CN110229788A - 一种脐血单个核细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脐血单个核细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)将采集到的脐血转移到无菌三联袋中；(2)将转移后脐血进行离心分离；(3)将离心完成的血袋放于分浆夹上去除血浆上清，沉淀物即为单个核细胞制剂。本发明的制备方法没有使用羟乙基淀粉和Ficoll淋巴细胞分离液，制备出来的单个核细胞制剂安全无副作用，且单个核细胞的回收率达到了95％以上，细胞活性在93％以上。同时本发明还提供了一种脐血单个核细胞制剂，该制剂体积小，只有10ml，便于新生儿的输注与使用。
Description
技术领域
本发明涉细胞技术领域，具体涉及一种脐血单个核细胞的制备方法。
背景技术
在免疫细胞治疗中，一般采用羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)离心沉淀法或Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。
虽然羟乙基淀粉离心沉淀法虽然在操作上比较简便，细胞回收率可达到80％以上，但是细胞分离的效果不佳，得到的细胞纯度难以满足要求，有较多的血小板、红细胞及粒细胞等。Ficoll密度梯度离心法，由于红细胞、粒细胞比重大，离心后会沉于管底；而淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后会漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中，吸取分层液液面的白膜层细胞，就可从外周血中分离得到单个核细胞。这个方法所得到的细胞纯度较好，红细胞比例少，但是细胞回收率低，小于50％。
同时，羟乙基淀粉离心沉淀法采用的羟乙基淀粉属于大分子物质，在身体里面不容易代谢，尤其对于早产儿完全不能应用。而Ficoll也有轻微毒性，输注早产儿体内安全性无法保证。
因此，寻求一种分离效果好，细胞回收率高，且能直接应用于婴儿，尤其是早产儿的脐血单个核细胞的制备方法，成为亟待解决的问题。
发明内容
为克服解决上述技术问题，本发明提供一种脐血单个核细胞的制备方法，通过改进现有的脐血单个核细胞的制备方法，得到可用于刚出生的早产儿临床输注的脐血单个核细胞制剂，利用本方法制备的制剂安全性高细胞活性高，回收率高。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种脐血单个核细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)将采集到的脐血转移到无菌三联袋中；
(2)将转移后脐血进行离心分离；
(3)将离心完成的血袋放于分浆夹上去除血浆上清，沉淀物即为单个核细胞制剂。
优选地，在脐血中加入抗凝剂。
优选地，所述步骤(2)离心的条件是温度20℃、离心力500G、离心时间13分钟。
本发明还提供一种由上述方法制备的脐血单个核细胞制剂。
优选地，所述脐血单个核细胞制剂单核细胞浓度为14～29×106/ml。
优选地，所述脐血单个核细胞制剂为10ml。
本发明的有益效果：
1.本发明获取单个核细胞过程中没有使用羟乙基淀粉和Ficoll淋巴细胞分离液，制备出来的单个核细胞制剂安全无副作用。而且单个核细胞的回收率达到了95％以上，细胞活性好。
2.本发明的制备方法只经过一次简单离心，即可达到想要的产品，简单方便操作，避免了多次操作带来的细菌污染的风险。
3.本发明的制备方法是在新生儿脐血断脐后，6小时内即进行单个核细胞的制备，并且制备时间30分钟内即可完成，完成后即刻回输到自体，充分保证的细胞的活性和质量。
4.制备过程中脐血没有经过冻存，避免了加入冻存保护剂，因此产品中的成分没有任何新加的成分，应用于新生儿没有任何的风险。
5.制备的产品体积只有10ml，体积小，便于新生儿的输注与使用。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1脐血单个核细胞的制备方法
(1)将采集的脐血27ml中加入28ml抗凝剂，充分混匀后转移到无菌三联袋中，其中经细胞计数其全血单个核细胞(MNC)106/ml为3.1，全血单个核细胞(MNC)108/ml为1.705；
(2)将转移后脐血进行离心分离，离心的条件是温度20℃、离心力500G、离心时间13分钟；
(3)将离心完成的血袋放于分浆夹上去除血浆上清，沉淀物即为单个核细胞制剂，经离心浓缩后，脐血单个核细胞制剂为10ml，其全血单个核细胞(MNC)106/ml为16.28，全血单个核细胞(MNC)108/ml为1.628。
实施例2-30与实施例1唯一区别在于采集脐血的量不同，加入抗凝剂的量不同。
各实施例中脐血和添加的抗凝剂的量，以及全血单个核细胞(MNC)106/ml和全血单个核细胞(MNC)108/ml，如表1所示：
表1：各实施例中脐血和添加的抗凝剂的量，以及全血MNC 106/ml和全血MNC 108/ml
统计各实施例制备方法获得的脐血单个核细胞，进行细胞计数和回收率统计，同时，进行细胞活性检测，结果如表2所示：
表2：各实施例的脐血单个核细胞制剂的单个核细胞数、回收率和细胞活性
单个核细胞数和回收率的检测是通过sysmex的XN2000血球仪进行检测，细胞活性运用台盼蓝染色法进行检测
由上述结果可看出，本发明制备方法制备所得的单核细胞的单个核细胞数在14～30×106/ml、细胞活性在93％以上，其细胞单个核细胞回收率在95％。
对实施例1-30制备的单核细胞进行标准检测，检测结果如表3所示：
表3：各实施例的脐血单个核细胞制剂标准检测结果
由上述结果显示，本发明制备方法制备所得的单核细胞的各项标准均符合应用要求，且不含防冻剂、羟乙基淀粉和Ficoll试剂，能直接应用于婴儿，没有任何的风险。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种脐血单个核细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将采集到的脐血转移到无菌三联袋中；
(2)将转移后脐血进行离心分离；
(3)将离心完成的血袋放于分浆夹上去除血浆上清，沉淀物即为单个核细胞制剂。
2.如权利要求1所述的脐血单个核细胞的制备方法，其特征在于，在脐血中加入抗凝剂。
3.如权利要求1所述的脐血单个核细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)离心的条件是温度10℃-20℃、离心力400-800G、离心时间10-15分钟。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的脐血单个核细胞方法制备的脐血单个核细胞制剂，其特征在于，所述脐血单个核细胞制剂为10ml。
5.如权利要求1所述的脐血单个核细胞制剂，其特征在于，所述制剂中单个核细胞浓度为14～29×106/ml。
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