CN108192867A - 一种临床用脐血单核细胞的制备方法 - Google Patents

一种临床用脐血单核细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脐带血单核细胞的制备方法：步骤一、脐带血初步筛选与保存；步骤二、培育；步骤三、吸取；步骤四、收集；步骤五、细胞培养；步骤六、单核细胞冻存和检测；步骤七；单核细胞的使用。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行统一、系统监控，以实现脐带血单核细胞分离、冷冻的标准产品。

Description

一种临床用脐血单核细胞的制备方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种临床用脐血单核细胞的制备方法。
背景技术
单核细胞可以分化为树突状细胞和巨噬细胞，是开展树突状细胞和巨噬细胞相关研究的重要前体细胞。单核细胞由多能造血干细胞分化而来，在骨髓中发育，并进入血液，停留2～3d后再迁移到周围组织中。因此，外周血可成为获取单核细胞的重要来源。通常情况下，单核细胞仅占外周血细胞的3％～8％，且独立的细胞株难以获得。目前常用的分离单核细胞的方法包括贴壁法、免疫磁珠法和流式法。因此，如何获得理想的单核细胞是开展相关实验研究的关键。
脐带血是造血干细胞的来源之一，造血干移植已成为治疗多种血液病、某些恶性实体肿瘤、部分遗传性疾病、重症免疫缺陷等疾病的最有效措施之一。临床应用已证明造血干细胞移植对于重建或者改善骨髓造血功能有良好的疗效。单核细胞(包括单核细胞、淋巴细胞、干细胞等)是造血干细胞移植的有效成分。单核细胞的分离是干细胞移植和进一步研究的关键，它直接关系到分离后样本体积、造血干/祖细胞或间充质干细胞分离率、细胞活性维持及移植的成败。
脐带血单核细胞冻存更是解决了空间的问题。低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。
脐带血单核细胞冻存也是为细胞治疗标准化提供了基础，使用统一浓度的细胞进行冻存，便于检测细胞冻存前后各项指标，为实现产业化标准化提供数据支持。
婴儿出生后遗留在胎盘和脐带中的血是干细胞的重要来源。脐带血中的造血干细胞可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤(如：急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合症和淋巴瘤等)、血红蛋白病(如：海洋性贫血)、骨髓造血功能衰竭(如：再生障碍性贫血)、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患、某些实体肿瘤(如：小细胞肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌和进行性肌营养不良等)。自1988年脐血干细胞就用来治疗根达综合症、亨达综合症、和拉综合症和急性淋巴细胞性白血病等许多儿童疾病。截至2011年，脐带血不仅已能有效地治疗几十种难治性疾病和多种不治之症，而且它所能治疗的疾病种类还在不断地增加。自体储存的脐带血一旦需要使用时，不需配型，细胞活性强，无免疫排斥的危险，移植成活率高，治愈率高，医疗费用低。
在人脐血中有一类具有干细胞特征的细胞群体，被称为人间充质干细胞(MSCs)。人间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在不同诱导条件下可分化为三胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经细胞等。此外，还表达IL6、G-CSF和SCF等多种造血细胞生长所需要的因子，能够维持长期培养的造血祖细胞增殖，显示MSC具有支持造血和促进造血恢复的作用。同时研究表明MSC具有免疫调节作用，在体外能够抑制T淋巴细胞增殖，体内动物实验发现MSCs移植可以抑制异体免疫反应，减轻移植相关的排斥反应，并延长异体移植物的存活时间。最近的临床试验发现MSCs联合造血干细胞移植可以减轻GVHD并降低移植失败率。MSC的多向分化能力和免疫调节能力决定了其在细胞治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。
目前常规脐血单核细胞(富含造血干细胞)多用动物血清加白蛋白冻存，如鸡、猪、牛等，其中胎牛血清因获取量大、污染轻而被广泛应用。但近年随着人畜共患病发病率的增加，以异种血清培养的组织向临床应用的安全性受到质疑，因此自体血清培养越来越受到重视。
中国发明专利申请号：201510159307.0公开了一种脐血单个核细胞冻存液、应用、制备方法。本发明提供的一种脐血单个核细胞冻存液，包括二甲基亚砜(DMSO)联合勃脉力A(复方电解质注射液)、羟乙基淀粉(HES)，该方案相比传统配方，可避免动物源性病原体的污染，同时避免采用细胞培养基作为冻存液组成成分，并保证了良好的细胞冻存效果，冻存2个月后，用本发明冻存液冻存的CBMC复苏后细胞活率平均值为94.73％，显著(P＜0.05)高于用传统冻存液(10％DMSO+90％FBS)的冻存效果。细胞复苏后可直接进行临床移植，在细胞治疗临床应用方面颇具实用价值。
中国发明专利申请号：02103676.4公开了脐血造血干细胞的制作方法,按如下步序进行:(1)采集脐血,将出生的胎儿的脐血采到脐血采集袋内；(2)加入红细胞沉淀剂；(3)离心分离1,将脐血采集袋中脐血中的红细胞分离；(4)移出红细胞,将红细胞输送到红细胞收集袋内；(5)离心分离2,将白细胞包括造血干细胞与血浆再一次分离；(6)移出血浆,将被分离的血浆输入到血浆收集袋内,脐血收集袋内剩余的脐血为含富集白细胞的脐血；(7)加入冷冻剂,将脐血收集袋中的富集白细胞脐血中加入冷冻剂；(8)包装；(9)降温；(10)入库保存。用本发明方法制作的造血干细胞可长期存放,以便于随时取用,大大地方便了治疗,及时解除病人痛苦,适用于制作在脐血库中长期存放的造血干细胞。
但目前公开的各类间充质干细胞制备方法虽均能获得脐血单核细胞(富含造血干细胞)，但都不符合临床应用的标准，本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现脐血单核细胞(富含造血干细胞)的临床标准产品。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种临床用脐带血单核细胞的制备方法，本发明的方法是一种节约成本、安全可控的方法。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本发明提供一种脐带血单核细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：脐带血初步筛选与保存：将分离、经过初步筛选的脐带血置于低温下保存；
步骤2：培育：将脐带血样本置于含有RPMI-1640培养基的培养皿中，于37℃，含CO2的细胞培养箱中孵育。
步骤3：吸取：待单核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞，PBS缓冲液轻洗涤，加入少量RPMI-1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞。
步骤4：收集：将步骤3中收集到的贴壁细胞离心，去上清液，得单核细胞。
步骤5：细胞培养：取步骤4中收集到的单核细胞到培养基进行培养，调整细胞密度至设定值。
步骤6：单核细胞冻存和检测：收集细胞并计数和活率，按4×107/ml/管进行冷冻保存；并将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取3×106细胞做细胞表面标志检测；
步骤7：单核细胞的使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
优选地，步骤1中，所述初步筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史；
所述低温具体指温度范围为4～7℃。
优选地，步骤2中，细胞培养箱中的CO2含量为2～8％，孵育时间为1～4h。
优选地，步骤3中，PBS缓冲液轻洗涤次数为2～4次。
优选地，步骤4中，所述离心的条件为800～1500r/min,3～10min,更优选地为1000r/min,5min。
优选地，步骤五中，所述培养采用的培养基为市售完全培养基、培养时间为3～5天；所述设定值为0.6～1.3×108/T75瓶。
优选地，步骤六中，用于冷冻的冷冻保护液为体积分数为6％血浆的DMSO溶液，用于保护冷冻细胞的活性；
本发明在实施过程中，对冷冻保护液的组分进行了筛选，相比之下，6％DMSO+血浆比6％DMSO+右旋糖酐、6％DMSO+培养基要效果好，在复苏后细胞活率无明显变化。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.全过程全面质量监控，从脐带血采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控。
2.通过此法收集得到的脐带血耗时短、成本低。
3.无血清培养基，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏风险。
4.低浓度冻存保护剂，保持细胞的活性及干细胞的干性，使复苏后的细胞尽可能地保证各种生物学特性不受损伤。
5.还包括裂解红细胞的步骤，解决了现有技术不适于异体移植的问题，避免了异体移植引起急性肾功衰竭等负面作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种临床用脐带血单核细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：脐带血初步筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带血，置于血袋中于7℃保存。
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤2：培育：将脐带血样本置于含有RPMI-1640培养基的培养皿中，于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中孵育2h。
步骤3：吸取：待单核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞，PBS缓冲液轻洗涤2次，加入少量RPMI-1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞。
步骤4：收集：将步骤3中收集到的贴壁细胞在1000r/min条件下离心5min，去上清液，得单核细胞。
步骤5：细胞培养：取步骤4中收集到的单核细胞到市售培养基进行培养，调整细胞密度至1.1×108/T75瓶。
步骤6：单核细胞冻存和检测：细胞培养3天，收集细胞并计数和活率，冷冻保护液为6％的血浆和DMSO混合溶液，4℃预冷90min，按1～4×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取3×106细胞做细胞表面标志检测；
步骤7：单核细胞的使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
实施例2
本实施例提供一种临床用脐带血单核细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：脐带血初步筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带血，置于血袋中于5℃保存。
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤2：培育：将脐带血样本置于含有RPMI-1640培养基的培养皿中，于37℃，含6％CO2的细胞培养箱中孵育3h。
步骤3：吸取：待单核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞，PBS缓冲液轻洗涤2次，加入少量RPMI-1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞。
步骤4：收集：将步骤3中收集到的贴壁细胞在1200r/min条件下离心8min，去上清液，得单核细胞。
步骤5：细胞培养：取步骤4中收集到的单核细胞到市售培养基进行培养，调整细胞密度至1.2×108/T75瓶。
步骤6：单核细胞冻存和检测：细胞培养3天，收集细胞并计数和活率，冷冻保护液为6％的血浆和DMSO混合溶液，4℃预冷90min，按1～4×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取3×106细胞做细胞表面标志检测；
步骤7：单核细胞的使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
实施例3
本实施例提供一种临床用脐带血单核细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：脐带血初步筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带血，置于血袋中于6℃保存。
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤2：培育：将脐带血样本置于含有RPMI-1640培养基的培养皿中，于37℃，含4％CO2的细胞培养箱中孵育1h。
步骤3：吸取：待单核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞，PBS缓冲液轻洗涤2次，加入少量RPMI-1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞。
步骤4：收集：将步骤3中收集到的贴壁细胞在1000r/min条件下离心7min，去上清液，得单核细胞。
步骤5：细胞培养：取步骤4中收集到的单核细胞到市售培养基进行培养，调整细胞密度至1.0×108/T75瓶。
步骤6：单核细胞冻存和检测：细胞培养3天，收集细胞并计数和活率，冷冻保护液为6％的血浆和DMSO混合溶液，4℃预冷90min，按1～4×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取3×106细胞做细胞表面标志检测；
步骤7：单核细胞的使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
性能测试
对实施例1～3制备的单核细胞进行标准检测，检测结果如下表所述：
表1
检测结果显示，本发明制备方法制备所得的单核细胞的各项标准均符合应用要求。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种脐带血单核细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：脐带血初步筛选与保存：将分离、经过初步筛选的脐带血置于4～7℃下保存；
步骤2：培育：将脐带血样本置于含有RPMI-1640培养基的培养皿中，于37℃，2～8％CO2的细胞培养箱中孵育2h；
步骤3：吸取：待单核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞，PBS缓冲液轻洗涤2次，加入少量RPMI-1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞；
步骤4：收集：将步骤3中收集到的贴壁细胞离心，去上清液，得单核细胞；
步骤5：细胞培养：取步骤4中收集到的单核细胞到培养基进行培养，调整细胞密度至1.1×108/T75瓶；
步骤6：单核细胞冻存和检测：收集细胞并计数和活率，按4×107/ml/管进行冷冻保存；并将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取3×106细胞做细胞表面标志检测；
步骤7：单核细胞的使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述脐带血是从健康足月产妇志愿者中采集、筛选而来；
初步筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中的CO2的分数也可以是4～8％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中离心的条件是800～1500r/min,3～10min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中离心的条件是1000r/min,5min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6中，使用的冷冻保护液为体积分数为6％血浆的DMSO溶液。
7.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，所述方法还包括根据实际需要对红细胞进行裂解的步骤。
8.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，所述方法还包括合并、收集单核细胞的步骤。
9.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，所述方法还包括所述单核细胞冻存之后对单核细胞进行复苏的步骤。
10.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤6所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
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