CN102399741A - 逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液、方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液、方法及用途。本发明提供的逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液是由多种植物提取物与蛋白混合组成的皮肤，可以将人的体细胞逆向诱导分化，在2周内产生几百亿数量级别的造血干细胞，并且这种植物和蛋白诱导性造血干细胞具有与人自然造血干细胞类似的细胞特异表型，不仅具有多种疾病治疗和抗衰老保健的应用潜力，而且适用于建立新型的造血干细胞库，长期永久保存自体造血干细胞。与现有的脐带血/骨髓/周围血干细胞库相比较，这种新型的自体造血干细胞具有生产/保存干细胞数量大，干细胞质量可监测性好，应用领域广等优势。

Description

逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液、方法及用途
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液、方法及用途。
背景技术
几十年来，造血干细胞在临床上应用于血液系统疾病的治疗，被证明是治疗恶性血液疾病的有效方法。造血干细胞还被证明具有横向分化能力，具有分化形成骨细胞、神经细胞和心肌细胞等多种细胞的潜能。所以，自体造血干细胞还被广泛应用于再生医学和修复医学领域的多种疾病的再生性修复治疗。
由于异体或异种干细胞移植会不可避免地产生免疫排斥反应，自体干细胞已经成为现代生命科学发展的最重要的领域之一。人和动物出生后，机体内存留的造血干细胞数量极其稀少。因此，自体干细胞的来源困难和生产数量不足，一直是困扰着现代再生医学和自体组织器官工程的进一步发展。如何获得巨额数量的自体造血干细胞是当前国际干细胞疾病治疗的一个重大技术瓶颈。
近年来，应用基因重组技术已经证明，体细胞可以被重新编码而逆向分化，产生被称为诱导性自体多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS干细胞)，为自体干细胞的生产技术提供了新的途经。因此，利用体细胞逆向分化产生自体多能干细胞已经成为干细胞技术研发的热点。
目前造血干细胞的来源可分为三类：骨髓造血干细胞，动员周围血干细胞和脐带血干细胞。骨髓造血干细胞和动员周围血干细胞一般有核细胞数只达到5-10x108/Kg，CD34+细胞只达到1-5x106/Kg；80ml脐带血干细胞数量更少，CD34+细胞只达到1-5x106。研究显示，在非血液病领域的疾病和创伤的修复治疗中，造血干细胞的用量与组织器官疾病及损伤修复的效果大小成正相关。以上三种造血干细胞的数量，还远远满足不了重大实质性组织器官疾病，如心脏病、大脑神经疾病和损伤、肝病、肾衰竭等等疾病的再生和修复治疗的需要，其疗效明显不足。
因此，还有必要研究和开发出新的造血干细胞来源。
发明内容
体细胞是干细胞顺向分化产生的，具有某些具体功能的子代细胞。体细胞的染色体DNA和干细胞的染色体DNA在基因结构和基因的数量上并不存在差异。体细胞和干细胞之间的最主要的差别可能只是某些功能基因处于不同的活性表达状态。功能基因表达的差异决定了细胞的具体功能和形态的差异。我们推测，干细胞向体细胞顺向分化的程序启动后，干细胞本身的干细胞特性决定基因的开关就被关闭，随后，干细胞就分化形成了具有某种特定功能的体细胞；换句话说，在体细胞染色体DNA序列中仍然存在造血干细胞特性决定基因，例如CD34基因、ABCG2基因和CD133基因等，这些基因只是处于关闭或静止状态。利用某些物质打开体细胞DNA序列中的造血干细胞特性决定基因CD34、ABCG2和CD133等基因开关，这些体细胞就可能重新逆向分化而形成新的造血干细胞。
因此，本发明的目的是提供一种用于逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液。
本发明的另一个目的是提供一种逆向分化体细胞产生造血干细胞的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种用于逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液，所述培养液为在RPMI1640培养基中添加以下成分：当归提取物10～100mg/ml、人参提取物10～100mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-276325～30μM、干细胞因子5～30ng/ml、白细胞介素-3 5～30ng/ml、白细胞介素-6 5～30ng/ml、白细胞介素-11 5～30ng/ml；优选地，所述培养液中还包括水蛭提取物80～120mg/ml。
优选地，所述培养液为在RPMI 1640培养基中添加以下成分：当归提取物50mg/ml、人参提取物50mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632 10μM、干细胞因子10ng/ml、白细胞介素-3 10ng/ml、白细胞介素-6 10ng/ml、白细胞介素-11 10ng/ml；优选地，所述培养液中还包括水蛭提取物100mg/ml。
此外，本发明还提供了上述培养液在逆向分化体细胞产生造血干细胞中的用途。
另一方面，本发明提供一种逆向分化体细胞产生造血干细胞的方法，所述方法包括采用上述培养液培养体细胞，使其逆向分化产生造血干细胞。
优选地，所述方法包括以下步骤：1)用添加以下成分的RPMI 1640培养基培养体细胞48-72小时：当归提取物10～100mg/ml、人参提取物10～100mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632 5～30μM、干细胞因子5～30ng/ml、白细胞介素-3 5～30ng/ml、白细胞介素-6 5～30ng/ml、白细胞介素-11 5～30ng/ml；2)换用添加以下成分的RPMI 1640培养基培养6-9天：当归提取物10～100mg/ml、人参提取物10～100mg/ml、水蛭提取物80～120mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-276325～30μM、干细胞因子5～30ng/ml、白细胞介素-3 5～30ng/ml、白细胞介素-6 5～30ng/ml、白细胞介素-11 5～30ng/ml。
优选地，所述方法包括以下步骤：1)用添加以下成分的RPMI 1640培养基培养体细胞48-72小时：当归提取物50mg/ml、人参提取物50mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632 10μM、干细胞因子10ng/ml、白细胞介素-3 10ng/ml、白细胞介素-6 10ng/ml、白细胞介素-11 10ng/ml；2)换用添加以下成分的RPMI 1640培养基培养6-9天：当归提取物50mg/ml、人参提取物50mg/ml、水蛭提取物100mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632 10μM、干细胞因子10ng/ml、白细胞介素-3 10ng/ml、白细胞介素-6 10ng/ml、白细胞介素-11 10ng/ml。
优选地，所述步骤1)和2)的培养条件如下：5％CO2和37℃。
优选地，所述方法还包括用DMEM培养液在逆向分化体细胞之前培养体细胞的步骤；更优选地，所述培养条件为：细胞密度2-5x106/ml，5％CO2，37℃，培养24-48小时。
优选地，所述方法还包括检测逆向分化体细胞产生的造血干细胞的步骤；更优选地，所述检测方法为：以CD34、ABCG2和/或CD133作为特异细胞表型检测指标，采用流式细胞仪、细胞免疫荧光技术和/或Westernblot蛋白印迹技术进行检测。
优选地，所述方法还包括冷冻保存逆向分化体细胞产生的造血干细胞的步骤；更优选地，所述冷冻保存方法为：将造血干细胞以1x1010/ml的细胞密度与二甲基亚砜混合，以10％二甲基亚砜和10％低分子右旋糖酐浓度降温至-80℃，然后转移到-186℃液氮中深低温保存。
优选地，所述方法中，体细胞选自：血液单个核细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等。具体地，所述体细胞的来源包括：脐带血；胎盘；细胞专业公司商品化提供的非永生化人的各种体细胞株；细胞专业公司商品化提供的永生化人的各种体细胞株；常规血库保存的血液和白细胞悬液；新鲜分离制备的人的皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞等；因手术切除而废弃的部分健康组织器官，如脑、肌肉、肝、脾、肾、骨、和脂肪组织等。
此外，本发明还提供了上述方法制备的造血干细胞或造血干细胞库。
本发明还提供了上述造血干细胞作为种子细胞和再生修复细胞，在制备用于再生医学/修复医学领域的疾病和损伤；恶性血液病；抗衰老保健的药物中的用途；优选地，所述再生医学/修复医学领域的疾病和损伤选自：缺血性心脏病、糖尿病、脑出血、脑梗死、股骨头坏死、卵巢早衰、脑震荡、脑挫裂伤、大脑损伤、开放性颅脑损伤、肝硬化、纤维肝、脂肪肝、出血性坏死性胰腺炎、胰腺损伤、胰腺纤维化、各种肿瘤化疗后免疫功能减退综合症、放疗后免疫功能减退综合症的免疫功能重建、慢性肾上腺皮质功能减退症、腺垂体功能减退症、垂体前叶机能减退症、中枢性尿崩症，甲状腺切除术后甲状腺损伤、甲状腺功能减退症、甲状旁腺机能减退症和肾功能衰竭；所述恶性血液病选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，先天性溶血性贫血、再生障碍性贫血和放射性疾病。
由此可见，本发明不同于已有的利用基因重组技术诱导体细胞逆向分化产生干细胞(iP干细胞)，提供了一种新的人的体细胞逆向分化产生自体造血干细胞的生产调控技术，利用植物提取物和蛋白配方技术诱导体细胞逆向分化产生的干细胞(Plants and Proteins induced pluripotentstem cell，PPiPS干细胞)，使得细胞结构接近于自然干细胞，安全性高。具体而言，本发明在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，应用经过筛选优化设计的植物提取物和蛋白组成的培养液配方，在体外重新激活体细胞DNA序列中的造血干细胞特性决定基因开关，使这些体细胞就重新逆向分化而形成新的造血干细胞，并且可以冰冻长期保存植物和蛋白诱导性人自体造血干细胞，建立个人的植物和蛋白诱导性自体造血干细胞库。
因此，本发明提供的技术方法解决了以下这些问题：
(1)选用什么样的人的体细胞作为逆向分化生产人自体造血干细胞的原料细胞；
(2)怎样处理和培养各种原料细胞；
(3)怎样使原料细胞逆向分化生产人自体造血干细胞；
(4)怎样检测生产的人自体造血干细胞；
(5)怎样冰冻长期保存植物和蛋白诱导性人自体造血干细胞；
(6)怎样建立植物和蛋白诱导性人自体造血干细胞库的系统过程以及方法。
在本发明的一个优选实施方案中，提供的方法包括以下步骤：
(1)选用的人的原料体细胞及制备方法，原料体细胞可以是：血液单个核细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞等；
(2)选用的原料体细胞的培养方法：以2-5x106的密度，用相应的细胞培养液在5％CO2和37℃条件下培养24-48小时；
(3)使原料细胞逆向分化生产人自体造血干细胞的方法：相应的原料体细胞用相应的细胞培养液在5％CO2和37℃条件下培养24-48小时后，换用细胞培养液A1(RPMI1640Medium、当归提取物50mg/ml、人参提取物50mg/ml、Y-27632 10μM、stem cell factor 10ng/ml、IL-3 10ng/ml、IL-610ng/ml、IL-11 10ng/ml)继续在5％CO2和37℃条件下培养72小时，然后换用细胞培养液A2(RPMI1640Medium、人参提取物50mg/ml、当归提取物50mg/ml、水蛭提取物100mg/ml、Y-27632 10μM、stem cell factor10ng/ml、IL-3 10ng/ml、IL-6 10ng/ml、IL-11 10ng/ml)继续在5％CO2和37℃条件下培养6-9天。
(4)检测生产的人自体造血干细胞的方法：利用造血干细胞的特异细胞表型CD34、ABCG2、CD117或CD133等作为检测指标，在换用细胞培养液A2继续培养后的第3、第6、第9和第12天，分别采用流式细胞仪、细胞免疫荧光技术和Western blot蛋白印迹技术检测造血干细胞的生成速度、生成率、生成数量和纯度。国际上自1989年起就定义以特异细胞表型CD34、ABCG2、CD117或CD133等作为造血干细胞的检测指标，并且一般情况下仅1-2个表型存在(如CD34表型阳性)即可鉴定为造血干细胞，例如，临床应用多年的造血干细胞采集机就是采集CD34表型阳性细胞或采集CD133表型阳性细胞直接用于白血病的治疗，具体还可参见韩忠朝编，《造血干细胞理论与移植技术》，河南科学技术出版社，2000年。
(5)冰冻长期保存植物和蛋白诱导性人自体造血干细胞的方法：吸打悬浮贴壁生长的植物和蛋白诱导性造血干细胞并收集到50ml毫升的离心管内，在离心机内以1500rpm，4℃离心10分钟，弃上清。制备的植物和蛋白诱导性造血干细胞以1x1010/ml和DMSO混合，以10％DMSO和低分子右旋糖酐浓度降温至-80℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温保存，建立植物和蛋白诱导性自体造血干细胞库。
本发明适用于建立新型的自体造血干细胞库，长期永久保存自体造血干细胞。与现有的脐带血/骨髓/周围血干细胞库相比较，这种新型的自体造血干细胞库具有生产/保存干细胞数量大，干细胞质量可监测性好，应用领域广等优势。具体而言，本发明的效果和优势在于以下几方面：
首先，本发明提供的是一种新的体细胞逆向分化产生人自体造血干细胞的方法，在不改变体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，使体细胞重新逆向分化而形成干细胞。
其次，本发明提供的方法生产干细胞的生产速度快，产量巨大，纯度高。例如，仅用200ml人周围血液在1-2周内，就可产生几百亿数量级别的第1代自体/异体造血干细胞，纯度达到6-50％。
第三，本发明提供的方法生产的造血干细胞具有正常2倍体的染色体核型；并且裸鼠移植不产生肿瘤，具有较高的安全性。
第四，本发明提供的方法适用于在任何年龄的人个体中生产造血干细胞，因此可以是一种可以在任何年龄的人个体中建立自体造血干细胞库的新技术方法。
此外，本发明提供的方法利用干细胞的特异表型作为检测指标，各种植物和蛋白诱导性人自体干细胞的生产工艺流程可以被严格地、多次地、系统地进行流式细胞技术和免疫细胞化学技术检测。因此，作为自体种子细胞和再生修复细胞，本发明还具有大规模工业化和产业化生产自体造血干细胞的可能性。例如，在再生医学、自体组织器官工程和自体造血干细胞生产的产业化领域，植物和蛋白诱导性人自体干细胞可能具有良好的潜在应用前景。主要的应用范围包括：
本发明适用于再生医学/修复医学领域的疾病和损伤的治疗，治疗病种广泛，如缺血性心脏病、糖尿病、脑出血、脑梗死、股骨头坏死、卵巢早衰、脑震荡、脑挫裂伤、大脑损伤、开放性颅脑损伤、肝硬化、纤维肝、脂肪肝、出血性坏死性胰腺炎、胰腺损伤、胰腺纤维化、各种肿瘤化疗后免疫功能减退综合症、放疗后免疫功能减退综合症的免疫功能重建、慢性肾上腺皮质功能减退症、腺垂体功能减退症、垂体前叶机能减退症、中枢性尿崩症，甲状腺切除术后甲状腺损伤、甲状腺功能减退症、甲状旁腺机能减退症和肾功能衰竭的病损/创伤组织器官的再生性修复治疗。
本发明适用于各种恶性血液病，如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，先天性溶血性贫血、再生障碍性贫血、放射性疾病。治疗方法是应用化疗或放疗等手段杀灭病人的肿瘤细胞，然后输入健康的自体/异体造血干细胞。
本发明适用于自体干细胞的抗衰老保健，利用巨额数量的自体造血干细胞再生性修复全身各组织器官的衰老变性，恢复组织器官的年青结构和生理功能。作为器官组织再生和修复的种子细胞，植物和蛋白诱导性自体造血干细胞可以应用于自身的抗衰老保健。长期和定期补充植物和蛋白诱导性自体造血干细胞，通过再生、再造、修复、补充和替换的机制，综合性修复和再生机体病损、衰老退化的组织器官结构，恢复或再生其生理功能，产生了多细胞、多器官、多系统的综合抗衰老效果，并获得皮肤亮丽、外貌年青化、精神焕发、青春重现、生物学年龄年轻、延缓衰老的全面抗衰老保健功效。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1A为实施例1中作为原料细胞的血液单个核细胞，图1B为采用本发明的方法，用A2培养液培养第9天生产的诱导性造血干细胞。
图2为实施例1中采用本发明的方法，用A2培养液培养第9天，应用细胞免疫荧光化学技术检测生产的诱导性造血干细胞的CD34、ABCG2和CD133特异表型。
图3为实施例1中采用本发明的方法，用A2培养液培养第9天，应用蛋白印迹技术检测生产的诱导性造血干细胞的CD34、ABCG2和CD133特异表型的结果。
图4为实施例1中采用本发明的方法，用A2培养液培养第9天，应用流式细胞仪技术检测生产的诱导性造血干细胞的CD34、ABCG2和CD133特异表型的结果。
图5为实施例1中采用本发明的方法，用A2培养液培养第3、6、9、12和15天，根据采用流式细胞仪技术检测生产的诱导性造血干细胞的CD34、ABCG2和CD133特异表型的结果而做出的造血干细胞的生成速度、生成率、生成数量和纯度图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
以下各实施例中，采用的植物和蛋白诱导培养液如下：
A1培养液配方：RPMI1640培养基(购自GICO公司)、当归提取物(购自河南天然植物原料厂、郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、人参提取物(购自河南天然植物原料厂、郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632(购自Sigma公司)10μM、干细胞因子(stem cell factor，购自R&D公司)10ng/ml、白细胞介素-3(IL-3，购自R&D公司)10ng/ml、白细胞介素-6(IL-6，购自R&D公司)10ng/ml、白细胞介素-11(IL-11，购自R&D公司)10ng/ml。
A2培养液配方：RPMI1640培养基、人参提取物50mg/ml、当归提取物50mg/ml、水蛭提取物(购自郑州荔诺生物科技有限公司)100mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632 10μM、干细胞因子10ng/ml、白细胞介素-3(IL-3)10ng/ml、白细胞介素-6(IL-6)10ng/ml、白细胞介素-11(IL-11)10ng/ml。
实施例1
本实施例以周围静脉血、脐带血作为原料细胞为例，采用本发明提供的植物和蛋白诱导培养液，生产并长期保存诱导性造血干细胞。
1、周围静脉血的无菌采集和处理
采集周围静脉血/脐带血之前，应征得供血本人或直系亲属的同意，并记录供血本人及家庭的遗传和传染病史以及医院所有相关的病毒检查结果。
周围静脉血/脐带血常规抗凝，4℃保存。在24小时之内送至干细胞制作生产中心。在中心需要再做相应的病毒检测后，进入中心电脑登记程序，在记录相应的条形码编号后，血液标本进入无菌干细胞生产车间。
2、诱导性造血干细胞的生产
在干细胞生产车间，血液标示应用Ficoll标准分离技术(具体参见沈关心等主编，《现代免疫学实验技术》(第2版)，湖北科学技术出版社，1998年)分离单个核细胞后，进行单个核细胞计数。应用DMEM培养液以2-5x106的密度，在5％CO2和37℃条件下培养24-48小时；换用细胞培养液A1继续在5％CO2和37℃条件下培养72小时，然后换用细胞培养液A2继续在5％CO2和37℃条件下培养6-9天。
3、诱导性造血干细胞的检测
检测生产的人自体造血干细胞的方法：利用造血干细胞的特异细胞表型CD34、ABCG2和CD133等作为检测指标，在换用细胞培养液A2继续培养后的第3、第6、第9和第12天，分别采用流式细胞仪、细胞免疫荧光技术和Western blot蛋白印迹技术检测(具体参见沈关心等主编，《现代免疫学实验技术》(第2版)，湖北科学技术出版社，1998年)造血干细胞的生成速度、生成率、生成数量和纯度。
电镜显示原料细胞和由其诱导的造血干细胞的细胞形态分别如图1A和图1B所示。图2中示出了应用细胞免疫荧光化学技术检测生产的诱导性造血干细胞的CD34、ABCG2和CD133特异表型。应用Western blot蛋白印迹技术检测植物和蛋白诱导性造血干细胞(PPiHPS)和CD34、ABCG2和CD133特异表型，并且以原料细胞(周围血单个核细胞，PBMC)作为对照。由电泳结果可见，PPiHPS干细胞CD34、ABCG2和CD133特异表型阳性，而PBMC原料细胞CD34、ABCG2和CD133特异表型阴性。图4为应用流式细胞仪技术检测生产的诱导性造血干细胞的CD34、ABCG2和CD133特异表型的结果。如图所示，用A2培养液培养第9天，CD34、ABCG2和CD133特异表型的生成速度分别为5.4％、6.83％和9.93％。而图5示出用A2培养液培养第3、6、9、12和15天，根据应采用流式细胞仪技术检测生产的诱导性造血干细胞的CD34、ABCG2和CD133特异表型的结果而做出的从原料细胞生成造血干细胞的生成速度曲线图。
通过实验结果可知，一般情况下，200ml周围静脉血/80ml脐带血的单个核细胞在细胞培养液A2培养后的第6天，植物和蛋白诱导性造血干细胞的产量可达1-3.5x1011，纯度达到5-40％。
4、诱导性造血干细胞的保存
冰冻长期保存诱导性造血干细胞的方法：吸打悬浮贴壁生长的造血干细胞并收集到50ml毫升的离心管内，在离心机内以1500rpm，4℃离心10分钟，弃上清。制备的诱导性造血干细胞以1x1010/ml和DMSO混合，以10％DMSO和低分子右旋糖酐浓度降温至-80℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温保存，建立植物和蛋白诱导性自体造血干细胞库。
实施例2
本实施例以胎盘作为原料细胞为例，采用本发明提供的植物和蛋白诱导培养液，生产并长期保存导性造血干细胞。
1、胎盘的无菌采集和处理
胎盘来源于妇产科医院(北京五洲女子医院、北京安定门医院等)。采集胎盘直系亲属的同意，并记录本人及家庭的遗传和传染病史以及医院所有相关的病毒检查结果。在中心需要再做相应的病毒检测后，进入中心电脑登记程序，在记录相应的条形码编号后，胎盘标本进入无菌干细胞生产车间。
用含有消毒剂的生理盐水/磷酸缓冲液/DMEM培养液依序清洗胎盘，应用剪碎、研磨和DMEM培养液冲洗的方法，将胎盘细胞收集到50ml毫升的离心管内，在离心机内以1500rpm，4℃离心10分钟，弃上清。再次用培养液清洗离心两次。采用16G、18G和20G的针头过滤，把胎盘细胞制成单个细胞并计数。
2、诱导性造血干细胞的生产
应用DMEM培养液以2-5x106的密度，在5％CO2和37℃条件下把胎盘细胞培养24-48小时；换用细胞培养液A1继续在5％CO2和37℃条件下培养72小时，然后换用细胞培养液A2继续在5％CO2和37℃条件下培养6-9天。
3、诱导性造血干细胞的检测
检测生产的自体造血干细胞的方法：利用造血干细胞的特异细胞表型CD34、ABCG2、CD117和CD133等作为检测指标，在换用细胞培养液A2继续培养后的第3、第6、第9和第12天，分别采用流式细胞仪、细胞免疫荧光技术和Western blot蛋白印迹技术检测造血干细胞的生成速度、生成率、生成数量和纯度。
一般情况下，一个胎盘制备的单个胎盘细胞在细胞培养液A2培养后的第6天，植物和蛋白诱导性造血干细胞的产量可达1-2x1012，纯度达到10-40％。
4、诱导性造血干细胞的保存
冰冻长期保存植物和蛋白诱导性人自体造血干细胞的方法：吸打悬浮贴壁生长的植物和蛋白诱导性造血干细胞并收集到50ml毫升的离心管内，在离心机内以1500rpm，4℃离心10分钟，弃上清。制备的植物和蛋白诱导性造血干细胞以1x1010/ml和二甲基亚砜(DMSO)混合，以10％DMSO和低分子右旋糖酐浓度降温至-80℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温保存，建立植物和蛋白诱导性自体造血干细胞库。
实施例3
本实施例对实施例2中制备的植物和蛋白诱导性造血干细胞进行裸鼠移植的安全性研究，具体如下。
在两组裸鼠移植试验中，裸鼠皮下移植注射1×108个植物和蛋白诱导性造血干细胞或1×108个人自然胚胎干细胞，观察接种部位有否肿瘤形成。连续观察90天。
结果显示，植物和蛋白诱导性造血干细胞试验组10只裸鼠无一例产生肿瘤，具有较高的安全性；而人自然胚胎干细胞试验组10只裸鼠全部产生肿瘤。

Claims (11)

1.一种用于逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液，其特征在于，所述培养液为在RPMI 1640培养基中添加以下成分：当归提取物10～100mg/ml、人参提取物10～100mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632 5～30μM、干细胞因子5～30ng/ml、白细胞介素-3 5～30ng/ml、白细胞介素-6 5～30ng/ml、白细胞介素-11 5～30ng/ml；优选地，所述培养液中还包括水蛭提取物80～120mg/ml。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液为在RPMI1640培养基中添加以下成分：当归提取物50mg/ml、人参提取物50mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-2763210μM、干细胞因子10ng/ml、白细胞介素-3 10ng/ml、白细胞介素-6 10ng/ml、白细胞介素-11 10ng/ml；优选地，所述培养液中还包括水蛭提取物100mg/ml。
3.权利要求1或2所述的培养液在逆向分化体细胞产生造血干细胞中的用途。
4.一种逆向分化体细胞产生造血干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1或2所述的培养液培养体细胞，使其逆向分化产生造血干细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)用添加以下成分的RPMI 1640培养基培养体细胞48-72小时：当归提取物10～100mg/ml、人参提取物10～100mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-276325～30μM、干细胞因子5～30ng/ml、白细胞介素-3 5～30ng/ml、白细胞介素-65～30ng/ml、白细胞介素-11 5～30ng/ml；
2)换用添加以下成分的RPMI 1640培养基培养6-9天：当归提取物10～100mg/ml、人参提取物10～100mg/ml、水蛭提取物80～120mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632 5～30μM、干细胞因子5～30ng/ml、白细胞介素-3 5～30ng/ml、白细胞介素-6 5～30ng/ml、白细胞介素-11 5～30ng/ml；
优选地，所述步骤1)和2)的培养条件如下：5％CO2和37℃。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用DMEM培养液在逆向分化体细胞之前培养体细胞的步骤；优选地，所述培养条件为：细胞密度2-5x106/ml，5％CO2，37℃，培养24-48小时。
7.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测逆向分化体细胞产生的造血干细胞的步骤；优选地，所述检测方法为：以CD34、ABCG2和/或CD133作为特异细胞表型检测指标，采用流式细胞仪、细胞免疫荧光技术和/或蛋白印迹技术进行检测。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括冷冻保存逆向分化体细胞产生的造血干细胞的步骤；优选地，所述冷冻保存方法为：将造血干细胞以1x1010/ml的细胞密度与二甲基亚砜混合，以10％二甲基亚砜和10％低分子右旋糖酐浓度降温至-80℃，然后转移到-186℃液氮中深低温保存。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述体细胞选自：血液单个核细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等。
10.权利要求3至9中任一项所述方法制备的造血干细胞或造血干细胞库。
11.权利要求10所述的造血干细胞作为种子细胞和再生修复细胞，在制备用于再生医学/修复医学领域的疾病和损伤；恶性血液病；抗衰老保健的药物中的用途；优选地，所述再生医学/修复医学领域的疾病和损伤选自：缺血性心脏病、糖尿病、脑出血、脑梗死、股骨头坏死、卵巢早衰、脑震荡、脑挫裂伤、大脑损伤、开放性颅脑损伤、肝硬化、纤维肝、脂肪肝、出血性坏死性胰腺炎、胰腺损伤、胰腺纤维化、各种肿瘤化疗后免疫功能减退综合症、放疗后免疫功能减退综合症的免疫功能重建、慢性肾上腺皮质功能减退症、腺垂体功能减退症、垂体前叶机能减退症、中枢性尿崩症，甲状腺切除术后甲状腺损伤、甲状腺功能减退症、甲状旁腺机能减退症和肾功能衰竭；所述恶性血液病选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，先天性溶血性贫血、再生障碍性贫血和放射性疾病。
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