作为鼻咽癌患者OS总生存期的独立预判因素，同时N分期(危险比＝2.576；95％可信区间为1.388-4.78；p＝0.003)和ISG15⁺CD163⁺表达水平(危险比＝3.244；95％可信区间为1.253-8.398；p＝0.015)可以作为鼻咽癌患者DFS的独立预判因素。(如表1-2所示)。为进一步研究ISG15⁺CD163⁺与肿瘤临床分期的关系，我们使用Spearman秩相关系数法分析了ISG15⁺CD163⁺表达与T分期、N分期、临床分期、远处转移的相关性，结果显示鼻咽癌组织中ISG15⁺CD163⁺细胞的数量与其晚期临床阶段(TNM，IV期)显着正相关(Spearmen r＝0.253，p＝0.016)(图1-6C)。而ISG15⁺CD163⁺细胞的数量与肿瘤T分期(Spearme r＝0.173，p＝0.103)、淋巴结分期(Spearme r＝0.130，p＝0.223)和远处转移(Spearme r＝0.056，p＝0.599)之间存在正相关，但相关性不显着(图18D、E、F)。如图18所示，ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞浸润增加与鼻咽癌患者临床晚期相关(A.Kaplan-Meier生存分析，ISG15⁺CD163⁺高表达患者总生存率比低表达者低；B.Kaplan-Meier生存分析，ISG15⁺CD163⁺高表达患者总无病生存率比低表达者低；C.Spearman秩相关系数分析，ISG15⁺CD163⁺细胞数量与肿瘤的临床晚期显著正相关(Spearme r＝0.253，p＝0.016、p＜0.05)；D.Spearman秩相关系数分析，ISG15⁺CD163⁺细胞数量与T分期无显著正相关性(Spearme r＝0.173，p＝0.103)；E.Spearman秩相关系数分析，ISG15⁺CD163⁺细胞数量与N分期无显著正相关性(Spearme r＝0.130，p＝0.223)；F.Spearman秩相关系数分析，ISG15⁺CD163⁺细胞数量与远处转移无显著正相关性(Spearmer＝0.056，p＝0.599))。上述结果表明，ISG15⁺CD163⁺高表达与患者预后不良相关且可以作为鼻咽癌患者OS和DFS的独立预判因素，ISG15⁺CD163⁺细胞数目与鼻咽癌患者临床晚期显著正关。

表1-2 90例鼻咽癌患者预后的单因素和多因素分析结果

(四)分析

肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展及治疗抵抗中发挥重要作用^[76]。ISG15主要由肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞分泌，而ISG15的分泌以IFN-α/β依赖的方式被诱导^[77]。

我们检测了35例新鲜鼻咽癌组织和13例新鲜鼻咽慢性炎症组织中IFN-α和β的mRNA水平，Real-time PCR结果显示，鼻咽癌组织中IFN-α和β的mRNA的表达水平明显高于正常鼻咽上皮；Western blot检测发现，鼻咽癌细胞中ISG15高表达，这提示在鼻咽癌中，I型IFN可能诱导ISG15表达的上调。而进一步的实验发现，IFN-β处理鼻咽癌细胞后，其ISG15的表达上调。上述结果提示鼻咽癌肿瘤微环境中EBV感染和IFN-α和β分泌增多，均可导致ISG15的表达上调，说明ISG15可能是参与鼻咽癌肿瘤微环境调控的重要蛋白。而ISG15在鼻咽癌微环境中的作用和具体机制仍不清楚。

研究表明，ISG15不仅可以诱导PBMC分泌大量IFN-γ，IL-2和IL-12等细胞因子，进而调节细胞功能^[78]，还可以增强NK细胞的增殖和裂解能力^[78]。最近研究发现，在ISG15缺乏的患者中未观察到对病毒感染的特殊易感性，而缺乏分泌型ISG15会导致淋巴细胞IFN-γ产生水平降低，从而导致对环境分枝杆菌的易感性^[79]。这些发现表明ISG15具有细胞外免疫调节活性。我们实验发现ISG15在T细胞和巨噬细胞表达均上调，其中又以巨噬细胞的上调更明显。提示ISG15可能通过微环境中的免疫细胞参与鼻咽癌的免疫调节。随后，我们用IFN-β处理鼻咽癌细胞，发现鼻咽癌细胞内和释放到细胞外的ISG15均增加。而高表达ISG15及EBV阳性的鼻咽癌细胞与THP1细胞共培养，均可促进THP1细胞分泌ISG15。这些发现表明鼻咽癌细胞感染EBV和表达ISG15均可上调巨噬细胞分泌ISG15，而鼻咽癌细胞可旁分泌ISG15，参与肿瘤微环境的免疫调控。

在明确了ISG15作为鼻咽癌微环境因子并参与微环境免疫调控后，我们通过免疫组化染色并分析发现鼻咽癌组织中CD68⁺巨噬细胞和ISG15⁺CD163⁺肿瘤相关巨噬细胞数量增加，且与患者预后不良相关。另有两项研究也发现巨噬细胞与鼻咽癌不预后相关，他们发现在EBV阳性的鼻咽癌标本中FoxP3⁺Treg细胞(调节性T细胞)和CD68⁺巨噬细胞数量增加，并且与预后不良有关^[80]。而进一步的研究发现，鼻咽癌组织中CD163⁺M2巨噬细胞与FoxP3⁺Treg细胞异常增多呈正相关，且两者数量增多与临床晚期和总生存期缩短相关。体外实验发现，鼻咽癌细胞可诱导巨噬细胞成为M2型巨噬细胞(肿瘤相关巨噬细胞，TAMs)，有助于Treg细胞在鼻咽癌中聚集，促进肿瘤细胞免疫逃逸^[80，81]。而我们还发现临床晚期患者鼻咽癌组织标本中ISG15⁺CD163⁺TAMs浸润明显增加，且与鼻咽癌患者的临床晚期和淋巴结分期有关。目前认为肿瘤基质中浸润的巨噬细胞以抑制免疫的TAMs为主，而TAMs的主要表面标记物有CD163、CD206、Arg1等，其中CD163被公认为最具特异性的TAMs表面标记物^[61]，因此本研究中选择CD163作为TAMs的特异性标记物。恶性肿瘤是人类的主要死亡原因之一，人们设计了许多指标来评价肿瘤患者临床疗效，主要包括总生存期(OS)，无病生存期(DFS)，无疾病生存期(PFS)，疾病进展时间(TTP)，客观缓解率(ORR)及疾病控制率(DCR)等，其中OS和DFS是反应肿瘤患者生存状况和肿瘤疗效的重要指标，广泛地应用于肿瘤患者的预后评估^[82-84]。本研究中通过分析患者的OS和DFS，发现ISG15⁺CD163⁺细胞高表达患者OS和DFS均缩短，说明ISG15⁺CD163⁺细胞是鼻咽癌患者预后不良相关。由于鼻咽癌IV期患者的病死率较I-III期明显增多^[2]，因此，我们分别对I-III期和IV期的鼻咽癌ISG15⁺CD163⁺表达与预后的关系进行分析。结果发现在I-III期的鼻咽癌中，ISG15⁺CD163⁺高表达患者的DFS期较ISG15⁺CD163⁺低表达的患者明显缩短，而IV期鼻咽癌中，ISG15⁺CD163⁺高表达患者的DFS比ISG15⁺CD163⁺低表达患者也缩短，提示ISG15⁺CD163⁺在预后相对好的I-III期和预后相对差的IV期鼻咽癌中，均具有稳定的评判价值。基于上述结果，我们认为ISG15是重要的鼻咽癌微环境因子，ISG15⁺巨噬细胞与鼻咽癌不良预后相关。

(五)结论

1、I型干扰素和EBV感染可促进鼻咽癌细胞产生和分泌ISG15；

2、ISG15被鼻咽癌细胞、巨噬细胞分泌到胞外，在鼻咽癌微环境中起细胞因子作用；

3、表达ISG15的肿瘤相关巨噬细胞与鼻咽癌的不良预后相关。

四、ISG15诱导TAMs分化进而促进鼻咽癌细胞迁移和致瘤性的作用

引言：

ISG15在鼻咽癌微环境中发挥细胞因子作用，且ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞浸润增加与鼻咽癌患者预后不良相关，这就引起了我们对ISG15与肿瘤相关巨噬细胞在鼻咽癌中的作用的关注。研究发现胰腺导管腺癌(PDAC)细胞产生的I型干扰素，诱导肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)分泌ISG15，从而抑制抗肿瘤免疫，进而加速了肿瘤干细胞的自我更新，增强了肿瘤的侵袭能力和致瘤潜力^[10]。我们的研究发现IFN-β可诱导鼻咽癌细胞分泌ISG15，且鼻咽癌微环境中巨噬细胞表达ISG15。因此有必要明确ISG15能否诱导巨噬细胞的M2表型，进而在鼻咽癌中发挥促癌作用。

本研究将通过体外实验，验证ISG15对巨噬细胞M2表型的诱导作用；同时通过体内外实验，探讨巨噬细胞M2表型是否能促进鼻咽癌迁移和致瘤能力。

(一)材料

1.1细胞系

本章节所用细胞系及培养方法参照第三节。

1.2动物

本实验所用BALB/c裸鼠购于上海南方模式生物科技股份有限公司，为4-6周龄的雌BALB/c小鼠，体重约20g，微生物级别为SPF级，在25-27℃恒温、45-50％恒湿，高度除尘除菌的新鲜空气，及无特殊病原体的环境中饲养，供应无菌水和饲料自由摄入。BALB/c裸鼠T细胞增殖、自然杀伤(NK)和淋巴因子激活的杀伤(LAK)活性下降，脾细胞释放的IL-2减少，适合人癌细胞的体内成瘤实验。所购动物入中山大学北校区中山大学附属肿瘤医院动物实验中心隔离饲养3-5天、观察正常后转入动物房，便可用于皮下接种肿瘤实验。

1.3主要试剂和耗材

除第三节实验材料中所列的主要试剂及耗材以外，本章所需试剂及耗材如下：

1.4主要仪器

除第三节实验材料中所列的主要试剂及耗材以外，本章所需试剂及耗材如下：

1.5 Real-time PCR引物

1.6主要溶液的配制

本章节所用溶液及配制方法参照第三节。

(二)方法

除第三节实验材料中所列的主要试剂及耗材以外，本章所需试剂及耗材如下：

1、Transwell迁移实验

用无血清培养基对matrigel进行10倍稀释，然后在transwell小室的底部加入50ul，放入37℃培养箱3h使之凝固，以用来做Invasion实验。把饥饿过夜的细胞消化计数，接种在Transwell和Invasion小室中，室内加入200ul无血清培养基，室外加入500ul含有10％FBS的培养基，继续培养24-48h。终止时，将小室取出，PBS清洗后用棉签小心擦去小室滤膜上层的细胞，再把小室至于甲醇中固定10min，再用结晶紫染色10min，用清水轻柔地清洗干净，晾干后，在显微镜下计数5-6个视野的细胞数目，并拍照。

2、人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分离及单核细胞分离制备

密度离心法分离细胞：医院及其血液中心采取的新鲜的肝素抗凝的外周静脉血与等体积的Hank′s缓冲液稀释并充分混匀；将人淋巴细胞分离液从4℃取出，恢复至室温，转移至50ml试管中备用；用无菌吸管吸取稀释后的静脉血，沿管壁缓慢入至人淋巴细胞分离液液面上(分离液∶抗凝血＝3∶4)，缓缓地不要晃荡，保持界面的清楚；将加完外周静脉血后的50ml试管放入台式离心机中，4℃400g(约2000rpm)20min，升6降0(缓升慢降)；离心完毕后，取出50ml试管，离心后管内可分为三层，在上、中层界面处有一层以单个核细胞为主的白膜层，即为我们所需要的单个核细胞；吸出白膜层(即为人外周血单个核细胞)，转移到5倍体积的无血清1640的15ml离心管中，细胞计数；洗涤：将单个核细胞(PBMC)加入Hank′s液中，2000rpm，室温离心8分钟，并充分洗涤细胞两次。孵育：末次离心后，弃去上清，按1x10⁷个细胞/80ulbuffer的比例加入buffer。每80ul细胞悬液+20ul CD11b磁珠液，4度孵育15min；加入1-2ml buffer，300g离心10min；3ml buffer重悬细胞。(buffer：PH7.2PBS，含有0.5％BSA，2mM EDTA；需提前准备，PBS送高温消毒后，加入BSA和EDTA后，0.22过滤器过滤去菌；细胞房4℃冰箱冷藏)。上磁力柱：将LS柱子上磁力架上；将细胞悬液，滴入柱子中，用15ml管接住留下液体；加3ml buffer，重复洗3次。加柱子从磁力架取下并放在15ml离心管上，用5ml buffer滴入柱子中，将已结合磁珠的细胞分离下来，得到外周血单核细胞并细胞计数。细胞培养：用无血清1640重悬，在24或12孔板中培养(12孔板，1×10⁶个细胞/1ml/孔)；24小时细胞贴壁后，更换为含10％血清和M-CSF(40ng/ml)的1640中3-5天，诱导为巨噬细胞

备用于实验。

3、流式细胞分选术(FACS)

将分选得到的单核细胞，用40ng/ml的重组人M-GSF诱导为巨噬细胞

然后分组处理：NC、rISG15 100ng/ml、rISG15 200ng/ml、rISG15 500ng/ml、LPS(诱导M1)25ng/ml、IL4(诱导M2)50ng/ml，共6个孔，处理24小时后终止。24小时后消化细胞，转入EP管中，3000rpm×1min沉淀细胞，用1X PBS 500ul，洗涤2次。用100ul体积的抗体稀释液(0.2ul抗体)，其中CD163带PE基团(BD公司的，红色)，HLA-DR带FITC基团(绿色)，HLA-DR用1ul/400ul。抗体4℃，避光孵育30min后。用1×PBS洗涤两次，再用400ul的PBS重悬后，转移到流式管，备上机。同时备1支去离子水和1支去离子水稀释的消佳净水。

4、裸鼠皮下移植瘤实验

采用皮下注射成瘤的方法，选用HK1细胞株和rISG15诱导的巨噬细胞，具体步骤如下：消化细胞，计数，把细胞悬浮在无血清的RPMI 1640培养基中；实验组为HK1+M2(rISG15诱导的巨噬细胞)，对照组为

取出预先溶解的Matrigel，按1∶4体积比和细胞悬液混匀至100uL，EP管分装备用；将细胞悬液接种于裸鼠背部近前肢的皮下，每组各接种10只，隔日周围皮下注入0.1μg rISG15，直到实验终止；成瘤后每日测量瘤体的长短径，脊椎脱臼法处死动物，解剖取出异质瘤，称重、拍照。

5、数据统计

参见第三节：12

(三)结果

1、分泌型ISG15诱导TAMs表型并促进鼻咽癌增殖和迁移

鉴于ISG15主要由TAMs表达并与鼻咽癌进展相关，我们需要进一步明确分泌型ISG15能否激活巨噬细胞的M2表型。首先，我们使用CD11b磁珠分选健康人外周血得到外周血单核细胞并诱导为巨噬细胞，使用rISG15处理巨噬细胞，然后通过流式细胞仪测量M1/M2巨噬细胞的表面标志物，HLA-DR/CD163比率。结果发现rISG15处理后的巨噬细胞表达较低的HLA-DR和较高的CD163(图19A)。同时，Real-time PCR结果显示，分泌型ISG15可增加巨噬细胞中M2型细胞因子(如IL-10和TGF-β)的表达，而使用ISG15受体抑制剂A286982，可以抑制ISG15诱导的巨噬细胞分泌M2型细胞因子(如IL-10和TGF-β)的表达(图19B)。如图19所示，分泌型ISG15诱导TAMs表型(A.巨噬细胞(HLA-DR FITC-A，CD163 PE)中，通过HLA-DR/CD163比值测量的rISG15转换了M1/M2表面标记；B.rISG15诱导巨噬细胞M2型细胞因子(如IL-10和TGF-β)的mRNA表达升高，但巨噬细胞M1型细胞因子(如iNOS)的mRNA表达无升高(**P＜0.01，***P＜0.001)。(A：A286982是ISG15受体LFA-1的小分子阻断剂))。

此外，体外Transwell实验发现，rISG15处理后的巨噬细胞，其上清液显著促进了鼻咽癌细胞HK1的迁移(图20A)，表明ISG15激活了M2巨噬细胞极化并增强了鼻咽癌细胞的迁移；而体内动物实验发现，与只接种鼻咽癌细胞的对照组相对，皮下接种鼻咽癌细胞和rISG15诱导的巨噬细胞的实验组小鼠，皮下肿瘤生长更快、体积更大，表明rISG15诱导的巨噬细胞可增强鼻咽癌细胞的体内致瘤能力(图20B)。如图20所示，分泌型ISG15诱导TAMs表型并促进鼻咽癌增殖和迁移(A.Transwell实验发现，rISG15处理后的巨噬细胞上清液显著促进了鼻咽癌细胞株HK1的迁移，且呈现剂量依赖性(**P＜0.01，***P＜0.001)；B.将有和没有rISG15预处理的人外周血来源的巨噬细胞与NPC细胞混合(比例为1∶3)并行裸鼠皮下接种，每两天将rISG15注射到接种部位周围，建立成瘤模型；C.实验组(HK1+巨噬细胞M2(rISG15 treated macrophages))小鼠都成瘤(10/10)，但对照组

小鼠仅8只成瘤(8/10)，且rISG15处理组的肿瘤体积更大(**P＜0.01))。上述结果提示，分泌型ISG15可以诱导巨噬细胞M2表型，并在体内外促进鼻咽癌进展。

(四)分析

巨噬细胞是肿瘤微环境中浸润最为丰富的免疫细胞，它们在从早期癌变到肿瘤转移的过程中都发挥着重要的作用^[60，61]。根据肿瘤微环境中巨噬细胞的功能极化状态，可分为经典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型主要出现在癌症初期，参与慢性炎症反应和杀伤肿瘤细胞的过程；而M2型可促进肿瘤细胞生长、促进淋巴管及血管生成及抑制抗肿瘤免疫反应，进而促进癌症发生发展及转移^[61，62]。由于在大多数肿瘤中，TAMs主要发挥促癌作用^[62]，因此，通常说的TAMs就是M2型巨噬细胞，而具有TAMs特征的炎症也被称为癌症的第七个标志。

现在公认的是，IFN-γ单独或与LPS或细胞因子(如TNF和GM-CSF)一起诱导经典活化的M1型巨噬细胞，后者通过产生活性氧/氮(ROS/RNS)和促炎症细胞因子，例如IL-12，IL-6，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，发挥免疫防疫和抗癌作用；而IL-4，IL-10，IL-13，IL-6，IL-21，IL-33和Notch信号可以诱导M2型的巨噬细胞活化，后者通过产生抗炎症细胞因子，例如IL-10，TGF-β和IL-13，发挥免疫抑制和促癌作用^[63，64]。然而，TAMs的激活是可逆的，已有报道，IFN-γ刺激下，M2型巨噬细胞可向M1型细胞还原，进而降低M2型巨噬细胞的免疫抑制作用^[65]。

我们通过体外实验发现使用rISG15处理人外周血来源的巨噬细胞，可使其高表达M2型巨噬细胞表面标记物CD163，HLA-DR/CD163比值降低。同时，检测到M2表型细胞因子(IL-10，TGF-β)的表达水平上调，而M1表型细胞因子(诱导性一氧化氮合酶，iNOS)的表达水平无变化。这提示分泌型ISG15能诱导巨噬细胞的M2表型。而使用ISG15受体抑制剂A286982，可以抑制ISG15诱导的巨噬细胞分泌M2型细胞因子，这提示ISG15可通过其受体诱导巨噬细胞M2表型。

研究发现肿瘤相关巨噬细胞可促进乳腺癌、肺癌、肝癌等多种癌症的转移^[66]。我们的研究发现，rISG15处理后的巨噬细胞，其上清液显著促进了鼻咽癌细胞的迁移；且体内动物实验发现，与对照组相对，皮下接种鼻咽癌细胞和rISG15诱导的巨噬细胞的实验组小鼠，皮下肿瘤生长更快、体积更大。这些结果表明分泌型ISG15可以诱导巨噬细胞M2表型可增强鼻咽癌细胞迁移和体内致瘤能力。然而，M2表型巨噬细胞促癌作用的机制是多种多样的，主要表现在：

(1)M2表型巨噬细胞可通过分泌VEGF、CSF1(集落刺激因子1)、PDGF和TGF-β等细胞因子，促进肿瘤血管生成^[66]；分泌血管内皮生长因子(VEGF)-C和-D，促进肿瘤淋巴管生成，进而促进肿瘤的生长及转移^[85]。

(2)M2表型巨噬细胞与肿瘤干细胞(TSC)相互作用促进肿瘤的致癌性和治疗抵抗^[67]，前者通过分泌细胞因子MFG-E8和IL-6激活STAT3和音猬因子信号通路，增加TSC的自我更新、致瘤潜力和治疗抵抗；另一方面，TSC可促进M2型巨噬细胞产生MFG-E8和IL-6^[67]；此外，M2型巨噬细胞可通过细胞因子TGF-β、WNT信号通路促进癌细胞的干细胞样特性^[86]。

(3)M2表型巨噬细胞介导肿瘤免疫逃逸促进肿瘤发生发展^[68]。

大量证据表明，巨噬细胞被极化为促癌的M2表型后，可分泌一系列趋化因子(例如CCL22，CCL20，CCL5等)，细胞因子(例如IL-10、TGF-β等)和酶(例如环氧合酶2[COX-2]，精氨酸酶1[ARG1]等)参与肿瘤免疫调节^{[62，87，88]}。研究发现，TAMs分泌的CCL22或CCL20通过募集nTregs(天然型调节性T细胞)促进肿瘤免疫抑制微环境的形成^[88，89]。其次，TAMs产生的免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β通过上调CD4⁺T细胞中的关键调节转录因子叉头框P3(Foxp3)诱导Treg(调节性T细胞)的产生，导致肿瘤免疫抑制^[90]；而Treg细胞通过抑制CD8⁺T细胞产生IFN-γ，促进了TAMs表型并维持其生存^[91]。TAMs还通过表达ARG1以耗尽L-精氨酸，从而抑制T细胞的激活。此外，缺氧可上调TAMs中缺氧诱导因子(HIF)1α和2α的表达水平，进而上调ARG1和iNOS的表达，从而耗尽精氨酸并产生NO，导致肿瘤免疫抑制^[92]。除分泌上述抑制因子外，TAMs还表达经典的MHC I类分子HLA-C(人类白细胞抗原C)和非经典的MHCI类分子HLA-E和HLA-G，通过与受体NKG2结合，抑制NK细胞和T细胞的活化^[93]。此外，TAMs还表达程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)配体1(PD-L1)，通过激活PD-L1受体直接抑制T细胞免疫^[92]。

(4)M2表型巨噬细胞通过分泌蛋白酶改变细胞间连接并破坏基底膜^[66]和促进上皮间质转化(EMT)^[69]，进而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。

研究发现，M2表型巨噬细胞不仅可以组织蛋白酶，还可以分泌IL-4来诱导组织蛋白酶活性破坏基底膜，进而促进乳腺癌细胞的侵袭性和肺转移能力^[94]。在胰腺癌微环境中，TAMs内高组织蛋白酶活性与肿瘤转移正相关，而其分泌的组织蛋白酶B和S可改变细胞间连接并破坏基底膜，进而促进肿瘤细胞侵袭和转移^[95，96]。在三阴性乳腺癌小鼠模型中，TAMs诱导的局部和全身水平的(基质金属蛋白酶-9)MMP-9，VEGF，几丁质酶-3样蛋白1(CHI3L1)和Lipocalin-2(LCN2)介导了癌症转移^[97]。最新研究发现，TAMs可通过激活胰腺癌细胞中的TLR4/IL-10信号通路来降低E-钙粘蛋白，而增加波形蛋白的表达。这表明TAMs可促进胰腺癌的EMT^[95，96]。在大肠癌中，浸润性TAMs的数量与癌细胞中Snail的表达呈正相关^[98]。此外，另一项研究表明，源自TAMs的TGF-β通过Smad/Snail信号通路诱导大肠癌细胞EMT^[99]。同样，TAMs通过分泌TGF-β促进肝癌中的癌细胞EMT^[86]。在乳腺癌中，TAMs通过分泌CCL18促进乳腺癌细胞EMT^[100]。

(5)M2表型巨噬细胞增强肿瘤细胞的放化疗抵抗。

在乳腺癌中，抑制音猬因子信号途径可显着诱导M2表型巨噬细胞IL-6表达，IL-6表达的上调促进了乳腺癌对化疗药物的抵抗^[101]。在结直肠癌中，TAMs分泌的IL-6激活了STAT3途径，进而增加了抗凋亡蛋白RAB22A和bcl2在癌细胞中的表达，从而促进了癌细胞化疗耐药性^[102]。在胰腺导管腺癌(PDAC)中，TAMs中STAT3的激活增强了癌细胞对吉西他滨的耐药性。在非小细胞肺癌中，MFG-E8通过激活STAT3和抑制音猬因子信号途径与IL-6协同增强癌细胞对顺铂的耐药性^[67]。此外，TAMs通过分泌CSF1增强前列腺癌中CSF1R信号传导来抑制放射治疗的功效^[103]。TAMs的细胞外基质沉积通过重塑或介导癌细胞与TAMs之间的相互作用来增强癌细胞对放化疗的抵抗^[66]。

我们通过qRT-PCR实验，发现rISG15诱导后的巨噬细胞的M2表型因子升高、而使用rISG15受体抑制剂可抑制M2表型因子的表达；通过流式细胞术发现巨噬细胞在rISG15诱导后，M2表型巨噬细胞增多；同时Transwell和动物实验发现，在细胞和动物水平M2型巨噬细胞可促进肿瘤的迁移和成瘤能力。上述实验表明rISG15可诱导巨噬细胞M2表型，进而促进鼻咽癌的迁移和成瘤能力。为进一步明确M2型巨噬细胞在鼻咽癌中的促癌机制，我们需要通过rISG15诱导或构建过表达ISG15单体稳株，检测M2型巨噬细胞分泌的细胞因子、趋化因子、酶(包括组织蛋白酶，机制金属蛋白酶，环氧合酶-2，精氨酸酶-1等)以及M2型巨噬细胞表面受体表达情况，并进一步研究其功能和机制。

(五)结论

1、ISG15可诱导巨噬细胞M2表型

2、ISG15通过诱导巨噬细胞M2表型进而促进鼻咽癌的迁移和和体内致瘤能力

五、ISG15促TAMs分化进而促进鼻咽癌迁移的机制研究

引言：

前期研究中我们发现ISG15可诱导巨噬细胞的M2表型，且M2表型的巨噬细胞可促进鼻咽癌细胞的迁移和致瘤能力。然而ISG15是如何诱导巨噬细胞的M2表型仍未知。研究发现细胞外游离的ISG15可通过与膜转运蛋白结合进入细胞内发挥作用，还可以与NK细胞表面的ISG15受体结合来调节免疫应答^[21，8]。因此，寻找巨噬细胞上ISG15的可能受体或膜转运蛋白，有助于揭示ISG15诱导巨噬细胞M2表型的机制。而筛选M2型巨噬细胞分泌的细胞因子，有助于揭示M2巨噬细胞促进鼻咽癌恶性进展的机制。

本研究在人体外实验中，从细胞因子谱检测筛选细胞因子，并验证其对鼻咽癌恶性表型的影响；通过免疫荧光筛选可能的膜受体或膜转运蛋白并进行功能验证，进一步从细胞表型、功能及调控机制等方面进行系统和全面的阐述。

(一)材料

1.1细胞系

本章节所用细胞系及培养方法参照第三节。

1.2主要试剂和耗材

除第三节实验材料中所列的主要试剂及耗材以外，本章所需试剂及耗材如下：

1.3主要仪器

本章节所用仪器参照第三节。

1.4主要溶液的配制

本章节所用溶液及配制方法参照第三节。

(二)方法

1、细胞因子谱检测(Raybiotech，catalog no.AAH-CYT-1000)

膜封闭：将试剂盒中各组分取出并平衡至室温，然后将抗体阵列膜(打印面朝上)放入孵育盘中，加入2ml封闭缓冲液，室温孵育30分钟，吸管吸弃封闭缓冲液。上清孵育：每个抗体阵列膜中，加入2ml细胞培养上清，4℃孵育过夜。洗膜I：次日，吸管吸弃孵育上清，1X洗涤缓冲液I，2ml室温下孵育5分钟，共3次；2ml 1X洗涤缓冲液II，室温下孵育5分钟，共3次。与生物素化检测抗体混合物一起孵育：在抗体阵列膜中，加入1ml生物素化抗体混合物，室温下孵育2小时，吸管吸弃生物素化抗体混合物。洗膜II：按步骤c。与HRP结合的链霉亲和素一起孵育：在抗体阵列膜中，加入2ml的1X HRP-链霉亲和素，并在室温下孵育2小时，吸管吸弃HRP-链霉亲和素。洗膜III：按步骤c。显影及分析：化学发光显影或者X光胶片压片显影(注意避免膜干燥)，进行光密度测定和分析。

2、酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测上清液中CCL18

包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1～10ug/ml)，每孔加100ul，4℃过夜。封闭：移去包被液，每孔用1xPBST(含0.1％吐温-20)洗3次，每次2min，每孔加入5％BSA 300ul，室温封闭1-2小时，可存储于4℃冰箱备用。加样：设置2-3个复孔，每孔加入100ul待检测上清液，室温1～2h。洗涤：弃液，每孔加350ml 1xPBST，洗3次，每次2min。每孔加入100ul用封闭液稀释缓好的检测抗体，室温孵育1～2h。洗涤：弃液，每孔加350ml 1xPBST，洗3次，每次2min。每孔加入100ul用封闭液稀释好的偶联二抗，室温孵育1～2h。洗涤：弃液，每孔加350ml 1xPBST，洗3次，每次2min。HRP酶结合物：每孔加酶结合物工作液100ul，室温孵育30min底物：每孔加底物溶液(TMB)100ul，混匀，室温避光孵育15分钟左右。视颜色情况，决定终止时间。终止：每孔加终止液50ul，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。观察记录结果：用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

3、数据统计

(三)结果

1、分泌型ISG15诱导的M2巨噬细胞通过分泌CCL18促进鼻咽癌迁移

为了明确ISG15诱导的巨噬细胞的上清如何促进鼻咽癌细胞迁移，我们通过使用细胞因子阵列检测并分析了用rISG15处理的巨噬细胞，其上清液中的细胞因子谱。结果表明，与对照组相比，CCL18是ISG15诱导的巨噬细胞上清液中增加最多的细胞因子(图21A)。为进一步验证巨噬细胞分泌CCL18是受ISG15诱导，我们通过ELISA检测了rISG15、rISG15+CCL18中和抗体和热灭活rISG15处理的巨噬细胞上清的CCL18表达水平，结果发现rISG15处理的巨噬细胞，CCL18分泌增加，且呈现对ISG15的浓度依耐性；而rISG15+CCL18中和抗体和热灭活rISG15处理的巨噬细胞分泌的CCL18下降，证实了ISG15诱导的巨噬细胞能产生CCL18，且ISG15能促进CCL18的分泌增加(图21B)。这些结果表明，分泌的ISG15是巨噬细胞中诱导CCL18分泌的细胞分子。研究发现，CCL18在鼻咽癌中可通过诱导EMT进癌细胞侵袭转移^[59]。为此，我们使用rISG15、rISG15+CCL18中和抗体、热灭活rISG15和rISG15+A286982处理的巨噬细胞上清行Transwell实验，结果发现rISG15处的巨理噬细胞的上清液可促进鼻咽癌细胞的迁移，而在CCL18多克隆抗体、灭活的rISG15和ISG15抑制剂存在下，由ISG15处的巨理噬细胞的上清液诱导的鼻咽癌细胞迁移增强被消除(图21C)。如图21所示，分泌型ISG15诱导的M2巨噬细胞通过分泌CCL18促进鼻咽癌迁移(A.细胞因子阵列法检测rISG15诱导的巨噬细胞上清中的细胞因子，发现CCL18、CCL11、CCL1表达增强(红色标记框指示CCL18的位置)；B.ELISA发现ISG15诱导的巨噬细胞上清液中CCL18水平增加，而热灭活rISG15或使用CCL18中和抗体可逆转这一现象；C.rISG15、rISG15+CCL18中和抗体、热灭活rISG15和rISG15+A286982处理的巨噬细胞上清行Transwell实验，结果发现rISG15处的巨理噬细胞的上清液可促进鼻咽癌细胞的迁移，而在CCL18中和抗体、灭活的rISG15和ISG15抑制剂存在下，由ISG15处的巨理噬细胞的上清液诱导的鼻咽癌细胞迁移增强被消除。CM(conditioned medium，条件培养基))。

综上所述，ISG15诱导的巨噬细胞通过CCL18分泌促进鼻咽癌细胞的迁移。

2、分泌型ISG15诱导的M2巨噬细胞通过白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和Src信号通路诱导分泌CCL18

白细胞功能相关抗原1(LFA-1)是由CD11a(αL整合素)与CD18(β2整合素)构成的整合素受体。据报道在NK细胞中，LFA-1是ISG15的受体，其CD11a的α1结构域含有ISG15的结合位点^[21]。为明确LFA-1在巨噬细胞中是否也作为ISG15的受体。我们通过免疫荧光实验，在荧光共聚焦显微镜下观察发现，rISG15处理的人巨噬细胞和THP1细胞膜上检测到LFA-1的表达(图22A)。而使用LFA-1的小分子抑制剂A286982，通过ELISA实验检测细胞上清中CCL18的表达，发现A286982可明显抑制rISG15诱导的人巨噬细胞和THP1细胞分泌CCL18(图22B)。这些结果证实了ISG15诱导M2巨噬细胞并分泌CCL18依赖于ISG15受体LFA-1。由于ISG15可通过Src信号传导增加NK细胞IL-10的分泌^[21]，为明确rISG15诱导的巨噬细胞是否持续激Src信号。我们检测了rISG15诱导不同时长的巨噬细胞中SRC信号的表达，结果发现，Tyr416的磷酸化以时间依赖性方式激活了SRC信号(图22C)。而使用LFA-1和Src的小分子抑制剂A286982和PP2，阻碍了ISG15诱导的Src信号的激活(图3-2D)。此外，通过ELISA实验检测细胞上清中CCL18的表达，发现PP2以剂量依赖性方式减少了ISG15诱导的巨噬细胞分泌CCL18(图11E)。总之，ISG15诱导巨噬细胞分泌的CCL18依赖于ISG15受体LFA-1和Src信号传导。如图22所示，分泌型ISG15诱导的M2巨噬细胞通过白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和Src信号通路诱导分泌CCL18(A.免疫荧光证明ISG15受体CD11a/CD18，也称为LFA-1，在人巨噬细胞和THP1细胞的膜上表达；B.ELISA结果显示LFA-1，A286982的小分子抑制剂，抑制巨噬细胞和THP1细胞的CCL18分泌；C.在ISG15诱导的巨噬细胞中通过Tyr416的磷酸化以时间依赖性方式激活SFK信号传导；D.LFA-1和Src的小分子抑制剂，A286982和PP2阻碍了ISG15诱导的SFK信号传导；E.如通过ELISA确定的，PP2以剂量依赖性方式减少了ISG15诱导的巨噬细胞的CCL18分泌)。

(四)分析

细胞因子是直接连接免疫细胞和肿瘤细胞的关键信号分子，肿瘤相关巨噬细胞通过分泌不同细胞因子影响肿瘤的发生发展^[75]。本研究中，通过细胞因子阵列实验证明CCL18是ISG15诱导的TAMs分泌的主要细胞因子。而TAMs分泌的CCL18可促进肿瘤细胞EMT，并在肿瘤进展中起着关键微环境因子的作用^[100，104]。我们的实验证实，CCL18可促进NPC细胞的迁移。这一结果与Huang等^[66]的研究发现一致，他们通过检测复发和转移的NPC患者，发现CCL18与血清EBV滴度和肿瘤进展密切相关。EBV⁺NPC细胞表现出更高的吸引单核细胞并使其活化为TAMs样表型的能力^[59]。这些发现证明鼻咽癌细胞迁移与EBV感染和TAMs有关。由于ISG15的抗病毒活性和免疫调节作用，它可能是将EBV潜伏感染与TAMs联系起来的主要肿瘤微环境因素。而ISG15诱导的TAMs产生的CCL18可能会在病毒感染、TAMs和肿瘤进展三者之间发挥重要作用。

通过上述研究，我们发现分泌型ISG15可以诱导巨噬细胞的M2表型进而发挥促癌作用，但其机制仍不清楚。目前认为的可能机制如下：1、分泌型ISG15与膜受体结合，激活下游信号通路发挥作用；2、分泌型ISG15与膜转运蛋白结合，进入细胞发挥作用3、ISG15以外泌体形式传递到细胞中发挥作用^[7]。

新近研究证实，LFA-1是NK细胞上ISG15的膜受体^[21]。我们的实验也证明了LFA-1在巨噬细胞上的表达，而抑制LFA-1可消除ISG15诱导的M2型巨噬细胞CCL18的分泌。这些结果表明，ISG15作为鼻咽癌微环境细胞因子，其对巨噬细胞的调控作用，需要通过结合巨噬细胞的表面受体LFA-1来完成。LFA-1是1981年，哈佛大学的Davignon等人在筛选抗细胞毒性T细胞单抗时发现的一种淋巴细胞膜的表面分子^[105]，属于整合素家族，是白细胞表面的跨膜受体。它是由CD11a(αL整合素)与CD18(β2整合素)两个亚组成的异二聚体蛋白复合物，因此又被称为CD11a/CD18^[106]。α亚基(CD11a)分子量约为180kD，由一个I结构域、一个β-螺旋结构域和一个二价阳离子结合位点组成；β亚基(CD18)分子量约为95kD，其N端附近有一个I样结构域和一个二价阳离子结合位点。I样结构域与CD11a亚基的I结构域同源。另外，CD18的I样结构域和CD11a的β-螺旋结构域之间存在相互作用^[107]。

研究发现，除T细胞、B细胞外，嗜中性粒细胞和NK细胞上也表达LFA-1。而在NK细胞中，LFA-1被证实是ISG15的受体，且CD11a的I结构域是ISG15的结合位点^[21]。而当白细胞不表达功能性CD18亚基时，T细胞无法粘附于抗原呈递细胞(APC)，导致T细胞无法激活及免疫抑制^[107]。二价阳离子结合位点通过与二价阳离子Mg 2+和Ca 2+的结合，使LFA-1构型发生变化(活化)，促使LFA-1与其特征性配体(ICAM-1)的结合^[108]。LFA-1及其配体ICAM-1(细胞间粘附分子-1)之间的相互作用对于淋巴细胞和免疫系统功能至关重要。LFA-1参与多种细胞生物学过程，包括黏附，外渗，迁移，凋亡，细胞毒性，细胞因子产生和淋巴细胞增殖^[107]。我们的实验发现rISG15处理的巨噬细胞的胞膜上的表达LFA-1，提示ISG15可通过结合其受体LFA-1对巨噬细胞进行调控。我们实验发现ISG15可诱导巨噬细胞M2表型细胞因子表达上调，而使用LFA-1阻滞剂A286982可阻断这一现象。上述结果说明ISG15结合受体后，可激活巨噬细胞的M2表型，而这个过程可被LFA-1阻滞剂A286982阻断，表明ISG15是通过结合其受体LFA-1发挥促巨噬细胞M2表型的作用。

此外，ISG15结合膜受体LFA-1，可导致Src家族激酶(SFKs)的激活^[21]。我们的研究发现，ISG15以时间依赖性方式通过Tyr416位点的磷酸化诱导Src信号的激活。Src激酶家族是一些具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白质，是典型的模块化信号传导蛋白，包括9个成员：Src、Blk、Fgr、Fyn、Hck、Lyn、Lck、Yes和Yrk。它们的保守结构域结构包括一个棕榈酰化或豆蔻酰化的N末端片段，后接SH3、SH2、酪氨酸激酶(SH1)结构域和一个短的C末端^[109]。其中，Src由豆蔻酰化的N端、特定片段、SH3结构域、SH2结构域、连接段、SH1结构域和C端调节尾端组成。磷酸化调节一直是Src激酶调节机制的重要组成部分，Src的磷酸化位点包括Tyr527、Tyr416、Thr34、Thr46和Ser72等，其中Tyr527位点和Tyr416位点是最重要的磷酸化位点^[110]。当Tyr527位点被磷酸化后，它将结合Src的SH2结构域，两者结合后将遮盖酶活性中心，从而抑制Src的酪氨酸激酶活性；而当Tyr416位点被磷酸化后，Src与底物结合区域将打开，允许激酶与底物接触，从而正向调控Src的活性^[109]。

研究表明Src在细胞增殖、分化、粘附和迁移等生物学功能中都发挥重要作用，并与癌症发生发展密切相关^[111]。Src通过与整合素，E-钙粘着蛋白和粘着斑激酶相互作用来参与调节细胞迁移和粘附^[112]。Src与MAPK、PI3K-Akt、STAT等信号通路相互作用，调节细胞存活，增殖和分化等过程^[113]。此外，Src与多种肿瘤发生发展相关。Src在前列腺癌组织和原代细胞中高表达，使用Src抑制剂治疗后癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力降低，动物实验发现使用抑制剂后肿瘤的进展和转移减少^[114，115]。研究发现在结直肠腺瘤性息肉中Src的表达水平比正常黏膜高五到八倍，在腺癌组织中Src的表达水平更高。Src高表达不仅与肿瘤的分期，大小和转移潜力有关，而且与无进展生存期和总体生存期的可能性有关^[115，116]。在乳腺癌中，Src家族激酶(Src，Yes，and Fyn)活性增强且蛋白表达升高，且表达ER(雌激素受体)的乳腺细胞可通过增加Src激酶活性来响应雌激素刺激。在非小细胞肺癌中，Src通过与受体酪氨酸激酶(EGFR、VEGFR)和S下游效应分子(STAT3 and FAK)之间相互作用，促进癌症进展。在头颈鳞癌中，Src家族激酶(Src，Yes，Fyn和Lyn)表达升高，并通过STAT3和STAT5蛋白信号通路，促进癌细胞存活与增殖^[117]。在胰腺癌中，Src在胰腺癌组织和细胞中高表达，Src下游Akt信号通路的活化以及下游效应分子FAK高表达，促进了癌细胞增殖和化疗抵抗^[115]。另有研究发现，Src在骨骼形成和重塑中也起着重要作用，并且与乳腺癌，前列腺癌和肺癌向骨骼的转移有关^[111，114]。

由于Src家族激酶在肿瘤中的重要作用，越来越多的研究开始关注于其小分子抑制剂。PP2是一种特异性Src小分子抑制剂，它通过竞争Src蛋白激酶域中ATP结合位点阻止靶蛋白的磷酸化而发挥作用。我们的研究发现，PP2可抑制Tyr416位点的磷酸化并抑制ISG15诱导的M2型巨噬细胞分泌CCL18，这提示ISG15可通过磷酸化方式激活Src，进而促进M2型巨噬细胞分泌CCL18。进一步实验发现使用CCL18中和抗体、热灭活rISG15或LFA-1抑制剂A286982处理巨噬细胞后，巨噬细胞上清CCL18表达下降且上清液诱导的鼻咽癌细胞迁移能力减弱。上述结果提示ISG15激活巨噬细胞M2表型后，后者通过分泌CCL18促进鼻咽癌细胞迁移的。

CCL18即趋化因子(C-C基序)配体18(CCL18)，是仅存在于灵长类动物中的CC趋化因子，它具有趋化特性，也可直接作用于免疫细胞，在纤维化、炎症、免疫和癌症过程中发挥重要作用^[118]。研究发现，CCL18刺激肺成纤维细胞产生胶原蛋白在肺纤维化中发挥作用^[119]。CCL18可募集调节性T细胞，抑制与炎症相关的趋化因子受体反应并调节免疫细胞功能，发挥抑制炎症的作用。另一方面，CCL18可由Th2型细胞因子(IL 4、IL 13和IL 10)诱导产生，并募集Th2细胞和嗜碱性粒细胞，趋化炎性特征的巨噬细胞，激活嗜碱性粒细胞，诱导组胺释放并增强成熟单核细胞的增殖，发挥促炎症反应作用^[118]。在特应性皮炎中，CCL18在患者血清和病变皮肤中过度表达，并与疾病的严重程度相关；在未使用过药物的过敏性哮喘患者中，支气管肺泡灌洗液和血清中CCL18的水平升高^[120]。在变应性鼻炎，春季结膜炎和伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎中已证明CCL18水平升高^[121]。CCL18表达还与各种以T和B淋巴细胞功能障碍为特征的免疫疾病有关，例如Sjogren综合征，巨细胞动脉炎，类风湿性关节炎，硬皮病或大疱性类天疱疮^[122]。炎性疾病期间CCL18水平升高表明它参与了炎性过程，但并未证明其主要的促炎或抗炎作用。也有研究发现，CCL18通过激活转录因子Slug或Snail，促进癌细胞EMT，进而增加其侵袭和迁移^[123，124]。

此外，CCL18还可以通过与其受体结合发挥调节作用。CCR8是已知的CCL18功能性受体，两者结合后，通过G蛋白信号激活CCR8，诱导CCR8内化，并激活靶细胞的趋化性和钙通量^[125]；PITPNM3和G蛋白偶联受体30(GPR30)是已发现的CCL18病理条件下的受体，PITPNM3在癌细胞中高表达，并介导CCL18诱导的癌细胞和肿瘤相关幼稚T细胞的迁移^[126]；而GPR30在急性淋巴细胞白血病的B淋巴细胞中表达，调节白血病细胞的增殖和归巢等过程^[127]。

综上所述，我们发现ISG15通过结合其受体LFA-1促巨噬细胞M2表型，同时通过磷酸化Tyr416位点，导致SFK信号通路激活，进而促进CCL18的分泌，而CCL18可通过促进鼻咽癌迁移。

(五)结论

1、ISG15诱导的TAMs分泌CCL18，从而促进鼻咽癌细胞迁移和致瘤性。

2、ISG15诱导的TAMs分泌CCL18，取决于其表面受体LFA-1和SRC家族激酶(SFK)信号通路。

六、结语

1.鼻咽癌细胞分泌ISG15到胞外，IS15作为鼻咽癌微环境因子参与肿瘤调控；

2.表达ISG15的肿瘤相关巨噬细胞与鼻咽癌患者不良预后相关；

3.ISG15诱导TAMs表型并促进鼻咽癌细胞迁移和体内成瘤；

4.ISG15诱导的巨噬细胞分泌CCL18，从而促进鼻咽癌细胞迁移；该调控作用依赖于ISG15表面受体LFA-1(CD11a/CD18)和SRC家族激酶(SFK)的参与。

基于前述内容，本发明提供有下述技术方案：

ISG15或ISG15受体作为靶点在制备肿瘤治疗药物中的用途。进一步地，ISG15受体包括LFA-1。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括鼻咽癌治疗药物。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括通过抑制鼻咽癌细胞转移以治疗鼻咽癌的药物。进一步地，所述肿瘤治疗药物抑制肿瘤细胞分泌ISG15触发巨噬细胞促癌表型的过程，所述巨噬细胞促癌表型包括M2表型和/或分泌M2细胞因子的表型和/或分泌CCL18的表型。进一步地，M2型细胞因子包括IL-10、TGF-β、IL-4。进一步地，所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞。进一步地，肿瘤治疗药物包括肿瘤细胞ISG15抑制剂和/或巨噬细胞ISG15受体抑制剂。

LFA-1抑制剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括鼻咽癌治疗药物。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括通过抑制鼻咽癌细胞转移以治疗鼻咽癌的药物。进一步地，肿瘤治疗药物通过抑制巨噬细胞LFA-1以抑制巨噬细胞的CCL18分泌和/或抑制巨噬细胞转变为促癌表型，所述促癌表型包括M2表型和/或分泌M2细胞因子的表型和/或分泌CCL18的表型。进一步地，LFA-1抑制剂包括A286982。

SRC作为靶点在制备肿瘤治疗药物中的用途。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括鼻咽癌治疗药物。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括通过抑制鼻咽癌细胞转移以治疗鼻咽癌的药物。进一步地，肿瘤治疗药物通过抑制巨噬细胞内SRC以抑制巨噬细胞的CCL18分泌和/或抑制巨噬细胞转变为促癌表型，所述促癌表型包括M2表型和/或分泌M2细胞因子的表型和/或分泌CCL18的表型。

SRC信号通路抑制剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括鼻咽癌治疗药物。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括通过抑制鼻咽癌细胞转移以治疗鼻咽癌的药物。进一步地，SRC信号通路抑制剂通过抑制Tyr416磷酸化以抑制SRC信号转导。进一步地，肿瘤治疗药物通过抑制巨噬细胞内SRC信号通路以抑制巨噬细胞的CCL18分泌和/或抑制巨噬细胞转变为促癌表型，所述促癌表型包括M2表型和/或分泌M2细胞因子的表型和/或分泌CCL18的表型。进一步地，SRC信号通路抑制剂包括PP2。

CCL18或CCL18受体作为靶点在制备肿瘤治疗药物中的用途。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括鼻咽癌治疗药物。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括通过抑制鼻咽癌细胞转移以治疗鼻咽癌的药物。

CCL18中和抗体和/或抑制剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括鼻咽癌治疗药物。进一步地，所述肿瘤治疗药物包括通过抑制鼻咽癌细胞转移以治疗鼻咽癌的药物。进一步地，CCL18中和抗体为多克隆抗体。

巨噬细胞CCL18分泌抑制剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。进一步地，肿瘤为鼻咽癌。进一步地，所述巨噬细胞CCL18分泌抑制剂通过抑制巨噬细胞CCL18基因表达、竞争CCL18结合位点和/或抑制巨噬细胞分泌CCL18的通路上游基因或蛋白以抑制CCL18的分泌。进一步地，所述巨噬细胞CCL18分泌抑制剂包括CCL18中和抗体。

ISG15诱导巨噬细胞分泌CCL18通路的抑制剂在制备肿瘤治疗试剂中的用途。进一步地，肿瘤为鼻咽癌。进一步地，抑制剂作用于肿瘤细胞ISG15、巨噬细胞ISG15受体、巨噬细胞SRC通路和/或巨噬细胞CCL18以抑制其表达。进一步地，抑制剂包括LFA-1抑制剂A286982、通过抑制Tyr416磷酸化以抑制SRC信号转导的SRC抑制剂和/或巨噬细胞CCL18抑制剂。进一步地，SRC抑制剂包括PP2，巨噬细胞CCL18抑制剂包括CCL18中和抗体。

ISG15抑制剂在制备免疫调控的试剂中的用途。进一步地，ISG15抑制剂抑制肿瘤细胞ISG15的分泌或抑制肿瘤细胞ISG15与巨噬细胞ISG15受体的结合。进一步地，免疫调控试剂抑制巨噬细胞的M2极化。进一步地，免疫调控试剂抑制巨噬细胞分泌M2型细胞因子。进一步地，M2型细胞因子包括IL-10，TGF-β、IL-4。进一步地，巨噬细胞为存在于肿瘤微环境中的巨噬细胞。进一步地，免疫调控试剂抑制肿瘤细胞ISG15的分泌以抑制巨噬细胞细胞内ISG15分泌。

抑制ISG15和ISG15受体结合的抑制剂在制备抑制巨噬细胞功能表型转换的试剂中的用途。进一步地，所述的抑制剂选自下组：(a)特异性抑制ISG15表达和/或活性的拮抗剂；(b)特异性抑制ISG15受体表达和/或活性的拮抗剂；(c)ISG15的结构类似物；(d)ISG15受体的结构类似物；(e)上述各项的任意组合；所述的抑制巨噬细胞功能表型转换是指抑制巨噬细胞由非M2表型转换为M2表型。进一步地，所述的巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞。进一步地，所述的试剂还用于选自下组的一个或多个用途：(i)降低M2表型巨噬细胞的比例；(ii)提高CD8⁺T细胞效应物的比例；(iii)治疗肿瘤；(iv)调节肿瘤组织免疫微环境；其中，所述的肿瘤为富含巨噬细胞浸润和/或高表达ISG15蛋白的肿瘤。进一步地，所述的抑制剂包括ISG15抑制剂、ISG15受体抑制剂。进一步地，所述ISG15受体抑制剂为LFA-1抑制剂A286982。

抑制ISG15和ISG15受体结合的抑制剂在制备抑制巨噬细胞分泌M2表型细胞因子的试剂中的用途。进一步地，所述的抑制剂选自下组：(a)特异性抑制ISG15表达和/或活性的拮抗剂；(b)特异性抑制ISG15受体表达和/或活性的拮抗剂；(c)ISG15的结构类似物；(d)ISG15受体的结构类似物；(e)上述各项的任意组合；所述M2表型细胞因子包括IL-10，TGF-β、IL-4。进一步地，所述的巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞。进一步地，所述的制剂或组合物还用于选自下组的一个或多个用途：(i)降低M2表型巨噬细胞的比例；(ii)提高CD8⁺T细胞效应物的比例；(iii)治疗肿瘤；(iv)调节肿瘤组织免疫微环境；其中，所述的肿瘤为富含巨噬细胞浸润和/或高表达ISG15蛋白的肿瘤。进一步地，所述的抑制剂包括ISG15抑制剂、ISG15受体抑制剂。进一步地，所述ISG15受体抑制剂为LFA-1抑制剂A286982。

ISG15或ISG15受体抑制剂在制备提高肿瘤微环境中CTL免疫治疗效果的试剂中的用途。进一步地，试剂通过减小CTL效应物数量损失或提高CTL效应物数量以提高CTL免疫治疗效果。

ISG15⁺巨噬细胞在制备调节CTL免疫反应的药物中的用途。进一步地，药物通过增加或减少肿瘤微环境中ISG15⁺巨噬细胞以相应的降低或提高CTL免疫反应。进一步地，药物增多或减少鼻咽癌微环境中的ISG15+巨噬细胞。进一步地，ISG15⁺巨噬细胞为ISG15⁺肿瘤相关巨噬细胞。进一步地，ISG15⁺巨噬细胞为ISG15⁺CD163⁺巨噬细胞。进一步地，药物通过增多或减少ISG15⁺巨噬细胞以调节CD8⁺T细胞的效应物数量而调节CTL反应。进一步地，效应物包括IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B。

减少ISG15⁺巨噬细胞的制剂在制备肿瘤治疗的试剂中的用途。进一步地，肿瘤为鼻咽癌。

Cd68⁺巨噬细胞和/或ISG15⁺巨噬细胞检测试剂在制备鼻咽癌预后的试剂中的用途。进一步地，试剂联合鼻咽癌临床分期以预后。进一步地，所述预后包括OS、DFS的预估。进一步地，ISG15⁺巨噬细胞为ISG15⁺cd163⁺巨噬细胞。进一步地，ISG15⁺巨噬细胞为ISG15⁺肿瘤相关巨噬细胞。进一步地，试剂联合N分期以预后。进一步地，试剂联合T分期、淋巴结分期和远处转移以预后。

N分期检测试剂在制备鼻咽癌预后的试剂中的用途。

一种检测试剂盒，用于检测肿瘤细胞分泌的ISG15、ISG15⁺巨噬细胞、巨噬细胞分泌的CCL18和/或属于巨噬细胞自被ISG15诱导至分泌CCL18的通路中的基因。

一种试剂盒，包含ISG15抑制剂、ISG15受体抑制剂、ISG⁺巨噬细胞杀伤试剂、LFA-1抑制剂、SRC抑制剂、CCL18抑制剂和/或CCL18受体抑制剂。

七、英文缩略词注解

Claims (10)

1.ISG15或ISG15受体作为靶点在制备肿瘤治疗药物中的用途，所述肿瘤治疗药物包括鼻咽癌治疗药物。

2.LFA-1-SFK-CCL18通路抑制剂在制备肿瘤治疗药物中的用途，所述肿瘤治疗药物包括鼻咽癌治疗药物。

3.CCL18或CCL18受体作为靶点在制备肿瘤治疗药物中的用途。

4.ISG15诱导巨噬细胞分泌CCL18通路的抑制剂在制备肿瘤治疗试剂中的用途。

5.抑制ISG15和ISG15受体结合的抑制剂在制备抑制巨噬细胞功能表型转换的试剂中的用途。

6.ISG15或ISG15受体抑制剂在制备提高肿瘤微环境中CTL免疫治疗效果的试剂中的用途。

7.减少ISG15⁺巨噬细胞的制剂在制备肿瘤治疗的试剂中的用途。

8.Cd68⁺巨噬细胞和/或ISG15⁺巨噬细胞检测试剂在制备鼻咽癌预后的试剂中的用途。

9.一种检测试剂盒，其特征在于，用于检测肿瘤细胞分泌的ISG15、ISG15⁺巨噬细胞、巨噬细胞分泌的CCL18和/或属于巨噬细胞自被ISG15诱导至分泌CCL18的通路中的基因。

10.一种试剂盒，其特征在于，包含ISG15抑制剂、ISG15受体抑制剂、ISG⁺巨噬细胞杀伤试剂、LFA-1抑制剂、SRC抑制剂、CCL18抑制剂和/或CCL18受体抑制剂。

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