CN100500825C - 淋巴细胞分离管及分离血液中淋巴细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种淋巴细胞分离管，包括管体，所述管体底部设置有疏松多孔材料。本发明还公开了采用上述淋巴细胞分离管进行血液淋巴细胞分离的方法。本发明的淋巴细胞分离管方便实用、生产工艺简单、安全无毒且制作成本低廉。

Description

淋巴细胞分离管及分离血液中淋巴细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种细胞分离装置，特别是涉及一种淋巴细胞分离管。
背景技术
分离血液中的淋巴细胞，通常采用密度梯度离心的方法。也就是在一只离心管中，先加入一定体积的(比如3毫升)淋巴细胞分离液，然后小心翼翼的在分离液的界面上铺上血液。由于分离液的密度比红细胞低，比淋巴细胞高，所以经过离心之后，红细胞沉到分离液底部，而淋巴细胞悬浮在分离液和血浆之间。这就达到了分离血液中淋巴细胞的目的。如图1所示，图1中从左到右依次为：在离心管中加入分离液；小心翼翼的铺上待分离的全血；经过离心，红细胞沉到管底，淋巴细胞悬浮于血浆和分离液界面之间。在淋巴细胞分离液的界面上铺血液是一步很困难的操作，费时费力，并且还要有相当的技巧，否则，会把血液与分离液的界面弄混，使得分离效果变差，甚至分离不出淋巴细胞来。
有鉴于此，国外的一些公司，开发出了一种淋巴细胞分离管。比如挪威的Axis Shield公司的Lympho-tube以及美国GreinerBio公司的Leuco-Septube。其做法是在普通的离心管中间粘上一层滤网，通过滤网，把离心管内的空间分成两部分。滤网下面的这部分离心管装上淋巴细胞分离液，滤网上部分空间空出来，等待实验者加入血液。滤网的孔径较小，可以把血液与分离液分隔开，因此可以直接倒入血液而不必担心会弄混二者的界面。但是，滤网的孔径又比血细胞要大，所以，在离心的时候，血细胞可以自由通过滤网，不影响细胞的分层。如图2所示，图2中从左到右依次为：分离液分隔在滤网下面；加入全血，血液和分离液被滤网隔开；经过离心，红细胞透过滤网，沉到管底，淋巴细胞悬浮于血浆和分离液界面之间。
基于滤网的淋巴细胞分离管使得淋巴细胞分离的操作步骤大大简化。但是它也存在以下几点不足之处：
第一，生产工艺复杂，目前只有国外几家公司能够生产加工。在离心管光滑的内壁表面粘上一层薄薄的滤网是很困难的事情。滤网外周要与离心管壁紧闭的粘在一起，不能留下空隙，否则无法起到隔开血液与分离液的目的；粘连要有一定的机械强度，否则在运输或者离心的时候就会脱落；整个加工过程要在严格无菌的环境中完成，不能染菌，也不能残留内毒素。
第二，用于粘黏的胶水有毒性，对分离的血细胞有不利影响。不论是用水溶性胶水、脂溶性胶水还是聚合物胶水，都不可避免地会有未聚合的毒性小分子残留。即使采用烘烤或者洗涤的方法也不能完全除去。并且，洗涤、烘烤也增加了生产工艺的复杂性。
第三，价格昂贵。由于生产工艺复杂，并且生产技术垄断在国外公司手中，所以目前此类淋巴细胞分离管的价格十分昂贵。
发明内容
本发明的目的就是为了针对现有技术的问题，提供一种方便实用、生产工艺简单、安全无毒且成本低廉的淋巴细胞分离管。
本发明的再一目的是提供一种采用上述淋巴细胞分离管分离血液中的淋巴细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种淋巴细胞分离管，包括管体，所述管体底部设置有疏松多孔材料。
所述疏松多孔材料的平均孔径为0.2～0.8毫米。
所述疏松多孔材料吸附有淋巴细胞分离液。
所述淋巴细胞分离管用于分离血液中的淋巴细胞。
本发明还公开了一种分离血液中的淋巴细胞的方法，所述方法包括步骤：将全血加入淋巴细胞分离管中并离心，所述淋巴细胞分离管包括管体，所述管体底部设置有疏松多孔材料，该疏松多孔材料吸附有淋巴细胞分离液。
优选的，上述方法中，离心力为600～1000g，优选800g，离心时间为10～30分钟，优选20分钟。
由于采用了以上的技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
由于疏松多孔材料能够将淋巴细胞分离液吸附使成为半固态，在进行血液淋巴细胞分离时，可以将血液直接倒入，而不必担心弄混血液与分离液二者的界面，与传统方法相比具有方便实用的特点。
此外，本发明的淋巴细胞分离管与基于滤网的分离管相比较还具有如下优点：
第一，生产工艺简单。只需要在洁净环境中把一定量疏松多孔材料置于离心管底部，然后加入一定体积的淋巴分离液即可。疏松多孔材料与管体之间通过摩擦力即可相互固定，无须粘黏，完全可以在普通的洁净车间中生产。
第二，完全无毒。由于采用了医用级别的疏松多孔材料，材料自身无毒；由于不需要粘黏固定，完全排除了胶水毒性的问题。
第三，成本低廉。由于生产工艺简单，无须投入高昂的设备费用，所以生产成本大幅降低。
附图说明
图1是传统淋巴细胞分离液分离血细胞的过程示意图。
图2是采用滤网淋巴细胞分离管分离血细胞的过程示意图。
图3是采用本发明的淋巴细胞分离管分离血细胞的过程示意图。
具体实施方式
本发明的淋巴细胞分离管，包括管体，并且在管体底部设置有疏松多孔材料。管体加管体底部的疏松多孔材料，可以作为本发明的淋巴细胞分离管的最简单的产品形式。使用者在应用此种分离管进行血液淋巴细胞分离操作时，只需先往疏松多孔材料中滴加适量淋巴细胞分离液，使分离液被疏松多孔材料吸附成为半固态，之后即可往分离管中倒入血液进行淋巴细胞分离。也可将淋巴细胞分离液预先加入管体的疏松多孔材料中，制成本发明的另一种可以直接进行血液淋巴细胞分离的产品形式。
本发明所用的管体，可以根据需要采用常见的各种容量规格的离心管制备。所用的疏松多孔材料，可以选用安全无毒的医学材料，如特种海绵等。在本发明中，疏松多孔材料的孔径大小需要满足以下条件：既能使血液中的红细胞顺利通过，同时又能将淋巴细胞分离液吸附成为半固态。本发明的疏松多孔材料的平均孔径优选为0.2～0.8毫米。
本发明的淋巴细胞分离管，所述的疏松多孔材料置于管体的底部。为了增强淋巴细胞层的分离效果，疏松多孔材料的上表面通常制作成一个基本上平的平面。疏松多孔材料可以完全将管体底部填满，也可在底部管尖保留少量空隙。空隙的存在不影响本发明的淋巴细胞分离管的使用效果。但是疏松多孔材料的体积一方面应能保证与管壁之间存在足够的摩擦力，使在产品运输或使用过程中，疏松多孔材料不会从管体内滑出；另一方面，还需要保证能将分离液吸附住，从而即使在倒置时，分离液也不至于从疏松多孔材料中滴落或流出。
本发明中所用的淋巴细胞分离液，可以使用与传统分离方法中完全一样的配方，比如基于传统葡聚糖-泛影葡胺(Ficol-Isopaque)的分离液。
本发明中，“半固态”或“半固体”是指淋巴细胞分离液经疏松多孔材料吸附后，形成不流动、不滴落的状态，也不会与所加入的血液混合。
本发明的淋巴细胞分离管，与滤网淋巴细胞分离管相比，采用了完全不同的原理实现血液与淋巴细胞分离液的分隔。应用本发明的分离管进行血液淋巴细胞分离时，可以直接将血液倒入分离管内，并进行离心。离心时的离心力通常为600～1000g，优选800g，离心时间通常为10～30分钟，优选为20分钟。在离心的时候，红细胞可以轻易进入疏松多孔的材料中，置换出淋巴细胞分离液。而淋巴细胞届时就会悬浮于分离液的上方。整个实验操作过程与基于滤网的淋巴细胞分离管一样轻松与便捷。具体操作过程如图3所示，图3中，左：淋巴细胞分离液被疏松多孔材料吸附，呈半固态；中：加入全血，血液和半固态分离液不会混合；右：经过离心，红细胞钻入疏松多孔材料内部，同时置换出一部分游离的分离液，淋巴细胞悬浮于血浆和分离液界面之间。
利用本发明的淋巴细胞分离管经过多次实验，发现分离血液淋巴细胞的效果非常理想。本发明的半固体淋巴细胞分离管加入全血，经过离心之后，血细胞分层清晰。密度大的红细胞可以轻易钻入底部疏松多孔的材料中，置换出一部分分离液。淋巴细胞层就悬浮在血浆和游离的分离液之间。聚层明显，条带清晰。
采用本发明的半固体淋巴细胞分离管的淋巴细胞获得率与传统的直接使用分离液分离以及国外的滤网淋巴细胞分离作了对比。具体的实验数据见表一。其中实验中所用的半固体淋巴细胞分离管中，疏松多孔材料的平均孔径为0.5毫米，疏松多孔材料所吸附的淋巴细胞分离液与表一中直接使用分离液分离方法中所用的淋巴细胞分离液相同，离心时的离心力为800g，离心时间为20分钟。
表一：分离液、滤网分离管、半固体分离管分血的PBMC得率1
 
血液体积 淋巴细胞分离液<sup>2</sup> 滤网分离管<sup>3</sup> 半固体分离管 P值<sup>4</sup>
3mL 3.10×10<sup>6</sup> 3.05×10<sup>6</sup> 3.07×10<sup>6</sup> <0.01
5mL 5.17×10<sup>6</sup> 5.06×10<sup>6</sup> 4.97×10<sup>6</sup> <0.01
8mL 7.97×10<sup>6</sup> 7.85×10<sup>6</sup> 8.27×10<sup>6</sup> <0.05
1每组实验重复六次，取平均值。
2选用挪威Axis Shield公司Lympho-prep产品作为对照，该产品在国内使用广泛。
3选用挪威Axis Shield公司Lympho-tube产品作为对照，该产品在国内已经有少量使用。
4采用t检验，检验三种细胞分离方法分离出的细胞数量，在两两之间是否有显著差别。
实验表明，三种分离方案分得细胞的得率均没有显著性差别。
淋巴细胞分离时，不仅要求得率高，而且要求活力强。
我们采用台盼蓝活细胞计数的方法比较了同样三种方案分得细胞的活力。实验重复六次，取平均值。细胞存活率见表二。
表二：分离液、滤网分离管、半固体分离管分血的PBMC细胞存活率5
 
淋巴细胞分离液 滤网分离管 半固体分离管 P值<sup>6</sup>
平均存活率 98.7％ 98.1％ 99.2％ <0.01
5实验重复六次，取平均值。
6采用t检验，检验三种细胞分离方法分离出的细胞数量，在两两之间是否有显著差别。
实验表明，三种分离方案分得细胞的活力都非常高，三者没有显著性差别。

Claims (7)

1、一种淋巴细胞分离管，包括管体，其特征在于：所述管体底部设置有疏松多孔材料，疏松多孔材料的孔径大小需要满足以下条件：既能使血液中的红细胞顺利通过，同时又能将淋巴细胞分离液吸附成为半固态。
2、根据权利要求1所述的一种淋巴细胞分离管，其特征在于：所述疏松多孔材料的平均孔径为0.2～0.8毫米。
3、根据权利要求1或2所述的一种淋巴细胞分离管，其特征在于：所述疏松多孔材料吸附有淋巴细胞分离液。
4、根据权利要求3所述的一种淋巴细胞分离管，其特征在于：所述淋巴细胞分离管用于分离淋巴细胞的淋巴细胞。
5、一种分离血液中淋巴细胞的方法，所述方法包括步骤：将全血加入淋巴细胞分离管中并离心，所述淋巴细胞分离管包括管体，所述管体底部设置有疏松多孔材料，该疏松多孔材料吸附有淋巴细胞分离液，疏松多孔材料的孔径大小需要满足以下条件：既能使血液中的红细胞顺利通过，同时又能将淋巴细胞分离液吸附成为半固态。
6、根据权利要求5所述的一种分离血液中淋巴细胞的方法，其特征在于：血液直接倒入分离管中。
7、根据权利要求5所述的一种分离血液中淋巴细胞的方法，其特征在于：离心时离心力为600～1000g，离心时间为10～30分钟。
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