CN109789163A

CN109789163A - 用于在治疗肝损伤中使用的基于巨噬细胞的疗法

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Publication number: CN109789163A
Application number: CN201780056623.2A
Authority: CN
Inventors: 斯图尔特·福布斯; 菲利普·斯达克·刘易斯; 莱斯利·弗雷斯特
Original assignee: University of Edinburgh
Current assignee: University of Edinburgh
Priority date: 2016-09-19
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2019-05-21
Also published as: JP7115755B2; AU2017328913A1; EP3515460A1; WO2018051136A9; US20190240256A1; AU2017328913B2; US11285174B2; WO2018051136A1; JP2019532634A

Abstract

本发明涉及用于在治疗肝损伤中使用的替代性活化的巨噬细胞(AAM)和采用AAM以治疗和预防肝损伤的方法。

Description

用于在治疗肝损伤中使用的基于巨噬细胞的疗法

技术领域

本发明涉及用于在治疗肝损伤中使用的替代性活化的巨噬细胞。

背景技术

在美国过量服用对乙酰氨基酚(扑热息痛，APAP)是临床上急性肝损伤(ALI)的常见病因，也是急性肝衰竭(ALF)的主要病因(1-5)。APAP还可作为临床前研究的范例肝毒素，并且支持APAP肝毒性的分子机制现已得到充分了解，这是至少四十年的研究。然而，在临床中，对于APAP诱发的ALI的治疗管理主要局限于N-乙酰半胱氨酸(NAC)疗法，在药物摄入后早期(通常在10小时内)其作为有效的解毒剂。然而，对于APAP摄入后迟发(即超过10小时)的患者，NAC治疗的有效性大大降低(6)。对迟发性患者的治疗主要在于支持性护理，可能需要对随后发展为ALF的患者进行肝移植。由于短缺合适的器官供体并需要相关的终生免疫抑制，因而肝移植显然不是理想的治疗性干预方式。因此，迫切寻求适用于APAP中毒迟发性患者的新疗法。

APAP中毒被表征为肝脏中的小叶中心肝细胞快速坏死。如果没有立即的临床干预，大量肝损伤可能发展成与败血症样反应相关的肝衰竭，被称为全身性炎症反应综合征(SIRS)，通常以免疫激活、脑病、体温过低和高风险的多器官衰竭及死亡为特征(7)。最近的研究已经表明，用于维持肝脏先天免疫力的组织驻留巨噬细胞(库普弗细胞(KupfferCell)，KC)将会在APAP攻击后早期被耗竭，导致损伤期间肝脏免疫缺陷(8)。巨噬细胞被认为通过分泌TNF相关弱凋亡诱导因子(TWEAK)来刺激胆管细胞增殖(Bird,T.G.等人，Bonemarrow injection stimulates hepatic ductular reactions in the absence ofinjury via macrophage-mediated TWEAK signaling.Proc Natl Acad Sci U S A 110,6542-6547,doi:10.1073/pnas.1302168110(2013)；Jakubowski,A.等人，TWEAK inducesliver progenitor cell proliferation.J Clin 548Invest 115,2330-2340,doi:10.1172/jci23486(2005))。虽然这些胆管细胞可能与纤维化相关(Williams,M.J.,Clouston,A.D.&Forbes,S.J.Links between hepatic fibrosis,ductular reaction,andprogenitor cell expansion.Gastroenterology 146,349-356,doi:10.1053/j.gastro.2013.11.034(2014))，但是它们也可能含有再生性肝祖细胞(HPC)(Lu,W.Y.等人，Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulationcapacity.Nat Cell Biol 17,971-983,doi:10.1038/ncb3203(2015))。KC还提供肠源性病原体的免疫屏障，该肠源性病原体在肝损伤期间变得失调，进一步危害全身性毒性(9,10)。还存在全身性免疫效应，导致以CCR2依赖性方式被募集于肝脏中的循环性单核细胞的耗竭和功能障碍(11-13)。还存在关于巨噬细胞在肝损伤期间的作用的相互矛盾的文献，其可能反映在组织损伤和再生期间巨噬细胞生物学的复杂塑性。

健康肝脏中的干细胞具有巨大的再生能力，但由病毒感染、酒精滥用、暴露于毒素和代谢紊乱所引起的慢性损伤会导致纤维化瘢痕、肝硬化和再生过程最终失败(Friedman,S.L.Mechanisms of hepatic fibrogenesis.Gastroenterology 134,1655-1669,doi:10.1053/j.gastro.2008.03.003(2008))。

唯一可用的治疗方法是器官移植，但随着需求不断增加以及供体数量受限，迫切需要替代疗法(Soltys,K.A.等人，Barriers to the successful treatment of liverdisease by hepatocyte transplantation.J Hepatol 53,769-774,doi:10.1016/j.jhep.2010.05.010(2010))。

迫切寻求可用于治疗肝损伤的新疗法。本发明的目的是提供用于肝损伤的新疗法。有利地是，这种疗法将能够加速肝坏死消退、抑制全身性炎症反应并促进肝再生。

发明内容

根据本发明，提供了替代性活化的巨噬细胞(AAM)，将其用于在预防或治疗肝损伤中使用，如慢性或急性肝损伤。

合适地，肝损伤可以是急性肝损伤，如与使用药物或过量服用药物相关的肝损伤。合适地，肝损伤可能是由使用一种或多种选自由以下所组成的组的药物导致：对乙酰氨基酚、克拉霉素、他汀类、烟酸、胺碘酮、甲氨蝶呤、异烟肼、呋喃妥因、沃格孟汀、阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、吡罗昔康、萘丁美酮、双氯芬酸、他克林或双硫仑。合适地，药物可以是对乙酰氨基酚。合适地，肝损伤可能由中毒引起，如蘑菇中毒。

合适地，可以在肝脏显现出坏死迹象时给予AAM。合适地，可以在中毒或过量服用药物后10小时或更长时间给予AAM。

可以通过用IL-4、IL-13、CSF-1或其组合将巨噬细胞极化来制备替代性活化的(M2样)巨噬细胞。合适地，可以用IL-4和IL-13将源自骨髓的巨噬细胞(BMDM)极化。有利地是，可以从来自待治疗的受试者的巨噬细胞样品来制备替代性活化的巨噬细胞，使得AAM相对于具有肝损伤的受试者是自体同源的。

合适地，替代性活化的巨噬细胞可以源自多能细胞，如诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ES细胞)。

合适地，将替代性活化的巨噬细胞配制用于静脉内给药。

合适地，可以以10⁷至10⁹个细胞的剂量提供替代性活化的巨噬细胞。

在另一方面，本发明提供了预防或治疗受试者中肝损伤的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的替代性活化的巨噬细胞。

合适地，肝损伤可以是急性肝损伤，如与使用药物或过量服用药物相关的肝损伤。合适地，肝损伤可能是由使用一种或多种选自由以下所组成的组的药物导致：对乙酰氨基酚、克拉霉素、他汀类、烟酸、胺碘酮、甲氨蝶呤、异烟肼、呋喃妥因、沃格孟汀、阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、吡罗昔康、萘丁美酮、双氯芬酸、他克林或双硫仑。合适地，药物可以是对乙酰氨基酚。

合适地，可以静脉内给药和/或可以以10⁷至10⁹个细胞的剂量进行给药。

附图说明

以下通过参考附图进一步描述了本发明的实施方式，其中：

图1示出了静脉内给予的BMDM快速移入肝脏和脾脏。(A)红外荧光光学成像示出了在4小时内在健康和APAP中毒的小鼠中累积在上腹部的Vivotrack标记的BMDM(5×10⁶，静脉内注射)。(B)每15分钟测量的腹部ROI荧光信号的定量示出了长达4小时的累积。空心圆表示小鼠接受未染色的BMDM，而实心圆表示小鼠接受Vivotrack染色的BMDM(黑色圆圈：健康；红色圆圈：APAP中毒)。(C)如标记后的细胞ATP水平所示，BMDM耐受Vivotrack。(D)荧光显微镜照片示出了标记后GFP阳性的BMDM染色强烈且均匀，但未标记的BMDM染色不明显。(E)器官离体成像示出了移植(静脉内)后4小时在健康和APAP中毒小鼠的肝脏、肺脏和脾脏中的BMDM定位。(F)以器官荧光定量的器官示出了在接受未染色细胞的健康小鼠(灰色条)和接受染色细胞的小鼠(黑色条：健康；红色条：APAP中毒)的肝脏、肺脏和脾脏中的BMDM定位。相对于健康小鼠，APAP中毒小鼠的肝脏中荧光信号似乎减少了70％，表明受损肝脏中的肝脏植入更少。(G)在CFSE染色的巨噬细胞中，针对对异硫氰酸荧光素(FITC)的免疫组织化学3,3'-二氨基联苯胺(DAB)的染色示出了在肝脏和脾脏实质中具有典型巨噬细胞形态的细胞呈阳性染色(黑色箭头)。BMDM看上去是在肝脏坏死区域内部及周围(中央静脉(CV)周围具有强烈的背景染色；左图中间行)。在肾脏、肺或脑组织中未检测出BMDM。图中的条形图示出了平均值在标准偏差附近波动。

图2示出了替代性活化的巨噬细胞(AAM)在APAP诱导的肝损伤后减少肝坏死。用APAP处理(350mg/kg；腹膜内)禁食过的小鼠，并在给予APAP后16小时用未经处理的(幼稚的)BMDM或预极化的BMDM(经典活化的巨噬细胞(CAM)、AAM或失活的巨噬细胞(DAM))处理。(A)肝损伤生物标志物(ALT/AST/ALP)和功能性标志物(总胆红素/血清白蛋白)的血清化学分析示出了处理组之间没有差异。空心圆表示如图所示的每组动物个体的值，(B)苏木精和伊红(H+E)染色显示出APAP诱导肝损伤在中心静脉周围的特征性嗜酸性粒细胞坏死区域。各小图示出了来自小鼠肝脏的不同代表性图像(2×放大)。右下方示出了坏死定量，如图所示，将其表示为各组中平均值(水平线)上下的每个动物个体值(空心圆)。星号表示统计学上的显著性(P<0.05，Kruskall-Wallis检验)。

图3示出了极化的BMDM治疗在APAP诱导的肝损伤后诱导肝细胞增殖。(A)在处死小鼠前1小时，用BrdU(1mg，腹膜内)标记在用APAP诱导肝损伤后用极化BMDM治疗的小鼠，以标记增殖性细胞。各小图示出了所示的每组代表性免疫荧光(IF)染色。细胞核用DAPI染色，并且采用抗-BrdU一抗(或同种型对照抗体)以及之后的Alexa Fluor 555nm二抗来染色BrdU阳性。在Operetta高内涵成像系统(Perkin Elmer)上对切片进行成像和定量。通过计数BrdU阳性细胞核(染成红色的细胞核，在546nm通道中的最小荧光强度为500RFU)的数量(表示为相对于所有细胞核的百分数)来量化切片。右下方示出了各组BrdU量化，将每组BrdU量化表示为平均值(黑线)上下的每个动物个体值(空心圆)。每个小图的左下方示出了比例尺。星号表示多组间统计学上的显著性(P<0.05，单向ANOVA)。(B)共免疫染色表明实质和非实质来源的增殖性细胞使AAM治疗小鼠中肝脏再生。

图4示出了给药经极化的BMDM减弱了在具有APAP诱导肝损伤的小鼠中的循环性炎性细胞因子组。采用电化学发光技术(Meso Scale Discovery，盖瑟斯堡，马里兰州)测定接受BMDM(幼稚BMDM、CAM和AAM)的小鼠血清中的10种促炎性细胞因子组。各小图示出了所分析的每种细胞因子的各组数据(IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、CXCL1(KC/GRO)、TNFα)。每个空心圆表示每组中各动物个体的数据点。星号表示统计学上的显著性水平(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；单向ANOVA)。

图5示出了在APAP诱导肝损伤后的小鼠中，给予AAM上调Csf1表达并减少炎性Cxcl1和Il6表达。在BMDM治疗APAP诱导的肝损伤后，在整个肝脏中测定一组已知与ALI期间的巨噬细胞信号传导有关的细胞因子和趋化因子。各小图示出了相对于给予APAP后接受PBS的小鼠(无BMDM)，各组中每个基因的相对表达平均值。黑色棒状条示出了标准偏差附近波动的倍数差平均值(n＝6)。在AAM治疗的小鼠中，促存活基因Csf1的表达显著更高。与循环性标志物一致，在AAM治疗的小鼠中Cxcl1和Il6的表达显著降低。将Gapdh用作管家基因。星号表示统计学上的差异(P<0.05；单向ANOVA)。

图6示出了AAM表现出比幼稚和CAM更强的吞噬能力。(A)将极化的BMDM与凋亡的荧光胸腺细胞一起孵育。将各种BMDM与凋亡的胸腺细胞(如前所述，用1μM氢化可的松处理从3-5周龄C57BL6小鼠收获的原代胸腺细胞(D.A.Ferenbach等人，2010))一起孵育。按照制造商的说明书，采用CMTMR(Invitrogen)标记凋亡的胸腺细胞(L.Bosurgi等人，2015)，然后与极化成不同表型的BMDM(绿色，AAM；红色，CAM；黑色，幼稚)孵育，持续30、60或120分钟。各小图示出了CMTMR-阳性BMDM的百分数(左)、其平均荧光强度(MFI；左起第二个)、归一化的MFI(右起第二个)和MFI直方图(右)。淡蓝色直方图代表未染色的细胞。(B)在AAM的吞噬作用之后，BMDM上的Ly6C表达降低。左图示出了极化成不同表型的Ly6C阳性BMDM的百分数，右图示出了代表性的直方图。(C)AAM比幼稚或CAM吞噬更多的酵母聚糖包被的pHrodo颗粒。将BMDM与酵母聚糖包被的pHrodo生物颗粒一起孵育长达125分钟，并通过高内涵成像实时分析。图表示出了随着时间推移，各组细胞(绿色，AAM；红色，CAM；黑色，幼稚)高于荧光阈值(吞噬作用阳性)在标准偏差附近波动的平均分数。(D)在不同时间拍摄的代表性图像示出了AAM比幼稚巨噬细胞或CAM更早地呈现出绿色荧光并且具有更强能力。用蓝色细胞核染色剂(NucBlue)和DeepRed Cell Mask将细胞可视化。

图7示出了移植的AAM在体内具有高度吞噬作用，并保留其抗炎表型。(A)研究设计时间线示出了在APAP后16小时BMDM移植前对禁食小鼠单次给予APAP。通过在APAP后36小时处死小鼠之前，由PKH26染料攻击(静脉注射；仅由吞噬细胞摄取的染料)来估计内源性和外源性细胞的吞噬能力。(B)来自接受PBS(上行)或AAM(下行)的小鼠的代表性肝左外叶在培养皿中的照片。在APAP后PBS治疗的小鼠中观察到出血性坏死的病灶区域(蓝色箭头)，而在巨噬细胞治疗的小鼠的肝脏中未观察到。(C)在接受BMDM疗法的小鼠中的血清转氨酶显著降低(ALT，左图；AST，右图)。(D)上面两幅图示出了巨噬细胞治疗的小鼠的肝脏中Ly6C+浸润性巨噬细胞适度减少，该小图示出了浸润性细胞的百分数(左)和绝对数值(右)。下面两幅图示出了表明Ly6C+巨噬细胞在巨噬细胞治疗的小鼠肝脏中具有更高的吞噬能力的趋势(左图，百分数；右图，绝对数值)。(E)在移植后20小时，在血液和肝脏中均检测到较高数量的移植的BMDM。(F)在肝脏中检测到的BMDM大多数是Ly6C阴性，表明大多数细胞保留其抗炎表型。(G)移植的巨噬细胞在肝脏中表现出显著的吞噬活性，吞噬作用以CFSE+PKH26+巨噬细胞为门。超过95％的Ly6C-BMDM对吞噬作用呈阳性，证实在体内具有较高的吞噬能力。

图8示出了在健康小鼠中给药未处理的BMDM后的血清化学。测定BMDM给药(1×10⁶个细胞，静脉内)后20小时收获的小鼠血清中的肝损伤标志物和功能标志物。各小图示出了各组中平均值(黑线)上下的小鼠个体值(空心圆)。相对于PBS溶媒对照(学生t检验)，BMDM组中没有一种生物标志物具有统计学显著性。

图9示出了在APAP处理后早期(4小时)给药幼稚BMDM不会减轻肝损伤。测定在给予APAP后24小时(BMDM给药后20小时；1×10⁶，静脉内)收获的小鼠血清中的肝损伤标志物和功能标志物。尽管测量的标志物没有统计学显著性，但是在BMDM治疗的小鼠中示出血清转氨酶更高的趋势，并且仅在BMDM治疗的组中观察到死亡(学生t-检验)。

图10示出了在普通塑料和超低附着塑料上发生的细胞因子介导的BMDM极化。在普通塑料(黑色条)或超低附着塑料(灰色条)上培养BMDM持续48小时，其中用LPS(50ng/mL)和IFNγ(20ng/mL)培养CAM，用IL-4(20ng/mL)和IL-13(20ng/mL)培养AAM，用IL-10(10ng/mL)培养DAM，或不用生长因子(幼稚巨噬细胞)。(A)经典活化基因(Nos2、Tnf、Ccl2)的相对基因表达分析示出了，在普通塑料和低附着塑料上的用LPS/IFN处理的BMDM中的表达一致性显著地增加。(B，C)原型的替代性活化基因(B，替代性活化的基因：Chil3、Retnla、Mrc1、Arg1；C，DAM：Il10)的基因表达分析示出了分别用IL-4/IL-13(B)和IL-10(C)培养的BMDM中的表达一致性增加。对于这两种塑料类型，替代性活化的基因被IL-4/IL-13上调，而在IL-10处理后，低附着塑料上的Il10基因表达更高。

图11示出了在具有APAP诱导肝损伤的小鼠中整个肝脏中，给药极化的BMDM表现出炎性细胞因子组偏低的趋势。使用电化学发光技术(Meso Scale Discovery，盖瑟斯堡，马里兰州)测定来自用BMDM(幼稚、CAM、AAM)治疗小鼠的血清的10种促炎性细胞因子组。小图示出了每种分析的细胞因子的各个组的数据(IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、CXCL1(KC/GRO)、TNFα)。每个空心圆表示每组动物个体的数据点。星号表示统计学显著性水平(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；单向ANOVA)。

图12示出了源自人类单核细胞的巨噬细胞在体外极化后表现出改变的吞噬作用动力学。将人类单核细胞与人类重组CSF1体外孵育7天以驱动分化，然后用LPS/IFN培养(以通过经典活化分化为hCAM)、用IL4/IL-13培养(以通过替代性活化分化为hAAM)、或无刺激(分化为幼稚MDM)。将巨噬细胞以1×10⁵个细胞/孔接种在96孔CellCarrier板中，并用酵母聚糖绿色pHrodo生物颗粒孵育125分钟。(A)每组四个孔的pHrodo阳性细胞的实时平均分数。点表示在标准偏差附近波动的平均值。(B)在孵育期间的不同时间所培养的hMDM的代表性图像。染为蓝色表示NucBlue细胞核。染为红色表示cell mask深红细胞质染色。绿色信号表示在酸性溶酶体中摄入的pHrodo生物颗粒。吞噬作用的趋势与小鼠BMDM类似，但是颗粒摄取延迟。

图13示出了流式细胞术门设置策略。示出了肝脏消化物分类亚群的代表性流式散点图。上图示出了用于分析的所有细胞，不包括双联体(doublet)，和阴性染色的肝脏/死亡细胞。将该亚群表示为总肝脏巨噬细胞或CD45+细胞的比例。将肝脏常驻巨噬细胞定义为CD45+Ly6G-CD3-NK1.1-CD19-CD11b^低F4/80^高活细胞。将肝脏浸润性巨噬细胞定义为来自消化的肝脏的非实质部分的CD45+Ly6G-CD3-NK1.1-CD19-CD11b^高F4/80^低活细胞，并用于鉴定巨噬细胞亚群。通过将每个子集表示为NPC的比例、计算肝脏消化部分中NPC的总数、以重量差异计算整个肝脏中NPC的总数来对每个肝脏中绝对细胞数量进行定量，从而计算每种亚群的总数量。将移植的AAM确定为CFSE+。在总CD45+Ly6G-CD3-CD19-NK1.1-活细胞的门内计算CFSE+细胞百分数。将从接受溶媒而不是AAM的APAP中毒小鼠的肝脏设置为阴性。以其Ly6C表达对AAM进一步分类，使用FMO对照设置门。计算CFSE+细胞门内的吞噬细胞(阳性和阴性)百分数。将来自移植AAM但注射有溶媒而不是PKH26PCL的APAP中毒小鼠的肝脏设定为阴性。计算同一门内的PKH26PCL MFI。

图14示出了流式细胞术门设置策略。示出了吞噬作用分析分类亚群的代表性流式散点图。各小图示出了在研究中分析的所有细胞，但不包括双联体。将BMDM确定为CD11b+。计算CD11b+细胞门内的吞噬细胞的百分数。将吞噬作用阳性的BMDM定义为CMTMR+(即，荧光凋亡胸腺细胞)。从吞噬性BMDM的百分数(37℃)中减去非特异性结合的百分数(4℃下的吞噬作用，右上图)。基于它们的Ly6C表达将吞噬细胞进一步分类(右下图)。采用FMO对照设置门。

图15示出了在APAP中毒的小鼠中递送AAM后的全血参数。我们观察到在接受DPBS(溶媒对照)与AAM(5×10⁶，静脉内)的中毒动物的任何全血参数之间没有统计学差异。(A)个小图示出了按组分类的空心圆(动物个体)，如表示为白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hgb)、血细胞比容(HCT)和血小板(PLT)。(B)每组的淋巴细胞的数量(左)和百分数(右)。(C)每组的单核细胞的数量(左)和百分数(右)。(D)每组的粒细胞的数量(左)和百分数(右)。

图16示出了ESDM和BMDM之间的比较。用图像分析BMDM(A)和ESDM(B)的染色细胞离心涂片，证明ESDM更大(C)(比例尺为30μM)。BMDM(D)和ESDM(E)的流式细胞术分析证明了纯的ESDM群体。在添加Phrodo珠粒后第0(I)、50(II)、100(III)和150(IV)分钟的BMDM(G)和ESDM(H)的实时活吞噬作用测定图像，和采用Harmony图像分析软件对吞噬速率定量(I)(比例尺为50μM)。[*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；n＝3，(C)非配对t检验，(F)Kruskal-Wallis检验的单向ANOVA，(I)Sidak多重比较检验的双向ANOVA]。

图17示出了ESDM和BMDM的M1和M2刺激。格里斯(Griess)一氧化氮测定幼稚的、刺激为M1和刺激为M2的BMDM和ESDM(A)，并通过qRT-PCR分析关键标志物的表达，将iNos(B)和Cd86(C)作为M1的标志物，将Arg1(D)和Fizz1(E)作为M2表型的标志物，并且将Tweak(F)、Mmp9(G)、Mmp12(H)和Mmp13(I)作为组织重塑的标志物。量化刺激为M1和刺激为M2的BMDM(J)和ESDM(K)的吞噬作用。[*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；每组n＝3，Tukey多重比较检验的双向ANOVA]。

图18示出了较高剂量的ESDM具有抗纤维化作用。损伤和巨噬细胞注射10×10⁶或20×10⁶个巨噬细胞的示意图(A)。来自CCl₄处理的肝脏的肝脏切片的PSR染色(B-G)和aSMA染色(H-M)，其肝脏注射有10×10⁶(10m)或20×10⁶(20m)的ESDM。比例尺为200μM。[*p<0.05，每组n＝5，非配对t检验]。

图19示出了ESDM可以在受损的肝脏中启动祖细胞反应。与损伤肝脏对照相比，在注射有ESDM的小鼠中观察到显著更高数量的PanCK阳性细胞(A-F)。比例尺为100μM。[*p<0.05，每组n＝5，非配对t检验]。

图20示出了ESDM可以重新填充脂质体氯膦酸盐处理的小鼠的肝脏。源自单核细胞的巨噬细胞与组织驻留巨噬细胞相比，标志物表达是差异性表达的，Myb(A)、Ccr2(B)和Pu.1(C)。脂质体氯膦酸盐诱导的库普弗细胞耗竭和注射ESDM或BMDM的示意图(D)。来自不同处理组的肝脏切片的CFSE免疫染色(E-H；比例尺为100μM)和CFSE免疫组织化学(I-L，比例尺为50μM)。量化CFSE+免疫染色(M)和CFSE+免疫组织化学(N)。箭头指向检测到的CFSE+细胞。碱性磷酸酶(ALP)(O)和白蛋白水平(P)的血清分析。在通过F4/80免疫组织化学进行脂质体氯膦酸盐处理后肝脏中巨噬细胞群体的估计(Q)。PBS对照(A)和氯膦酸盐处理后24小时(B)、48小时(C)、72小时(D)的F4/80染色的肝脏切片的代表性图像。F4/80+染色的定量分析(E)。通过FITC免疫组织化学估计不同器官中的ESDM和BMDM植入(R)。分别用PBS(A-D)、脂质体氯膦酸盐(E-H)、脂质体氯膦酸盐和BMDM(I-L)以及脂质体氯膦酸盐和ESDM(M-P)处理的小鼠的肝脏、肺、肾脏和心脏切片中的外源性巨噬细胞的代表性图像(比例尺为100μM)。[*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；每组n＝5，单向ANOVA]。

图21示出了与溶媒对照相比，在注射后20小时时的ESDM治疗的小鼠中血清转氨酶没有差异。

图22示出了在用重组鼠源IL-4/IL-13体外极化ESDM 24小时后，M2相关基因显著增加。

图23示出了替代性活化的ESDM在体外具有较强的吞噬作用。与未孵育的等同细胞相比，ESDM与凋亡的胸腺细胞体外孵育显示出吞噬作用阳性率为79％。

图24示出了在ESDM注射(5×10⁶，静脉内)后20小时，ESDM治疗的小鼠的肝小叶中心坏死区域减小。各小图示出了苏木精和伊红(H+E)染色及在图像定量过程中使用的其相应图像分割(分类器)。

图25示出了定位于肝脏和脾脏的移植的ESDM(黑色箭头)。图A-肝脏切片(上行，放大×20；下行，放大×40)。图B-脾脏切片。

图26示出了产生的来自人类多能干细胞的巨噬细胞(源自hPSC的巨噬细胞)表达CD11b和25F9两者(B)但不表达CD93(A)，以及在刺激时关键性M1相关基因(C，D)和M2相关基因(E，F)上调。使用实时吞噬作用测定法，iPSC-DM与MDM具有相同的趋势，其中“幼稚”和激活为M2的巨噬细胞比激活为M1的巨噬细胞更具有吞噬作用(G，H)。[*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n＝3，(C-F)单向ANOVA，(G-H)Tukey多重比较检验的双向ANOVA]。

图27示出了源自iPSC的巨噬细胞表达CD45(A)、25F9(B)、CD169(C)、CD163(C)、CD14(D)和CD43(E)。在一小部分iPSC中存在低水平的VCAM1(F)和CD15(G)。iPSC不表达CD93(B)。

图28示出了源自iPSC的巨噬细胞表达CD206(A)、CD115(B)、CD86(C)、CX3CR1(E)、CCR2(F)、CCR5(G)和CCR8(H)，但不表达HLA-DR(D)。

图29示出了火山图，其证明了来自移植到APAP中毒的或健康的小鼠(n＝3)后的FACS分选的AAM的低密度微阵列数据(分别相对于y轴和x轴上的倍数变化具有统计学显著性)，以确定移植后20小时时的转录变化程度。在APAP和PBS处理的小鼠之间的统计学显著不同的基因在水平线之上。学生t检验。AAM通常保留其抗炎表型，其中所分析的基因的95％在APAP处理的小鼠和PBS处理的小鼠之间没有差异。

具体实施方式

本发明人出乎意料地发现，替代性活化的巨噬细胞(AAM)在治疗肝损伤方面具有特殊效用。出乎意料的是，给予AAM可产生以下一种或多种有利效果：坏死减少、肝细胞增殖增加、促炎性细胞因子水平降低、损伤部位的吞噬作用增加以及内源浸润性炎性巨噬细胞比例减少。因此，AAM疗法可以有利地：加速肝炎坏死消退、抑制全身性炎症反应、减少肝纤维化、减少肝脏瘢痕和/或促进肝再生。

在体外源自ESC的造血细胞被认为与发育过程的卵黄囊中原始造血波(primitivewave of haematopoiesis)相关的血细胞更紧密相关(Zambidis,E.T.,Peault,B.,Park,T.S.,Bunz,F.&Civin,C.I.in Blood Vol.106 860-870(2005))。已知组织驻留巨噬细胞来自原始造血波，其在胚胎中出现造血干细胞(HSC)之前就存在并在没有Myb的情况下能够发育(Schulz,C.等人，A lineage of myeloid cells independent of Myb andhematopoietic stem cells.Science 336,86-90,doi:10.1126/science.1219179(2012))。合适地，本文描述的巨噬细胞可以是组织驻留样巨噬细胞。可替换地，本文描述的巨噬细胞可以是源自单核细胞样巨噬细胞。可以将组织驻留样巨噬细胞表征为具有较低的Myb和Ccr2表达水平和较高的Pu.1表达。

替代性活化的(M2样)巨噬细胞是本领域已知的，并且可以通过用辅助性T细胞2(th2)细胞因子白细胞介素-4(IL-4)和IL-13将源自骨髓的巨噬细胞极化来制备。例如，在Gordon等人(Immunity 32,May 28,201,pages 593-604)中详细描述了AAM。有利地是，可以从如本发明实施例中所述的巨噬细胞产生AAM。

AAM可以具有高表达Chil3(Ym1)、Retnla(Fizz)、Mrc1(甘露糖受体1)和Arg1(精氨酸酶)的特征。

如在本文中所使用的，“肝损伤”是指肝毒性。仅仅通过举例来说，由于自身免疫性肝炎、原发移植物无功能、小规模综合征、恶性肿瘤和/或药物诱导的肝损伤，引发受试者的肝损伤。合适地，药物诱导的肝损伤可能是使用一种或多种选自由以下组成的清单的药物的结果：克拉霉素、他汀类、烟酸、胺碘酮、甲氨蝶呤、异烟肼、呋喃妥因、沃格孟汀、阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、吡罗昔康、萘丁美酮、双氯芬酸、他克林或双硫仑。更合适地，药物诱导的肝损伤是过量服用对乙酰氨基酚的结果。

对肝脏的长期损害可导致慢性肝损伤。仅仅通过举例来说，慢性肝损伤可以由病毒性肝炎、酒精、肥胖和代谢紊乱引起。慢性肝损伤可能导致纤维化、肝脏瘢痕形成和肝硬化，其被表征为瘢痕组织取代正常肝脏组织。本发明出乎意料地发现，给予的ESDM在体内显著减少肝纤维化量、下调纤维生成的肌成纤维细胞数量和激活肝祖细胞(特别是PanCK+胆管细胞)。此外，出乎意料地发现ESDM可以重新填充库普弗细胞耗尽的区室。在不希望受理论束缚下，认为ESDM可以分泌将瘢痕组织的细胞外基质(ECM)组分分解掉的基质金属蛋白酶(MMP)。合适地，极化为M2样巨噬细胞的ESDM也可以具有治疗慢性肝损伤的效用。

本发明还出乎意料地发现，在培养中引发成AAM表型的巨噬细胞在体内保留了这种抗炎表型。这克服了潜在的安全性担忧，即移植的巨噬细胞可能变成促炎表型，从而对损伤治疗有害。

合适地，可以在肝损伤后的再生阶段给予AAM。例如，在药物诱导的肝损伤后的16小时后。本发明已经表明，在该阶段给予AAM可以减少坏死。例如，在实施例中已经表明在给予过量服用对乙酰氨基酚后的再生阶段中给予AAM会使小叶中心坏死减少60％、肝细胞增殖增加8倍、和降低循环性促炎性细胞因子(如IFN-γ、IL-6、CXCL1和TNF-α)的水平。因此，AAM可以加速再生反应。

在不希望受理论束缚下，认为AAM从肝脏中除去坏死物质是由于其极高的吞噬作用表型。

有利地是，可以从来自待治疗的受试者的巨噬细胞样品制备替代性活化的巨噬细胞，使得AAM相对于具有肝损伤的受试者是自体同源的。例如，可以从受试者收获巨噬细胞样品，扩增，表征为AAM，并重新注入。

合适地，替代性活化的巨噬细胞可以源自人类诱导的多能干细胞。这对于快速发展为急性肝衰竭的肝损伤(如对乙酰氨基酚中毒)可能是有利的。

从多能干细胞(如ES细胞和iPSC)产生巨噬细胞的多种方法是本领域已知的，参见Yeung等人2012年(“Conditional-ready mouse embryonic stem cell derivedmacrophages enable the study of essential genes in macrophage function”.Sc.Rep.2015Mar 10；5:8909.doi:10.1038/srep08908)，Zhuang等人2012年(“Purepopulations of murine macrophages from cultured embryonic stemcells.Application to studies of chemotaxis and apoptotic cell clearance.”JImmunol Methods.2012Nov 30；385(1-2):1-14.doi:10.1016/j.jim.2012.06.008.Epub2012Jun18)，Sneju等人(“Application of iPS cell-derived macrophages to cancertherapy”Oncoimmunology.2014；3:e27927)，Hale等人(“Induced Pluripotent Stem CellDerived Macrophages as a Cellular System to Study Salmonella and OtherPathogens”PLOS,http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0124307)，Zhang等人(“Functional Analysis and Transcriptomic Profiling of iPSC-derivedMacrophages and Their Application in Modeling Mendelian Disease”CircRes.2015Jun 19；117(1):17-28)，Mucci等人(“Murine iPSC-Derived Macrophages as aTool for Disease Modeling of Hereditary Pulmonary Alveolar Proteinosis due toCsf2rb Deficiency”Stem Cell Reports.2016Aug 9；7(2):292-305)和van Wigenburt等人(“Efficient,Long Term Production of Monocyte-Derived Macrophages from HumanPluripotent Stem Cells under Partly-Defined and Fully-Defined Conditions”PLOSONE 8(8):e71098.doi:10.1371/journal.pone.0071098)。可以用T辅助细胞2(th2)细胞因子白细胞介素-4(IL-4)和IL-13将这种巨噬细胞极化为AAM。用IL-4/IL-13极化可导致Chil3(例如，与初始BMDM相比增加高达约100倍)、Retnla(例如，增加高达1000-100000倍)、Mrc1(例如，增加高达约10倍)、Arg1(例如，增加高达约100-1000倍)基因表达的动态变化。

合适地，AAM可以源自ES细胞。因此，可以通过在集落刺激因子-1(CSF-1)(也被称为M-CSF)和IL-3的存在下培养ES细胞以形成胚状体(EB)来产生源自ES细胞的巨噬细胞(ESDM)。EB附着于组织培养塑料，而巨噬细胞祖细胞是非贴壁的，因此被释放到培养基中。然后，可以在不同时间点(例如在10或20天之后)收获巨噬细胞祖细胞，并接种到未经处理的Petri培养皿上，并在仅存在CSF-1下培养。该过程可以产生单核细胞样细胞，其附着在塑料上形成单层并成熟为ESDM。可以通过检测成熟巨噬细胞特异性标志物F4/80(小鼠巨噬细胞特异性的)或25F9(人类巨噬细胞特异性的)和CD11b的存在来监测ES细胞成熟为ESDM。另外，人类巨噬细胞可以被表征为不存在单核细胞标记物CD93。有利地是，所述的方法产生基本上同质的ESDM群体。

可替换地，AAM可以源自iPSC。合适地，将iPSC分化为巨噬细胞的方法可以包括用细胞因子混合物1(包含骨形态发生蛋白(BMP4)、血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF))补充培养基。可以在补充有细胞因子混合物1的新鲜培养基中将细胞切割、移出、分开和再培养。可以在第2天用细胞因子将细胞悬浮培养3天，以形成EB。然后可以将EB转移至补充有细胞因子混合物2(包含M-CSF、IL3、Glutamax、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇)的培养基中。可以将EB维持在该培养基中，持续该方案剩余的持续时间，每3-4天用新鲜培养基替换用过的培养基。在约2周后，将在培养混悬液中的EB所产生的巨噬细胞祖细胞收获并转移到补充有细胞因子混合物3(M-CSF、Glutamax、青霉素/链霉素)的培养基中，并使其成熟为源自iPSC的巨噬细胞(iPSC-DM)。可以继续每周收获巨噬细胞祖细胞两次，持续约2个月。

优选地，源自iPSC的巨噬细胞(iPSC-DM)来自人类iPSC。可替换地，iPSC-DM可以是鼠源的。

随后可以通过用LPS和IFNγ处理，将得到的ESDM或iPSC-DM在体外极化，以便采用任一种M1样表型。可替换地，可以利用IL-4将ESDM或iPSC-DM极化以产生AAM。可替换地，可以利用IL-4、IL-13和CSF-1将ESDM极化以产生AAM。M1样极化的巨噬细胞也被称为经典活化的巨噬细胞(CAM)。可以将源自ESDM的AAM表征为Chil3(Ym1)、Retnla(Fizz)、Mrc1(甘露糖受体1)和Arg1(精氨酸酶)高表达。相比之下，可以将M1样极化巨噬细胞(如ESDM、BMDM或iPSC-DM)表征为NO产生显著增加和iNos和Cd86的基因表达增加。

如在本文中所使用的，术语“受试者”是指可以受益于肝损伤治疗的任何个体。受试者可以是人类受试者。

如在本文中所使用的，术语“治疗”是指对阻止进展或者部分地或完全地减少受试者中肝损伤临床症状的干预。合适地，治疗可以导致肝再生增加或加速。

应理解，治疗有效量的AAM将取决于各种因素，包括待治疗的受试者的体重。举例来说，治疗有效量可以是1×10⁷至1×10⁹AAM剂量的形式，或治疗有效量可以是2×10⁷至2×10⁹AAM剂量的形式。具体地，治疗有效量可以是2×10⁷剂量的形式。

合适地，可以以单剂量提供AAM或包含AAM的药物组合物。然而可以理解的是也可以使用多剂量。

合适地，AAM可以包含在药物组合物中。例如，药物组合物可以包含治疗有效量的AAM和药学上可接受的载体。

如在本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指适合于给药至受试者的任何合适的稀释剂、辅料或其组合。药学上可接受的载体可以是有助于将AAM递送至受试者的有机或无机的物质。

在合适的实施方式中，本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂和相容性载体。该组合物还可以包含抗氧化剂和/或防腐剂。合适的抗氧化剂可以选自由以下所组成的组：提及的硫醇衍生物(例如，硫代甘油、半胱氨酸(cysteine)、乙酰半胱氨酸、胱氨酸(cystine)、二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽)、生育酚、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、磺酸盐(例如，硫酸钠、亚硫酸氢钠、丙酮合亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、甲醛次硫酸氢钠、硫代硫酸钠)和去甲二氢愈创木酸。合适的防腐剂可以是例如苯酚、氯丁醇、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和氯化十六烷基吡啶。

可以通过任何合适的途径将本发明的药物组合物给予至受试者。合适的给药途径可以选自由静脉内注射或输注所组成的组。用于给予药物组合物的其它方法是本领域技术人员已知的。

贯穿在本说明书的说明书部分和权利要求书中，词语“包含(comprise)”和“含有(contain)”及其变体意味着“包括但不限于”，并且它们不旨在(和不)排除其它部分、添加剂、组分、整体或步骤。贯穿在本说明书的说明书部分和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则单数形式包括复数形式。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则应将说明书理解为考虑复数以及单数。

应将结合本发明的特定方面、实施方式或实施例描述的性质、整体、特征、化合物、化学部分或基团理解为适用于本文描述的任何其它方面、实施方式或实施例，除非与其不相容。本说明书中公开的所有性质(包括任何所附权利要求、摘要和附图)、和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合进行组合，除了至少一些这样的特征和/或步骤的组合是互斥的。本发明不限于任何前述实施方式的细节。本发明延展到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的性质的任何一种新性质或任何新性质的组合，或者如此公开的任何方法或过程的步骤的任何一种新的步骤或任何新的步骤的组合。

读者的注意力指向在与本申请相关的本说明书同时或在本说明书之前提交的并且与本说明书一起公开受公众审查的所有论文和文件，并且在本文中通过引用将所有这些论文和文件的内容都包含在内。

实施例

实施例1:源自骨髓的巨噬细胞

方法

小鼠BMDM：将C57/BL6雄性小鼠(8-10周龄)的股骨和胫骨收集于含有青霉素/链霉素(100U/mL，100μg/mL)的Hank平衡盐溶液(HBSS，Gibco)中。用补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素(100U/mL，100μg/mL)的DMEM:F12(1:1)细胞培养基(Gibco)排出骨髓(BM)。将小鼠骨髓离心(400g，5分钟)，然后在含有20ng/mL鼠重组CSF1(Peprotech)的经过补充的DMEM:F12培养基(20mL)中重新悬浮，并通过100μm过滤器过滤。然后将骨髓混悬液转移到无菌的超低附着烧瓶(Corning Inc.)中，并在37℃和5％CO2下以20mL体积孵育。每隔一天，用含有400ng CSF1的新鲜培养基替换10-20％的培养基。对于BMDM极化，在移植前24小时，用脂多糖(LPS，50ng/mL，Sigma Aldrich)和重组鼠源干扰素γ(IFNγ，20ng/mL，Peprotech)在超低附着烧瓶中极化细胞以产生经典活化的巨噬细胞(CAM)。对于AAM，用重组鼠源白细胞介素-4和白细胞介素-13(IL-4/IL-13，20ng/mL，Peprotech)极化BMDM。对于失活的巨噬细胞(DAM)，用重组鼠源白细胞介素-10(IL-10，10ng/mL，Peprotech)刺激BMDM，持续24小时。

源自人类单核细胞的巨噬细胞：基本上如前所述，用冷冻保存的CD14单核细胞分化出源自人类单核细胞的巨噬细胞(hMDM)(19)。简言之，将冷冻保存的母液快速解冻，并将其在超低附着烧瓶(Corning)中以2×10⁶个细胞/mL稀释于补充有10％FBS(v/v)、2mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素(500U/mL，500μg/mL)和100ng/mL人类重组CSF1(Miltenyi)的Iscove改良的Eagle培养基中。使细胞分化为巨噬细胞，持续7天，用含有1μg CSF1的10％培养基每两天更换培养基。在7天后，收获hMDM、计数、并铺板于含有人类重组细胞因子(Peprotech，详述如上)的CellCarrier平板上，以便得到CAM和AAM，或者将剩余的未刺激的hMDM(幼稚hMDM)用于吞噬作用测定(参见下文)。

APAP诱导的肝损伤和BMDM给予：所有动物实验均在英国内政部的程序和伦理指导下进行，并且由兽医独立审查实验设计。由Harlan(UK)提供野生型C57BL6雄性小鼠(10周龄)，并允许在清洁的动物设施中适应至少两周。将小鼠以五只/六只一组饲养在敞口笼中，并同步至12小时黑暗/光照循环，随意获取食物和水。在给予APAP之前，将小鼠禁食至少12小时。使小鼠接受单次注射(腹膜内)的溶于温盐水的APAP(350mg/kg)或单独的盐水。将CFSE染色的BMDM重新悬浮于Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液(DPBS)中，并在给予APAP后4小时或16小时，在气态异氟烷/氧气麻醉下通过尾静脉给予1×10⁶个细胞/100μL。在处死(cull)小鼠前1小时，用1mg 5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU，Sigma Aldrich)的PBS溶液脉冲(腹膜内)小鼠以标记增殖性细胞。在不断上升的CO2气氛中，通过窒息人道处死小鼠。通过心脏穿刺收集全血，并使其在4℃下凝结过夜以收集血清。收获肝脏组织，并将肝左外叶分成两片，并置于冷冻异戊烷浴中或用methacarn固定24小时。将剩余的肝脏和其它器官在福尔马林(4％多聚甲醛)中固定24小时，然后进行石蜡包埋。

体内细胞追踪：为了确认外周给予的移植细胞的肝定位，我们利用荧光成像。在移植之前，在体外用VivoTrack 680(近红外荧光成像剂，Perkin Elmer)染色BMDM。将BMDM(5×10⁶)与重新组成的VivoTrack(2mL)在4mL DPBS中孵育，并在室温下在黑暗环境中孵育15分钟，随后洗涤两次以除去过量的染料。在16小时时对健康的(DPBS处理的，腹膜内)或APAP治疗的小鼠进行成像。将小鼠麻醉，并用气态氧/异氟烷保持并剪掉毛皮，然后在背部位置以15分钟间隔采用PhotonIMAGER^TM(Biospace实验室)成像套件在687nm激发和722nm发射(487nm下背景校正)下拍摄纵向荧光图像。在5小时后，人道处死小鼠，并且将器官离体成像以确认AAM定位。在一些实验中，采用从组成型表达GFP的小鼠(20只)分化的BMDM以确认体外Vivotrack 680染色。

CFSE染色：基本上按照制造商的说明书，用CellTrace CFSE(ThermoFisher)对BMDM染色。简言之，将BMDM以1×10⁷个细胞/mL重新悬浮于DPBS中，并以50μM的终浓度在37℃的黑暗条件下与CFSE孵育20分钟。将细胞离心(400g，5分钟)，并以10×DPBS体积洗涤，并在37℃的黑暗条件下再次孵育20分钟。最后，将染色的细胞离心，并以1×10⁷个细胞/mL重新悬浮于DPBS中，并储存在冰上直至移植。

血清制备：允许血液在4℃下凝结过夜。通过连续离心获得血清。简言之，通过在1500g(5分钟，4℃)下离心以从血细胞中分离出血清，并移液到新的微管中。将血清再次离心(14000g，5分钟，4℃)以沉淀任何残留的血细胞和细胞碎片。将血清转移至新的微管中，并在-20℃下冷冻直至使用。

血清化学评估：通过测量丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素和血清白蛋白进行血清化学。采用商业试剂盒(AlphaLaboratories Ltd)由(21)描述的方法测定ALT。通过商业试剂盒(Randox Laboratories)测定AST和ALP。采用商业试剂盒(Alpha Laboratories Ltd)由Pearlman和Lee(22)描述的酸重氮方法测定总胆红素。采用商业血清白蛋白试剂盒(Alpha Laboratories Ltd)确定小鼠血清白蛋白测量值。所有试剂盒均适用于Cobas Fara离心分析仪(罗氏DiagnosticsLtd)。对于所有测定，内部运行精确度为CV<4％。在一些实验中，除了ALP活性之外，均通过血浆样品进行测定。

苏木精-伊红染色和坏死定量：在旋转超薄切片机上切割4微米肝脏组织切片，并收集在Surgipath高级粘合剂载玻片(Leica Biosystems)上，并在45℃下干燥过夜。在Shandon Varistain Gemini ES自动化组织切片染色机(ThermoScientific)上用苏木精和伊红将切片染色，并使用Shandon ClearVue盖片机(ThermoScientific)进行封固。对于坏死定量，使用电动载物台和Olympus BX51显微镜，采用Dotslide VS-ASW软件(Olympus)扫描载玻片以产生单个图像，并使用Olympus PlanApo 2X镜头和Olympus XC10照相机获取图像。使用FIJI的可训练的WEKA分割插件(23)分析图像(24，25)。确定识别坏死组织和活组织的各自分类器(classifer)，并将其应用于每个图像中的所有组织。

BrdU免疫荧光染色：在Superfrost^TMPlus载玻片上收集福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)块4微米的切片。将切片脱蜡并再水化，然后在柠檬酸钠(pH 6.0)缓冲液中加热诱导抗原修复。将切片在蛋白质溶液(Spring Bioscience，普莱森顿，加州)中封闭30分钟，之后与大鼠抗BrdU一抗(Abcam)或同种型对照大鼠IgG(Vector Laboratories)孵育30分钟。将切片用PBS充分洗涤，然后在黑暗环境中加入山羊抗大鼠IgG二抗(Alexa555缀合物)60分钟。用PBS再次洗涤切片，然后安装固封在含DAPI的G荧光封片剂和盖玻片中。将切片在Operetta高内涵成像系统(PerkinElmer)上成像，并基于DAPI阳性区域(细胞核)中含有546nm处信号的阳性细胞的百分数进行定量。对于共定位实验，使用Alexa488缀合物，用Hnf4a(山羊抗小鼠，Santa Cruz)和CD31(兔抗小鼠，Abcam)(在黑暗环境中孵育60分钟)进行双重染色。

量化血清和肝脏的促炎性细胞因子：基本上按照制造商的说明书，采用基于发光的V-plex促炎症组1(小鼠)试剂盒(Meso Scale Diagnostics)证实了促炎性细胞因子组(IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、KC/GRO、TNF-α)在小鼠血清或肝匀浆液中多元表达(multiplex)。对于肝匀浆液，使用Tissue Tearor匀浆器(BiospecProducts)，在冷裂解缓冲液(150mM NaCl、20mM Tris、1mM EDTA、1mM EGTA、1％Triton X-100(v/v)、2×蛋白酶抑制剂混合物)(Sigma Aldrich)中裂解75mg肝脏组织。将粗制匀浆液离心(20,000g，10分钟，4℃)以除去细胞碎片。采用二喹啉甲酸(BCA)测定方法确定上清液中的蛋白质浓度。对于量化细胞因子，向每个孔中加入25μL血清或100μg肝匀浆液，并与体积为50μL的稀释剂41混合，并在振荡板-混合器(600rpm)上孵育2小时。充分洗涤孔(PBS，0.05％吐温20v/v)，然后施加二抗混合物。在QuickPlex SQ 120分析仪(Meso ScaleDiagnostics)上测定板，并根据每种分析物的标准曲线的线性回归量化分析物。根据推荐，以一式两份测定标准物。由于较高的批内分析精确度和和大量生物重复，以单线态测定样品。

基因表达分析以确定在超低附着塑料上体外确定适当BMDM细胞因子诱导的极化：将BMDM以2.5×10⁵个细胞/孔接种在24孔塑料板或24孔超低附着板中。允许细胞在完全培养基(含有20ng/mL CSF1的DMEM:F12培养基)中贴壁过夜。除去培养基，并用含有和不含有适当细胞因子的DMEM:F12培养基替换(n＝3；参见上述方法)，持续48小时以驱动极化。按照制造商的说明书，采用RNeasy Mini试剂盒(天根)，从细胞获得RNA。采用Nanodrop ND-1000(Thermo Scientific)通过分光光度法量化RNA，并采用包括基因组DNA去除步骤的定量逆转录试剂盒(天根)进行逆转录。使用以384孔格式的QuantiTect SYBR GreenPCR试剂盒(天根)在罗氏Lightcycler 480II(罗氏，巴塞尔，瑞士)上量化基因表达。采用针对以下基因设计的市售Quantitect引物(天根)测量基因表达：iNos、Tnf、Mcp(用于CAM)、Ym1、Fizz、Mr、Arg1(用于AAM)和Il10(用于DAM；Il-10-BMDM)。以18S rRNA作为管家基因，采用2-ΔΔCT方法，测定相对于幼稚BMDM的相对表达。

对来自APAP处理小鼠的肝脏组织的促炎性基因表达分析进行的基因表达分析：称取约10mg冷冻肝脏组织，并使用组织匀浆机在900μLQiazol裂解试剂(天根)中匀浆。加入氯仿(200μL)，手动混合，并孵育(5分钟，室温)。在离心(12000g，15分钟，4℃)后，除去水相中的RNA，并用异丙醇沉淀。在乙醇洗涤后，使用无RNA酶的水将空气干燥的沉淀RNA重新悬浮。量化RNA，用DNA酶处理，如上所述进行逆转录。采用针对Csf1、Csf2、Csf3、Ccl2、Ccl3、Ccl5、Ccl7、Ccl12、Cxcl1、Cxcl2、Il-6、Tnf和Tgfβ的Quantitect引物(天根)用于基因表达分析。将Gapdh用作管家基因。

吞噬作用测定：采用未极化的BMDM(幼稚)、CAM或AAM以研究吞噬作用。将BMDM与凋亡的胸腺细胞(用1μM氢化可的松处理从3-5周龄的C57BL6小鼠收获的原代胸腺细胞，如前所述(26))一起孵育。按照制造商的说明书，采用CMTMR(Invitrogen)来标记凋亡的胸腺细胞(27)。用标记的凋亡细胞在37℃或4℃下以1:5的比例攻击BMDM 30分钟、1小时或2小时。洗涤细胞，并在用抗CD11b BV650(克隆M1/70；Ebioscience)和抗Ly6C V450(克隆HK1.4；Ebioscience)染色后，用流式细胞仪检测细胞的吞噬作用。将吞噬作用计算为CD11b+CMTMR+细胞在37℃下的百分数减去CD11b+CMTMR+细胞在4℃下的百分数。计算在37℃下的CD11b+CMTMR+细胞的门内的Ly6C+细胞的百分数。在相同条件下的相同门中计算CMTMR的平均荧光强度(MFI)。在LSRII Fortessa(BD Biosciences)上获得数据。

用于实时实验的吞噬作用测定：在用适当的细胞因子刺激小鼠BMDM或hMDM(参见上述的方法)以驱动极化之前，将其在96孔CellCarrier微孔板(PerkinElmer)中铺板(1×10⁵/孔)过夜。在成像之前，按照制造商的说明书，用NucBlue活细胞染色剂(ThermoFisher)和CellMask深红质膜染色(ThermoFisher)将BMDM染色。将平板转移至Operetta高内涵成像系统(PerkinElmer)并使其在37℃和5％CO₂下平衡。按照制造商的说明书，通过向孔中加入pHrodo绿色酵母聚糖生物颗粒(ThermoFisher)引发吞噬作用。在添加生物颗粒之前和在添加生物颗粒之后以5分钟的间隔(最多150分钟)在DAPI通道中以488nm和647nm采集荧光图像。以Columbus图像分析软件(PerkinElmer)量化图像。基于大于500的荧光强度(488nm)对吞噬作用阳性的巨噬细胞进行分类，并表示为所有活细胞(NucBlue阳性细胞)的分数。分数平均值取自每组四个独立的孔。

肝脏消化、白细胞分离和流式细胞术：为了检查体内移植的AAM的定位和表型，在APAP给药后16小时将CFSE染色的AAM或溶媒移植至小鼠。3小时后，利用静脉注射PKH26PCL(100μL，0.1mM)来攻击小鼠以标记吞噬细胞。在36小时时，将来自处死小鼠的血液收集于EDTA管中，并立即在Celltacα分析仪(日本光电)上进行血液学分析。通过离心(6000rpm，10分钟，4℃)从剩余血液中收集血浆并冷冻。按照先前描述的方法(15，28)经稍作修改来消化肝脏。简言之，用PBS灌注肝脏，并在APAP给药后36小时在冰冷的RPMI培养基中收集左外叶。用5ml肝脏消化酶混合物(胶原酶V，Sigma，0.8mg/mL；胶原酶D，罗氏，0.63mg/mL；分散酶，Gibco，1mg/mL；DNase 1，罗氏，100μg/mL)以手术刀机械破坏该肝左外叶。将匀浆物在37℃和240rpm的振荡培养箱中消化25分钟。将肝脏消化物穿过70μm过滤器，并用RPMI制成30mL。将消化物离心(300g，5分钟，4℃)，并在红细胞裂解处理(Sigma)之前进行洗涤。对细胞进行计数，并使用一组抗体染色以靶定细胞表面标志物，同时具有适当的对照(即，未染色的，减去荧光的)。通过用10％小鼠血清将细胞在4℃下孵育20分钟，然后与一抗组合(各自以1:200稀释度使用)在4℃下孵育20分钟来阻断非特异性抗体结合。采用了以下的缀合抗体：CD11b BV650(克隆M1/70；Ebioscience)、Ly-6C V450(克隆HK1.4；Ebioscience)、CD45.2AF700(克隆104；Ebioscience)、F4/80APC(稀释度1:100；克隆BM8；Invitrogen)、Ly-6G PE-Cy7(克隆1A8；Biolegend)、CD3PE-Cy7(克隆17A2；Biolegend)、NK1.1PE-Cy7(克隆PK136；Biolegend)、CD19PE-Cy7(克隆6D5；Biolegend)。按照制造商的方案，利用FixableViability Dye eFluor780(1:1000，Ebioscience)评估细胞活力。在抗体染色后，立即分析样品，或用BD Cell Fix(BD Bioscience)固定样品，然后在LSRII Fortessa(BDBiosciences)流式细胞仪上进行分析。采用FlowJo10软件(Tree Star)分析数据。

统计：除非另有说明，否则所有数据均表示为平均值±标准偏差。对于统计测试，对两组参数数据进行学生t检验，并且对两组非参数数据集进行Mann-Whitney U检验。对于包括多于一组的数据集，对参数数据集进行单向ANOVA。采用Shapiro-wilk检验以确定数据集是否是正态分布的。所有统计均在GraphPad Prism 6.0(GraphPad软件)中进行。

结果

在静脉内给药后立即追踪脾脏和肝脏BMDM：采用体内和离体成像技术来监测健康和APAP中毒的小鼠中BMDM的早期生物分布。为了监测肝脏定位，用或不用Vivotrack 680(红外荧光成像剂)标记BMDM，并(以5×10⁶，静脉内)移植至给予APAP后16小时的小鼠或健康对照。在最初的4小时内观察到健康的和APAP处理的小鼠的上腹部中的荧光信号呈几乎线性累积，表明在一个或多个腹部器官中逐渐定位(图1A，B)。BMDM对Vivotrack标记的耐受性很好，表明标记后的ATP水平没有显著降低(图1C)。此外，荧光显微镜显示，相对于仅在488nm处可见的未标记的细胞，GFP阳性的BMDM在Vivotrack标记性细胞后展示出强烈且均匀的红外荧光信号(图1D)。离体分析证实了在BMDM给药后4小时健康和APAP处理的小鼠中BMDM在肝脏和脾脏中的定位(图1E)。在可以作为静脉血通过的屏障的肺中也观察到大量信号。定量结果表明在健康小鼠的肝脏中定位程度较高，而在脾脏中定位相当(图1F)。最后，使用显微镜方法，在体外用CFSE(CellTrace，Life Technologies)将BMDM染色，在给予APAP后16小时移植，并在36小时时采集。使用针对FITC的基于DAB的免疫组织化学染色检测CFSE染色的细胞。在脾脏和肝脏的具有典型巨噬细胞形态的FFPE切片中检测到DAB阳性细胞(图1G)，但在肺、心脏或脑中没有检测出DAB阳性细胞(数据未显示)。在健康的和APAP中毒的动物中观察到肝脏和脾脏的BMDM定位，其中一些BMDM定位于坏死病变中，其通过中央静脉周围的弥散背景DAB染色可视化(图1G)。

AAM治疗减少APAP处理的小鼠中的坏死区域：为了测试BMDM治疗ALI的治疗性潜力，我们采用APAP诱导肝损伤的小鼠模型，其导致在给予APAP后约12小时达到肝损伤坏死峰值。仅在健康动物中进行的BMDM移植不会对临床化学过程中常规测量的循环性肝脏生物标志物造成任何显著扰动(图8)。我们测试了在给予APAP后不久(4小时)给予未处理的(幼稚)BMDM(1×10⁶，静脉内)是否会减少损伤。由给予APAP后24小时血清转氨酶并未降低证明，在给予APAP后4小时给予幼稚BMDM治疗并无治疗性效果(APAP/PBS vs APAP/BMDMs；ALT:6365±2955vs 10603±7974U/L,AST:6333±3138vs 7068±5584U/L)(图9)。此外，在BMDM治疗组中的两只小鼠表现出异常表型后，出于人道原因将其提前处死。因此，我们在给予APAP(1×10⁶，静脉内)后16小时的再生阶段期间移植BMDM。采用多种重组因子，在体外将BMDM极化为不同表型。在所有BMDM治疗组中，给予APAP后36小时时的血清ALT均略低(图2A，PBS：3800±1934U/L vs幼稚：2737±2020，CAM：2413±1222，AAM：2248±1196，DAM：2993±2182)，但没有达到统计学意义。由于血清转氨酶具有相对较长的循环半衰期并且可能仍然通过随后的损伤而升高，因此我们对在36小时时收获的肝脏组织进行苏木精和伊红染色。采用图像分析软件量化了由APAP引起的小叶中心坏死，将坏死区域表示为相对于所有肝脏组织的百分数。用AAM治疗的小鼠显示出坏死区域减少60％(图2B，P<0.03)。

APAP诱导的肝损伤后AAM治疗诱导实质和非实质增殖：我们在巨噬细胞疗法(给予APAP后36小时)后20小时测定肝脏中的BrdU掺入。在处死小鼠前1小时用1mg BrdU脉冲(腹膜内)小鼠以标记增殖性细胞。免疫荧光(IF)切片在高内涵成像系统上成像，并且通过与DAPI染色的细胞核共定位以忽略背景染色来确认BrdU阳性。IF分析显示在AAM疗法后肝脏中增殖性细胞增加至8.4倍(P<0.05)(图3A)。在用CAM治疗的小鼠中，增殖性细胞增加也是8.5倍(P＝0.03)，然而对于DAM不是如此，尽管也更高但没有达到统计学上的显著性。为了理解在AAM治疗的小鼠中增殖性细胞的特性，我们利用Hnf4a(肝细胞标志物)和CD31(内皮细胞标志物)进行双重染色。我们观察到大多数BrdU阳性细胞与Hnf4a共定位，与CD31密切相关的非实质细胞分布在中心静脉周围(图3B)。

循环性促炎性细胞因子组在APAP诱导肝损伤后的经极化巨噬细胞治疗的小鼠中较低：我们假定巨噬细胞减少损伤后的炎症反应以促进愈合。为了研究这一点，我们使用电化学发光技术测量了在36小时时收获的小鼠血清中的10种炎性细胞因子组(IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、KC/GRO、TNF-α)。一致地，AAM示出了促炎性细胞因子组显著减少(图4)，表现为IFN-γ(82％，P<0.01)、IL-12p70(73％，P＝0.02)、IL-6(75％，P<0.01)、CXCL1(36％，P<0.01)和TNFα(27％，P<0.01)减少。在用CAM(IFN-γ(88％，P＝0.03)、IL-6(80％，P＝0.01)、CXCL1(45％，P<0.01)和TNFα(39％，P<0.01))和DAM(IFN-γ(86％，P<0.01)、IL-6(64％，P＝0.01)、CXCL1(35％，P<0.01)、TNFα(23％，P＝0.02))治疗的小鼠中也观察到循环促炎性细胞因子减少。此外，用幼稚BMDM治疗的小鼠显示出一些促炎性标志物减少，尽管程度低于极化的等效物(IFN-γ(73％，P<0.01)、CXCL1(36％，P<0.01)、TNF(23％，P<0.01))。这些数据表明，在APAP中毒的再生阶段期间给予的巨噬细胞发挥了抗炎反应，特别是在用AAM治疗的小鼠中。

此外，我们通过qPCR测量了与炎症和/或修复有关的整个肝脏组织中的一组基因(Csf1、Csf2、Csf3、Ccl2、Ccl3、Ccl5、Ccl7、Ccl12、Cxcl1、Cxcl2、Il-6、Tnf和Tgfβ)的表达。这表明与溶媒对照相比，AAM治疗的小鼠中的促存活Csf1基因表达增加至平均2.3倍(P<0.01)(图6)。与此相一致，在同一动物组中，我们观察到唯一显著变化的是促炎性基因Cxcl1(至2.4倍，P<0.05)和IL-6(至5.8倍，P<0.05)减少。该数据解释了在多组间观察到的组织学差异(图3B)，其中仅AAM提供坏死区域显著减少。此外，促炎性细胞因子Cxcl1和IL-6的基因表达数据反映了循环性蛋白质水平谱(图5)。

AAM示出了体外吞噬速率和能力增加：我们测量了在体外极化为不同表型的BMDM的吞噬作用。在用荧光标记的凋亡胸腺细胞孵育经极化BMDM后，我们观察到在30分钟吞噬作用后更多AAM发生了吞噬作用的非显著性趋势(增加11％vs幼稚，增加7.3％vs M1)，但这种差异在60和120分钟之后稳定下来(图6A)。此外，与其它组相比，AAM在30分钟时的平均荧光强度(MFI)显著增加(增加21％vs幼稚，增加75％vs CAM，以直方图绘制数据)，并且在60分钟时相对于CAM巨噬细胞增加64％。在归一化至细胞数量之后，观察到AAM中的MFI较高(增加67％vs CAM)。测量了表达炎性标志物Ly6C(经典的炎性骨髓表面标志物)的BMDM的百分数。AAM具有显著降低的Ly6C阳性细胞百分数，在30分钟时减少22％vs幼稚、减少34％vsCAM，在60分钟时减少44％vs幼稚、减少52％vs CAM，以及在120分钟时减少61％vs幼稚、减少72％vs CAM(图6B)。

采用极化的BMDM来监测用酵母聚糖(酵母中存在的葡聚糖)包被的pH-敏感性荧光微珠的吞噬作用的实时吞噬作用测定。与流式细胞术分析一致，观察到随时间推移AAM中pHrodo阳性细胞百分数增加，其在接近90分钟时稳定(图6C)。提供了显示AAM与幼稚和CAM相比的吞噬速率和能力增加的代表性图像(图6D)。

AAM是高度吞噬的并且在体内保留抗炎表型：进行体内吞噬作用实验以表征移植后的AAM。在给予APAP后16小时，将CFSE标记的AAM移植(5×10⁶，静脉内)至小鼠。3小时后，用静脉注射给予PKH26(用于特异性标记吞噬细胞的红色荧光染料)来攻击小鼠以标记内源性和外源性巨噬细胞(参见图7A，用于研究设计)。在仅接受溶媒的小鼠中观察到总体组织学异常，其具有出血性坏死的点状区域的特征，而这在AAM治疗的小鼠中基本上不存在(图7B)。血清化学分析显示出AAM治疗的小鼠中血清转氨酶显著降低(ALT降低59％，AST降低75％)(图7C)。

观察到BMDM治疗的小鼠肝脏中浸润性炎性巨噬细胞百分数适度但统计学显著性降低(图7D)，其对应于这些炎性细胞中吞噬细胞增加的趋势(P＝0.08)。静脉注射移植后20小时，在肝脏和血液中都检测到移植的AAM，占在肝脏消化过程中收获的肝脏白细胞的约1％(图7E)。在移植的AAM中，检测到其中83％是Ly6Clo，证实这些细胞在体内保留了它们的抗炎表型(图7F)。测量了基于其Ly6C表达的吞噬PKH26的移植细胞的百分数。70％的Ly6Chi细胞和超过98％的Ly6Clo细胞是PKH26阳性，表明移植的AAM在原位具有高度吞噬作用。

讨论

APAP中毒到医院就诊的常见原因，每年在美国和英国具有数千人到急诊室就诊。治疗的主要内容包括早期的NAC给药(一种巯基供体)，以在广泛损伤发生之前提高肝脏的抗氧化能力。然而，这种解毒疗法的有效性在随后出现肝坏死可能已经建立的患者中显著降低。APAP中毒是美国ALF的主要病因，其中肝移植是唯一有效性的疗法。因此，临床上需要鉴定和开发用于治疗患有真正肝损伤的患者的新的治疗策略以降低ALF的风险。此外，加速从ALI中恢复并降低相关成本和临床支出的治疗方法也将是非常有益的。

我们测试了用于肝损伤(如ALI)的潜在细胞疗法。巨噬细胞参与体内凋亡细胞和坏死细胞两者的清除。然而，在APAP-ALI期间，KC(肝脏驻留巨噬细胞)耗竭会导致先天免疫缺陷(8)。先前已经研究了将巨噬细胞作为其它疾病适应症(包括糖尿病(30)、肾纤维化(31)、肺部疾病(32)和恶性肿瘤(33))的潜在细胞疗法，但尚未在肝损伤(如ALI)的背景下进行评估。由于潜在的凝血病，侵入性手术在APAP模型中是不实际的，但由于疾病的暴发性质，将治疗快速递送到损伤部位是必要的。因此，我们在健康和APAP中毒小鼠中在4小时内将BMDM静脉内(通过尾静脉)递送至肝脏和脾脏。我们观察到与健康对照相比，APAP处理的小鼠中BMDM植入减少。这可能是由于浸润的小生境或受干扰的肝脏微循环，这是APAP-ALI的标志(34)。在静脉注射之后，肺是细胞的另一个障碍，但巨噬细胞由于其相对小的尺寸而适合于外周给药。事实上，我们在给药后20小时没有在肺中观察到任何巨噬细胞，这表明在推注后肺定位是暂时的。然而，肺栓塞仍然具有安全隐患。因此，可以采用其它非侵入性给药途径，在健康小鼠中静脉注射给予1×10⁶BMDM似乎是安全的，将不会导致任何血液化学指数变化，并且在递送5×10⁶个细胞后不会改变APAP处理小鼠中的任何血液学参数(数据未显示)。

通过释放炎症调节因子和危险相关的分子模式(DAMP，例如HMGB1)，APAP-ALI期间的肝细胞死亡是先天免疫系统激活的引发事件(35)。先天免疫系统的不受控制的全身性激活可导致多器官衰竭和死亡，临床上被认为是SIRS，这是临床结果的关键性决定因素(7)。对我们的小鼠模型给药AAM会导致已知在人ALF期间升高的循环性促炎性细胞因子减少(36，37)。此外，在APAP-ALI中坏死物质的清除可能会延迟，因为在初始损伤期间内源性KC也会损失，导致肝脏先天免疫能力降低(8)。通过过继转移吞噬细胞来补充这种先天免疫能力可以限制从垂死细胞或肠源性病原体释放的炎症信号，以减少全身性炎症，并防止进展为ALF。巨噬细胞疗法对肝损伤的一种潜在安全问题是移植的巨噬细胞本身可能变为促炎性并且加剧炎症和损伤，然而，我们发现，一旦在培养中引发成为替代性活化的表型，移植的AAM将保留其体内抗炎症表型至少持续20小时(图7F)。

在APAP-ALI之后的肝再生是损伤消退的重要特征。我们发现APAP后36小时时增殖性细胞的数量增加至8倍，表明AAM疗法加速了再生反应。这表明AAM可以具有治疗多种肝损伤病因的效用。

双重染色揭示了增殖性细胞来源于肝细胞(Hnf4a阳性)和内皮细胞(CD31阳性)。小叶中心肝细胞是损伤的主要部位，因为这些CYP2E1阳性细胞产生APAP的毒性代谢物(N-乙酰基-对苯并醌亚胺(NAPQI))，其最终导致细胞死亡。然而，已知肝窦内皮细胞在APAP-ALI期间会受到干扰(38，39)。实质和血管系统的再生可能是在AAM介导的肝脏修复过程中的关键性机制。

在不希望受理论束缚下，我们假设AAM除去坏死物质是由于其极高的吞噬作用表型。CAM显示出吞噬能力减弱，也部分地减轻炎症并刺激增殖，尽管程度低于AAM。移植的BMDM可能会提供治疗性分泌蛋白组并递送营养因子以减少炎症或促进原位肝再生。

移植的BMDM在肝脏中的寿命可能是短暂的。以前的研究已经表明通过直接肝门静脉注射在纤维化肝脏中移植后的至少7天能够检测到移植的BMDM(18)。我们团队还采用SPION以检测BMDM，经由MRI表示其在健康小鼠中不超过3周(数据未显示)。这些细胞的瞬时性质可能有利于允许移植细胞在数周内被自然清除，从而允许肝脏恢复至其正常的生理状态。由于治疗性窗口可以在移植后的最初48小时内出现，因此该疗法的瞬时特性也不是问题。然而，如果需要，可以优化这种基于细胞的疗法的药代动力学以比较多轮BMDM给药，或者提供持续输注的BMDM以降低栓塞的风险。

APAP中毒是医学紧急情况，其可以导致ALF破坏性地快速进展。这与其它肝脏疾病(如肝纤维化)形成对比，其中可以在治疗之前和之后监测患者数周和数月，从而具有能够进行细胞收获、扩增、表征和再输注的时间。在ALI的紧急临床情况下，可以建立现有的巨噬细胞库，以便可以在重症监护病房中立即给予AAM。干细胞领域的巨大进步最近描述了源自人类诱导多能干细胞(iPSC)的巨噬细胞，其重现了主要等效物的生物学和功能(40-42)。可以预料到，源自这些细胞的AAM可代表活细胞疗法。

总之，我们已经表明，通过利用限定因子将BMDM极化为具有高度吞噬作用的表型，这些细胞可以用作刺激细胞增殖、减轻全身性炎症和改善肝损伤(例如，在APAP-ALI的再生阶段间)中的坏死病变的细胞疗法。AAM可以代表一种有前景的细胞疗法，其加速具有转化潜能的肝脏组织修复。

实施例2：源自小鼠胚胎干细胞的巨噬细胞(ESDM)

关键点：

·ESDM减轻肝损伤的鼠模型中的纤维化并刺激胆管反应，特征参见BMDM疗法。

·ESDM与组织驻留巨噬细胞具有一些相似之处，可能反映出其发展起源。

·ESDM重新填充已经采用脂质体氯膦酸盐使巨噬细胞耗竭的小鼠库普弗细胞区室。

·开发了一种新的活细胞成像技术来量化吞噬作用，我们用它证明了胚胎干细胞来源和骨髓来源的巨噬细胞的吞噬指数差异。

我们证明了可以在体外由小鼠ESC大规模地产生纯巨噬细胞群体，并且这些细胞在肝纤维化的鼠模型中具有体内修复能力。源自ESC的巨噬细胞可以与其源自骨髓的对应物在吞噬活性和关键功能标志物的表达方面区分开来，支持了最近表明源自PSC的巨噬细胞在发育方面与组织驻留巨噬细胞(包括库普弗细胞和朗格汉斯细胞(Langerhans cell))相关的研究(Buchrieser,J.,James,W.&Moore,M.D.Human Induced Pluripotent StemCell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-ResidentMacrophages.Stem Cell Reports 8,334-345)。我们显示源自ESC的巨噬细胞能够有效地重新填充肝脏的巨噬细胞耗竭的库普弗细胞区室，从而提供研究组织驻留巨噬细胞对组织修复作用的有效策略。

结果

源自胚胎干细胞的巨噬细胞和源自骨髓的巨噬细胞的比较

我们采用我们所公开的方法从胚胎干细胞(ESC)产生了巨噬细胞(Zhuang，L等人，Pure populations of murine macrophages from cultured embryonic stemcells.Application to studies of chemotaxis and apoptotic cell clearance.JImmunol Methods 385,1-14,doi:10.1016/j.jim.2012.06.008(2012))，并将它们的表型和功能直接与经典的源自骨髓的巨噬细胞(BMDM，原代巨噬细胞的黄金标准来源)进行了比较。简言之，ESC在CSF-1和IL-3存在下生长以形成胚状体(EB)。EB附着于组织培养塑料，并将非贴壁的巨噬细胞祖细胞释放到培养基中。收获这些细胞，并将其铺板于仅存在CSF-1的未处理Petri培养皿上。它们产生附着在塑料上并形成单层的巨噬细胞。源自胚胎干细胞的巨噬细胞(ESDM)和BMDM具有可比较的形态，但ESDM的大小略大于BMDM(图16A-C)。流式细胞术分析显示超过90％的ESDM对巨噬细胞标志物F4/80和CD11b呈双重阳性，并且在分化过程中(第10天至第20天)从不同时间点获得的细胞表现出细胞表面标志物可比较水平的表达(图16E，F)。相比之下，BMDM群体具有略低的F4/80和CD11b双阳性细胞百分数，表明在该方案中产生的BMDM比ESDM更加异质(图16D，F)。

为了比较ESDM和BMDM的吞噬活性，我们采用Operetta高内涵成像系统(PerkinElmer)开发了一种新的实时成像测定法，该系统是完全自动化的，因此消除了操作者偏离成像和分析的偏差。在该测定法中，采用了仅在酸性细胞内环境中发荧光的pH敏感性pHrodo^TM生物颗粒(Thermo Fisher Scientific)。该测定法允许我们实时量化生物颗粒的量和摄入速率。用深红质膜染料和NucBlue Live ReadyProbes试剂对细胞进行染色，将细胞与pHrodo^TM生物颗粒孵育，并采用Operetta高内涵成像系统每5分钟成像一次，持续2.5小时(图16G，H)。对于这两种细胞类型，观察到随时间推移发荧光的细胞的数量增加，但ESDM的吞噬率显著低于BMDM(图16I)。我们之前使用流式细胞仪的研究表明，BMDM与ESDM之间的吞噬活性没有显著差异，但这种敏感的实时策略已经发现了细微差异。

通过分别用LPS和IFNγ或IL-4处理ESDM和BMDM，将ESDM和BMDM体外引发，以采用M1或M2样表型。在LPS/IFNγ刺激后由BMDM和ESDM产生的一氧化氮(NO)显著增加，但ESDM的激活水平不如BMDM高(图17A)。这通过ESDM中的M1相关基因(iNos和Cd86)的较低表达水平得到证实(图17B，C)。相比之下，由M2相关基因(Arg1和Fizz1)的表达增加所评估的，ESDM对IL4的反应显著高于BMDM(图17D，E)。与BMDM相比，ESDM中的组织再生标志物(如Tweak、Mmp12和Mmp13)较低，而Mmp9的表达水平较高(图17F-I)。

我们采用了我们的新型成像策略来比较M1-和M2-极化的ESDM和BMDM的吞噬活性。对于这两种细胞类型，LPS-IFNγ刺激降低了吞噬作用的速率，而IL4增加了吞噬作用的速率，但是与BMDM的等同培养物相比，ESDM在其经刺激的培养物中具有较低的吞噬作用速率(图17J，K)。

总之，这些数据表明，ESDM的表型可以以与BMDM相当的方式进行改良，但是它们对极化的反应程度存在细微差别。

ESDM作为肝纤维化鼠模型中的有效细胞疗法

我们接下来测试了ESDM是否可以在肝损伤的鼠模型中具有治疗性效果。用四氯化碳CCl₄每周处理小鼠两次，持续四周，随机选择一部分以在第二周开始时静脉内接受10×10⁶或20×10⁶ESDM。在ESDM注射后21天处死小鼠，并处理肝脏用于免疫组织化学(图18A)。

先前已经显示出BMDM疗法可以改善纤维化，因此我们采用针对肝胶原的PicroSirius Red(PSR)染色以评估ESDM是否也对肝纤维化具有影响。在采用较低数量(10×10⁶)的ESDM时，对纤维化水平没有显著影响(图18B-D)，而当注射两倍数量的ESDM时，观察到PSR染色显著减少(图18E-G)。肌成纤维细胞数量下降是纤维化消退期间的关键事件，并且我们还注意到，用较高剂量的ESDM处理的小鼠中αSMA阳性的肌成纤维细胞的数量显著较低(图18K-M)。还将健康的未受损的肝脏进行染色和分析。

我们观察到，与受损肝脏对照相比，已经注射了ESDM的CCl₄受损肝脏中以PanCK染色为标记的肝胆管细胞数量显著更高(图19A-F)。在接受两种剂量的ESDM的动物中，PanCK阳性细胞明显具有更高的数量，与先前用BMDM观察到的效果一致(Bird,T.G.等人，Bonemarrow injection stimulates hepatic ductular reactions in the absence ofinjury via macrophage-mediated TWEAK signaling.Proc Natl Acad Sci U S A 110,6542-6547,doi:10.1073/pnas.1302168110(2013))。

总之，该项研究表明可以大规模地产生ESDM，并且它们具有通过降低肌成纤维细胞的密度和由此产生的胶原沉积来调节肝损伤作用的潜力。在这些实验中采用的ESDM的细胞数量是先前研究中用于BMDM的细胞数量的10倍。

ESDM具有与组织驻留巨噬细胞相比较的表型吗？

在体外源自ESC的造血细胞被认为与发育期间的卵黄囊中的原始造血波相关的血细胞更相关(Zambidis,ET,Peault,B,Park,TS,Bunz,F&Civin,CI 2005,'Hematopoieticdifferentiation of human embryonic stem cells progresses through sequentialhematoendothelial,primitive,and definitive stages resembling human yolk sacdevelopment'Blood,vol 106,no.3,pp.860-870.DOI:10.1182/blood-2004-11-4522)。已知组织驻留巨噬细胞源自原始造血波，其在胚胎中出现造血干细胞(HSC)之前就存在并在没有Myb(一种重要的HSC转录因子)的情况下能够发育(Schulz,C.等人.A lineage ofmyeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.Science 336,86-90,doi:10.1126/science.1219179(2012))。我们认为，我们在鼠源ESDM和BMDM之间观察到的细微差异可能与其来源而非其培养条件有关。我们通过证明与BMDM相比，ESDM中Myb和Ccr2的表达水平更低，而Pu.1更高来证实这一点(图20A-C)。因此，如果ESDM更像组织驻留巨噬细胞而不是循环性源自单核细胞的细胞，那么我们假设它们在重新填充用脂质体氯膦酸盐消融内源性驻留巨噬细胞后的肝脏的库普弗细胞区室上将更加有效。

我们首先证实，脂质体氯膦酸盐处理确实消融了常驻巨噬细胞群体，并且分析了在不同时间点的组织以确定添加外源性巨噬细胞的最佳时间。在脂质体氯膦酸盐处理后48小时，在肝脏切片中未观察到F4/80+巨噬细胞，表明在该时间点已经完全耗尽。当内源性循环性巨噬细胞开始重新填充组织时，在处理后72小时，明显发现一些F4/80+巨噬细胞(图20P)。

用CFSE细胞追踪染料(Molecular probes，Life Technologies)标记ESDM和BMDM，并在脂质体氯膦酸盐处理后48小时静脉内注射5×10⁶个细胞(图20D)。24小时后收集肝脏、肺脏、肾脏和心脏组织，并采用抗FITC抗体(其检测包含CFSE的所有荧光素衍生物)进行的免疫染色来检测被注射的CFSE染色的细胞(图20E-H，R)。在来自经脂质体氯膦酸盐处理的接受过任一BMDM或ESDM的小鼠的肝脏切片中检测到CFSE+细胞。图像的定量结果表明，与BMDM相比，注射了ESDM的小鼠肝脏中存在的CSFE+细胞显著更多(图20M)。通过量化基于DAB的检测方法以鉴定CSFE+细胞证实了该结果(图20I-L，N)。在肺组织中也检测到一些BMDM和ESDM，但是在氯膦酸盐处理的动物的肾脏和心脏中植入的细胞非常少(图20R)。

这些数据表明，与BMDM相比，ESDM重新填充库普弗细胞区室的能力更高。

进行血清分析以评估所进行的处理对小鼠肝功能的影响(图20O，P)。与PBS对照小鼠相比，在脂质体氯膦酸盐处理的小鼠中碱性磷酸酶(ALP)水平显著升高，表明肝损伤。与对照相比，接受ESDM的小鼠的ALP水平显著降低，表明ESDM具有一些修复作用。ESDM受体小鼠的血清白蛋白水平也与健康对照可比较。

然后，我们测试了源自经培养的胚胎干细胞的巨噬细胞是否可以重现原代巨噬细胞改善对乙酰氨基酚诱导的肝损伤的治疗性功效。我们通过在16小时时单次静脉内注射(5×10⁶个细胞)测试了在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤模型中鼠ESDM的治疗性性能。虽然我们观察到血清化学标志物没有显著差异(图21)，但是我们确实观察到如通过H+E染色评估的坏死区域显著减少(图24)。与BMDM类似，在利用IL-4/IL-13过夜极化ESDM后，其替代性活化的标志物的基因表达(Ym-1、Fizz、MR、Arg-1)表现出极高的动态转换，证实了这些信号传导通路在这些细胞中是完整的(图22)。此外，极化的ESDM显示出能够吞噬摄入凋亡物质(所提出的这些细胞在肝损伤模型中的治疗机制)：我们证明极化的ESDM可以在体外容易地吞噬荧光标记的凋亡胸腺细胞(图23)。最后，我们通过细胞追踪示出，类似于BMDM，ESDM在静脉注射后很快就会出现在肝脏和脾脏中(图25)。结果表明，ESDM在急性肝损伤的模型中具有类似于原代BMDM的治疗能力。

讨论

我们开发了实时成像测定法以评估巨噬细胞吞噬能力。这使我们不仅可以监测最终吞噬的颗粒数量，还可以监测巨噬细胞吞噬颗粒的速率。我们发现，未受刺激的ESDM不如BMDM那样快速吞噬生物颗粒或吞噬生物颗粒的量。此外，引发成M2样表型的ESDM和BMDM比引发成M1样表型的等效物吞噬更多的生物颗粒。

ESDM有助于肝纤维化的鼠模型中的纤维化消退

当移植20×10⁶个ESDM时，肝纤维化量显著减少，并且在递送ESDM后αSMA+肌成纤维细胞的数量减少至对照的50％。当移植10×10⁶个ESDM时，未观察到纤维化或肌成纤维细胞数量显著变化，表明该抗纤维化作用是剂量依赖性的。有趣的是，像BMDM一样，高剂量和低剂量的ESDM都刺激了胆管反应，如PanCK+祖细胞显著增加所证明的。这些数据证明，ESDM疗法可以通过诱导PanCK+胆管细胞增殖来有助于受损肝脏组织的再生，并且在高剂量下可以改善纤维化。据我们所知，这是证明ESDM在肝损伤模型中的治疗性效果的首次研究。

ESDM比BMDM在重新填充库普弗细胞耗尽的肝脏方面更有效

我们发现，相比于BMDM，ESDM表达更低水平的Myb和Ccr2以及表达更多的Pu.1，表明组织驻留巨噬细胞谱。因此，我们评估了在库普弗细胞耗尽的肝脏中ESDM和BMDM的体内再填充能力，以测试在该实验中ESDM是否比BMDM更有效。与BMDM受体相比，在ESDM受体中检测到的CFSE+移植细胞数量显著更高。这些结果表明，通过部分地重新填充库普弗细胞区室，ESDM比BMDM在小鼠中逆转脂质体氯膦酸盐处理效果方面更有效。这可能是由于ESDM的表型与BMDM相比，与组织驻留巨噬细胞更具可比性，或者它们具有增强的迁移至巨噬细胞耗尽组织的能力。

材料和方法

小鼠ESC维持和分化：将小鼠胚胎干细胞(ESC)系E14IV维持在如前所述的补充有10％胎牛血清(FCS)(Lonza)、2mM丙酮酸钠(Gibco)、4mM L-谷氨酰胺(Gibco)、1％非必需氨基酸(Gibco)和0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)和100U/ml白血病抑制因子(LIF)的格拉斯哥极限必需培养基(Gibco)中(Jackson,M.,Taylor,A.H.,Jones,E.A.&Forrester,L.M.Theculture of mouse embryonic stem cells and formation of embryoidbodies.Methods Mol Biol 633,1-18,doi:10.1007/978-1-59745-019-5_1(2010))。如前所述，将补充有15％L929调节的培养液和1ng/ml重组IL-3的相同培养基(不含LIF)(干细胞技术)(在本文中被称为分化培养基)用于产生巨噬细胞(Zhang等人)。简言之，将6×10⁵个ESC在分化培养基中悬浮培养以形成胚状体(EB)。在第8天，将EB铺板到凝胶化的组织培养皿上，然后隔天(从第10至第20天)从这些培养物中收获非贴壁细胞，然后铺板到含有不含IL-3的分化培养基的未处理的细菌性Petri培养皿上。这些单核细胞样细胞附着在塑料Petri培养皿上，形成单层，并成熟为源自胚胎干细胞的巨噬细胞(ESDM)。

源自骨髓的巨噬细胞：从鼠股骨和胫骨排出骨髓，将其培养在含有10％FCS、15％L929调节的培养液和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Sigma)的25cm²超低附着烧瓶(Corning)中，培养7天(在第4天时更换培养基)，然后通过收集所有贴壁细胞和非贴壁细胞来收获源自骨髓的巨噬细胞(BMDM)。

离心涂片和快速罗曼诺斯基(Romanowsky)染色：通过收获、计数和将1×10⁵个巨噬细胞重新悬浮在200μL PBS中来以准备进行巨噬细胞的离心涂片。用Thermo ShandonCytospin 4以300g将巨噬细胞进行细胞离心3分钟，并使其风干。按照制造商的说明书，采用快速罗曼诺斯基染色包(TCS Biosciences)以固定并染色细胞。将载玻片在水中短暂冲洗，空气干燥，并用Mowiol(Sigma)固封。

巨噬细胞极化：通过用LPS(0.1μg/ml)(Sigma L4391-1mg)和IFNγ(10U/ml)或IL-4(20ng/ml)分别处理贴壁的ESDM和BMDM 48小时来体外引发以采用M1或M2样表型。按照制造商的说明书，采用Griess试剂系统(Promega)测量培养上清液中的NO-水平。

流式细胞术：收获细胞、计数并将1×10⁶个细胞重新悬浮于含有1％牛血清白蛋白(BSA)的100μL PBS中。以最佳浓度添加预缀合的抗体，并在冰上孵育20分钟。随后以2mLPBS(含1％BSA)洗涤细胞，并以400g离心5分钟。将细胞沉淀重新悬浮于含有1％BSA的200μLPBS中。在大多数实验中，用活/死细胞活力染色剂(如DAPI或7-AAD)对细胞进行染色。采用了以下的抗小鼠抗体：抗-F4/80APC(BioLegend)、抗-CD11b Alexafluor 488(BioLegend)。采用了以下的抗人抗体：抗-CD93PE(eBioscience)、抗-25F9APC(eBioscience)、抗-CD11bAlexafluor 488(BioLegend)。

实时定量PCR(qRT-PCR)：采用ABI 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR，并用SDS软件1.4版(Applied Biosystems)进行分析。通过UPL测定法使用Taqman Fast Universal PCR Master混合物(2x)(Applied Biosystems)，该UPL测定法是在Universal Probe Library System Assay Design Center(罗氏)设计的(表1)。将ΔΔCt方法与GAPDH一起使用以归一化cDNA水平，并且每个实验的“对照”样品用作校准物以计算基因表达的相对变化。将所有数据表示为相对于校准物表达水平的变化倍数。

表1：引物序列

A用于小鼠巨噬细胞基因表达分析的qRT-PCR分析的引物

B用于人类巨噬细胞基因表达分析的qRT-PCR分析的引物

通过实时成像进行吞噬作用测定：在成像前三天将1×10⁵个巨噬细胞铺板在组织培养级96孔板(CellCarrier，PerkinElmer)中。用PBS洗涤细胞，向每个孔中加入100μlNucBlue Live Ready Probes试剂(Molecular Probes)(每1ml PBS两滴)，并在37℃下孵育20分钟。用PBS洗涤细胞，并按照制造商的说明书，用100μl/孔的Cell Mask^TM深红质膜染色剂(Molecular Probes)处理，并再孵育30分钟。吸出Cell Mask^TM试剂，并向每个孔中加入100μL PBS。将一小瓶pHrodo^TM绿色酵母聚糖A生物颗粒缀合剂(Molecular Probes)以0.5mg/mL重新悬浮于2ml PBS中，彻底涡旋并短暂超声处理，然后进一步以1:5稀释在PBS中。在成像之前立即向每个孔中加入100μL pHrodo^TM生物颗粒。在Operetta高内涵成像系统(Perkin Elmer)上以5分钟的间隔和40X放大倍数进行成像，并且以Harmony高内涵成像和分析软件(Perkin Elmer)分析图像。每个实验进行三次，包括3次技术性重复。

肝纤维化模型：通过每周两次(持续4周时期)腹膜内注射2μL/g CCl⁴(CCL₄:橄榄油为1:3)诱导8-10周龄129/SV小鼠(Harlan Laboratories)的肝损伤。随机选择小鼠以在第2周开始时使其接受静脉内注射ESDM或对照盐水(每组n＝5)，并在21天后处死小鼠。用盐水灌注肝脏，取出，并用福尔马林固定，并处理以便用于免疫组织化学。

脂质体氯膦酸盐介导的库普弗细胞耗竭：脂质体氯膦酸盐(5mg/mL)购自clodronateliposomes.org。将氯膦酸盐混悬液升温至37℃，并在注射前充分混合。将200μL脂质体氯膦酸盐或对照PBS(每组n＝5)注射至尾静脉。

免疫组织化学：将组织包埋在石蜡中，切割成4μm切片，并固定在载玻片上，并如所述进行免疫组织化学以检测αSMA、PanCK、CFSE和F4/80(Thomas,J.A.等人，Macrophagetherapy for murine liver fibrosis recruits host effector cells improvingfibrosis,regeneration,and function.Hepatology 53,2003-2015,doi:10.1002/hep.24315(2011)；Russo,F.P.等人，The bone marrow functionally contributes toliver fibrosis.Gastroenterology 130,1807-1821,doi:10.1053/j.gastro.2006.01.036(2006))(表2)。对于PSR染色，将切片脱蜡并再水合。用苏木精处理切片8分钟，然后用天狼猩红(Picro Sirius Red)处理1小时。随后用酸化水洗涤载玻片，脱水并固封。

表2：抗体的列表

A用于流式细胞术的抗小鼠抗体

B用于流式细胞术的抗人抗体

C用于免疫组织化学的抗体

为了量化PSR和αSMA染色，将40X图像(尼康Eclipse E600显微镜)平铺，并采用图像分析软件ImageJ量化阳性染色。为了量化PanCK染色，如所描述的，对每个样品的20个非重叠区域计数阳性细胞(Thomas J.A.等人，Macrophage therapy for murine liverfibrosis recruits host effector cells improving fibrosis,regeneration,andfunction.Hepatology 53,2003-2015,doi:10.1002/hep.24315(2011))。

统计分析：采用GraphPad Prism软件(版本6.0c)进行统计分析。将所有数据表示为平均值+平均值标准误差(SEM)。将p值小于0.05认为是统计学上显著的(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。采用以下的统计分析：非配对学生t检验和ANOVA。

源自鼠源胚胎干细胞的巨噬细胞：基本上如前所述(Zhuang等人，2012)，从鼠源E14小鼠胚胎干细胞系分化出纯的mESDMS群体(Handyman等人，1989)。简言之，用含有重组IL-3(1μg/mL)和含m-CSF(15％v/v)的L929调节培养液的GMEM培养ESC，培养8天，以产生非贴壁巨噬细胞祖细胞。在仅含有含m-CSF(15％v/v)的L929调节培养液的GMEM中，使巨噬细胞祖细胞成熟6-10天。之后，从超低附着烧瓶(Corning)收获mESDM，计数并在含重组鼠IL-4(20ng/mL)、IL-13(20ng/mL)和CSF1(20ng/mL)的GMEM中极化24小时。收集极化的ESDM，计数并用CFSE染色，然后注射到用对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝损伤的小鼠中(5×10⁶，静脉内)。

APAP诱导的肝损伤：在给予APAP之前，将小鼠禁食14小时。使小鼠接受单次注射的溶于温盐水的APAP(350mg/kg，腹膜内)或单独的盐水。将CFSE染色的ESDM重新悬浮于Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液(DPBS)中，并在给予APAP后16小时，通过尾静脉给予5×10⁶个细胞/100μL。在处死小鼠前1小时，用1mg 5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU，Sigma Aldrich)的PBS溶液脉冲(腹膜内)小鼠以标记增殖性细胞。处死小鼠，并通过心脏穿刺收集全血。在血液凝结后经由离心(14,000g，4℃)收集血清。收集肝脏组织，并在福尔马林中固定(20小时)或在干冰上冷冻并在分析前储存于-80℃下。

坏死定量：在旋转超薄切片机上切割4微米肝脏组织切片，并收集在Surgipath高级粘合剂载玻片(Leica Biosystems)上，并在45℃下干燥过夜。在Shandon VaristainGemini ES自动化组织切片染色机(ThermoScientific)上用苏木精和伊红将切片染色，并使用Shandon ClearVue盖片机(ThermoScientific)进行封固。对于坏死定量，使用电动载物台和Olympus BX51显微镜，以Dotslide VS-ASW软件(Olympus)扫描载玻片以产生单个图像，并使用Olympus PlanApo 2X镜头和Olympus XC10照相机获取图像。使用FIJI的可训练的WEKA分割插件分析图像。确定识别坏死组织和活组织的各自分类器，并将其应用于每个图像中的所有组织。

基因表达分析：为了在超低附着塑料上体外确认合适ESDM细胞因子诱导的极化，将ESDM以2.5×10⁵个细胞/孔接种在24孔塑料板或24孔超低附着板中。允许细胞在完全培养基(含有20ng/mL CSF1的DMEM:F12培养基)中贴壁过夜。除去培养基，并用含有和不含有适当细胞因子的DMEM:F12培养基替换(n＝3；参见上述方法)，持续24小时以驱动极化。按照制造商的说明书，采用RNeasy Mini试剂盒(天根)，从细胞获得RNA。采用Nanodrop ND-1000(Thermo Scientific)通过分光光度法量化RNA，并采用包括基因组DNA去除步骤的定量逆转录试剂盒(天根)进行逆转录。使用以384孔格式的QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(天根)在罗氏Lightcycler 480II(罗氏，巴塞尔，瑞士)上量化基因表达。采用针对以下基因(Ym1、Fizz、Mr、Arg1)设计的市售QuantiTect引物(天根)测量基因表达。以18S rRNA作为管家基因，采用2-ΔΔCT方法测定相对于幼稚ESDM的相对表达。

吞噬作用测定：将AAM与凋亡的胸腺细胞(用1μM氢化可的松处理从3-5周龄C57BL6小鼠收获的原代胸腺细胞，如前所述)一起孵育(30)。按照制造商的说明书，采用CMTMR(Invitrogen)标记凋亡的胸腺细胞(31)。在37℃或4℃下以1:5比率用标记的凋亡细胞攻击BMDM 30分钟、1小时或2小时。洗涤细胞，并在用抗-CD11b BV650(克隆M1/70；Ebioscience)和抗-Ly6C V450(克隆HK1.4；Ebioscience)染色后通过流式细胞术来验证吞噬作用。计算在37℃下的CD11b+CMTMR+细胞的门内的Ly6C+细胞的百分数。计算在相同条件下相同门中CMTMR的平均荧光强度(MFI)。在LSRII Fortessa(BD Biosciences)上获得数据。

用于ESDM定位的免疫组织化学：在旋转超薄切片机上切割4微米的肝脏和脾脏组织切片，收集于Superfrost Plus粘合剂载玻片(Thermo Fisher)上，并在45℃下干燥过夜。将载玻片在二甲苯中脱蜡并通过醇(100％-70％)再水化。通过在pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液中煮沸15分钟以进行抗原修复。通过在室温下与Bloxall(Vector)孵育15分钟来阻断内源性过氧化物酶活性。用PBS漂洗载玻片。通过在室温下分别与亲和素封闭液(Invitorgen)和生物素封闭液(Invitrogen)孵育15分钟来封闭内源性亲和素和生物素结合位点。每步之后用PBS漂洗载玻片。在室温下用蛋白质封闭液(Spring Bioscience)封闭非特异性结合1小时。用1:200抗体稀释剂(Invitrogen)稀释的抗-FITC一抗(Invitrogen，CAT#71-1900)孵育载玻片。将同种型对照抗体(Vector，1-1000)稀释在抗体稀释剂中以匹配一抗的蛋白质浓度。将载玻片在4℃下孵育过夜。用PBS漂洗载玻片。用1:500抗体稀释剂稀释的生物素化山羊抗兔二抗(Vector，BA-1000)孵育载玻片，并且在室温下孵育1小时。用PBS漂洗载玻片。在室温下用Vector RTU ABC试剂(Vector)孵育载玻片30分钟，以允许检测DAB。用PBS漂洗载玻片，然后在黑暗中在室温下用DAB试剂(Dako)孵育5分钟。用PBS漂洗载玻片。用Harris苏木精复染载玻片，然后短暂放入Scott自来水中。通过醇(70％-100％)将载玻片脱水，并在二甲苯中清洗。将载玻片封固在Pertex封固剂中，并采用配备有QImaging Retiga 2000R照相机的尼康Eclipse E600显微镜成像。

实施例3：源自人类iPSC的巨噬细胞

人类iPSC分化成巨噬细胞

为了将我们的工作扩展到人类研究，我们基于van Wilgenburg等人发表的工作(Efficient,long term production of monocyte-derived macrophages from humanpluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.PLoSOne 8,e71098,doi:10.1371/journal.pone.0071098(2013))优化了不含饲养细胞和血清的方案，以便从人类诱导的多能干细胞(iPSC)产生巨噬细胞。在室内产生人类诱导的多能干细胞系SFCi55，并证实其是多能的且具有正常的核型(Yang,C-T.,Ma,R.,Axton,R.,Jackson,M.,Taylor,H.,Fidanza,A.,Marenah,L.,Frayne,J.,Mountford,J&Forrester,L.M.(2016).Activation of KLF1Enhances the Differentiation and Maturation ofRed Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells.Stem Cells 10.1002/stem.2562)。将它们维持在StemPro培养基中，通过用StemPro补充物(Invitrogen)、1.8％BSA(Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)和20ng/ml人类碱性FGF(Invitrogen)补充含有Glutamax的DMEM/F12(Invitrogen)而制备所述培养基。将iPSC分化为巨噬细胞的方法改编自van Wilgenburg等人。在第0天，从6孔板的一个汇合孔中取出用过的培养基，并用补充有细胞因子混合物1(50ng/ml BMP4，50ng/ml VEGF和20ng/ml SCF)的2ml StemPro(ThermoFisher)替换。采用EZPassage^TM工具切割细胞，并且用巴斯德吸管轻轻移出。将它们平均分至超低附着6孔板(Corning)的两个孔中，并且向每个孔中加入2ml含有细胞因子混合物1的X-VIVO^TM 15培养基。将细胞悬浮培养3天(在第2天用细胞因子补足)，以制备胚状体(EB)。在第4天，EB增加，并将其转移到涂覆有明胶的组织培养级6孔板中，所述组织培养级6孔板含有补充有细胞因子混合物2(100ng/ml M-CSF、25ng/ml IL3、2mM Glutamax、1％青霉素/链霉素、0.055Mβ-巯基乙醇)的X-VIVO^TM 15培养基。每孔铺板约30个EB。将EB维持在该培养基中，持续该方案剩余的持续时间，每3-4天用新鲜的培养基替换用过的培养基。在大约2周后，EB在培养上清液中产生巨噬细胞祖细胞，收获这些细胞，并转移到10cm²细菌培养皿(包含补充有细胞因子混合物3(100ng/ml M-CSF、2mM Glutamax、1％青霉素/链霉素)的X-VIVO^TM 15培养基)中，并且允许成熟5-7天以成为源自iPSC的巨噬细胞(iPSC-DM)。可以每周收获巨噬细胞祖细胞两次，持续约2个月。

产生的源自人类iPSC的巨噬细胞(iPSC-DM)表达成熟巨噬细胞特异性细胞表面标志物25F9和CD11b两者(图18B)，但并不表达单核细胞标志物CD93(图26A)。源自iPSC的巨噬细胞还表达CD45、CD169、CD163、CD14、CD43、CD206、CD115、CD86、CXCR1、CCR2、CCR5和CCR8(图27和28)。在一小部分iPSC中存在低水平的VCAM和CD15(图27F，G)。iPSCDM不表达HLA-DR(图28D)。人类iPSC-DM对刺激物有反应，即在被LPS-IFNγ激活时M1相关基因CD40和CD80上调，而在应答IL4时M2相关基因TGM2和MRC1基因表达升高(图26C-F)。

在我们实时成像吞噬作用测定中，我们将幼稚的和极化的人类iPSC-DM与源自人类单核细胞的巨噬细胞(MDM)进行了比较。人类iPSC-DM与人类MDM具有相同的趋势，其中发现“幼稚”和IL4处理的巨噬细胞比LPS-IFNγ处理的巨噬细胞更具有吞噬作用(图26G，H)。然而，让人想起我们在小鼠ESDM中的观察结果，“幼稚”及极化状态下的人类iPSC-DM的吞噬作用均不如人类MDM，表明它们具有较少的炎性表型。

当将它们分别与小鼠BMDM和人类MDM直接比较时，发现它们的吞噬作用更低并且偏离抗炎表型。

实施例3-确定在注射至对乙酰氨基酚(APAP)诱导急性肝损伤(APAP-ALI)的小鼠后的替代性活化巨噬细胞的转录谱。

方法

除了在通过FACS(FACS ARIA II，BD Biosciences)分选后直接收集到裂解缓冲液(天根)中之外，如上从健康的和APAP中毒的小鼠的经消化的肝脏收集CFSE染色的AAM。细胞产量在4.3×10⁴-5.6×10⁵的范围内。按照制造商的说明书，采用QIAshredder柱(天根)将裂解物匀浆化。采用RNeasy微试剂盒(天根)获得总RNA，然后采用RT²PreAMP cDNA合成试剂盒(天根)进行预扩增。使用编目的RT²分析仪PCR Array(077ZG，天根)和罗氏Lightcycler480II PCR仪(384孔格式，罗氏)测定扩增的cDNA。使用GeneGlobe在线门户网站(天根)分析数据。所有样品均通过了数据质量控制标准。将C_T截止值设定为35。采用Actb、Gusb和Hsp90ab1的算术平均值进行归一化。通过绘制相对于p值(基于学生t检验计算，n＝3次重复)的倍数变化(2^-ΔCt)来生成火山图。处理组和对照组分别是来自APAP处理的小鼠的AAM和PBS处理的小鼠的AAM。

结果

分析的基因如下：C3、C3ar1、C4b、Ccl1、Ccl11、Ccl12、Ccl17、Ccl19、Ccl2、Ccl20、Ccl22、Ccl24、Ccl25、Ccl3、Ccl4、Ccl5、Ccl7、Ccl8、Ccr1、Ccr2、Ccr3、Ccr4、Ccr7、Cd14、Cd40、Cd40lg、Cebpb、Crp、Csf1、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl11、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl5、Cxcl9、Cxcr1、Cxcr2、Cxcr4、Fasl、Fos、Ifng、Il10、Il10rb、Il17a、Il18、Il1a、Il1b、Il1r1、Il1rap、Il1rn、Il22、Il23a、Il23r、Il5、Il6、Il6ra、Il7、Il9、Itgb2、Kng1、Lta、Ltb、Ly96、Myd88、Nfkb1、Nos2、Nr3c1、Ptgs2、Ripk2、Sele、Tirap、Tlr1、Tlr2、Tlr3、Tlr4、Tlr5、Tlr6、Tlr7、Tlr9、Tnf、Tnfsf14、Tollip、Actb、B2m、Gapdh、Gusb、Hsp90ab1和Hsp90ab1。

从图29中可以看出，AAM通常保留其抗炎表型，其中经分析基因的95％在APAP处理的小鼠和PBS处理的小鼠之间未发生改变。因此，结果表明AAM在促炎环境中保留其M2表型。

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Claims

1.一种替代性活化的巨噬细胞，其用于在治疗肝损伤中使用。

2.根据权利要求1使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中所述肝损伤是急性肝损伤。

3.根据权利要求1或权利要求2使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中所述肝损伤是由使用一种或多种选自由以下所组成的组的药物导致：对乙酰氨基酚、克拉霉素、他汀类、烟酸、胺碘酮、甲氨蝶呤、异烟肼、呋喃妥因、沃格孟汀、阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、吡罗昔康、萘丁美酮、双氯芬酸、他克林或双硫仑。

4.根据权利要求3使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中所述药物是对乙酰氨基酚。

5.根据权利要求3或权利要求4使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中在使用所述一种或多种药物后10小时给予所述替代性活化的巨噬细胞。

6.根据前述权利要求中任一项使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中通过用IL-4、IL-13、CSF-1或其任何组合将巨噬细胞极化而获得所述替代性活化的巨噬细胞。

7.根据权利要求6任一项使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中所述巨噬细胞是源自骨髓的巨噬细胞。

8.根据前述权利要求中任一项使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中所述替代性活化的巨噬细胞相对于患有肝损伤的受试者是自体同源的。

9.根据权利要求1至6中任一项使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中所述替代性活化的巨噬细胞源自多能干细胞，如诱导的多能干细胞或胚胎干细胞。

10.根据前述权利要求中任一项使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中将所述替代性活化的巨噬细胞配制用于静脉内给药或输注。

11.根据前述权利要求中任一项使用的所述替代性活化的巨噬细胞，其中以1×10⁷至1×10⁹个细胞的剂量提供所述替代性活化的巨噬细胞。

12.一种预防或治疗受试者中肝损伤的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的替代性活化的巨噬细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肝损伤是急性肝损伤。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者已经服用或被怀疑服用过量的一种或多种选自由以下所组成的组的药物：对乙酰氨基酚、克拉霉素、他汀类、烟酸、胺碘酮、甲氨蝶呤、异烟肼、呋喃妥因、沃格孟汀、阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、吡罗昔康、萘丁美酮、双氯芬酸、他克林或双硫仑。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述药物是对乙酰氨基酚。

16.根据权利要求14所述的方法，其中在服用所述药物后至少10小时给予所述替代性活化的巨噬细胞。

17.根据权利要求12所述的方法，其中通过用IL-4、IL-13、CSF-1或其任何组合将巨噬细胞极化而获得所述替代性活化的巨噬细胞。

18.根据权利要求12所述的方法，其中所述巨噬细胞是源自骨髓的巨噬细胞。

19.根据权利要求12所述的方法，其中所述替代性活化的巨噬细胞相对于患有肝损伤的受试者是自体同源的。

根据权利要求12所述的方法，其中所述替代性活化的巨噬细胞源自多能干细胞，如诱导的多能干细胞或胚胎干细胞。

20.根据权利要求12所述的方法，其中给药是静脉内给药。

21.根据权利要求12所述的方法，其中以1×10⁷至1×10⁹个细胞的剂量提供所述替代性活化的巨噬细胞。