CN103977029A

CN103977029A - 经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用

Info

Publication number: CN103977029A
Application number: CN201410144390.XA
Authority: CN
Inventors: 秦鸿雁; 马鹏飞; 窦科峰; 韩骅
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2014-04-11
Publication date: 2014-08-13

Abstract

本发明涉及一种经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用，其特征是：该经典激活的巨噬细胞在治疗和制备肝纤维化药物中的应用。本发明的M1型巨噬细胞本身高表达的基质金属蛋白酶（MMPs）分子，回输后募集自体巨噬细胞进入肝脏并分泌大量MMPs，二者协同作用，加速胶原纤维的降解，减轻肝纤维化。M1型巨噬细胞对肝纤维化有较好的治疗作用，为临床治疗肝纤维化-肝硬化提供了新的有效方法。

Description

经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用

技术领域

本发明属于肝纤维化治疗领域，涉及巨噬细胞极化、细胞治疗领域。具体涉及一种经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用。

背景技术

肝纤维化由各种持续的慢性肝损伤导致，其渐进性发展最终可形成肝硬化，甚至诱发肝癌，严重威胁着人们的生命健康。针对晚期肝硬化的有效治疗手段十分有限，但有效的治疗可以逆转肝纤维化，甚至恢复肝脏正常的结构和功能。因此，探索有效的肝纤维化治疗方法具有重要的意义。针对肝纤维化的细胞治疗具有重要的临床应用前景。目前，国内外很多学者研究细胞移植对肝纤维化的治疗作用，所采用的细胞多为骨髓细胞、造血系统干细胞、间充质干细胞等。自体细胞移植具有无免疫排斥、获取方便和来源充足等优点，已成为最具前景的肝纤维化治疗方法之一。研究表明在肝损伤后骨髓来源的干细胞能募集到肝脏，分化成为肝细胞等，对肝纤维化-肝硬化有一定的治疗作用。采集患者外周血单个核细胞进行自体回输，能够有效缓解病人肝硬化症状，延长生存时间，具有较好的治疗效果。然而骨髓细胞是一群异质性细胞，其中的哪些细胞成分对肝纤维化起到治疗效果存在争议。James等利用单一细胞成分——巨噬细胞治疗肝纤维化，发现巨噬细胞治疗明显降低小鼠肝纤维化水平，改善小鼠的肝脏功能，为肝纤维化的治疗提供了新的思路。

巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞。在肝纤维化的发展过程中，巨噬细胞发挥着双刃剑的作用。一方面，活化的巨噬细胞分泌大量细胞因子，导致肝星形细胞激活并合成分泌大量胶原纤维；另一方面，巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶类(MMPs)，降解胶原纤维，诱发肝星形细胞凋亡，使肝纤维化消融缓解。提示纤维化过程中，巨噬细胞的功能复杂多样，具有一定的异质性。大量研究表明，活化的巨噬细胞可分为经典激活的M1型巨噬细胞和选择性激活的M2型巨噬细胞。二者对肝纤维化的作用不同，分别具有抗纤维化和促进纤维化的作用。

鉴于巨噬细胞的异质性和不同极化类型的巨噬细胞对肝纤维化的不同作用，体外极化诱导后的巨噬细胞有望成为对肝纤维化具有更好疗效的细胞类型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用，为临床治疗肝纤维化-肝硬化提供了新的有效方法。

为实现上述本发明目的，本发明的技术方案是：经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用，其特征是：该经典激活的巨噬细胞在治疗和制备肝纤维化药物中的应用。

所述的经典激活的巨噬细胞是由细胞因子LPS和 IFN-γ联合刺激诱导而成。

所述的经典激活的巨噬细胞即：M1型巨噬细胞，是由100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ诱导24小时得到。

本发明的有益效果是：M1型巨噬细胞本身高表达的基质金属蛋白酶（MMPs）分子，回输后募集自体巨噬细胞进入肝脏并分泌大量MMPs，二者协同作用，加速胶原纤维的降解，减轻肝纤维化。M1型巨噬细胞对肝纤维化有较好的治疗作用，为临床治疗肝纤维化-肝硬化提供了新的有效方法。

下面结合实施例及实施例附图对本发明作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1 A是光镜下分化成熟的巨噬细胞的形态观察（左10×，右20×）；

图1 B是 FACS检测培养第7天的细胞；

图2 是实时定量PCR检测巨噬细胞极化相关标志物的表达变化；

图3A(a)是天狼星红染色（10×），图3A(b)胶原沉积面积统计；

图3B是肝脏组织中Hyp含量的统计；

图3 C(a)是 α-SMA的免疫组化染色（40×），图3 C(b)是其统计结果；

图3 D是回输4周后小鼠血清白蛋白（Alb）水平的统计结果；

图4 A 是不同极化类型巨噬细胞MMPs分子mRNA表达水平；其中，a为MMP-2，b为MMP-9，c为MMP-13；

图4 B 是不同极化类型巨噬细胞中趋化因子mRNA的表达水平；

图4 C是肝脏组织切片F4/80染色（40×）及细胞数目统计结果，其中，图4C(a) 是肝脏组织切片F4/80染色（40×），4C(b) 是细胞数目统计结果；

图4 D是回输1d后小鼠肝脏组织MMPs的表达；其中，a为MMP-2，b为MMP-9，c为MMP-13；

图4 E是回输后1周内尿液中Hyp含量统计结果。

具体实施方式

1、小鼠骨髓来源巨噬细胞的培养及极化诱导

选取健康成年雄性C57/B6小鼠，完整取出股骨和胫骨。用1×PBS冲长骨骨髓腔，获得细胞，反复轻柔吹打，以红细胞裂解液去除红细胞。得到单细胞悬液，均匀种入10cm皿中，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液培养过夜（16h为宜），以除去贴壁速度较快的基质细胞如纤维细胞等。次日，收集未贴壁细胞，均匀种植于培养皿中，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液培养，加入GM-CSF，使其终浓度为40ng/ml，刺激骨髓细胞向单核巨噬细胞分化。于培养第4天半量换液，并补充GM-CSF。于培养7天后即可成功诱导巨噬细胞。光镜下观察贴壁细胞形态（如图1A），并用流式细胞术鉴定细胞（图1B）。图1为培养成熟的巨噬细胞光镜表型和流式细胞术鉴定结果。其中图1A示细胞形态符合巨噬细胞表型，图1B示培养第7天巨大多数细胞表达巨噬细胞分子标志。

细胞因子LPS联合IFN-γ刺激巨噬细胞向M1型极化，而IL-4刺激巨噬细胞向M2型极化。骨髓来源的巨噬细胞培养成熟后，直接向细胞培养液中加入LPS和IFN-γ使终浓度分别为100 ng/mL和20 ng/mL；或者加入IL-4 使终浓度为20 ng/mL，进行极化诱导刺激24 h，即可得到M1或M2型巨噬细胞。实时定量PCR检测两类细胞中极化相关标志分子的表达以鉴定所得细胞，结果如图2。图2为不同极化类型的巨噬细胞表型的鉴定，如图示，经LPS+IFN-γ刺激后的巨噬细胞iNOS、IL-12、TNF-α mRNA水平明显升高，而Arg-1、Ym1和MR分子表达水平降低，符合M1型巨噬细胞特征（即本发明的经典激活的巨噬细胞）。

2、肝纤维化小鼠模型

选择8周龄的健康雄性C57/B6小鼠进行造模。从小鼠的左下腹部进针，腹腔内注射100 μL四氯化碳溶液（含15 μL CCl₄和85 μL橄榄油，并充分混匀），对照组小鼠每只注射100μL橄榄油。注射后，用棉球按住针孔以防漏出，并轻柔按摩腹部片刻，使药物均匀分布。每周腹腔注射2次，持续4周，细胞治疗后继续注射4周。

3、巨噬细胞回输治疗

将已经极化诱导成功的巨噬细胞（M0、M1、M2）和等量1×PBS从小鼠尾静脉回输。其中，各组细胞悬液浓度均为1×10⁷个/mL PBS，每只小鼠给予100μL细胞悬液。于巨噬细胞回输2d后，各组继续给予腹腔CCl₄注射4周。并于第16次给药2d后，获取小鼠组织、血液标本进行治疗效果的评估。

效果评估内容：

1）肝脏组织天狼星红染色评估肝脏胶原沉积。图3为M1型巨噬细胞回输后肝纤维化的水平评估。图3A为天狼星红染色及统计结果，如图3A示M1型巨噬细胞回输组小鼠仅在肝小叶周边出现较少的纤维胶原沉积，小叶内很少有红染的纤维组织出现，纤维化程度最轻。统计学分析结果示M1组胶原沉积面积最小。

2）肝脏组织羟脯氨酸（Hyp）测定评估肝脏胶原含量。图3B为小鼠肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量测定统计结果显示， M1回输组小鼠肝脏中Hyp含量显著低于其它3组。

3）肝脏组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫化学染色评估肝脏活化星形细胞数量。图3C为α-SMA免疫组化及统计结果，如图3C示M1组活化的HSCs数量少于其它3组，有统计学意义。提示，M1型巨噬细胞回输后，HSCs激活和增殖减少或者活化HSCs的凋亡增加，合成和分泌胶原纤维的细胞减少。

4）血清白蛋白测定评估肝功能。如图3D示M1组小鼠血清白蛋白水平高于PBS、M0、M2组。提示，M1型巨噬细胞回输后，不仅有纤维化的减轻，肝细胞的再生增加或者肝细胞的凋亡坏死减少，从而使的肝功能好转。

上表是各实验组肝纤维化评价指标的结果，提示，M0型巨噬细胞回输对小鼠肝纤维化有一定的治疗效果，但是M1型巨噬细胞回输对纤维化的治疗效果更加显著，而M2型巨噬细胞几乎对纤维化无治疗作用，因此，经典活化的M1型巨噬细胞是更加理想的治疗肝纤维化的细胞类型。

5）统计学处理：采用Image Pro V6.0软件进行形态学结果的定量分析，采用Graphpad V4.0 软件进行数据的统计分析与作图。图4为M1型巨噬细胞回输治疗作用的机制探讨。图4A示M1型巨噬细胞高表达MMPs分子；图4B示M1型巨噬细胞高表达巨噬细胞趋化因子配体；图4C示M1型巨噬细胞回输组小鼠肝脏中有更多自体巨噬细胞的募集；图4D示M1型巨噬细胞回输后小鼠肝脏高表达MMPs分子；图4E示M1型巨噬细胞回输后小鼠尿液中Hyp含量最高，提示其胶原降解最多。综上，说明M1型巨噬细胞通过自身高表达MMPs分子和其回输后招募的巨噬细胞表达MMPs分子，增加肝脏胶原纤维的降解，这可能是其治疗肝纤维化的机制之一。

上述利用经典激活的巨噬细胞回输治疗小鼠肝纤维化模型的实验证明，经典激活的巨噬细胞能够有效的缓解小鼠肝纤维化，改善小鼠肝功能，对肝纤维化有较好的治疗效果。因此，该经典激活的巨噬细胞能够应用于治疗和制备肝纤维化药物。

本发明的优点：

1.骨髓来源巨噬细胞培养与极化诱导方法简单易行，获取方便。

2.为肝纤维化-肝硬化的临床细胞治疗提供了新的思路。

本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索到，这里不一一叙述。

Claims

1.经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用，其特征是：该经典激活的巨噬细胞在治疗和制备肝纤维化药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用，其特征是：所述的经典激活的巨噬细胞是由细胞因子LPS和 IFN-γ联合刺激诱导而成。

3.根据权利要求2所述的经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用，其特征是：所述的经典激活的巨噬细胞即：M1型巨噬细胞，是由100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ诱导24小时得到。